N.K. Sana, I. Hossin, 1E.M. Haque and Ranajit Kumar Shaha

Department of Biochemistry and Molecular Biology

1Department of Chemistry, University of Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh

IDENTIFIKASI, PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI LIPASE DARI

PERKECAMBAHAN BIJI KANOLA (Brassica napus L.)

Lipase (EC 3.1.1.3)

Windy Widowaty20507015

AGENDA PRESENTASIPENDAHULUAN1.Lipase2.Aplikasi lipase pada industri3.Biji Kanola (Brassica napus L.)TUJUAN METODEHASIL DAN PEMBAHASANKESIMPULAN

PENDAHULUANLipase (triacylglicerol acylhydrolase, E.C.

3.1.1.3) adalah enzim yang terdapat dalam hewan, tumbuhan dan mikroorganisme yang mengkatalis hidrolisis dari ikatan ester gliserol dan mensintesis ester gliserol.

Aktivitas lipase terdapat pada jaringan tanaman yang sedang tumbuh terutama tanaman yang banyak mengandung triacylglycerol.

Aktivitasnya pada biji tanaman meningkat sangat cepat pada tahapan perkecambahan.

LIPASE

Penggunaan lipase dalam skala industri sangat berkembang. Lipase dapat digunakan untuk memproduksi asam lemak (Linder, M et al., 2002), biosurfaktan (Edmundo, C et al., 1998), pembentukan komponen aroma dan flavour (Athawale et al., 2003), pelumas (Hills, G., 2003), poliester (Kumar, A. Et al., 2000) dan biomodifikasi lemak (Neklyudov, A.D et al., 2002).

Pada industri makanan, lipase dari berbagai sumber telah digunakan sebagai pembentuk aroma dalam proses pembuatan keju dan juga dalam pembentukan aroma pada chocolate crumb, digunakan juga untuk memperbaiki konsistensi dari pengocokan putih telur (Alan, 1975).

PENDAHULUAN

APLIKASI

Klasifikasi ilmiahKerajaan: PlantaeDivisi: MagnoliophytaKelas: Magnoliopsida

Ordo: CapparalesFamili: BrassicaceaeGenus: BrassicaSpesies: B. napus

BIJI KANOLA

PENDAHULUAN

Brassica napus L. (suku kubis-kubisan atau Brassicaceae) dikenal dari salah satu kelompoknya yang menjadi tumbuhan penghasil minyak penting dunia.

Minyak kanola juga dikenal dengan nama minyak "LEAR" (singkatan dari Low Erucic Acid Rapeseed).

Minyak yang dihasilkan kultivar masa kini mengandung hingga 65% asam lemak takjenuh sederhana (asam oleat) dan sekitar 30% asam lemak takjenuh berganda (asam linoleat dan asam α-linolenat) salah satu minyak pangan dengan nilai gizi terbaik.

Penggunaan lain minyak rapa adalah sebagai campuran dalam oli/pelumas, lak, cat, lilin, farmasetika, emulgator, campuran plastik, tensida, dan sabun.

TUJUANTujuan penelitian ini adalah untuk

mempelajari degradasi lipid secara enzimatis pada biji kanola selama perkecambahan.

METODEBahan yang digunakan Pengamatan Degradaasi Lipid pada biji KanolaUji Aktivitas Lipase dari biji KanolaPemurnian Lipase dari biji Kanola1.Gel Filtrasi2.DEAE Cellulose Chromatography3.CM-Cellulose Column ChromatographyKarakterisasi Lipase dari biji Kanola1.pH optimum2.Suhu Optimum3.Spesifitas substrat4.Penentuan berat molekul

Biji kanola diperoleh dari Bangladesh Agriculture Research Institute, Irshardi, Pabna dan Rajshahi Local Shaheb Bazar Market dipilih biji yang mature dan baik bentuknya.

cawan petri + kertas saring Direndam dengan air destilasi (kontrol) ; larutan NaCl

dan buffer Na-Phosphate (Na2HPO4-NaH2PO4) 0, 50, 100, 150, 200 mM

Simpan di ruang gelapT = 25oC, t = 120 jam

Bahan yang digunakan

Interval waktu perkecambahan24, 48, 72, 96, 120 jam

Kotiledon dipisahkan dari biji

Dibilas dengan air

Disimpan pada T = 4oC

Pengamatan waktu perkecambahan dari Brassica napus L. menunjukkan aktivitas maksimum pada 40 jam dan aktivitasnya akan menurun secara drastis pada hari-hari berikutnya digunakan untuk ekstraksi Lipase.

Pengamatan Degradaasi Lipid pada biji Kanola

500 mg biji/280 mg kotiledon

Homogenisasi dengan nitrogen cair

+ 1,2 ml isopropanol dipanaskan T = 70oC, t = 10 menit

Sentrifugasi

Bubuk dikeringkan dengan nitrogen

Lemak diekstrak dengan campuran chloroform/metanol

Penyaringan dengan rotovapor

Uji Aktivitas Lipase dari biji Kanola

Substrat Olive oil1 unit aktivitas lipase = 1 mol asam lemak

bebas yang lepaskan / menit

Hidrolisis Triolein1 unit Lipase = 1 mmol asam oleat yang

dilepaskan per menit pada suhu 37oC

Metode A

Metode B

Pemurnian Lipase dari Biji Kanola2 gr kotiledon

(40 hari perkecambahan)

25 ml air destilasi

Di bubukanSentrifigasi 8000 g, t = 20 menit , T =

4oC•Supernatan ditampung dalam beaker glass•Percipitate dicampur dengan 25 ml air destilasi

+ Amonium sulfat

Dialisis dengan 5 mM buffer fosfat (pH 7), t

= 24 jamLiofilisasi untuk

column chromatography

Gel FiltrasiLarutkan dalam 10

ml buffer fosfat 50mM pH 7,2

Kolom Sephadex G-50

DEAE cellulose chromatography

Active protein

Active protein Dialisis dengan 10 mM Tris-HCl (pH 8,2)

DEAE cellulose column

CM cellulose column chromatographyActive protein

Larutkan dalam 2 ml air destilasi

CM cellulose column

chromatographyDicuci dengan

buffer fosfat dan dielusi dengan

sodium klorida (0-0,5 mM

Aktivitas maksimum

Liofilisasi

Suhu Optimum

Aktivitas lipase diamati dalam buffer fosfat pH 7 dengan suhu bervariasi

pH Optimum

Aktivitas lipase diamati dalam buffer fosfat dengan variasi pH

antara 3-10 pada suhu 37oC

Spesifitas substrat Dan ion logam

Bermacam2 triacylglycerol sebagai

substrat dan ion2 logam sebagai aktivator dan

inhibitor

Penentuan Berat MolekulGel filtrasi (sephadex column G-75)

Marker Trypsin inhibitor (12.028kD), Carbonic anhydrase (29kD),α-amylase (58kD), bovine albumin (66kD)dan β-

galaktosidase (116kD)

SDS-PAGEBio-Rad mini electrophoresis system.

PAGE 7% gel, 2000V dan 5AProtein standar lysozyme (14kDa), β-

lactoglobulin (18,4kDa), trypsinogen (24kDa), Pepsin (36kDa), chicken albumin (45kDa) dan

bovine albumin (66kDa)

Penentuan nilai Km

Laju sebanding dengan banyaknya produk yang dibentuk per satuan waktu. (Vi)

ditentukan dengan menghitung jumlah 1 produk pada waktu yang bervariasi

HASIL DAN PEMBAHASAN

Adanya aktivitas lipase yang tinggi, menyebabkan komponen lemak dalam biji kanola menurun secara drastis.

Pengaruh faktor perlakuan dengan adanya buffer Penurunan pertumbuhan biji oleh adanya pengaruh garam

dan Na-buffer disebabkan adanya korelasi inhibisi dari hidrolisis TAG.

Pemurnian Lipase :

Lipase dari Brassnica napus L. merupakan golongan lipase dengan pH netral

Lipase dari Pen.cyclopium antara 35-40oC dan dari Rh.delemer antara 30-35oC

Ba2+ dan Mg2+ menstimulasi kerja lipase pada konsentrasi 1, 2 dan 3 mM

Inhibisi oleh Cu2+,Zn2+, Hg2+ dan Fe2+

Apparent Km untuk Brassnica napus L. terhadap substrat olive oil dan triolein adalah 0,23 dan 5,8 mM

KESIMPULANLipase dari biji kanola mempunyai aktivitas yang

hampir sama dengan lipase-lipase dari tumbuhan.

Dibandingkan dengan lipase dari hewan atau mikroba, mempunyai aktivitas yang lebih rendah.

Lipase dari biji kanola merupakan protein yang kecil dengan mesa molekul 34 kDa, oleh karenanya sangat mudah untuk dilakukan manipulasi yang dapat digunakan sebagai model pembelajaran bagaimana interaksi antara enzim dan substrat dapat terjadi.

Sifat-sifat yang dimiliki lipase seperti pH yang netral, stabilitasnya dan spesifitas substrat dapat diaplikasikan dalam berbagai industri.