NonNon--bilayer phospholipids arrangements and bilayer phospholipids arrangements and microparticles in pregnancy complicationsmicroparticles in pregnancy complications

Begoña Campos, Ph.D.Dept. Obstetrics and

GynecologyCollege of Medicine

University of Cincinnati

Papel de los arreglos de Papel de los arreglos de fosfolípidosfosfolípidosde no de no bicapabicapa y las y las micropartículasmicropartículas en en complicaciones del embarazocomplicaciones del embarazo

ColaboradoresColaboradores

ENCB-IPNDra. Isabel Baeza RamirezDr. Carlos WongDr. Miguel Ibañez

University of CincinnatiDr. Mark ChamesDr.Mike HnatMSc Jessica Neil

Son los lípidos antigénicos?Son los lípidos antigénicos?

Organización de los fosfolípidosOrganización de los fosfolípidos

Membrana plasmáticaMembrana plasmática

Estructuras de los fosfolípidosEstructuras de los fosfolípidos

ArreglosArreglos de de phospholipidosphospholipidos

La fase de no bicapa puede ser La fase de no bicapa puede ser inducida por:inducida por:

• Estructura química de los fosfolipidos• Temperatura• Otros factores intrínsecos (Fuerza

iónica, pH, drogas, etc…)

NPA en Sistemas BiológicosNPA en Sistemas Biológicos

Son los Son los lípidoslípidos de no de no bicapabicapa antigénicos?antigénicos?

Arreglos de fosfolípidos de no bicapa (NPA)Arreglos de fosfolípidos de no bicapa (NPA)

TBS

TBS + Ca2+

TBS + Mn2+

PC/PA

Liposomes from:

Micelle Liposome

Liposome

Bilayer

Mab clones176

+ Mn2+

-Mn2+

205 308 aCaM

1.0

0.8

0.6

Ts-m

Ab

Ts-m

Ab

Ts-m

Ab

polyclo

nal Ab

polyclo

nal Ab

polyclo

nal Ab

H308-APm

Ab

H308-APm

Ab

H308-APm

Ab0.4

0.2

0.0

TBS

Ab

sorb

ance

(49

2 n

m)

TBS + Mn2+ TBS + Ca2+

Liposome-coated surface

Aguilar et al., J. Biol. Chem 274(36):25193-25196, 1999.

1.0

0.8

0.6

PC PCPA PACL CL

0.4

0.2

0.0

murine polyclonal Ab H308-APmAb

Abs

orba

nce

(492

nm

)

Non-liposomal-coated surface

ArreglosArreglos de no bicapa en de no bicapa en membranasmembranascellularescellulares

NPA en apoptosis en NPA en apoptosis en celulascelulas BeWoBeWo

ConclusionesConclusiones

• Arreglos de no bicapa son imunogenicos• Anticuerpo monoclonal exclusivamente

reacciona arreglos de no bicapa • Anticuerpo monoclonal prolonga el tiempo

de coagulación • Arreglos de no bicapa están presentes en

membranas celulares

ModelosModelos animalesanimales

InfusiónInfusión

A CB D

InmunizaciónInmunización con NPAcon NPA

Cambios histológicos en ratones Cambios histológicos en ratones BalbBalb/c /c inmunizados con NPAinmunizados con NPA

Baeza, I et al., Eur. J. Of Immunol 34(2):576-86, 2004.

Están los anticuerpos contra Están los anticuerpos contra lípidos de no lípidos de no bicapabicapa presente en presente en el suero de pacientes con el el suero de pacientes con el síndrome de síndrome de antifosfolípidosantifosfolípidos??

PreeclampsiaPreeclampsia

es definida como el incremento de la presión arterial acompañada de edema, proteinuria o ambas que ocurre después de la 20a semana de gestación.

La preeclampsia se presenta en aproximadamente un 8% del total de los embarazos y hay un incrementoen el riesgo asociado con casos de primer embarazo, embarazosmúltiples, madres de avanzadaedad, mujeres afroamericanasy antecedentes previos de diabetes, hipertensión o enfermedad renal.

DiagnosticoDiagnostico

• Examen de orina: Proteínas en la orina > 300 mg/lt en 24 horas

• Acido úrico elevado• Función renal alterada: Elevación de la urea y

creatinina• Función hepática alterada: Elevación de las

transaminasas• Trombocitopenia (conteo de plaquetas inferior a

100.000)

CausasCausas, , incidenciaincidencia y y factoresfactores de de riesgoriesgo

La causa exacta de la preeclampsia no se conoce.

Existen numerosas teorías no comprobadas que incluyen:factores genéticos, alimenticios, vasculares (vasos sanguíneos) y autoinmunes.

PreeclampsiaPreeclampsia

“The problem with the placenta is generally considered to be an inadequate uteroplacental circulation leading to placenta hypoxia, oxidative stress and, in the most severe cases, infarction.”

Redman CWG and Sargent, IL., 2001.

TratamientoTratamiento

El único tratamiento conocidoactualmente para la preeclampsia esel parto.

Clinical Science (2006) 110, (443–458)

Apoptosis and PreeclampsiaApoptosis and Preeclampsia

• Enhanced apoptosis is associated with abnormal pregnancies such as first trimester abortions and ectopic pregnancies (Kokawa, Shikone and Nakano, 1998)

• A high level of apoptosis has been found in both animal and human placentae from pregnancies complicated by fetal growth restriction, compared to placentae from pregnancies with normal growth (Miller et al., 1996, Smith, Baker and Symonds, 1997)

Cual es el papel de las estructuras Cual es el papel de las estructuras lipidicaslipidicas de no de no bicapabicapa en en preeclampsia?preeclampsia?

Traffic 5:725-738, 2004

Localización de NPA y Localización de NPA y anexinaanexina A5A5

Paraffin sections of placenta tissue from patients with PE were immunostained with NPA monoclonal antibody asprimary antibody (A,B) or with annexin A5 antibody (C,D), using the vectastain elite ABC kit with AEC as the peroxidase substrate. Red staining shows reactivityto the NPA antibody. Samples were counterstained with hematoxylin. Black arrows show the staining of the placenta in the syncytiotrophoblast. Magnification is asindicated in the figure.

NPA en preeclampsiaNPA en preeclampsia

PE without IUGR

PE with IUGR

Son antigénicos las estructuras NPA en Son antigénicos las estructuras NPA en preeclampsiapreeclampsia??

Mean Reactivity of Patient Serum to Non-bilayerPhospholipid arrangements

_____________________________________________Normal Hypertensive

IgM 26.84 ± 9.90 38.95 ± 17.19 p<0.0031IgG 23.31 ± 14.24 0.51 ± 17.34 p<0.00017

____________________________________________

Debris Placental, Debris Placental, MuerteMuerte celularcelular y y preeclampsiapreeclampsia• Se han detectado microfragmentos de Sincitiotrofoblastos

(STBM)en la circulación materna de mujeres embarazadas sanas, sin embargo los niveles de microparticulasdetectados en mujeres embarazadas que presentan preeclamsia son significativamente elevados (Knight et al., 1998).

• STBM dañan el endotelio directamente y por lo tanto son pro-inflamación.

• Se ha propuesto que son parte del desalojo de debricelular, subcelular y molecular que se libera de la superficie del sincitio.

• Este debris es probablmente derivado de celulas en apoptosis y necrosis.

DeterminacionDeterminacion de los de los nivelesniveles de NPA en de NPA en sujetossujetos normalesnormales y en y en pacientespacientes con con desordenesdesordenes de de hipertensionhipertension en el en el embarazoembarazo

DeterminacionDeterminacion de los de los nivelsnivels de NPA en de NPA en pacientespacientes con con desordenesdesordenes de de hipertensionhipertensionen el en el embarazoembarazo

Milli

ons

of N

PA/m

l

We are we going now…We are we going now…

MicroparticulasMicroparticulas

Después de la activación de las células eucarióticas están pueden liberar componentes de su membrana plasmática al espacio intracelular. Estas vesículas son llamadas

Microparticulas (microvesiculas orectosomes)

Cellular MicroparticlesCellular Microparticles

• Son una población heterogénea con respecto al origen celular, numero, tamaño, composición antigénica y propiedades funcionales.

• Parece que resultan del proceso de exocitosis (budding process).

ProduccionProduccion de de MicroparticulasMicroparticulas

Son derivadas de la membrana celular durante:

• Activación por agonistas o por estrés físico o químico (apoptosis, aumento de la conocen tracion de calcio intracelular, modificación de la membrana plasmática)

• Por lisis parcial o completa• Por daño oxidativo• Por otros insultos

Cellular MicroparticlesCellular Microparticles

Son principalmente producidas po:I) Celulas circulantes:

a) Plaquetasb) Leucocitosc) Eritrocitos

II) Células que forman las paredes vasculares:a) Células del Endoteliob) Macrófagosc) Células del músculo liso

ComposicionComposicion de de laslas microparticulasmicroparticulas

Cell ActivatedCell

Platelets: Glycoprotein IIb-IIIa,

P-selectin,Other adhesion proteins

Endothelial cells:CD31 or CD146

Leukocytes:CD4, CD3 or CD 8

Phosphatidylserine ?

Several proteins

Stimulus

+Microparticles

Microparticles mechanismMicroparticles mechanism

Leukocytes

Platelet

PlateletEndothelial

Leukocytes

MmmmmmMmmmmm

TrabajoTrabajo presentepresente

• Que dispara la producción de microparticulas?

• Composición de la membrana• Conformación de la membrana• Proteínas de la membranas• Desestabilización de la membrana

por drogas, o por patologías.

ReportesReportesHum Reprod. 2004 Jan;19(1):191-5.Related Articles, Links

•Prevalence of circulating procoagulant microparticles in women with recurrent miscarriage: a case-controlled study.

Carp H, Dardik R, Lubetsky A, Salomon O, Eskaraev R, Rosenthal E, Inbal A.

Department of Obstetrics & Gynecology, Sheba Medical Center, Tel Hashomer, Israel. carp@netvision.net.il

BACKGROUND: Circulating microparticles are markers of cell activation associated with various prothrombotic states. As hypoxia due to uteroplacental thrombosis is considered to be one of the causes of pregnancy loss, microparticles may be associated with pregnancy loss, in addition to, or as part of, other procoagulant states such as antiphospholipid syndrome or hereditary thrombophilias. The objective of this study was to examine the prevalence of circulating microparticles in women with recurrent pregnancy loss. METHODS: A total of 96 women with recurrent pregnancy losses were enrolled in a case-control study and compared with 90 parous women. Microparticles were measured by flow cytometry using fluorescent anti-CD51/CD31 antibodies. RESULTS: Microparticle levels >2 SD above the mean of controls (57,700/ml) were detected in 12 out of 96 women with recurrent miscarriages (12.5%), compared with two of the 90 control women (2.2%), P<0.008. The titre of microparticles did not correlate with age, number of pregnancy losses, primary secondary or tertiary aborters status, or with pregnancy losses in the 1st or 2nd trimesters. CONCLUSIONS: A proportion of women with pregnancy loss have elevated endothelial microparticles suggesting that endothelial damage or activation might be associated with the pathogenesis of pregnancy loss.

Thromb Haemost. 2001 Jan;85(1):18-21.Related Articles, Links•

Comment in: • Thromb Haemost. 2001 Jan;85(1):3-4.

•Circulating procoagulant microparticles in women with unexplained pregnancy loss: a new insight.

Laude I, Rongieres-Bertrand C, Boyer-Neumann C, Wolf M, Mairovitz V, Hugel B, Freyssinet JM, Frydman R, Meyer D, Eschwege V.

Unite 143 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, H pital de Bicetre, Le Kremlin-Bicetre, France.

One of the frequently proposed mechanisms for pregnancy losses refers to uteroplacentalthrombosis. However the contribution of classical thrombotic risk factors remains questionable and, if real, does not account for a large number of pregnancy losses. The aim of this study was to investigate the presence of circulating procoagulant microparticles, a new marker of cell activation already associated with various prothrombotic clinical settings. Microparticles were assessed by an original prothrombinase assay on platelet depleted plasma obtained from 74 women with a history of pregnancy loss without apparent cause and 50 controls. Patients were studied at least 2 months after the last obstetrical event and were classified into 2 groups: 49 women with at least 3 consecutive spontaneous abortions at or before the 10th postmenstrual week and 25 with at least one fetal death beyond the 10th postmenstrual week. Among the 74 patients, 41 had increased levels of circulating microparticles, 29 belonging to the group of early pregnancy loss (59%) and 12 to the group of late pregnancy loss (48%). The high prevalence of increased levels of procoagulant microparticles in both groups makes this new marker very promising for the understanding, follow up and therapeutical handling of pregnancy loss.

Objetivos específicosObjetivos específicos

• Evaluar los niveles de microparticulas de los diferentes tipos celulares en el plasma de pacientes con perdida fetal.

• Evaluar los niveles de diferente celular marcadores para activación, proliferación y apoptosis presentes en las microparticles.

• Evaluar si la elevación de los fosfolipidosde no bicapa en la membrana celular incrementan la producción de microparticles.

What we need!What we need!

Baterias

What we need!What we need!

Thank you, thank you, thank you Thank you, thank you, thank you Collaborator IPN-MexicoIsabel Baeza, PhD

Carlos Wong, PhD Miguel Ibañez, PhD

Thank youFellows Lab personal

Mark Chames, MD Jessica Neil MSciMike Hnat, DO Anie Eis

Erin TichnerKatie Recht

Diane Brockman MSci

Evaluation of cell origin of microparticlesEvaluation of cell origin of microparticles

Bu the use of cytofluorometric analysis using cell type markers:1) Platelets: CD42, CD62P2) Endothelial Cells: CD31, CD54, CD62E, α,υ,β,ε−integrins, MMP-2, MMP-9, MT1-MMP3) Leukocytes: CD454) Granulocyte: αCD145) Lymphocyte: αCD4, αCD8

Evaluation of activation, apoptosis, Evaluation of activation, apoptosis, endothelial dysfunctionendothelial dysfunctionWe are evaluating:

1) Cell Activation: CD62E and CD542) Apoptosis: CD31, CD105, caspase 3 and annexin V. The ratio CD62/CD31 is a useful measure for discriminating endothelial 3) Endothelial dysfunction:

E-selectin, ICAM-1, ICAM-1

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NPA and DiabetesNPA and Diabetes