NOVOSTI V MIKROBIOLONOVOSTI V MIKROBIOLOŠŠKI DIAGNOSTIKIKI DIAGNOSTIKI

INVAZIVNIH GLIVIINVAZIVNIH GLIVIČČNIH BOLEZNINIH BOLEZNI

SaSašša Sima Simččiičč, UL MF In, UL MF Inšštitut za mikrobiologijo in imunologijotitut za mikrobiologijo in imunologijo

MikrobioloMikrobiološška diagnostika invazivnih glivika diagnostika invazivnih gliviččnih bolezninih bolezni

1. Pregledovanje direktnih mikroskopskih preparatov iz klini1. Pregledovanje direktnih mikroskopskih preparatov iz kliniččnih vzorcevnih vzorcev

2. Histopatolo2. Histopatološško dokazovanje invazije povzroko dokazovanje invazije povzroččiteljev v tkivaiteljev v tkiva

3. Osamitev in identifikacija3. Osamitev in identifikacija

4. Dolo4. Določčanje antigenov gliv v serumu in drugih telesnih tekoanje antigenov gliv v serumu in drugih telesnih tekoččinahinahin doloin določčanje protiteles v serumuanje protiteles v serumu

5. Dokazovanje nukleinskih kislin v klini5. Dokazovanje nukleinskih kislin v kliniččnih vzorcihnih vzorcih

www.p-e-g.org/sac/fruehjahrstagung07/Donnelly.pdf

Omejitve pri dokazovanju nukleinskih kislin v kliniOmejitve pri dokazovanju nukleinskih kislin v kliniččnih vzorcihnih vzorcih

1.1. Nezadostno poznavanje bioloNezadostno poznavanje biološških dejavnikov (sprokih dejavnikov (sproššččanje DNA iz gliv na mestuanje DNA iz gliv na mestuokuokužžbe, kinetika sprobe, kinetika sproššččanja in prehod DNA v krvni obtok anja in prehod DNA v krvni obtok –– nekroza tkiva ??,nekroza tkiva ??,vpliv antimikotikov).vpliv antimikotikov).

2.2. Metoda PCR Metoda PCR šše ni standardizirana!!!e ni standardizirana!!!KakKakššen vzorec je primeren?en vzorec je primeren?Katera metoda za izolacijo DNA je primerna?Katera metoda za izolacijo DNA je primerna?Katere tarKatere tarččne sekvence pomnone sekvence pomnožževati?evati?Kateri naKateri naččin pomnoin pomnožževanja uporabiti (RTevanja uporabiti (RT--PRC Roche LC,PRC Roche LC,Corbett RotorCorbett Rotor--Gene ali Applied Biosystems TaqMan)?Gene ali Applied Biosystems TaqMan)?

3. 3. Medlaboratorijska primerjava rezultatov izbranih metod PCR kaMedlaboratorijska primerjava rezultatov izbranih metod PCR kažžeena preveliko variabilnost rezultatov (problem analitske obna preveliko variabilnost rezultatov (problem analitske obččutljivosti PCR metode,utljivosti PCR metode,problem laproblem lažžno negativnih rezultatov pri bolnikih z IAno negativnih rezultatov pri bolnikih z IAin lain lažžno pozitivnih rezultatov pri bolnikih brez klinino pozitivnih rezultatov pri bolnikih brez kliniččnih znakov IA).nih znakov IA).

4.4. DoloDoloččitev aspergilusne DNA v vzorcih BAL ne loitev aspergilusne DNA v vzorcih BAL ne loččuje med kontaminacijo s konidijiuje med kontaminacijo s konidijiin invazijo v tkivo (boljin invazijo v tkivo (boljšši izbor je test na GM, ker se GM vei izbor je test na GM, ker se GM veččinoma sproinoma sprošščča iz hifa iz hifmed rastjo aspergilusa, in manj iz konidijev).med rastjo aspergilusa, in manj iz konidijev).

MikrobioloMikrobiološška diagnostika invazivnih glivika diagnostika invazivnih gliviččnih bolezninih bolezni-- najbolj pogosto uporabljeni testi na antigene glivnajbolj pogosto uporabljeni testi na antigene gliv

1.1. Aspergiloza: ELISA na galaktomanan (BioRad, Platelia AspergillusAspergiloza: ELISA na galaktomanan (BioRad, Platelia Aspergillus Antigen)Antigen)

2.2. ““PanPan--fungalfungal”” kolorimetrikolorimetriččni test na 1,3ni test na 1,3--betabeta--DD--glukanglukan(Associates of Cape Cod, Fungitell; Wako; Seikegaku Kogyo)(Associates of Cape Cod, Fungitell; Wako; Seikegaku Kogyo)

3.3. Kandidoza: ELISA na manan (BioRad, Platelia Candida Antigen)Kandidoza: ELISA na manan (BioRad, Platelia Candida Antigen)

4.4. Kriptokokoza: ELISA na kapsularni polisaharidni antigenKriptokokoza: ELISA na kapsularni polisaharidni antigen(Meridian, Premier Cryptococcus)(Meridian, Premier Cryptococcus)

5.5. Histoplasmoza: ELISA na polisaharidni antigenHistoplasmoza: ELISA na polisaharidni antigen(MiraVista, H.capsulatum Antigen EIA)(MiraVista, H.capsulatum Antigen EIA)

CID 2004: 39; 199

Conclusion:“highly sensitive and specificin detecting early IFIs,including candidiasis,fusariosis, trichosporonosis,and aspergillosis”

CID 2005: 41; 654

Conclusion: “reproducible assay results with high specificity and high PPV”

Med Mycol 2006: 44; SI85.

Conclusions:“the G-test was developed in 1992 by Obayashi et al. and has found wide applicationin Japan in the fields of hematological diseases and HSCT, in the diagnosis of deep mycosis”

“BG was discussed as a surrogate marker for a presumptive therapy of patients with fevernot responding to broad-spectrum antibiotics”

Lancet Infect Dis 2004: 4; 349Conclusions:“may has a significant variation inperformance”

“the causes of this variability aremultifactorial”(biological and epidemiological)

“understanding the biology of GMrelease by Aspergillus will greatly enhanceour understanding of the kinetics of thisand other surrogate markers”

CID 2006: 42; 1417Conclusions:“the accuracy of the test is variable amongdifferent patient populations”

“the test is more useful in patientswho have hematological malignancy or whohave undergone HSCT than in solid-organtransplant recipients”

“further studies with attention tothe impact of antifungal therapy andrigorous assessment of false-positivetest results are needed”

CID 2006: 43 (Suppl 1); S15

Conclusion:“the combination of the 2 tests (GM and BG) improved specificity (to 100 %)and PPV (to 100 %) for the diagnosis of IA, without affecting sensitivity and NPV”

CID 2007: 44; 402Conclusions:“experience with use of beta-glucan assay in HSCT recipients is limited”

“although valuable as diagnostic adjuncts to support a diagnosis of a probable IFIin patients with compatible host factors and radiological findings as defined in theEORTC/MSG criteria, the value of these laboratory markers as screening toolsfor IFIs is controversial, and more research is required”

“it is a high priority to validate the application of these tests to antifungal algorithms”

LaLažžno pozitivni (5 % odrasli no pozitivni (5 % odrasli --83 % novorojenci)83 % novorojenci)in lain lažžno negativni rezultati na GM v serumuno negativni rezultati na GM v serumu

1.1. GM je stranski produkt fermentacije pri pridobivanju betaGM je stranski produkt fermentacije pri pridobivanju beta--laktamskihlaktamskihantibiotikov (Tazocin; kljub ukinitvi terapije, laantibiotikov (Tazocin; kljub ukinitvi terapije, lažžno pozitivni rezultati lahkono pozitivni rezultati lahkoostanejo veostanejo večč dni pri bolnikih z okvaro ledvic).dni pri bolnikih z okvaro ledvic).

2.2. PoPošškodbe kodbe ččrevesne stene ali nezrela revesne stene ali nezrela ččrevesna stena pri otrocih posperevesna stena pri otrocih pospeššijoijoabsorpcijo GM iz hrane in vode.absorpcijo GM iz hrane in vode.

3.3. Infuzija z RacolInfuzija z Racol--om, ki vsebuje sojine proteine; prisotnost paraproteinovom, ki vsebuje sojine proteine; prisotnost paraproteinovIgM, CIC in avtoprotiteles v serumu, ki se veIgM, CIC in avtoprotiteles v serumu, ki se vežžejo s protitelesi v testuejo s protitelesi v testu(bolniki s kroni(bolniki s kroniččno GVHD po alogenski HSCT). no GVHD po alogenski HSCT).

4.4. BombaBombažžni brisi.ni brisi.

5.5. Gastrointestinalna kolonizacija z Gastrointestinalna kolonizacija z Bifidobacterium spp.Bifidobacterium spp. (lipoteihoi(lipoteihoiččna kislinana kislinain lipoglikan) pri novorojenin lipoglikan) pri novorojenččkih in otrocih, ki ji sledi translokacija.kih in otrocih, ki ji sledi translokacija.

LaLažžno pozitivni rezultati (od 5% pri odraslih do 83% pri novorojencno pozitivni rezultati (od 5% pri odraslih do 83% pri novorojencih)ih)in lain lažžno negativni rezultati na GM v serumuno negativni rezultati na GM v serumu

6.6. Kriptokokoza (galaktoksilomanan ima epitope, ki so navzkriKriptokokoza (galaktoksilomanan ima epitope, ki so navzkrižžno reaktivnino reaktivniz GM), navzkriz GM), navzkrižžna reaktivnost s na reaktivnost s Penicillium spp.Penicillium spp.

7.7. Vzroki za laVzroki za lažžno negativne rezultate pri IA: zmanjno negativne rezultate pri IA: zmanjššano sproano sproššččanje GM v krianje GM v krina mestu okuna mestu okužžbe, zaradi dejavnikov iz okolja (pH in omejena kolibe, zaradi dejavnikov iz okolja (pH in omejena količčina hranil na mestuina hranil na mestuokuokužžbe vplivata na sprobe vplivata na sproššččanje GM v kri), in abscesi.anje GM v kri), in abscesi.

8.8. AntimikotiAntimikotiččna terapija zmanjna terapija zmanjšša oba obččutljivost testiranja (AmB utljivost testiranja (AmB in vitroin vitro omejiomejirast micelija).rast micelija).

9. 9. Drugi vzroki za variabnilnost rezultatov:Drugi vzroki za variabnilnost rezultatov:sprosproššččanje GM iz hif, prehod iz mesta okuanje GM iz hif, prehod iz mesta okužžbe v kri,be v kri,vezava GM s sestavinami v krvi, dejavniki v bolniku (mesto in obvezava GM s sestavinami v krvi, dejavniki v bolniku (mesto in obseg bolezni,seg bolezni,antimikotiki, starost, metodoloantimikotiki, starost, metodološški dejavniki ki dejavniki –– prag, definicija pozitivnega izvida),prag, definicija pozitivnega izvida),razvrrazvrššččanje IGB.anje IGB.

LaLažžno pozitivni rezultati na GM v drugih klinino pozitivni rezultati na GM v drugih kliniččnih vzorcihnih vzorcih

1.1. BAL: uporaba tekoBAL: uporaba tekoččine za izpiranje Plasmalyte (Baxter), ki vsebujeine za izpiranje Plasmalyte (Baxter), ki vsebujeNaNa--glukonat.glukonat.

2.2. BAL: pogosto pri bolnikih po presaditvi pljuBAL: pogosto pri bolnikih po presaditvi pljučč, zaradi kolonizacije, zaradi kolonizacijedihal z aspergilusom; testiranje BAL se kombinira s slikovno diadihal z aspergilusom; testiranje BAL se kombinira s slikovno diagnostignostiččnonometodo hrmetodo hr--CT.CT.

3.3. Urin: kriUrin: križžna reaktivnost protiteles EBna reaktivnost protiteles EB--A2 s ciklofosfamidom.A2 s ciklofosfamidom.

LaLažžno pozitivni rezultati na BG v serumuno pozitivni rezultati na BG v serumu LaLažžno negativni rezultati na BG v serumuno negativni rezultati na BG v serumu

1.1. GramGram--pozitivna bakteriemija.pozitivna bakteriemija.

2.2. Kontaminacija z BG pri izvedbi testa.Kontaminacija z BG pri izvedbi testa.

3.3. Hemoliza vzorca.Hemoliza vzorca.

4.4. Terapija s frakcijami plazemskih proteinov aliTerapija s frakcijami plazemskih proteinov alikoagulacijskimi faktorji in nekaterimi zdravili.koagulacijskimi faktorji in nekaterimi zdravili.

5.5. Hemodializa z uporabo celuloznih membran inHemodializa z uporabo celuloznih membran instik z bombastik z bombažžnimi gazami.nimi gazami.

6.6. Kardiopulmonarni obtok.Kardiopulmonarni obtok.

7.7. VroVroččinska kap, in nepoznani razlogi.inska kap, in nepoznani razlogi.

8.8. BG v antibiotikih (npr. amoksicilinBG v antibiotikih (npr. amoksicilin--klavulanska k.)

1.1. Velika koncentracija bilirubina inVelika koncentracija bilirubina intrigliceridov v krvi.trigliceridov v krvi.

klavulanska k.)

CID 2004: 39; 1467

CID 2006: 43 (Suppl 1); S15

Conclusions:“GM can be detected in BAL, CSF and urine from patients with IA with highersensitivity than is the case with culture, as well as early in the course of infection”

“PPV and NPV are 100 % when BAL GM EIA testing is combined with hr-CT scanning”

“GM EIA and qPCR assay add to the sensitivity of BAL for diagnosing IPA inhigh risk patients”

Conclusions:

“ “Platelia Candida Mannan EIA” is highly specific;there remains however a lack of the sensitivity (40-75%; probably dueto a rapid clearance of mannan), necessary for early detectionof systemic candidiasis)”

“Test strategy works for C.albicans, C.glabrata and C.tropicalis butdoes not work as well with C.parapsilosis, C.kefyr, or C.krusei(EBCA1 mAb used in the mannan assay recognize a mannose epitope presentto a much lesser extent in mannan from the last three species”

Clin Microbiol Rev 2004: 17; 281.

J Clin Microbiol 2005: 43; 2181J Clin Microbiol 2005: 43; 2181

Conclusions:

“The usefulness of antibody detection may be limited when the patientsunder investigation are immunosuppressed and/or heavily colonized but uninfected”

“The specificities for two antigen detection assays (ELISA and latex agglutination)and PCR method are high,although the Candida PCR method has enhanced sensitivity over both antigen assays”

“Both PCR and ELISA techniques should be used in unison to aid the detection ofinvasive Candida infections”

ZakljuZaključčkiki

Vsaka metoda ima omejitve, zato bi bilo najbolje uporabiti serijVsaka metoda ima omejitve, zato bi bilo najbolje uporabiti serijsko testiranjesko testiranjeveveččih vzorcev z veih vzorcev z veččimi metodami (gliviimi metodami (gliviččna bolezen je dinamina bolezen je dinamiččen proces).en proces).

Slikovno diagnostiSlikovno diagnostiččno metodo hrno metodo hr--CT in zanesljive laboratorijske teste na analiteCT in zanesljive laboratorijske teste na analiteiz gliv bi mogli uporabiti kot markerje za uvedbo antimikotiiz gliv bi mogli uporabiti kot markerje za uvedbo antimikotiččne terapijene terapijeali kot kriterij za spremembo ali kot kriterij za spremembo žže obstojee obstoječčega antimikotiega antimikotiččnega renega režžima.ima.

V prihodnosti si veV prihodnosti si večč obetamo od standardiziranih molekularnih metod, ki bodoobetamo od standardiziranih molekularnih metod, ki bodovkljuvključčene v mikrobioloene v mikrobiološško diagnostiko IGB. ko diagnostiko IGB.