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Análisis microbiológico: Documento aclaratorio

NT-32 Rev. 3 Abril 2012

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INDICE

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 1

2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN .......................................................................................................... 2

3. MÉTODOS DE ENSAYO ............................................................................................................................ 2

4. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS MÉTODOS. VALIDACIÓN. ........................................... 3

4.1. Métodos normalizados (Tipo I) ............................................................................................................ 3 4.2. Métodos alternativos (Tipo II) .............................................................................................................. 3 4.3. Métodos basados en métodos de referencia (Tipo III) ........................................................................ 4 4.4. Comprobación del funcionamiento de métodos Tipo I, II y III .............................................................. 4 4.5. Otros métodos (Tipo IV) ....................................................................................................................... 5

5. ESTIMACIÓN DE INCERTIDUMBRE .......................................................................................................... 5

6. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYO ...................................................... 5

6.1. Control interno ..................................................................................................................................... 6 6.2. Control externo (intercomparaciones) ................................................................................................. 6

7. REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 7

ANEXO I: CEPAS DE REFERENCIA

1. INTRODUCCIÓN

El desarrollo y realización de análisis de control microbiológico es una herramienta que tiene una repercusión

decisiva en el ámbito de la salud pública, la tecnología alimentaria y el Medio Ambiente.

Los laboratorios que realizan estos ensayos trabajan en un entorno de creciente exigencia y responsabilidad,

tanto legal como social, que reclama un nivel de calidad y de confianza extraordinarios. Por ello, tanto los

métodos de ensayo como los laboratorios que realizan los análisis deben asegurar, al máximo nivel permitido

por el desarrollo científico y técnico, la fiabilidad de los resultados. Esto implica que, además de reunir los

criterios técnicos que aseguren su validez, deben ser realizados con una serie de garantías, que permitan

obtener resultados comparables, con independencia del laboratorio que los ejecute. En este sentido, el empleo

de métodos de referencia, reconocidos y aceptados, es la herramienta más eficaz para obtener estas garantías

En la actualidad, existe una amplia disponibilidad de métodos de ensayo (por ejemplo normas de ensayo que

tienen reconocimiento internacional como métodos de referencia) que establecen el estándar científico a

considerar, llegando incluso, cada vez con más frecuencia, a convertirse en métodos oficiales al ser invocados

en la reglamentación.

Por otra parte, los criterios de acreditación de ENAC deben mantenerse siempre en línea con las tendencias que las comunidades científica y tecnológica establecen como más apropiadas, establecidas en este caso por métodos de referencia, como normas y documentos similares. Por esta razón, se considera necesario poner de manifiesto las ventajas que aporta a los laboratorios el uso de métodos de referencia normalizados, como vía principal para garantizar la validez de los métodos y la fiabilidad de los resultados, frente a métodos de elaboración propia que requieren de procesos complejos de validación.



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En la elaboración de este documento han participado la Sociedad Española de Microbiología (SEM), la

Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN), el Ministerio de Medio Ambiente y Medio

Rural y Marino (MARM) y la Asociación de Entidades de Ensayo, Calibración y Análisis-FELAB – (EUROLAB-

España-Asociación Española de Laboratorios de Ensayo, Calibración y Análisis / AELI – Asociación Española de

Laboratorios Independientes). Asimismo, se ha previsto la posibilidad de incorporar anexos a este

documento, relativos a cuestiones técnicas de interés, elaborados en su caso, en colaboración con

organizaciones técnicas competentes.

2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

El objetivo de este documento es establecer los criterios a utilizar por ENAC para la acreditación de los

laboratorios que realizan ensayos microbiológicos.

No debe entenderse esta nota como un documento en el que se establece una metodología para la validación

de métodos de ensayo sino como unas directrices que faciliten tanto la implantación en los laboratorios de los

aspectos aquí recogidos, como su evaluación por parte de ENAC.

Asimismo, se incluye un anexo sobre manipulación y conservación de cepas referencia, elaborado en

colaboración con la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).

3. MÉTODOS DE ENSAYO

La norma UNE-EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que “El laboratorio debe utilizar métodos de

ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean apropiados para el uso previsto”. Por tanto, debe

tenerse en cuenta el ámbito de aplicación, tanto por el laboratorio en cuanto a la selección de los

procedimientos de ensayo y su validación, como por el organismo de acreditación en las evaluaciones que

realice.

Además, la norma establece que “cuando el cliente no especifique el método a utilizar, el laboratorio debe

seleccionar los métodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales, regionales o

nacionales, por organizaciones técnicas reconocidas o en libros o revistas científicas especializados o

especificados por el fabricante de equipos”. Por tanto, en el caso de elegir un procedimiento de ensayo

interno, es recomendable que se parta de métodos de referencia que sean ampliamente aceptados, conocidos

y aplicados en el sector.

Así pues, debido al marco en que se ubica la aplicación y uso de los ensayos microbiológicos, se podría

establecer la siguiente clasificación de métodos, atendiendo al nivel de confianza que aportan y que, por tanto,

marcarán el nivel de información adicional que ENAC requerirá relativa a su validez:

Tipo I: Métodos normalizados. Son métodos desarrollados por un organismo de normalización o por otras organizaciones bien establecidas, cuyos métodos son generalmente aceptados por el sector técnico en cuestión (ILAC G 18) (Ej.: ISO, NF, NMKL, UNE, EN, AOAC, APHA etc.)” Nota: Un método normalizado ha sido exhaustivamente estudiado y describe de forma clara y exacta las condiciones de realización del ensayo. Sus características de funcionamiento deben ser acordes con el uso previsto. Estos métodos normalizados son considerados métodos de referencia ya que pueden ser utilizados para evaluar otros métodos desarrollados para la misma determinación (ISO 16140).



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Tipo II: Métodos alternativos. Métodos que han sido validados por comparación con el método de referencia que corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado (ej. ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994 etc.) y son generalmente reconocidos por la comunidad científica y tecnológica como equivalentes al método de referencia. Tipo III: Métodos basados en métodos de referencia. Métodos descritos en procedimientos internos del laboratorio, que están basados claramente en métodos de referencia y que no suponen una modificación técnica respecto del método de referencia que ponga en cuestión su validez técnica. Deben mantenerse actualizados en relación con el método de referencia en que se fundamentan.

Nota: En cualquier caso, se consideran modificaciones técnicas respecto del método de referencia,

aquellas que pongan en cuestión su validez técnica, como por ejemplo, cambios relevantes en un

medio de cultivo, cambios en las condiciones de incubación (tiempo/temperatura), etc.

Tipo IV: Otros métodos. Son aquellos métodos desarrollados por el propio laboratorio o por cualquier otra parte (un fabricante o proveedor de equipos, de medios de cultivo etc.), y que no disponen del reconocimiento de los métodos de referencia o de los métodos alternativos.

Nota: En los Anexos Técnicos únicamente los métodos del Tipo I reflejarán la norma o documento de

referencia. Los métodos englobados en los Tipos II, III y IV figurarán en el Anexo Técnico como Procedimiento

Interno.

Como parte de los procedimientos de ensayo, se deben incluir también los procedimientos para la preparación

de las muestras en relación con el alcance solicitado, pues se trata de un aspecto crítico en determinados

alcances (ej.: alimentos). Existen normas reconocidas que regulan la manipulación previa de los objetos de

ensayo (ej. serie de normas ISO 6887, UNE-EN ISO 8261) y que deben ser consideradas como una referencia

adecuada.

4. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS MÉTODOS. VALIDACIÓN.

Los métodos de ensayo presentados para su acreditación deben estar validados. Según la norma UNE-EN

ISO/IEC 17025 “la validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que

se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto”. Para ello, es necesario conocer las

características de funcionamiento del método.

Por otra parte, la extensión de las actividades de validación a realizar por el laboratorio dependerá del tipo de

método seleccionado:

4.1. Métodos normalizados (Tipo I)

Los métodos normalizados entendidos como de referencia no requieren una validación completa. El

laboratorio debe, tal y como establece la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 “confirmar que puede

aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos”.

4.2. Métodos alternativos (Tipo II)

A efectos de validación, los métodos alternativos se tratarán como los métodos de referencia. No

obstante, para que ENAC entienda que un método se puede considerar como método alternativo deberá

disponer de evidencias de su validación. En caso de que dichas evidencias no estén disponibles será

responsabilidad del laboratorio solicitante el aportarlas.



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4.3. Métodos basados en métodos de referencia (Tipo III)

Los métodos basados en métodos de referencia no precisan de una validación completa. No obstante el

laboratorio deberá realizar la necesaria comprobación de su funcionamiento.

4.4. Comprobación del funcionamiento de métodos Tipo I, II y III

El laboratorio debe justificar la selección del número y tipo de matrices en función del alcance de

acreditación y ésta debería basarse en la información tomada de referencias bibliográficas o estándares

internacionales (ej.: Anexo B de UNE-EN ISO 16140, ISO/TS 19036).

A continuación se indican las características de funcionamiento que al menos se deben confirmar en el

caso de métodos de referencia, alternativos y basados en métodos de referencia teniendo en cuenta la

naturaleza del método:

- Métodos cuantitativos:

Recuperación

En cuanto a la estimación de la recuperación debería evaluarse a partir de valores de referencia.

Estos valores podrían obtenerse por comparación con métodos de referencia, a partir de

muestras inoculadas con materiales de referencia o cepas de referencia o a partir de resultados

de interlaboratorios.

Reproducibilidad

Se considera una referencia adecuada las pautas establecidas en el documento técnico ISO/TS

19036:2006.

Hay que tener en cuenta que, se debe realizar el cálculo de la precisión (reproducibilidad) en

muestras con diferentes niveles de contaminación (ISO 19036:2006 y su modificación).

En el caso de muestras con alto nivel de contaminación se deben realizar las correspondientes

diluciones decimales para permitir el recuento de las placas, dentro del intervalo que se establece

en documentos de referencia (ej. normas ISO 8199 e ISO 7218).

- Métodos cualitativos:

Límite de detección

La estimación del límite de detección requiere del empleo de suspensiones de inóculo con niveles

de concentración bajos. El propio intervalo de confianza a estos bajos niveles hace que, desde un

punto de vista estadístico, no se pueda conocer de forma exacta si un determinado inóculo

contiene o no el microorganismo a detectar. Por tanto, es aceptable comprobar el método con

bajos niveles de inóculos de microorganismos diana de forma que se evalúen diferencias entre

las distintas matrices, analistas, equipos etc., verificándose la capacidad del laboratorio para

obtener resultados reproducibles y eficaces a estos niveles.



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Asimismo, puede obtenerse información sobre las características de funcionamiento de los métodos de:

- Actividades de control de calidad interno: Los resultados obtenidos en las actividades de control de

calidad interno aplicando el método de ensayo a confirmar, pueden ser utilizados en la

comprobación del método (ej. verificación de nuevas matrices).

- Participación en Intercomparaciones (Control de calidad externo): Los resultados obtenidos en la

participación en intercomparaciones, también pueden ser utilizados para la comprobación de un

método. Para ello, el laboratorio deberá evaluar la idoneidad y calidad del programa de

intercomparación, valorando si es adecuado utilizar la información proporcionada por el ejercicio

en la comprobación.

Puede tomarse como referencia lo dispuesto al respecto en G-ENAC-09 o ISO/TS 19036.

4.5. Otros métodos (Tipo IV)

La norma UNE-EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2 establece que el laboratorio debe validar los

métodos no normalizados y los métodos que diseña o desarrolla para confirmar que los métodos son

aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las

necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. Por tanto, para este tipo de métodos,

el laboratorio deberá evaluar su idoneidad para su ámbito de aplicación así como las actividades

necesarias a realizar para garantizar su validez técnica.

En este sentido las actividades recogidas en el apartado 4.4 que se han considerado como válidas para

asegurar la adecuación al uso, no permiten garantizar de forma completa la validez de los métodos

definidos como Tipo IV ni su caracterización ya que éstas deben estar fundamentadas en referencias

válidas (ej.: ISO 16140, ISO /TR 13843, UNE-EN ISO 17994…)

ENAC deberá disponer de evidencias completas de que dichos métodos han sido adecuadamente

validados. El laboratorio deberá disponer de toda la información sobre el trabajo experimental realizado

para la validación del método.

5. ESTIMACIÓN DE INCERTIDUMBRE

La estimación de Incertidumbre no es de aplicación a métodos cualitativos ni NMP.

En el caso de ensayos microbiológicos de recuento en productos agroalimentarios se ha publicado la ISO/TS

19036:2006 que puede utilizarse como referencia. En el caso de análisis microbiológico de aguas existe el

documento ISO 29201, el cual está en desarrollo.

6. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE ENSAYO

En la norma UNE-EN ISO/IEC 17025 se establece que el laboratorio debe disponer de un control de calidad para

realizar el seguimiento de la validez de los ensayos.



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En el ámbito de los ensayos microbiológicos, la implantación de actividades de control de calidad adecuadas

resulta especialmente importante, dado que no siempre es posible caracterizar de forma completa el

funcionamiento de estos procedimientos de ensayo. No obstante, es factible establecer sistemas que permitan

garantizar el adecuado control de los procedimientos de ensayo microbiológicos.

El aseguramiento de la calidad debe ser tanto interno como externo y puede aplicarse de diferentes formas:

6.1. Control interno

- Control de las condiciones de trabajo: proporciona información sobre la esterilidad de los medios y

materiales auxiliares utilizados y en general, sobre la buena práctica en la realización de los ensayos.

Deben existir criterios para la desviación permitida.

Ensayos cuantitativos:

- Control de la precisión: muestras naturales sin inocular y/o muestras naturales inoculadas

- Control de recuperación: muestras según lo establecido en el apdo. 4.4 (Recuperación)

Ensayos cualitativos:

- El control de calidad interno debe incluir actividades que garanticen un adecuado control del método a

niveles bajos de contaminación (ver apdo. 4.4 Límite de detección)

Estas actividades de control de calidad deben realizarse en la medida de lo posible con muestras naturales

tanto positivas (inoculadas o contaminadas naturalmente) como negativas.

6.2. Control externo (intercomparaciones)

La participación en intercomparaciones permite una evaluación del sesgo de forma que el laboratorio

pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de aceptación definidos por normas,

reglamentos, por el cliente o por el laboratorio.

Todas las actividades de aseguramiento de la calidad deberán planificarse de forma que, en el tiempo y en

función del alcance del método se incluya una adecuada representación de la variedad de matrices con las

que trabaja el laboratorio, complementándose así los resultados obtenidos en la validación inicial.

Por último, la periodicidad de las actividades de control de calidad tanto interno como externo deberá

establecerse considerando diversos factores como pueden ser:

- La robustez del método utilizado (en función de los controles específicos incluidos en el mismo,

método de referencia o de rutina, pruebas de confirmación, datos de validación, vigencia del método

etc.)

- La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos análisis (dado que se debe asegurar que el

laboratorio mantiene la destreza en la ejecución del mismo en cuanto a los materiales, equipos y

cualificación del personal)

- Los resultados históricos de aseguramiento de calidad, así como la correcta evaluación de los mismos.



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- Los resultados obtenidos en el conjunto de acciones de evaluación de la calidad (ej. siembra por

duplicado de placas, verificación del factor de dilución, interlaboratorios, muestras blancas, control de

medios de cultivo, controles ambientales, cualificación del personal etc.)

7. REFERENCIAS

Reglamento (CE) nº 2073/2005, de la Comisión, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios

microbiológicos aplicables a los productos alimenticios.

G-ENAC-04 Rev. 1 “Guía para la acreditación de laboratorios de análisis microbiológicos”.

G-ENAC-09 Rev. 1 “Guía para la expresión de la incertidumbre en los ensayos cuantitativos”.

ILAC-G18:04/2010. Guideline for the Formulation of Scopes of Accreditation for Laboratories

UNE-EN ISO 16140:2003 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo para

la validación de métodos alternativos.

ISO/TR 13843:2000 “Water quality – Guidance on validation of microbiological methods”.

ISO 17994:2004 “Water quality – Criteria for establishing equivalence between microbiological methods”.

ISO 19458:2006 “Water quality -Sampling for microbiological analysis”.

ISO 8199:2005 “Water quality – General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture”.

ISO/TS 19036:2006 “Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines for the estimation of

measurement uncertainty for quantitative determinations”.

UNE-EN ISO 6887-1:2004 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal.

Preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial y diluciones decimales para examen

microbiológico. Parte 1: Reglas generales para la preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial

y diluciones decimales”.

UNE-EN ISO 6887-2:2004 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal.

Preparación de las muestras de análisis, suspensión inicial y diluciones decimales para examen

microbiológico. Parte 2: Reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos”.

UNE-EN ISO 6887-3:2004 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación de

las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 3:

Reglas específicas para la preparación de pescados y productos de la pesca”.

UNE-EN ISO 6887-4:2004 y UNE-EN ISO 6887-4/AC:2005 “Microbiología de los alimentos para consumo

humano y animal. Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para

examen microbiológico. Parte 4: Reglas específicas para la preparación de productos distintos a leche y

productos lácteos, carne y productos cárnicos y, pescados y productos de la pesca”.

UNE-EN ISO 8261:2002 “Leche y productos lácteos. Directrices generales para la preparación de muestras

para análisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el análisis microbiológico”.



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UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 “Evaluación de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de

los laboratorios de ensayo y calibración.

UNE-ENV ISO 11133-1:2001. “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para la

preparación y producción de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la

calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio”.

UNE-ENV ISO 11133-2:2006. “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para la

preparación y producción de medios de cultivo. Parte 2: Guía práctica para las pruebas de rendimiento de

medios de cultivo”.

ISO 7218: 2007. “Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological

examinations”

CEN ISO CD 11133: 2009. “Microbiology of food, animal feeding stuffs, food production environment and

water – Preparation, production, storage and performance testing of culture media”.

ISO 29201. Water Quality – The variability of test results and the uncertainty of measurement of

microbiological enumeration methods.

“El presente documento se distribuye como copia no controlada. Puede consultar su revisión en la página

web de ENAC o internamente en red”.


NT-32 Rev. 3 Abril 2012 Anexo I

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CEPAS DE REFERENCIA

1. Número de pases que se pueden realizar a una cepa procedente de CC/BRC (Colección de

Cultivos Microbianos reconocida o Centro de Recursos Biológicos Microbianos):

- La reconstitución de la cepa y su primera siembra en medio de cultivo es sólo una activación

y no debe considerarse un pase.

- La activación es una etapa necesaria y crítica y debe hacerse en los medios de cultivo

indicados por la Colección. El laboratorio debe conservar registros de dicha etapa.

- Los pases que se hayan realizado en la Colección de procedencia no deben ser tenidos en

cuenta por el laboratorio ni afectan al número de pases que puede realizar (los pases

realizados en la Colección forman parte de los “Antecedentes” de la cepa y quedan

registrados en la ficha de cada cepa que la Colección debe mantener actualizada).

- El laboratorio debe demostrar que el número de pases que realiza a las cepas no afecta a

sus características (en función de su uso previsto). Debe tenerse en cuenta que a mayor

número de pases mayor riesgo de contaminación y de que se produzcan mutaciones.

2. Verificación de las cepas procedentes de CC/BRC en el laboratorio:

No es necesario que el laboratorio confirme la identidad de la cepa de referencia ya que ésta

viene aportada con el certificado.

Las verificaciones a realizar por el laboratorio dependerán, en cada caso, del uso previsto de la

cepa. Por tanto, el laboratorio deberá confirmar en el laboratorio únicamente las características

(bioquímicas, morfológicas, etc.) que le afecten según el uso de dicha cepa en su laboratorio. Por

otro lado, en cada pase debe evaluarse la viabilidad y la pureza.

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