Cell Reports

Supplemental Information

Notch Is Required for Inflammatory

Cytokine-Driven Goblet Cell Metaplasia in the Lung

Henry Danahay, Angelica D. Pessotti, Julie Coote, Brooke E. Montgomery, Donghui Xia, Aaron Wilson,

Haidi Yang, Zhao Wang, Luke Bevan, Chris Thomas, Stephanie Petit, Anne London, Peter LeMotte, Arno

Doelemeyer, Germán L. Vélez-Reyes, Paula Bernasconi, Christy J. Fryer, Matt Edwards, Paola Capodieci,

Amy Chen, Marc Hild, and Aron B. Jaffe

  

 

Figure  S1.  Bronchosphere  development,  Related  to  Figure  1.  (A‐C)  Quantitative  PCR  analysis  of goblet  cell markers  (A),  ciliated  cell markers  (B),  and  basal  cell markers  (C)  at  the  indicated  time points after plating  in 3D.   Shown  is the mean fold change +/‐ SEM relative to control from at  least three  independent  experiments.    (D)  Phase  contrast  images of  bronchospheres  at different  times 

after plating in 3D.  Scalebar = 50 m.  (E) Human airway basal cells labeled with Oregon Green 488‐DFFDA  were mixed  with  an  equal  amount  of  unlabeled  cells,  plated  in  3D  at  different  seeding densities and imaged after 3 days in culture.  Note that at seeding densities of 75 cells per well and lower, structures are clonal, exclusively containing either labeled cells or unlabeled cells.  Scalebar = 

50 m.  (F) Day 20 bronchospheres derived from human airway basal cells plated at a clonal density (75 cells/well) were  fixed and stained  for DNA  (blue), and markers of basal cells (p63, red), ciliated 

cells (acetylated ‐Tubulin, orange), and goblet cells (MUC5AC, green).  Scalebar = 50 m. 

 

Figure S2. Effect of IL‐13 on basal cell fate during bronchosphere development, Related to Figure 2.  IL‐13 treatment promotes goblet cell  formation at  the expense of ciliated cells.    (A) Human airway basal cells were grown in 3D  in the presence of  increasing concentrations of IL‐13, and analyzed for expression  levels of the  indicated goblet cell markers  (top  row), ciliated cell markers  (middle row), and basal cell markers (bottom row).   Shown  is the average fold change +/‐ SEM relative to control from  five  independent  experiments.  *p<0.05;  **p<0.01;  ****p<0.0001.  One‐way  ANOVA  and Dunnett’s Multiple Comparison Test. (B,C) Day 14 bronchospheres grown in the presence of 1 ng/ml 

IL‐13 (C) or vehicle control (B), and stained for DNA (blue), acetylated ‐Tubulin (orange), MUC5AC 

(green), and actin (red). Scalebar = 25 m. 

 

 

 

Figure S3. Expression of Notch receptors in basal cells and bronchospheres, Related to Figure 4.  (A‐C)  Expression  levels of Notch1, Notch2, Notch3,  and Notch4  in  human  airway basal  cells  prior  to plating  in Matrigel  (A), day 14 3D bronchospheres  (B), and FACS purified  ITGA6+ basal and  ITGA6‐ luminal cells  from day 21 ALI cultures  (C) were analyzed by qPCR. Shown  is the average expression +/‐  SEM  relative  to GAPDH  from  six  independent  experiments.  (D‐F)  RNA  samples  from  (C) were analyzed for expression of goblet cell markers (D), ciliated cell markers (E), and basal cell markers (F) to confirm  that  the  ITGA6+ and  ITGA6‐ populations were enriched  for basal cells and differentiated cells,  respectively. Shown  is  the average expression +/‐ SEM  relative  to  ITGA6+  (D, E) or  ITGA6‐  (F) cells from six independent experiments. 

 

Figure  S4.  Validation  of Notch  receptor‐specific  antibody  activity,  Related  to  Figure  4.    (A)  Co‐culture  luciferase  reporter assays of Notch1  (top), Notch2  (middle), and Notch3  (bottom),  induced with DLL1‐expressing  cells  (+DLL1).  ‐DLL1, control cells; DMSO, dimethyl  sulfoxide alone; DAPT, 10 mM  in DMSO;  IgG,  isotype  control  antibody,  10 mg/ml.   Data  is  expressed  as  the  fold  change  in reporter (luciferase) activity, relative to ‐DLL1 control cells (mean ± SEM from at least 3 independent experiments). (B) Human airway basal cells were grown in 3D in the presence of vehicle control, IgG, 

or  increasing  concentrations of  inhibitory antibodies  specific  for Notch1  (‐N1), Notch2  (‐N2), or 

Notch3 (‐N3), and analyzed for the expression  levels of the Notch target genes HEY1, HEY2, HES1, HES5, and NRARP.   Shown  is  the mean  fold change +/‐ SEM  relative  to control  from at  least  three independent  experiments.  *p<0.05;  ***p<0.001.  One‐way  ANOVA  and  Dunnett’s  Multiple Comparison Test. 

 

Figure S5. Notch3 inhibition has no effect on IL‐13‐induced goblet cell metaplasia, Related to Figure 4.  Human  airway  basal  cells were  grown  in  3D,  to  produce  bronchospheres,  in  the  presence  of 

vehicle control or IgG (10 μg/ml), with or without 1 ng/ml IL‐13, or increasing concentrations of ‐N3 (μg/ml) together with 1 ng/ml of IL‐13, and analyzed for the expression levels of the indicated goblet cell markers  (A), ciliated cell markers  (B), basal cell markers  (C), and the Notch  target gene NRARP (D).  Shown is the mean fold change +/‐ SEM relative to control from three independent experiments. **p<0.01; ***p<0.001. One‐way ANOVA and Dunnett’s Multiple Comparison Test. 

 

Figure  S6.     Notch2  inhibition  blocks  goblet  cell metaplasia  downstream  of multiple mediators, Related to Figure 5.   Human airway basal cells were grown  in air‐liquid  interface (ALI) cultures, and 

treated with IgG (0.1 μg/ml) or ‐N2 (0.1 μg/ml), together with the indicated proteins, from day 7 in culture  (day 0 at ALI) and analyzed at day 21  (day 14 at ALI) by  immunostaining  for the goblet cell 

markers MUC5AC  (red), MUC5B  (green),  and  acetylated  ‐Tubulin  (orange).    Quantification  was performed with 5‐6 independent regions of each filter from two independent experiments.  A total of more than 700 cells were counted  for each condition. Shown  is the percentage of cells stained  for each marker. 

 

Figure  S7.  Notch2  neutralization  inhibits  an  allergen  model  of  goblet  cell  metaplasia  in  vivo, Related  to  Figure  6.  (A)  Representative  images  of  PAS‐stained  lung  sections  from  the  indicated 

treatment  groups  (9‐10 mice  per  group).  PAS‐positivity  is  dark  violet.    Scalebar  =  100  m.    Inset 

Scalebar  =  10  m.    (B)  Quantification  of  the  relative  area  of  PAS  staining  in  the  lung.  (C) Representative  images of  lung sections  from the  indicated treatment groups  (9‐10 mice per group) 

stained  for  the  ciliated  cell‐specific marker  Foxj1.  Scalebar = 100 m.  Inset  Scalebar = 10 m.  (D) 

Quantification of the number of Foxj1+ cells per 100 m of epithelium. ***p<0.001. One‐way ANOVA and Dunnett’s Multiple Comparison Test. 

 

Table S1. Screening hits that modulated expression of one or more cell type‐specific markers by 2‐

fold or greater, Related to Figure 2. Provided as a separate Excel file. 

 

Movie  S1.  Timelapse  video of human airway basal  cells after plating  in 3D Matrigel, Related  to 

Figure 1. 

 

Movie S2. Timelapse video of day 9‐14 of bronchosphere development in 3D, Related to Figure 1. 

 

Movie S3. Timelapse video of beating cilia in fully formed bronchospheres, Related to Figure 1. 

 

Movie  S4.  High magnification  timelapse  video  of  beating  cilia  in  fully  formed  bronchospheres, 

Related to Figure 1. 

 

Supplemental Experimental Procedures 

Antibodies 

For production of anti‐Notch1 (A2), anti‐Notch2 (D3) and anti‐Notch3 (A4) antibodies, DNA synthesis 

was  carried  out  (Invitrogen)  for  light  and  heavy  chains  to  correspond  to  published  amino  acid 

sequences (Fung et al., 2008; Siebel and Wu, 2008, 2010). Synthetic products were subcloned into a 

dual  CMV  promoter  vector  (pRS5a  derivative  containing  dhfr  and  neomycin  resistance markers). 

Stable cell lines expressing the antibodies were made by transfection of CHOK1 PD cells followed by 

selection for methotrexate and G418 resistance. CHO pools were maintained in selection media and 

expanded for protein production. The conditioned medium was clarified using a filter train of 1.2 µm 

filter, 0.45 + 0.2 µm filter, and a final 0.2 µm (Sartorius Corporation, Edgewood, NY).  The conditioned 

medium  was  then  concentrated  five‐  to  ten‐fold  (Tangential  Flow  Filtration  Device,  Tangenx 

Corporation, Shrewsbury, MA) and applied to MabSelect SuRe (GE Healthcare, USA) equilibrated  in 

phosphate buffered saline  (PBS). The  IgG1 antibody molecules were eluted using 50mM citrate pH 

3.0, fractions were  immediately neutralized by dialysis  into 1X dPBS (Slide‐A‐Lyzer Dialysis Cassette, 

Pierce  Corporation)  into  PBS.    Protein  aggregation  was  measured  by  HPLC  (Shimadzu)  on  an 

analytical  sizing  column  (Tosoh  3000SWXL)  and  further  polished  on  a  Superdex  200  column  (GE 

Healthcare,  USA)  if  necessary.    Antibodies  were  concentrated  using  centrifugation  spin  columns 

(Vivaspin,  GE  Healthcare,  USA)  and  tested  for  endotoxin  values  using  an  Endosafe  PTS  reader 

(Charlesriver, USA) prior to use.   

Generation of Notch‐Gal4‐NLS‐VP16 retroviral vectors 

To  determine  the  capacity  of  anti‐Notch  antibodies  to  inhibit  Notch  ligand‐induced  signaling, 

reporter gene assays (RGA) using double stable reporter cell lines expressing HLR‐huNotch‐Gal4‐NLS‐

VP16 / Gal4‐UA‐Luciferase were developed.  

Human Notch1, Notch2  and Notch3  extracellular  and  trans‐membrane  portions  followed  by Gal4 

DNA binding domain, VP16 and a nuclear localization sequence (NLS) were cloned into the retroviral 

vector  pLNCX2  (Clontech,  cat#  631503).  Generation  of  these  chimeric  Notch  receptors  and 

corresponding  reporter gene assays allowed  for examination of  the effects of Notch antibodies of 

Notch receptor specific signaling.   

The coding sequence  for Gal4‐VP16 was gene synthesized and cloned  into the SalI‐ClaI sites of  the 

vector pLNXC2  (Clontech)  to make pLNXC2‐Gal4‐VP16. The extracellular  (ECD) and  transmembrane 

domains of human Notch3  (amino acids 1‐1669), human Notch1  (amino acids 1‐1762) and human 

Notch 2 (1‐1704) were gene synthesized and cloned  into the HindIII‐SalI sites of pLNXC2‐Gal4‐VP16 

to produce fusions of the respective Notch proteins to Gal4‐VP16. 

Retrovirus was produced by  transfecting 293‐GP2 Packaging Cell Line  (Clontech, cat# 631458) with 

the  appropriate  retroviral  vector  (pLNCX2_hNotch1_Gal4‐VP16,  pLNCX2_hNotch2_Gal4‐VP16  or 

pLNCX2_hNotch3_Gal4‐VP16).  Promega’s Fugene6 was used as the lipid‐based transfection reagent. 

Transfection was carried out according  to manufacturer’s  instructions. Virus was collected at 48 h 

after  transfection  and  immediately  used  to  transduce  HLR  cells  (HLR‐PathDetect,  Stratagene). 

Transduced cells were under selection for at least two weeks, before they were tested in a co‐culture 

assay. Clonal populations for each cell line were selected by standard protocols. 

Notch‐Gal4‐NLS‐VP16‐UA‐luciferase ligand‐induced reporter gene assay 

HLR‐Notch‐Gal4‐NLS‐VP16 / Gal4‐UA‐TATA‐Luciferase (HLR‐N) cells are activated by co‐culture with L 

cells stably expressing Delta1  (DLL1‐19)  (Hicks et al., 2000).   Co‐culture with  ligand expressing cells 

results  in activation of Notch signaling and proteolytic cleavage of  the Notch chimeric  receptors to 

release  the Gal4‐NLS‐VP16.   This Gal4‐NLS‐VP16  translocates  to  the nuclease where  it binds  to  the 

Gal4‐luciferase  reporter  resulting  in production of  luciferase.   At 90% confluency HLR‐N cells were 

detached using Trypsin‐EDTA and diluted  in assay medium  (DMEM, High glucose, L‐Glu,  Invitrogen, 

Cat# 11995‐065;  supplemented with 10% FBS, 1% P/S)  to a  concentration of 2x105  cells/ml. 50 µl 

HLR‐N cells per well (= 1x104 cells) were seeded into white flat‐bottomed 96‐well plates (Costar, Cat 

#3917) and incubated at 37 °C and 5% CO2 overnight.  

The next day, the Notch antibodies (IgGs) were diluted at the desired concentrations in assay media. 

5 µl of antibody dilution were added to the seeded cells and  incubated for 2 h at 37°C and 5% CO2. 

Next,  Jagged1  and Delta1  ligand  expressing mouse  L‐cells were  detached  using  Trypsin‐EDTA  and 

diluted in assay media to a concentration of 8x105 cells/ml. In each well, 50 µl mouse L‐cells (= 4x104 

cells/ well) were added to the cultured HLR‐N cells (50 µl HLR cells + 5 µl antibody + 50 µl mouse cells 

= 105 µl final volume) and incubated overnight at 37°C and 5% CO2. As a control 50 µl mouse parental 

L‐cells were added for the ligand independent setting. 

After overnight  incubation,  freshly prepared Bright‐Glo  reagent was warmed  to  room  temperature 

(Promega,  Cat  #E2610)  and  100  l  was  added  to  each  well.  After  5  min  incubation  time,  the 

luminescence was read in a luminometer (GeniosPro, Tecan).   

Supplemental references 

Fung, S.C., Li, K., Li, Y., Singh, S., and Zhou, B.‐B.S. (2008). Antagonist anti‐Notch3 antibodies and their use in the prevention and treatment of Notch3‐related diseases. US 2008/0226621 A1. 

Hicks, C., Johnston, S.H., diSibio, G., Collazo, A., Vogt, T.F., and Weinmaster, G. (2000). Fringe differentially modulates Jagged1 and Delta1 signalling through Notch1 and Notch2. Nat Cell Biol 2, 515‐520. 

Siebel, C.W., and Wu, Y. (2008). Anti‐Notch1 NRR antibodies and methods using same field of the invention. WO 2008/15025 A1. 

Siebel, C.W., and Wu, Y. (2010). Anti‐Notch2 antibodies and methods of use. US 2010/0080808 A1.