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Master Thesis

Synthese und in vitro Evaluation von organometallischenInhibitoren der humanen Thymidinkinase

Author(s): Arnold, Yvonne

Publication Date: 2003

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-004596535

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ETH Library

Departement Angewandte Biowissenschaften Institut für Pharmazeutische Wissenschaften

Synthese und in vitro Evaluation von

organometallischen Inhibitoren der humanen Thymidinkinase

Diplomarbeit

von

Yvonne Arnold Bürgerin von Schlierbach (LU)

Referent: Prof. Dr. P. August Schubiger Paul Scherrer Institut, Villigen Korreferent: PD Dr. Roger Schibli Paul Scherrer Institut, Villigen 3. März bis 25. Juli 2003

1

Ich bedanke mich: bei meinem Betreuer PD Dr. Roger Schibli für die grosse Unterstützung in allen chemischen und computertechnischen Angelegenheiten bei meiner Betreuerin Martina Netter für die Einführung in unser gemeinsames Forschungsgebiet bei Dr. Cécile Dumas, Niklaus Marti, Cristina Müller, Dr. Rolf Schwarzbach und Judith Stahel für die herzliche Aufnahme in der Forschungsgruppe und die Hilfsbereitschaft im Labor bei allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des „Center for Radiopharmaceutical Science“, die mich bei meiner Arbeit unterstützt und zu einer guten Atmosphäre beigetragen haben bei Prof. Dr. P.A. Schubiger, der mir die Diplomarbeit am PSI ermöglicht hat bei meinen Freunden Helen, Herbie, Rachael, Robin und Tiziana für die liebevolle Unterstützung während der Diplomzeit

2

Verwendete Abkürzungen Boc 1,1,-Dimethylethoxycarbonyl Boc2O Bis(1,1-dimethylethyl)dicarbonat DMF Dimethylformamid HPLC Hochdruck-Flüssig-Chromatographie RP-18 Reversed Phase C-18 Rt Retentionszeit HSV1-TK Herpes Simplex Virus Typ 1-TK hTK humane Thymidinkinase HV Hochvakuum IR Infrarot cm-1 Wellenzahl m mittel (medium) s stark (strong) w schwach (weak) keV Kiloelektronenvolt M Metallzentrum MeV Megaelektronenvolt MS Massenspektroskopie MW Molmasse NMR Kernmagnetische Resonanz d Doublett m Multiplett ppm parts per million s Singulett t Triplett NBMPR Nitrobenzylthioinosin PC Papierchromatographie PEG Polyethylenglykol PET Positronen-Emissionstomographie Rf ratio of fronts RT Raumtemperatur TEAP Triethylammoniumphosphat THF Tetrahydrofuran TK Thymidinkinase λ Wellenlänge

3

Zusammenfassung Ziel dieser Diplomarbeit war die Synthese und in vitro Evaluation eines organometallischen Inhibitors sowohl der humanen Thymidinkinase wie auch der Herpes Simplex Virus Typ 1- Thymidinkinase (HSV 1-TK). Es wurde ein 5'-Carboxamid Derivat von 5'-Aminothymidin synthetisiert. An das 5'-Aminothymidin wurde ein Polyethylenglykol-Spacer gekoppelt, welcher wiederum mit einem tridentaten Ligandsystem versehen wurde. Das Thymidinanalogon wurde durch Zugabe von [M(OH2)3(CO)3]+ (M=99mTc, Re) in einen stabilen organometallischen Komplex überführt. In vitro wurde die Inhibition der Thymidinkinase in Anwesenheit des Re-Komplexes getestet. Mittels Assay und Überprüfung des Reaktionsablaufes mit der HPLC konnte eine Inhibition der humanen Thymidinkinase-Aktivität von 25% (in Bezug auf die Aktivität bei Abwesenheit eines Inhibitors) nachgewiesen werden. Die Ki-Wert-Bestimmung des Re-Komplexes gegenüber der hTK ergab 45µM. Gegenüber der HSV1-TK zeigte der getestete Re-Komplex eine Inhibition der Thymidinkinase-Aktivität. In beiden in vitro Tests war die erzielte Inhibition deutlich geringer als erwartet im Vergleich zu vorgängig durchgeführten Messungen mit ähnlichen organometallischen Inhibitoren. Um die Spezifität der Bindung an die Thymidinkinase durch das Thymidin nachzuweisen, wurde in einem zweiten Teil der Arbeit ein organometallischer Metallkomplex ohne Pharmakophor synthetisiert und in vitro getestet. Nach dem Aufbau des Ligandsystems am primären Amin des Octadecylamins wurde der organometallische Komplex durch Zugabe von [Re(OH2)3(CO)3]+ synthetisiert. Die Überprüfung der Enzyminhibition des Re-Komplex gegenüber der humanen Thymidinkinase zeigte nur eine geringe Inhibition. Die Aktivität der HSV1-TK konnte durch Beifügung des Re-Komplex nicht beeinflusst werden.

4

Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 6

1.1 Thymidinkinase – ihre Augabe im Zellstoffwechsel 6

1.2 Thymidinkinase – ihre aktuellen und zukünftigen Anwendungen 7

1.3 Hintergrund und Ziel der Arbeit 8

2. Resultate 12

2.1 Synthesen 12 2.1.1 Organische Synthesen 12 2.1.2 Synthesen der Komplexverbindungen 14

2.2 Radioaktive Synthese 16 2.3 In vitro Evaluation 16

2.3.1 Rhenium-Komplexe 16 2.3.2 99mTc-Komplex 18

3. Diskussion 19

3.1 Synthesen 19 3.1.1 Organische Synthesen 19 3.1.2 Synthesen der Komplexverbindungen 21

3.2 Radioaktive Synthese 23

3.3 In vitro Evaluation 23 3.3.1 Rhenium-Komplexe 23 3.3.2 99mTc-Komplex 27

4. Schlussfolgerungen 28

5

5. Experimenteller Teil 29

5.1 Allgemeine Arbeitstechnik 29 5.1.1 Reagenzien 29 5.1.2 Pufferlösungen 29 5.1.3 Chromatographische Materialien und Methoden 30 5.1.4 IR-Spektroskopie 30 5.1.5 NMR-Spektroskopie 30 5.1.6 Massenspektroskopie und Elementaranalyse 30 5.1.7 Beta-Counter 30 5.1.8 Gamma-Counter 31

5.2 Synthesen 31 5.2.1 Synthese von Verbindung 1 31 5.2.2 Synthese von Verbindung 2 32 5.2.3 Synthese von Verbindung 3 32 5.2.4 Synthese von Verbindung 4 33 5.2.5 Synthese von Verbindung 5 34 5.2.6 Synthese von Verbindung 6 35 5.2.7 Synthese von Verbindung 7 35 5.2.8 Synthese von Verbindung 8 36 5.2.9 Synthese von Verbindung 9 37 5.2.10 Synthese von Komplex 10 38 5.2.11 Synthese von Komplex 11 39

5.3 Radioaktive Synthese 40 5.4 Enzyminhibition 41

5.4.1 Re-Komplex 10 41 5.4.2 Re-Komplex 11 42

5.5 Enzymkinetik 43 5.6 Zellinternalisierung 45

5.6.1 Aufbau der Zellkultur 45 5.6.2 Zelltest 45 5.6.3 Proteinbestimmung 46

6. Literatur 47

6

1. Einleitung

1.1 Thymidinkinase – ihre Aufgabe im Zellstoffwechsel Die Zellen eines Organismus unterliegen einem ständigem Teilungszyklus. Dazu müssen eine Vielzahl von benötigten essentiellen Bausteinen, wie beispielsweise Aminosäuren oder Nucleotide, bereitgestellt werden. Nucleotide sind die direkten Vorstufen der DNA und RNA. Ein wichtiger Aspekt der Nucleotidbiosynthese ist der Syntheseweg ihrer Basen, der Pyrimidine und Purine. Am Beispiel der Pyrimidinbase Thymidin soll der Synthesewege genauer betrachtet werden. Die de novo-Synthese von Thymidinmonophosphat setzt sich aus einer vielstufigen Synthese, ausgehend von Carbamylphosphat und Aspartat, zusammen (Fig. 1). Diese vielstufige Synthese kostet die Zelle viel Zeit und Energie. Müssen die Zellbausteine schnell bereitgestellt werden, z. B. wegen erhöhter Prolieferationsraten infolge einer Krebserkrankung, verfügen viele Zellen zusätzlich über Mechanismen zur Wiedergewinnung des aus dem hydrolytischen Abbau stammenden freien Thymidins. Dieser Weg, der sogenannte „Pyrimidin-Salvage-Pathway“, erlaubt der Zelle, die benötigten Nucleotide direkt durch Phosphorylierung des aus dem hydrolytischen Abbaus stammenden Thymidins bereitzustellen. Dieser Reaktionsschritt erfolgt durch Katalyse der Thymidinkinase, welche Thymidin in Anwesenheit von ATP und Mg2+ zu TMP phosphoryliert [1, 2]. de novo Synthese Pyrimidin Salvage Pathway Carbamylphosphat + Aspartat

O N NH

CH3O

OOH

OH

Aspartattranscarbamylase Dihydroorotase ATP Dihydroorotatdehydrogenase Orotat Phosphoribosyltransferase TK OMP-Decarboxylase Thymidylat Synthase ADP

NUCLEOTIDE

Zellen mit normaler Proliferation Zellen mit erhöhter Proliferation

POLYNUCLEOTIDE

Fig. 1: Gegenüberstellung de novo-Synthese – Thymidin-Salvage-Pathway

7

1.2 Thymidinkinase – ihre aktuellen und zukünftigen Anwendungen Zur Zeit bildet die Thymidinkinase in zwei therapeutischen Bereichen ein wichtiges Target. Zum einen stellt die Thymidinkinase in der Behandlung von viralen Erkrankungen ein wichtiges Target dar. Die Therapie erfolgt durch Verabreichung von Nucleosidanaloga, z.B. Aciclovir oder Ganciclovir. Die HSV1-TK erkennt die Nucleosidanaloga als Substrate und phosphoryliert sie. Andere zelluläre Enzyme überführen die Nucleosidanaloga in Triphosphate, wonach sie in die DNA eingebaut werden können. In der DNA integriert hemmen die Nucleosidanaloga die DNA-Polymerase und führen somit den Zelltod herbei. Aufgrund der unbefriedigenden therapeutischen Optionen stellt die Behandlung mit Gentherapie in der experimentellen Krebstherapie eine neue Herausforderung dar. Im Gegensatz zur konventionellen systemischen Zytokin- oder Chemotherapie beinhaltet die Gentherapie das Einbringen von Desoxyribonukleinsäure (DNA) in die Tumorzellen, in umgebende Parenchymzellen oder beteiligte Zellen der Immunabwehr. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Strategien in der Gentherapie von malignen Erkrankungen entwickelt. Exemplarisch seien einige der Strategien erwähnt: Die Expression von Suizid-Genen, von Genen zur Erhöhung der Tumorzell-Immunogenität, die Einführung von Tumor-Suppressor-Genen oder die Induktion einer Resistenz von Stammzellen gegenüber Chemotherapeutika. Die Herpes Simplex Virus -Thymidinkinase in Kombination mit Nucleosidanaloga ist ein vielversprechendes System in der Suizidgentherapie. Durch intrazelluläre Expression des Gens der Herpes Simplex Virus - Thymidinkinase wird, z.B. Ganciclovir, mit hoher Aktivität monophosphoryliert. Zelluläre Enzyme phosphorylieren das gebildete Monophosphat zum Ganciclovir-Triphosphat. Diese Substanz wird bei Teilung der Zelle in die synthetisierte DNA inkorporiert und führt dadurch zum Zelltod. So wurde beispielsweise nach erfolgter Expression der HSV-TK in Morris-Hepatom-Zellen in Ratten die Anreicherung von Ganciclovir und dem Substrat Difluordeoxycytidin überprüft [1-3]. Mit steigender Ganciclovirkonzentration, Inkubationsdauer und zunehmendem Anteil an HSV-TK exprimierenden Zellen erhöhte sich die Anreicherung. Die Korrelation der Ganciclovir- und Difluordeoxycytidinanreicherung mit der Wachstumshemmung erlaubte positive Rückschlüsse auf die angewandte Gentherapie zu ziehen. Die Anreicherung der Nucleosidanaloga Ganciclovir und Difluordeoxycytidin wurden mit PET verfolgt. Dies führt uns zu einer nicht invasiven nuklearmedizinischen Methode, die es erlaubt, die induzierte Enzymaktivität im Tumorgewebe zu erfassen. Radioaktive Markierung von Substanzen des Zellmetabolismus ermöglichen eine nicht invasive Diagnose und eine frühe Einschätzung des Tumorwachstums. 18F und 11C gehören zu den heute bereits bekannten Radionukliden, die zur Markierung von Nucleosidanaloga verwendet werden. In Figur 2 wird die diagnostische Anwendung von 11C-Methyl-Thymidin illustriert. Durch die Anwendung von 11C-Methyl-Thymidin konnte die deutlich reduzierte TK-Aktivität nach der Chemotherapie im Vergleich zum Therapiebeginn nicht invasiv studiert werden.

8

A B

Fig. 2: Nachweis der TK-Aktivität in einem Ewing Sarkom mittels 11C-Methyl-Thymidin A) TK-Aktivität vor der Chemotherapie, rot: hohe TK-Aktivität B) TK-Aktivität nach Behandlung des Sarkoms mit Chemotherapie

Ein grosser Nachteil der Radionuklide 18F und 11C liegt in ihrer Verfügbarkeit. Wegen den kurzen Halbwertszeiten (18F:110Min, 11C: 20 Min) sollte die Produktion direkt am Anwendungsort erfolgen. Eine andere Möglichkeit ist die radioaktiven Markierung mit 99mTc, die in der vorliegenden Diplomarbeit durchgeführt wurde [4-9]. Die beiden Radionuklide sind mittels Generatoren generell verfügbar. Dazu weisen sie, nebst der einfachen Verfügbarkeit, mit den idealen Zerfallseigenschaften und den tiefen Kosten ideale Voraussetzungen für den Einsatz in der Nuklearmedizin auf. 1.3 Hintergrund und Ziel der Arbeit Aus der Literatur waren Inhibitoren der Thymidinkinase in Form von 5'-Carboxamid-Derivaten von 5'-Amino-2',5'-Dideoxy-5-Ethyluridin bekannt [10]. Basierend auf diesen Kenntnissen war das Ziel unserer Arbeitsgruppe die Synthese und in vitro Evaluation von inhibierenden, 99mTc radioaktiv markierten 5'-Aminothymidin-Derivaten. Martin et al. synthetisierten eine neue Generation von Nucleosidanaloga, die Carboxamid-Derivate von 5'-Amino-2',5'-Dideoxy-5-Ethyluridin[10]. Diese Nucleosidanaloga wiesen eine sehr hohe inhibitorische Aktivität gegenüber der HSV1-TK und der HSV2-TK auf. Die Ki-Werte bewegten sich im Bereich von 1µM und 1nM. In Figur 3 sind Beispiele von den synthetisierten Inhibitoren dargestellt.

9

O

Cl

Cl

NH

N

NH

O

O

O

OH

ONH

N

NH

O

O

O

OH

F3CF3C

Ki (nM): HSV1-TK: 1.0 Ki (nM): HSV1-TK: 0.19 HSV2-TK: 3.3 HSV2-TK: 0.11 Fig. 3: Beispiele der von Martin et al. synthetisierten, neuen Generation von Inhibitoren der Herpes Simplex Virus - Thymidinkinase Dies ist eine enorme Verbesserung der Inhibition, verglichen mit den Ki-Werten von bereits existierenden Nucleosidanaloga. Als Beispiel sei hier der Ki-Wert von Aciclovir von 28 µM erwähnt. Basierend auf der Röntgenstruktur-Analyse der HSV1-TK und auf Berechnungen mittels Molecular Modeling zeigt sich, dass die aromatischen Reste von der in Figur 3 aufgezeigten Verbindungen ausserhalb der Bindungsstelle des Enzyms zu finden sind. Andere Röntgenstrukturanalysen zeigten, dass Derivatisierungen an anderen Positionen als am C5' des Aminothymidins eine massive Reduktion der Bindungsaffinität zur Folge hatten [11]. Die in Figur 3 aufgezeigten Verbindungen motiverten unsere Forschungsgruppe zur Entwicklung von Synthesestrategien für potentiell hochaffine, C5'-derivatisierte Nucleosidanaloga. Durch radioaktive Markierung dieser neu synthetisierten Nucleosidanaloga könnte ein Imaging von Tumorzellen möglich werden.

OO

N

M

COCO

OO

O N NH

CH3O

OOH

NH

R

R*n

CO

O

-

A B C

n=1,2,5,8; R=H, OH; R*=H, C6H5; M=99mTc, Re

Fig. 4: Grundgerüst, der organometallischen Thymidin-Analoga [4]

10

Ausgehend von 5'-Aminothymidin, wurden 5'-Carboxamid-Derivate entwickelt, die alle ein gemeinsames, in drei geteiltes Grundgerüst aufwiesen (Fig. 4): (A) tridentater Metallkomplex, (B) Spacer, (C) 5'-Aminothymidin Die Re-Komplexe wurden auf die Inhibition der hTK und der HSV1-TK getestet. Die hTK konnte inhibiert werden. Gegenüber der HSV1-TK zeigten die Komplexe dagegen keine oder nur eine geringe Inhibition.

dT + ATP TK TMP + ADP Mg2+

Fig. 5: Durch die Thymidinkinase (TK) katalysierte Reaktion Wie aus Figur 5 ersichtlich, reduziert sich bei Inhibition der Enzymaktivität die Bildung von TMP im gleichen Verhältnis wie ADP. In Figur 6 sind die Resultate der Enzyminhibitionstest der synthetisierten 5'- Carboxamid-Derivate zusammengestellt. In Abhängigkeit der Anzahl Methylengruppen des Spacers ist die %-Bildung von ADP, in Bezug auf die Thymidinkinaseaktivität bei Fehlen eines Inhibitors (100%), aufgetragen.

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

Methylengruppen

%A

DP

Fig. 6: Inhibition der hTK

11

Aufgrund der Resultate der getesteten Derivate (Fig. 6) wurde vermutet, dass Komplexe mit einer Alkylkette ziwschen n = 13 - 16 die grösste Inhibition der hTK erzielen sollte. Das Ziel dieser Diplomarbeit bestand nun darin, einen Inhibitor mit einem entsprechenden Spacer zu synthetisieren und ihn in vitro auf die inhibitorische Aktivität gegenüber der hTK und der HSV1-TK zu prüfen. Um die Hydrophilie des Inhibitors zu erhöhen, wurde eine Verbindung synthetisiert, die anstelle einer Alkylkette als Spacer, einen Polyethylenglykol-Spacer enthielt. Um die Spezifität der Bindung der Thymidinkinase an das Thymidin der organometallischen Inhibitoren zu verifizieren, wurde in einer zweiten Synthese eine Verbindung synthetisiert, die ausschliesslich aus den in Figur 4 gezeigten Einheiten A und B bestand. Zum Schluss wurde die inhibitorische Aktivität in vivo gegenüber der hTK und der HSV1-TK getestet.

12

2. Resultate 2.1 Synthesen 2.1.1 Organische Synthesen Die Verbindung 1 wurde gemäss Literatur ausgehend von Thymidin durch Zugabe von Triphenylphosphin, Natriumazid und Tetrabrommethan synthetisiert [12]. Mittels Dünnschichtchromatographie im Laufmittel Dichlormethan/Ethanol (9/1) wurde die Bildung der Verbindung 2 überprüft. Nach der Reinigung mittels Säulenchromatographie konnte im Infrarot-Spektrum die intensive N3-Bande bei 2100cm-1 nachgewiesen werden. Mit Palladium auf Aktivkohle wurde Verbindung 1 gemäss Literatur katalytisch hydriert [12]. Der Reaktionsverlauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie und Detektion mit Ninhydrin verfolgt. Im 1H-NMR-Spektrum von Verbindung 2 war im Vergleich zum 1H-NMR-Spektrum des Thymidins eine Verschiebung des Multipletts der Protonen an Position 5' von 3.85 – 3.96ppm nach 3.00 – 3.05ppm zu beobachten.

O N NH

CH3O

OOH

OH O N NH

CH3O

OOH

N3 O N NH

CH3O

OOH

NH2

i. ii.

1 2

Schema 1: (i) CBr4/PPh3/NaN3 in DMF, RT, 16h; (ii) H2, Pd/C, RT, 12h Durch Reaktion mit Bis(1,1-dimethylethyl)dicarbonat (Boc2O) in 1N NaOH : Dioxan 1:1 wurde am Aminoende der Amino- dPEG4-Säure die 1,1,-Dimethylethoxycarbonyl-Gruppe (Boc-Gruppe) eingeführt. Das 1H-NMR-Spektrum der Verbindung 3 zeigte bei 1.60ppm ein Singulett der Protonen der Boc-Schutzgruppe. Die Säuregruppe der Verbindung 3 wurde mittels N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviert. Die Bildung des Aktivesters verfolgte man mittels Dünnschichtchromatographie, entwickelt im Laufmittel Ethylacetat/Methanol (9/1). Der Rf-Wert betrug 0.63. Nach erfolgter Kopplung mit Verbindung 2 wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt In 6M HCl spaltete man die Boc-Schutzgruppe von Verbindung 4 ab. Mittels Dünnschichtchromatographie, Laufmittel Ethylacetat/Methanol (1/1), und Detektion mit Ninhydrin wurde die Bildung des freien, primären Amins verfolgt. Im 1H-NMR-

13

Spektrum war das Singulett der Protonen der Schutzgruppe bei 1.60ppm nicht mehr zu beobachten. Die Synthese des Ligandsystems wurde mit der Alkylierung des primären Amins der Verbindung 5 in Methanol unter Zugabe von Triethylamin und 2.1 Äquivalent Methylbromacetat begonnen. Nach Reinigung mit Säulenchromatographie wurde das Produkt mit einem Massenspektrum und einem 1H-NMR-Spektrum analysiert. Die Protonen der eingeführten Methylacetatgruppe erschienen im 1H-NMR-Spektrum als Singulett bei 2.66ppm, entsprechend 4 Protonen, respektive 3.90ppm, entsprechend 6 Protonen. Die Esterfunktionen der Verbindung 6 wurden in 1N NaOH bei 40oC verseift. Die Reaktion wurde mittels HPLC (Programm B) verfolgt. Die Verbindung 6 erschien bei einer Retentionszeit von 18.2 Minuten, während dem das verseifte Produkt bei einer Retentionszeit von 14.1 Minuten zu sehen war. Es wurde neutralisiert und mittels 1H-NMR-Spektrum das Produkt nachgewiesen.

NH2

O OHn

O i. NH

O OHO

O

n

O3 ii. /ii.a

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NH2

On

5 iii.

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NH

OO

O

n

4

iv.

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n O

O

CH3

CH3

O

O

6

v.

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n OH

OH

O

O

7

n=4 Schema 2: (i) Boc2O in 1N NaOH : Dioxan (1/1), RT, 4h; (ii) DCC, NHS in DMF, 55oC, 4h; (ii.a) Verbindung 2 , 55oC, 12h; (iii) 6M HCl, RT, 1.5h; (iv) BrCH2CO2CH3, Methanol, NEt3, 5h; (v) 1N NaOH, RT, 12h

14

Octadecylamin wurde in Methanol aufgenommen und durch Zugabe von Triethylamin und Methylbromacetat am primären Amin dialkyliert. Die Reaktion wurde mit Dünnschichtchromatographie verfolgt, mit Ninhydrin entwickelt und so auf freies Octadecylamin überprüft. Mittels Säulenchromatographie wurde gereinigt. Es resultierte eine weisse, leicht zähflüssige Substanz. Im 1H-NMR-Spektrum erschienen die Protonen der eingefügten Methylacetatgruppen als Singuletts bei 3.67ppm, entsprechend vier Protonen, respektive 3.84ppm, entsprechend sechs Protonen. Die Esterfunktion der Verbindung 8 wurde mit 1N NaOH verseift. Das Endprodukt wurde mittels Infrarot- und 1H-NMR-Spektrum analysiert.

NH2

i.

NOCH3

OCH3

O

O

8

ii.

NOH

OH

O

O

9

Schema 3: (i) BrCH2CO2CH3, Methanol, NEt3, unter Rückfluss, 100oC, 5.5h; (ii) 1N NaOH, 100oC, 12h

2.1.2 Synthesen der Komplexverbindungen Ausgehend von Verbindung 7 wurde unter Zugabe des Re-Precursors [NEt4]2[ReBr3(CO)3] der Rhenium-Komplex 10 synthetisiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm B) bei 254nm. Der Komplex erschien mit einer Retentionszeit von 20.1 Minuten. Die Produktfraktionen nach der Reinigung mittels Sep-Pak® Cartridge (2g) wurden mit der HPLC (Programm B) ermittelt. Der Komplex 10 erschien in den Fraktionen mit 100% Methanol. Es wurde im SpeedVac getrocknet und das Produkt mittels 1H-NMR-Spektrum, 13C-Spektrum, IR-Spektrum und Massenspektrum charakterisiert. Im IR-Spektrum konnten die CO-Banden bei 2016cm-1 und 1885cm-1 nachgewiesen werden. Bei 873 m/z resultierte das Signal des Komplexanions.

15

ReOCOC

OCBr

Br

BrO

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n OH

OH

O

O

2-

+

9

i.

OO

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n

Re

CO

COCO

OO

O

10

-

NEt+/Na+

n=4

Schema 4: (i) H2O, 50oC, 3.5h;

Die Komplexierung zur Verbindung 11 erfolgte in Methanol unter Zugabe vom Re-Precursor [NEt4]2[ReBr3(CO)3] ausgehend von Verbindung 9. Der Reaktionsverlauf wurde mittels HPLC (Programm B) verfolgt. Der Komplex erschien mit einer Retentionszeit von 22.4 Minuten. Die Komplexbildung wurde im IR- und 1H-NMR-Spektrum verifiziert. Im IR erschienen die für die CO-Gruppen charakteristischen Peaks bei 2023cm-1 und 1876cm-1. Das Singulett der Methylengruppen im 1H-NMR-Spektrum bei 3.15 ppm spaltete sich in ein AB-System auf.

NOH

OH

O

O

ReBr

CO

BrBr CO

CO2-

+

9

i.

O N

O Re

CO

COCO

OO 11

-

Na+

Schema 5: (i) Methanol, 40oC, 4h;

16

2.2 Radioaktive Synthesen Die Synthese des 99mTc-Komplexes 12 ausgehend von einer 10-3M Lösung der Verbindung 7 unter Zugabe von Technetium-Tricarbonyl-Precursor [99mTc(OH2)3(CO)3]+ wurde mittels HPLC (Programm B) kontrolliert. Der Peak des 99mTc-Komplexes erschien bei einer Retentionszeit von 20.7 Minuten. Die Reinigung des Komplexes für die weiteren in vitro Experimente erfolgte ebenfalls mit Hilfe der HPLC (Programm B).

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n OH

OH

O

O

TcH2O

H2O COCO

OH2CO+

7

+

i.

OO

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n

Tc

CO

COCO

OO

O

12

-

n=4

Schema 6: (i) PBS Puffer, 75oC, 30 Min. 2.3 In vitro Evaluation 2.3.1 Rhenium-Komplexe Mittels HPLC (Programm A) überprüfte man die inhibitorische Aktivität des synthetisierten Re-Komplexes 10 gegenüber der hTK und der HSV1-TK. Die Retentionszeit des ADP-Peaks betrug 7.4 Minuten, diejenige des dT-Peak 9.5 Minuten, diejenige des TMP-Peaks 12.5 Minuten und mit der grössten Retentionszeit erschien der ATP-Peak bei 15.8 Minuten.

17

Dreifachbestimmung der Inhibition gegenüber der hTK

60

80

100

120

140

160

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

Inhibitorkonzentration (mM)

%

TMP ADP

Fig. 7: Inhibitorische Aktivität des Re-Komplexes 10 gegenüber der hTK, Dreifachbestimmung

Figur 7 zeigt das Resultat der Überprüfung der inhibitorischen Aktivität des Re-Komplexes 10 gegenüber der hTK. Dargestellt ist die %-Bildung von TMP bzw. ADP in Abhängigkeit der Konzentration des Re-Komplexes 10. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität der Thymidinkinase bis auf 75% der Ursprungsaktivität reduziert werden konnte.

Einfachbestimmung der Inhibition gegenüber der HSV1-TK

60

80

100

120

140

160

0 0,5 1 1,5

Inhibitorkonzentration (mM)

%

2

TMP ADP

Fig. 8: Inhibitorische Aktivität des Re-Komplexes 10 gegenüber der HSV1-TK, Einfachbestimmung

18

In Figur 8 ist die Aktivität der HSV1-TK in % in Abhängigkeit der Re-Komplex 10-Konzentration aufgeführt. Es wurde keine Inhibition beobachtet, im Gegenteil, es wurde eine erhöhte HSV1-TK Aktivität gefunden. Der Re-Komplex 12 wies gegenüber der hTK eine sehr geringe und gegenüber der HSV1-TK keine Inhibition auf. Gemäss Literatur wurde der Ki-Wert des Re-Komplexes 10 gegenüber der hTK bestimmt [13]. Das Resultat der Dreifachbestimmung des Ki-Wertes betrug 45 µM ± 15µM. 2.3.2 99mTc-Komplex An HT-29 (Humanen Kolonkrebs-) Zellen wurde die Aufnahme des 99mTc-Komplexes 12 getestet. In einem Kontrollexperiment wurde die Zellinternalisierung von [methyl-3H]-Thymidin gemessen. In Figur 9 sind die Resultate der beiden Messreihen zusammengestellt.

dT*- Aufnahme

0,002,004,006,008,00

10,0012,0014,00

0 20 40 60 80 100 1

Zeit (min)

% c

pm/ m

g Pr

otei

20

n

Totale Aufnahme

+ 10 mikroM NBMPR

+ 10 mikroM Dipyridamol +4 mM dT+ 10 mikroM Re-Komplex 10

Tc-99m-Komplex-Aufnahme

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0 20 40 60 80 100 1

Zeit (min)

% c

pm/ m

g Pr

otei

20

n

Totale Aufnahme

+ 10mikroM NBMPR

+ 10 mikroM Dipyridamol +4mM dT+ 10mikroM Re-Komplex 10

a) b)

Fig. 9: a) Zellinternalisierung von [methyl-3H]-Thymidin in Abhängigkeit der Zeit b) Zellinternalisierung des 99mTc-Komplexes in Abhängigkeit der Zeit

In der Versuchsanordnung, in der ausschliesslich [methyl-3H]-Thymidin zugegeben wurde, konnte eine Zellinternalisierung beobachtet werden (Fig. 9a). In Anwesenheit von 10µM Nucleosidtransport-Inhibitor NBMPR war die Zellaufnahme deutlich reduziert. Es war keine Aufnahme über 2% zu beobachten. Noch grösser war die Inhibition der Internalisierung in der Versuchsanordnung mit 10µM Dipyridamol und 4mM Thymidin. Die Aufnahme pro mg Protein war zu keinem Zeitpunkt höher als 0.5% (% Angaben beziehen sich auf die Aktivität von dem zu Beginn zugegebener Menge [methyl-3H]-Thymidin). Wurden zusätzlich zum [methyl-3H]-Thymidin noch 10µM Re-Komplex 10 zugegeben, nahm die Internalisierung bis 25 Minuten kontinuierlich zu. Nach diesem Zeitpunkt blieb die Aufnahme konstant. Figur 9b zeigt die Resultate der Zellinternalisierung des 99mTc-Komplexes. In allen Versuchsanordnungen konnte nur eine sehr geringe Internalisierung beobachtet werden, die sich weit unter der 1% (in Bezug auf die Aktivität des 99mTc-Komplexes zu Reaktionsbeginn) bewegte.

19

3. Diskussion 3.1 Synthesen 3.1.1 Organische Synthesen Wie in Reaktionsschema 7 gezeigt, bestehen für die Synthese der C5-funktionalisierten organometallischen Thymidinkomplexe von 99mTc und Re dieser Diplomarbeit zwei unterschiedliche Strategien. Ausgehend von Verbindung 7 sollen anhand einer retrosynthetischen Analyse die beiden prinzipiellen Strategien erläutert werden. In Strategie A wird zuerst die Bindung zwischen dem Aminothymidin und dem Polyethylenglykolspacer mit dem Ligandsystem gespalten, bevor das Iminodiacetat am Aminoende des Polyethylenglykolspacers abgebaut wird. In Strategie B erfolgt als erstes der Abbau des Ligandsystems bevor die Bindung zwischen dem Aminothymidin und dem Polyethylenglykolspacer gespalten wird. In der Literatur wurden beide Strategien erfolgreich zur Synthese von C5-funktionalisierten organometallischen Thymidinkomplexen benutzt [4].

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n OH

OH

O

O Strategie A Strategie B

O

NO

n OH

OH

O

O

OH O N NH

CH3O

OOH

NH2+

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NH2

On

NH2

O OHn

O

O N NH

CH3O

OOH

NH2NH2

O OHn

O

+

Schema 7: Prinzipielle Strategien A bzw. B für die Synthese des organometallischen Inhibitors der vorliegenden Diplomarbeit

20

Für die Synthese des Komplex 10 wurde die Synthesestrategie B gewählt, da sich gezeigt hatte, dass bei Strategie A bereits der erste Schritt (Alkylierung des PEGs) problematisch war . Zur Erreichung dieses Komplexes sind sieben Syntheseschritte notwendig. Die Synthese der Verbindung 1 wurde gemäss Literatur mit einer Modifikation im Reinigungsschritt ausgeführt [12]. Zur Reinigung des Produkts mit Säulenchromatographie und dem Laufmittel Dichlormethan/Ethanol (2-10%), wurde der Ethanolanteil des Laufmittels in der durchgeführten Reinigung bis auf 50% erhöht. Die erzielte Ausbeute von 72% lag um 4% tiefer als die in der Literatur publizierte Ausbeute [12]. Durch katalytische Hydrierung wurde Verbindung 1, wie in der Literatur beschrieben, in Verbindung 2 überführt [12]. Das Reaktionsgemisch wurde heiss filtriert, um ein Auskristallisieren des Produkts vor der Filtration zu verhindern. Im Gegensatz zu der in der Literatur erreichten Ausbeute von 86% wurde in dieser Diplomarbeit lediglich eine Ausbeute von 23% erzielt. Dies lag unter anderem daran, dass während der Filtration des Reaktionsgemisches durch die Abkühlung bereits Produkt ausfiel und beim Auskristallisieren nicht alles Produkt aus der Mutterlauge gewonnen wurde. Die Synthese der Verbindung 3 beinhaltet drei Schritte, denen spezielle Beachtung geschenkt werden muss. Bevor die Kopplung der Verbindung 2 an die Amino- dPEG4-Säure erfolgen konnte, musste das primäre Amin der Amino- dPEG4-Säure geschützt werden. Ohne die Addtion von Boc-Schutzgruppen an das Aminoende der Amino- dPEG4-Säure, würde bei Zugabe der Verbindung 2 ein Gemisch von verschiedenen Produkten resultieren. Die Säurefunktion der Amino- dPEG4-Säure ist nicht nur ein Reaktionspartner für Verbindung 2, sondern auch für das Aminoende anderer Amino- dPEG4-Säuren. Da es sich um eine exotherme Reaktion handelt, wurde Boc2O in Portionen zum Reaktionsgemisch zugegeben. Das Abwägen erfolgte ebenfalls in Portionen, da das Boc2O bei Raumtemperatur sehr schnell schmolz (Schmelzpunkt: 22-24oC). Der Aktivierungsschritt von Verbindung 3 an der Carboxylgruppe erfolgte durch Zugabe von DCC und NHS und wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Ohne die Zwischenstufe zu isolieren wurde Verbindung 2 nach erfolgter Aktivierung der Reaktionslösung zugegeben. In 6M HCl wurde die Boc-Schutzgruppe von Verbindung 4 abgespalten. Mittels 5N NaOH wurde neutralisiert und anschliessend am HV getrocknet, wobei ein weisser Rückstand, der sich aus Verbindung 5 und NaCl zusammensetzte, resultierte. Durch Aufnahme in 4ml Ethanol konnte Verbindung 5 gelöst und durch Filtration vom NaCl getrennt werden. Verbindung 5 wurde am primären Amin des Polyethylenglykolspacers durch Zugabe von Triethylamin und Methylbromacetat alkyliert. Bei der Reinigung mittels Säulenchromatographie konnten zwei Verbindungen mit unterschiedlichen Rf-Werten gesammelt werden. Aus der Analyse mit einem 1H-NMR-Spektrum und einem Massenspektrum resultierte, dass die Verbindung mit dem Rf-Wert von 0.47 nur monoalkyliert war (6b), während dem die Verbindung mit dem Rf-Wert von 0.20 dialkyliert war und somit der gewünschten Verbindung 6a entsprach (Fig. 10).

21

O

O N NH

CH3

O

OOH

NH

NO

n

O

O

CH3

CH3

O

O

O

O N NH

CH3

O

OOH

NH

NH

On

OCH3

O

6a 6b Fig. 10: Isolierte Produkte nach Alkylierung der Verbindung 5; 6a: dialkyliert, 6b: monoalkyliert Zwecks Abspaltung der Methylgruppen wurde Verbindung 6 in 1N NaOH verseift. Nach dem Neutralisieren mit 1N HCl und dem Einengen am HV resultierte ein weisses Pulver. Via Alkylierung des primären Amins des Octadecylamin in Anwesenheit von Triethylamin und Methylbromacetat wurde die Verbindung 8 synthetisiert. Die Reaktion liess sich mittels Dünnschichtchromatographie qualitativ verfolgen. Nach Reinigung waren jedoch erst 41% des Octadecylamins dialkyliert. Die restlichen 59% waren erst monoalkyliert. Bei Wiederholung der Reaktion müsste zur Erhöhung der Ausbeute die Reaktionszeit verlängert werden. Verbindung 8 wurde in 9ml 1N NaOH bei 100oC verseift. Es wurde mit 1N HCl neutralisiert (pH=7), wobei sich ein weisser zähflüssiger Niederschlag bildete, der sich aus Verbindung 9 und NaCl zusammensetzte. Es wurde zentrifugiert, der Überstand mittels Pipette beseitigt und der Niederschlag mit Wasser suspendiert. Dabei wurde die Verbindung 9 gereinigt, indem das NaCl in Lösung gebracht und so entfernt werden konnte. 3.1.2 Synthesen der Komplexverbindungen Die Synthese des Komplex 10 erfolgte mit verschiedenen Modifikationen gemäss Literatur bei 50oC in Wasser. Nach Reinigung mittels Sep-Pak® Cartridge lag der einfach negativ geladene Komplex gemäss Elementaranalyse mit 55% NEt4+ (vom Re-Precursor [NEt4]2[ReBr3(CO)3] stammend) und 45% Na+ (aus der Neutralisation des Verseifungsschrittes) als Gegenionen vor. Wie in Figur 11 dargestellt, zeigten die vier Protonen der Iminodiessigsäure-Gruppe im 1H-NMR-Spektrum das Muster eines AB-Spin-Systems (J = 16 Hz).

22

3.89

5 3.84

1

3.69

7

3.64

2

ppm3.603.653.703.753.803.853.903.95

16 Hz16 Hz

Fig. 11: Ausschnitt aus dem 1H-NMR-Spektrum des Komplex 11, gezeigt das AB-System der vier Protonen der IDA- Einheit Die ursprünglich identischen Protonen nahmen nach der Bildung der starren koordinativen Bindungen zum Rhenium Positionen in äquatorialer und axialer Orientierung ein, und waren deshalb nicht mehr äquivalent (Fig. 12). Die Entstehung des AB-Spin-Systems aus dem Singulett der Protonen der Iminodiessigsäure-Gruppe konnte bereits bei Re-Tricarbonyl-Komplexen beobachtet werden [4, 5]. Da im 1H-NMR-Spektrum die Signale der nicht benachbarten H-Atome keine Verschiebung erfuhren, konnten sämtliche Interaktionen des Rheniums mit anderen funktionellen Gruppen des Thymidins ausgeschlossen werden.

Hax

Fig. 12: Anordnung der vier Protonen der IDA-Einheit des Re-Komplexes 10: 2 Protonen ordnen sich axial an (Hax), 2 Protonen ordnen sich äquatorial an (Heq)

23

Die Synthese des Re-Komplexes 11 wurde modifiziert nach Literatur aufgrund der schlechten Wasserlöslichkeit der Verbindung 9 in 100% Methanol durchgeführt [4]. Der Re-Komplex wurde durch Aufnahme in Wasser, wobei das während der Reaktion entstandene Salz [NEt4][Br] in Lösung ging, und anschliessender Filtration gereinigt. Ein Vergleich der IR-Spektren der Re-Komplexe 10 und 11 zeigte, dass die CO-Banden im gleichen Wellenzahlbereich erschienen (Komplex 10: 2016 bzw. 1885cm-1 , Komplex 11: 2022 bzw. 1876cm-1). Das Muster des AB-Systems im 1H-NMR-Spektrum konnte bei beiden Komplexen zwischen 3.6ppm und 4.0ppm beobachtet werden. 3.2 Radioaktive Synthese Die Markierung von Verbindung 7 in PBS-Puffer erfolgte mit dem 99mTc-Precursor [99mTc(OH2)3(CO)3]+. Der Reaktionsverlauf wurde mittels HPLC (Programm B) überprüft. Bei einer Retentionszeit von 20.7 Minuten erschien der Peak des markierten 99mTc-Komplex. Nach erfolgter Reinigung wurde mittels HPLC die Qualitätskontrolle durchgeführt. 3.3 In vitro Evaluation 3.3.1 Re-Komplexe Zur Überprüfung der biologischen Aktivität der Rhenium-Komplexe 10 und 11 testete man in vitro gegenüber der hTK und der HSV1-TK gemäss Literatur [14]. Dem Assay liegt die in Figur 13 aufgeführte Reaktion zu Grunde.

dT + ATP TK TMP + ADP Mg2+

Fig.13: Durch die Thymidinkinase (TK) katalysierte Reaktion

Die Bildung von ADP und TMP in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Re-Komplexe liess sich mit Hilfe der HPLC (Programm A) verfolgen. Figur 14 zeigt ein charakteristisches HPLC-Bild (UV 254nm).

24

ATPADP

TMPdT

Fig.14 : Charakteristisches HPLC-Bild, gemessen im UV bei 254nm

Bei uneingeschränkter Aktivität der Thymidinkinase nehmen die beiden Peaks des ATPs und des Thymidins ab, während dem die Peaks des ADP's und des TMP's zunehmen. Tritt eine Inhibition der Thymidinkinase durch die synthetisierten Re-Komplexe auf, ist die Abnahme des ATP- und Thymidin-Peaks verringert. Gleichzeitig reduziert sich auch die Zunahme des ADP- und TMP-Peaks. Die Aktivität der humanen Thymidinkinase konnte mit dem Re-Komplex 10 auf 75% der Ausgangsaktivität, bestimmt bei Fehlen eines Inhibitors, reduziert werden. Aus den Resultaten von vorgängigen Tests schien ein Zusammenhang von der Kettenlänge der Spacer und der Inhibition der hTK zu bestehen[4].

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

Methylengruppen

%A

DP

Fig. 15: Gemessene Inhibition des Re-Komplex 10 im Vergleich zum erwarteten Resultat

25

Figur 15 zeigt Resultate von getesteten Inhibitoren mit Alkylkettenspacern verschiedener Kettenlängen. Anhand dieser Resultate war zu erwarten, dass Spacer mit Alkylketten der Länge n = 13 – 16 die stärkste Inhibition der hTK hervorrufen könnten. Das Resultat der in dieser Arbeit durchgeführten Messung bestätigen diese Annahme jedoch nicht. Im Unterschied zu den Inhibitoren die bereits getestet wurden, verfügt der in dieser Arbeit getestete Inhibitor zwar über einen Spacer der Kettenlänge n = 15, der jedoch nicht aus einer Alkylkette, sondern aus Polyethylenglykol-Einheiten bestand. Mit dem Einführen eines Spacers aus Polyethylenglykol-Einheiten wollte man eine erhöhte Hydrophilie und so indirekt eine noch höhere inhibitorische Aktivität erzielen. Aufgrund des Resultats besteht die Möglichkeit, dass durch die erhöhte Hydrophilie des PEG-Spacers ein Interagieren mit dem Protein erschwert wurde. Die Einfachbestimmung der inhibitorischen Aktivität des Re-Komplexes 10 gegenüber der HSV1-TK ergab anstelle einer erwarteten Inhibition eine Aktivierung der HSV1-TK-Aktivität. Eine Aktivierung konnte bei einigen Komplexen bereits beobachtet werden, wobei eine abschliessende Erklärung dieses Phänomens derzeit nicht möglich ist. Die inhibitorische Aktivität des Re-Komplex 12 wurde gegenüber der hTK und der HSV1-TK geprüft. Erfolgt die Bindung der Re-Komplexe an die Thymidinkinase tatsächlich spezifisch am Thymidin, sollte beim Re-Komplex 12 keine Inhibition zu beoachten sein. Die hTK-Aktivität konnte nur sehr leicht inhibiert werden, während dem die HSV1-TK-Aktivität nicht beeinflusst werden konnte. Die Ki-Wert-Bestimmung erfolgte mittels DEAE (Diethylaminoethyl)-Paper Disc Methode[13]. Sämtliche Messungen erfolgten im linearen Bereich der Zeit-Umsatz-Kurve. Die Linearisierung der hyperbolischen Geschwindigkeits-Zeit-Kurve wurde mittels Lineweaver-Burk vorgenommen. Figur 16 zeigt exemplarisch das Resultat einer Linearisierung.

Lineweaver-Burk

y = 0,031x + 0,0001

y = 0,0135x + 0,0078

y = 0,0087x + 0,0079

-0,15

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

-7,00 -5,00 -3,00 -1,00 1,00 3,00 5,00 7,00

0 mikroM50 mikroM150 mikroM

Fig. 16: Lineweaver-Burk-Plot einer Ki-Wert-Bestimmung des Komplex 10 x-Achse: 1/[dT*]; y-Achse: 1/ Geschwindigkeit

26

Der Schnittpunkt der drei Geraden, entsprechend den drei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen, sollte theoretisch auf der Y-Achse liegen. Dieser Schnittpunkt entspricht 1/Ki. Im gezeigten Beispiel schneiden sich nur zwei der drei Geraden auf der Y-Achse. Durch Messungen bei mehreren dT*- Konzentrationen könnte die Bestimmung optimiert werden. In untenstehender Figur 17 ist eine Zusammenstellung der bereits publizierten Ki-Werte und des Ki-Wertes des Re-Komplex 10 dargestellt [4] .

Ki-Werte von Re-Komplexen mit Alkylketten unterschiedlicher Längen

0102030405060

0 5 10 15 20Anzahl Methylengruppen n

Ki-W

ert

in u

M

Fig. 17: Vergleich der Ki-Werte von Re-Komplexen mit verschiedenen Spacern In Abhängigkeit der Länge des Alkylspacers sind die Ki-Werte aufgetragen. Blau markiert die Ki-Werte der vorgängig bestimmten Komplexe und rot der Ki-Wert des Re-Komplexes 10. Die Trendlinie zeigt einen hyperbolische Verlauf, wobei die Re-Komplexe mit den Spacern der Alkylkettenlänge n = 6-8 den tiefsten Ki-Wert und somit die stärkste Inhibition aufweisen. Es lässt sich bei den Resultaten der Ki-Wert-Bestimmung, wie bereits beim HPLC Assays beobachtet, eine Abhängigkeit von der Kettenlänge der Spacer beobachten. Der Kurvenverlauf der beiden Grafiken weist einen hyperbolischen Verlauf auf. Im Gegensatz zum Resultat aus den HPLC Assays, zeigt der Ki-Wert ein Trend zu stärkerer Inhibition bei kürzeren Spacern. Während bei den Resultaten der HPLC Assays eine maximale Inhibition bei Spacerlängen von n = 13-16 erreicht wird, resultiert bei den Ki-Wert-Bestimmungen die maximale Inhibition bei Spacerlängen von n = 6-8 (Vergleiche Fig. 15 und 17). Um eine definitive Aussage machen zu können, ist es notwendig die Kurvenverläufe mit zusätzlichen Messungen, sowohl HPLC Assays wie auch Ki-Wert-Bestimmungen von Inhibitoren mit noch nicht getesteten Spacern, zu festigen. Lässt man nämlich bei den Resultaten der HPLC Assays den Messwert bei n = 20 weg, ist die maximale Inhibition ebenfalls bei Inhibitoren mit kürzeren Spacern zu finden.

27

3.3.1 99mTc-Komplex An HT-29 Zellen wurden Zellinternalisierungstests durchgeführt. Die Tests wurden mit vier verschiedenen Versuchsanordnungen durchgeführt. Es wurde die Aufnahme ohne Inhibitor, in Anwesenheit von zwei verschiedenen Nucleosidtransport-Inhibitoren und des Re-Komplex 10 getestet. Eine Verhinderung des Eintritts in die Zelle in Anwesenheit der beiden Nucleosidtransport-Inhibitoren würde darauf hinweisen, dass die Aufnahme über diese Nucleosidtransporter geschieht. Wäre keine Beeinflussung der Aufnahme zu beobachten, läge die Vermutung nahe, dass der Komplex über andere Wege, z.B. passiver Transport, in die Zelle gelangt. Die Zellinternalisierungs-Messungen mit dem 99mTc-Komplex zeigten unter keinen der getesteten Bedingungen eine Aufnahme. Einer der naheliegenden Gründe könnte der Polyethylenglykol-Spacer sein. Durch die verstärkte Hydrophilie wurde ein Passieren der Zellmembran erschwert. Ein anderer Grund könnte in der Qualität der verwendeten Zellen zu finden sein. Diese Vermutung konnte jedoch mit den Resultaten der Tests mit [methyl-3H]-Thymidin widerlegt werden. [methyl-3H]-Thymidin wurde von den Zellen aufgenommen (10%/mg Protein). Gab man jedoch die Inhibitoren des Nucleosidstransports zu, reduzierte sich die Internalisierung sehr stark (1-2%/mg Protein). Wie erwartet konnte so deutlich nachgewiesen werden, dass das [methyl-3H]-Thymidin vor allem über die Nucleosidtransporter in die Zelle eintritt und die Qualität der verwendetet Zellen für die in vitro Tests ausreichend war.

28

4. Schlussfolgerungen Durch die Resultate der in vitro Tests mit dem Re-Komplex 10 sollte die Hypothese bestätigt werden, dass dieser organometallische Komplex aufgrund der Länge des Spacers im Vergleich zu den bereits getesteten eine stärkere Inhibition gegenüber der hTK aufweist. Sowohl die Ergebnisse der Enzyminhibition als auch der Enzymkinetik zeigten jedoch, dass der getestete Komplex wesentlich geringer inhibierte, als dies erwartet wurde. Der Ki-Wert des Re-Komplexes 10 war mit 45µM zwar höher als erwartet, lag jedoch immer noch im tiefen Bereich der bereits getesteten organometallischen Komplexe. Dass der Komplex 10 spezifisch inhibiert, konnte mit einem Modellkomplex (ohne Pharmakophor) gezeigt werden. Sowohl beim in vitro Assay mit der humanen Thymidinkinase wie auch mit der Herpes Simplex Typ1-Thymidinkinase wurde keine Inhibition der Enzymaktivität festgestellt. Die Zellaufnahme des 99mTc-Komplex 12 konnte nicht beobachtet werden. Es scheint, dass der organometallische Komplex durch die Einführung des hydrophilen Spacers die Zellmembran nicht mehr passieren kann. Die in dieser Diplomarbeit und vorgängig bereits getesteten organometallischen Komplexe stellen eine lohnenswerte Gruppe von potentiell hochaffinen Inhibitoren der Thymidinkinase dar, die Verstärkung der Thymidinkinase-Inhibition weiterzuverfolgen. Ein nächster Schritt wäre beispielsweise die Synthese und in vitro Evaluation eines bereits getesteten Inhibitors, dessen Alkylketten-Spacer durch einen Polyethylenglykol-Spacer ersetzt wurde. Der anschliessenden Vergleich der Resultate würde es erlauben, Rückschlüsse auf den Einfluss des Spacers auf die inhibitorische Aktivität zu ziehen.

29

5. Experimenteller Teil 5.1 Allgemeine Arbeitstechnik 5.1.1 Reagenzien Die verwendeten Reagenzien wurden von den nachfolgenden Firmen bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt: - Anorganische und organische Verbindungen bzw. Lösungsmittel: Fluka, Merck, LAB-SCAN Analytical Sciences - Amino dPEG4 acid: Quanta BioDesign, Ltd., USA - Deuterierte Lösungsmittel: Armar - [Na][TcO4]-Lösung: Generator: Ultratechnekow FM (MO99/TC99M), Mallinckrodt Medical b.v. Die Lösungsmittel wurden im allgemeinen in der handelsüblichen Reinheit (puriss.) verwendet. Wasserfreies Methanol erhielt man mit den in der Laborpraxis üblichen Reinigungsmethoden. 5.1.2 Pufferlösungen Na+-freier Transport-Puffer mit Glucamin: pH 7.4, 1x (27.33g N-Methyl-DG /

1.19g HEPES / 0.68g KH2PO4 / 0.15g CaCl2

. 2H2O / 0.20g MgCl2 / 1.8g Glucose ad 1000ml H2O), pH-Einstellung mit 1N KOH

Nucleosid-Puffer: pH 7.4, 1x (27.60g NaH2PO4

. H2O / 8.49g N(Bu)4H2SO4 / 30ml MeOH ad 1000ml H2O), 30min entgasen im Ultraschallbad

PBS-Puffer: pH 7.4, 1x (5.8g NaCl / 6g Na2HPO4 /

1.5g NaH2PO4 . H2O ad 1000ml H2O),

pH-Einstellung mit 1N NaOH TEAP-Puffer: pH 2.25, 10x ( 800ml H2O + 70ml

TEA, pH-Einstellung mit H3PO4 85%, ad 1000ml H2O), 30min entgasen im Ultraschallbad

30

5.1.3 Chromatographische Materialien und Methoden Für die analytische Dünnschichtchromatographie verwendete man mit Kieselgel-60 beschichtete Alufolien (5 x 7.5cm) mit Fluoreszenzindikator (F254) von Merck. Kieselgel-60 (Korngrösse: 0.063-0.2mm) von Fluka benutzte man in der Säulenchromatographie. Die HPLC-Messungen führte man mit einer Merck/HITACHI L-7100 Intelligent Pump, gekoppelt mit einem UV-Detektor Merck/HITACHI L-4000, einem Radioaktivitätsdetektor LB 506 C-1 sowie einem Autosampler Merck/HITACHI L-7200 durch. Es wurden folgende Säulen verwendet: Von Interchrom die Säule Modulo-Cart QS NUCLEOSIL 5 C18, 250 * 4.6mm mit dem Nucleosidpuffer als mobile Phase (Programm A) und von Macheray Nagel die Säule SP 250/10 Nucleosil 100-5 C18, wobei als mobile Phase ein TEAP-Puffer/Methanol 100% -0% Gradient gefahren wurde (Programm B). Die UV-Absorption wurde bei 254nm gemessen. 5.1.4 IR-Spektroskopie Die IR-Spektren nahm man auf einem Perkin-Elmer FT-IR 16PC auf. Die Verbindungen wurden in Form eines Kaliumbromid-Presslings gemessen. 5.1.5 NMR-Spektroskopie Die Bestimmung der NMR-Spektren erfolgte auf einem 300MHz Varian Gemini 2000 NMR-Spektrometer. Sofern nicht anders vermerkt, wurden die Verbindungen in deuteriertem Methanol (CD3OD; 3.46ppm) aufgenommen. 5.1.6 Massenspektroskopie und Elementaranalysen Die Aufnahme der Massenspektren und die Elementaranalysen wurden am Laboratorium für Organische Chemie der ETH Zürich durchgeführt. 5.1.7 Beta-Counter In der Enyzmkinetik bestimmte man die Aktivitäten mit Hilfe eines Beckmann LS 6500 Scintillation Counter. Aktivitätsmessungen in Rahmen der Zellinternalisierungsversuche erfolgten auf einem TRI-CARB 1900 R Liquid Scintillation Analyzer von PACKARD.

31

5.1.8 Gamma-Counter Ebenfalls im Rahmen der Zellinternalisierungsversuche benutzte man zur Messung der γ-Strahlung einen Gamma-Counter vom Typ COBRA TMII Auto-Gamma von PACKARD. 5.2 Synthesen 5.2.1 Synthese von Verbindung 1 1g (4.1mmol) Thymidin wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen und am HV getrocknet. Anschliessend wurde das getrocknete Edukt unter Stickstoff in 10ml DMF aufgenommen. Es wurde 1.1g (4.1mmol) Triphenylphosphin und 1.3g (19.8mmol) Natriumazid, ebenfalls unter Stickstoff, zugegeben. Portionenweise wurde insgesamt 10.4g (4.1 mmol) Tetrabrommethan zugegeben. Dabei verfärbte sich das Reaktionsgemisch unter Wärmeentwicklung von gelb, über rot nach violett. Bei Raumtemperatur wurde unter Stickstoff gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Nach 16h wurde die Reaktion durch Zugabe von 10ml Methanol gestoppt. Während 1 Stunde wurde weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde schliesslich am HV eingeengt und getrocknet. Die Reinigung erfolgte mittels Säulenchromatographie. Als Elutionsmittel wurde Dichlormethan/Ethanol verwendet. Mit Dichlormethan/Ethanol (9/1) wurde die Reinigung gestartet und der Ethanolanteil stufenweise über Dichlormethan/Ethanol (8/2) auf Dichlormethan/Ethanol (1/1) erhöht. Die Produktefraktionen wurden gesammelt und am HV eingeengt. Die Ausbeute betrug 72% (0.79g). DC [Rf-Wert]; Dichlormethan/Ethanol (9/1) 0.67 IR [cm-1]; KBr 3390 (m) 1477 (m) 2100 (m) 1273 (m) 1721 (s) 1068 (m) 1656 (s)

O N NH

CH3O

OOH

N3

32

5.2.2 Synthese von Verbindung 2 0.79g (3mmol) der Verbindung 1 wurden in einen 100ml-Kolben eingewogen und in wenig Ethanol aufgenommen. Nach Zugabe von 80mg Palladium auf Aktivkohle (10% der Einwaage des Azidothymidins) wurde über Nacht unter H2 hydriert. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Die Reaktionslösung wurde heiss filtriert. Mit einem Stickstoffstrom wurde das Filtrat auf das halbe Volumen eingeengt und im Kühlschrank abgekühlt, wobei das Produkt als weisses kristallines Pulver ausfiel. Es wurde abgenutscht und am HV getrocknet. Die Ausbeute betrug 23% (0.17g) DC [Rf-Wert]; Dichlormethan/Ethanol (9/1) 0.78 1H-NMR [ppm]; CD3OD 7.63 (s, 1H) 3.00–3.05 (m, 2H) 6.36 (t, 1H) 2.38–2.43 (m, 2H) 4.39 – 4.41 (m, 1H) 2.05 (s, 3H) 3.94 – 3.96 (m, 1H) IR [cm-1]; KBr 3388 (w) 1699 (m) 2360 (s) 1650 (m) 2340 (s) 671 (w)

O N NH

CH3O

OOH

NH2

5.2.3 Synthese von Verbindung 3 200mg (0.75mmol) Amino- dPEG4-Säure wurden in einen 100ml- Zweihalskolben eingewogen und in 10ml 1N NaOH/Dioxan (1/1) aufgenommen. Unter Kühlung im Eisbad wurden 324mg (1.49mmol) Boc2O portionenweise zugegeben. Bei Raumtemperatur wurde während 4 Stunden gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Das Dioxan wurde unter Vakuum entfernt. Um das restliche Dioxan aus der verbleibenden Wasserphase zu entfernen, wurde 3-mal mit Ether ausgeschüttelt. Darauf wurde die Wasserphase mit 1N HCl auf pH 3 angesäuert und 3-mal mit Dichlormethan ausgeschüttelt. Die vereingten Dichlormethanphasen wurden über Na2SO4 getrocknet. Anschliessend wurde am HV eingeengt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 70% (0.19g).

33

DC [Rf-Wert]; Dichlormethan / Ethylacetat (1/1) 0.43 1H-NMR [ppm]; CD3OD 3.88 (m, 2H) 3.37 (t, 2H) 3.73–3.81 (m, 12H) 2.71 (t, 2H) 3.67 (t, 2H) 1.60 (s, 9H) 13C-NMR [ppm]; CD3OD 175.49 41.58 158.65 36.01 71.32 – 71.82 29.14 68.08

NH

O OHO

O

n

O

n=4 5.2.4 Synthese von Verbindung 4 100mg (0.27mmol) der Verbindung 3 wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen, am HV getrocknet und unter Stickstoff in 10ml DMF aufgenommen. Unter Stickstoff wurde 64mg (0.31mmol) N,N’-Dicyclohexylcarbodiimid und 36mg (0.31mmol) N-Hydroxysuccinimid zugegeben und anschliessend bei 55oC während 2 Stunden unter Stickstoff gerührt. Darauf wurden 66.1mg (0.27mmol) der Verbindung 2 unter Stickstoff zugegeben. Über Nacht wurde bei 55oC gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Das Reaktionsgemisch wurde am HV eingeengt und getrocknet. Die Reinigung erfolgte mittels Säulenchromatographie. Als Elutionsmittel wurde Ethylacetat/Methanol (9/1) verwendet. Die Fraktionen mit dem Produkt wurden vereinigt, am HV eingeengt und getrocknet. Es wurde eine Ausbeute von 81% (0.13g) erzielt. DC [Rf-Wert]; Ethylacetat / Methanol (1/1) 0.47 1H-NMR [ppm]; CD3OD 7.66 (s, 1H) 3.36 (t, 2H) 6.36 (t, 1H) 2.82–2.83 (m, 2H) 4.42 – 4.6 (m, 1H) 2.63 (t, 2H) 4.02 – 4.08 (m, 1H) 2.39 (t, 2H) 3.88 – 3.89 (m, 2H) 2.06 (s, 3H) 3.74–3.78 (m, 12H) 1.58 (s, 9H) 3.63 – 3.65 (m, 2H)

34

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NH

OO

O

n

n=4 5.2.5 Synthese von Verbindung 5 In 2ml 6M HCl wurden 130mg (0.22mol) der Verbindung 4 während 1.5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Die Reaktionslösung wurde mit 5M NaOH neutralisiert (pH=7), am HV eingeengt und getrocknet. Der Rückstand wurde in 4ml Ethanol aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wurde am HV eingeengt und getrocknet. Erneut wurde der Rückstand in 4ml Ethanol aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wurde am HV eingeengt und getrocket. Die Ausbeute betrug 84% (0.09g) DC [Rf-Wert]; Ethylacetat / Methanol (1/1) 0.34 1H-NMR [ppm]; CD3OD 7.67 (s, 1H) 3.64–3.66 (m, 2H) 6.34 (t, 1H) 3.30 (t, 2H) 3.42 – 3.48 (m, 1H) 2.82–2.84 (m, 2H) 4.06 – 4.1 (m, 1H) 2.64–2.68 (m, 2H) 3.88 – 3.90 (m, 2H) 2.43–2.49 (m, 2H) 3.73 – 3.80 (m, 12H) 2.06 (s, 3H) 13C-NMR [ppm]; CD3OD 173.18 67.07 165.11 67.00 151.11 40.99 137.11 39.41 110.58 33.50 85.10 32.92 71.66 17.20

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NH2

On

n=4

35

5.2.6 Synthese von Verbindung 6 87.9mg (0.18mmol) der Verbindung 5 wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen und in 10ml Methanol aufgenommen. Es wurde 75µl (0.54mmol) Triethylamin zugegeben. 35µl (0.38mmol) Bromessigsäure-methylester, aufgenommen in wenig Methanol, wurden mit Hilfe eines Tropftrichters über 10 Minuten zugetropft. Unter Rückfluss bei 100oC wurde gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Nach 5 Stunden wurde die Reaktion gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, am HV eingeengt und getrocknet. Die Reinigung erfolgte mittels Säulenchromatographie. Als Elutionsmittel wurde Ethylacetat/Methanol (1/1) verwendet. Die Fraktionen mit dem Produkt wurden vereinigt, am HV eingeengt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 13% (0.06g). DC [Rf-Wert]; Ethylacetat / Methanol (1/1) 0.26 1H-NMR [ppm]; CD3OD 7.64 (s, 1H) 3.04 (t, 2H) 6.29 (t, 1H) 2.74–2.80 (m, 2H) 4.45 – 4.49 (m, 1H) 2.66 (s, 4H) 4.06 – 4.1 (m, 1H) 2.38–2.46 (m, 2H) 3.90 (s, 6H) 2.07 (s, 3H) 3.78 – 3.86 (m, 18H) MS-Elektronenspray 656.4 = M+23; [C27H44N4O13] + Na+

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n O

O

CH3

CH3

O

O n=4 5.2.7 Synthese von Verbindung 7 63.3mg (0.1mmol) der Verbindung 6 wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen und in 2ml 1N NaOH aufgenommen. Bei Raumtemperatur wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm B). Mit 1N

36

HCl wurde neutralisiert (pH=7). Es wurde am HV eingeengt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 83% (0.06g). 1H-NMR [ppm]; CD3OD 7.64 (s, 1H) 3.41 (s, 2H) 6.29 (t, 1H) 3.02–3.08 (m, 2H) 4.20–4.25 (m, 1H) 2.64–2.68 (m, 2H) 4.06–4.1 (m, 1H) 2.61 (s, 4H) 3.88–3.90 (m, 2H) 2.43-2.46 (m, 2H) 3.79 – 3.86 (m, 12H) 2.07 (s, 3H) 3.64 – 3.66 (m, 2H) 13C-NMR [ppm]; CD3OD 173.20 69.61 165.10 66.52 151.27 60.73 137.11 56.53 110.71 36.09 85.10 33.29 71.66 10.52

O

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n OH

OH

O

O n=4 5.2.8 Synthese von Verbindung 8 2.0g (7.4mmol) Octadecylamin wurden in einen 100ml-Zweihalskolben gegeben und in 50ml MeOH aufgenommen. Es wurden 2.67ml (16.28mmol) Triethylamin zugegeben. 1.52ml (18.5mmol) Bromessigsäure-methylester, aufgenommen in wenig Methanol, wurden mit Hilfe eines Tropftrichters zugetropft. Unter Rückfluss bei 100oC wurde gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Nach 5 Stunden wurde die Reaktion gestoppt und das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt. Am HV wurde anschliessend eingeengt und getrocknet. Die Reinigung erfolgte mittels Säulenchromatographie. Als Elutionsmittel wurde Dichlormethan/Ethanol (9/1) verwendet. Die Fraktionen mit dem Produkt wurden vereinigt, am HV eingeengt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 41% (1.25g).

37

DC [Rf-Wert]; Dichlormethan / Ethanol (9/1) 0.73 1H-NMR [ppm]; CD3OD 3.84 (s, 6H) 1.44 (s, 32H) 3.67 (s, 4H) 1.03 (d, 3H) 1.70 (s, 2H)

NOCH3

OCH3

O

O

5.2.9 Synthese von Verbindung 9 1.25g (3mmol) der Verbindung 8 wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen und in 9ml 1N NaOH aufgenommen. Es wurde unter Rückfluss bei 100oC über Nacht gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels Dünnschichtchromatographie. Mit 1N HCl wurde neutralisiert (pH=7). Die Reaktionsmischung wurde zentrifugiert und der weisse Rückstand 2-mal mit Wasser gewaschen. 1H-NMR [ppm]; CD3OD 3.15 (s, 4H) 1.85 (s, 2H) 1.43 (s, 37H) 1.05 (s, 3H) IR [cm-1]; KBr 2915.8 (s) 1472.1 (m) 2849.3 (s) 1419.0 (m) 1632.1 (s) 1336.0 (m)

NOH

OH

O

O

38

5.2.10 Synthese von Komplex 10 51.4mg (0.09mmol) der Verbindung 7 wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen und in 3ml Wasser aufgenommen. Man gab 49.5mg (0.06mmol) Re-Precursor [NEt4]2 [ReBr3(CO)3] zu und rührte während 3.5 Stunden bei 50 oC. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm B). Die Reinigung erfolgte über eine 2g Sep-Pak® Cartridge. Als Elutionsmittel wurde ein Wasser – MeOH Gradient 100% - 0% verwendet. Das am HV eingengte Reaktionsgemisch wurde auf die Säule aufgetragen. Die Produktfraktionen wurden mittels HPLC (Programm B) eruiert und im SpeedVac getrocknet. Die Ausbeute betrug 70% (0.04g), wobei 55% (0.022g) davon als NEt4-Salz und 45% (0.018g) als Na+-Salz vorlagen. 1H-NMR [ppm]; CD3OD 7.65 (s, 1H) 3.72–3.82(m,18H) 6.28 (t, 1H) 3.60-3.68 (m, 2H) 4.42 – 4.47 (m, 1H) 2.63 (t, 2H) 4.02 (s, 1H) 2.49 (t, 2H) 3.98 (s, 4H) 2.06 (s, 3H) 3.89 (s, 2H) 13C-NMR [ppm]; CD3OD 197.69 68.54 196.76 67.93 181.91 67.02 173.71 63.64 165.10 51.99 151.06 40.93 137.05 38.74 110.53 36.49 85.03 11.20 71.65 6.33 70.19 IR [cm-1]; KBr 3432 (m) 1885 (s) 2923 (m) 1700 (m) 2364 (w) 1684 (m) 2344 (w) 1653 (s) 2016 (s) MS 873.0 = M; [ReC28H38N4O16]+

39

OO

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n

Re

COCO

OO CO

O

-

n=4 5.2.11 Synthese von Komplex 11 80.0mg (0.2mmol) der Verbindung 9 wurden in einen 50ml-Zweihalskolben eingewogen und in 5ml Methanol aufgenommen. Es wurden 146.5mg (0.2mmol) Re-Precursor [NEt4]2 [ReBr3(CO)3] zugegeben und bei 40oC gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm B). Am HV wurde eingeengt und getrocknet. Zur Entfernung des [Br][NEt4] wurden ca. 5ml Wasser zugegeben. Es wurde filtriert und der Rückstand am HV getrocknet. 1H-NMR [ppm]; CD3OD 3.60 – 3.90 (q, 4H) 1.90 (s, 2H) 1.44 (s, 32H) 1.05 (d, 3H) IR [cm-1]; KBr 3445 (w) 1876 (s) 2919 (s) 1650 (m) 2850 (m) 1469 (w) 2023 (s) 1391 (w)

O N

O Re

COCO

OO CO

-

40

5.3 Radioaktive Synthese 400µl einer 10-3M Lösung der Verbindung 7 in PBS-Puffer wurden in ein Penicillinfläschchen gegeben, dieses verschlossen und die Lösung während ca. 5 Minuten mit Stickstoff begast. 200µl einer Lösung des Technetium-Tricarbonyl-Precursors [Tc(OH2) 3 (CO)3]+ wurden zugegeben und während 30 Minuten bei 75oC inkubiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm B). Die Reinigung erfolgte ebenfalls mittels HPLC (Programm B). HPLC [Rt in min.]; Programm B 20.7

OO

O N NH

CH3O

OOH

NH

NO

n

Tc

COCO

OO CO

O

-

n=4

41

5.4 Enzyminhibition Die inhibitorische Aktivität der synthetisierten Komplexe 10 und 11 wurde nach Anleitung der Literatur mittels HPLC-Assay überprüft [14]. 5.4.1 Re-Komplex 10 Humane Thymidinkinase Gemäss Tabelle 1 wurden die Reaktionslösungen zusammengestellt:

Endkonz. Re-Komplex

mM

ATP 10mM

[µl]

Mg2+ 100mM

[µl]

Re-Kompl.9,2mM

[µl]

dT 50mM

[µl]

hTK [µl]

Tris 1M [µl]

H20 [µl]

0 3,75 3,75 0 1,5 4 3,75 58,25 0,5 3,75 3,75 3,75 1,5 4 3,75 54,5 1 3,75 3,75 7,5 1,5 4 3,75 50,75 2 3,75 3,75 15 1,5 4 3,75 43,25

Blank 3,75 3,75 15 0 4 3,75 44,75 Tabelle 1: Pipettetierschema des Assays zur Überprüfung der Inhibition des Re-Komplex 10 gegenüber der hTK In einer Dreifachbestimmung in einem Endvolumen von 75 µl wurde bei 37oC inkubiert. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 675µl einer 2.5mM EDTA-Lösung gestoppt. Die Bildung des Thymidinmonophosphats wurde qualitativ mittels HPLC (Programm A) bestimmt. Virale Thymidinkinase Es wurde eine Einfachbestimmung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der viralen Thymidinkinase durchgeführt. Gemäss Tabelle 2 wurden die Proben bereitgestellt: Endkonz. Re-Komplex

mM

ATP 10mM

[µl]

Mg2+ 100mM

[µl]

Re-Kompl. 9,2mM

[µl]

dT 50mM

[µl]

HSV1-TK [µl]

Tris 1M [µl]

H20 [µl]

0 3,75 3,75 0 1,5 3 3,75 59,25 0,5 3,75 3,75 3,75 1,5 3 3,75 55,5 1 3,75 3,75 7,5 1,5 3 3,75 51,75 2 3,75 3,75 15 1,5 3 3,75 44,25

Blank 3,75 3,75 15 0 3 3,75 45,75 Tabelle 2: Pipettetierschema des Assays zur Überprüfung der Inhibition des Re-Komplex 10 gegenüber der HSV1-TK

42

Es wurde während 30 Minuten bei 37 oC inkubiert. Durch Zugabe von 675µl einer 2.5mM EDTA-Lösung wurde die Reaktion gestoppt. Die quantitative Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm A). 5.4.2 Re-Komplex 11 Humane Thymidinkinase Eine Einfachbestimmung der inhibitorischen Aktivität des Re-Komplex 11 gegenüber der humanen Thymidinkinase wurde durchgeführt. Gemäss Tabelle 3 wurden die Proben bereitgestellt: Endkonz. Re-Komplex

mM

ATP 10mM

[µl]

Mg2+ 100mM

[µl]

Re-Kompl. 10mM

[µl]

dT 50mM

[µl]

hTK [µl]

Tris 1M [µl]

H20 [µl]

0 3,75 3,75 0 1,5 3 3,75 59,25 0,5 3,75 3,75 3,75 1,5 3 3,75 55,5 1 3,75 3,75 7,5 1,5 3 3,75 51,75 2 3,75 3,75 15 1,5 3 3,75 44,25

Blank 3,75 3,75 15 0 3 3,75 45,75 Tabelle 3: Pipettetierschema des Assays zur Überprüfung der Inhibition des Re-Komplex 11 gegenüber der hTK Es wurde während 15 Minuten bei 37 oC inkubiert. Durch Zugabe von 675µl einer 2.5mM EDTA-Lösung wurde die Reaktion gestoppt. Die quantitative Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm A). Virale Thymidinkinase Es wurde eine Einfachbestimmung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der viralen Thymidinkinase durchgeführt. Gemäss Tabelle wurden die Proben bereitgestellt: Endkonz. Re-Komplex

mM

ATP 10mM

[µl]

Mg2+ 100mM

[µl]

Re-Kompl. 10mM

[µl]

dT 50mM

[µl]

HSV1-TK [µl]

Tris 1M [µl]

H20 [µl]

0 3,75 3,75 0 1,5 3 3,75 59,25 0,5 3,75 3,75 3,75 1,5 3 3,75 55,5 1 3,75 3,75 7,5 1,5 3 3,75 51,75 2 3,75 3,75 15 1,5 3 3,75 44,25

Blank 3,75 3,75 15 0 3 3,75 45,75 Tabelle 4: Pipettetierschema des Assays zur Überprüfung der Inhibition des Re-Komplex 11 gegenüber der HSV1-TK

43

Es wurde während 15 Minuten bei 37 oC inkubiert. Durch Zugabe von 675µl einer 2.5mM EDTA-Lösung wurde die Reaktion gestoppt. Die quantitative Reaktionskontrolle erfolgte mittels HPLC (Programm A). 5.5 Enzymkinetik Die Ki-Wert-Bestimmung des Re-Komplex 10 erfolgte gemäss Literatur [13]. Es wurden die benötigten Reaktionslösungen hergestellt und die DEAE-Papiere vorgelegt: 2µM dT* 8µl der 11.7µM dT*-Stammlösung (Batch

251, 3.18TBq/mmol) gab man zu 38.52µl ddH2O.

0.5mM Lösung des Komplex 10 19.1mg von Komplex 10 aufgenommen in

40ml ddH2O MasterMix (MM) 1M Tris pH 7.4 150 µl 1M MgCl2 15 µl 100mM ATP 60 µl 1% BSA-Lösung 774 µl Total 999 µl

+ 1 µl TK 20 µg/ml (Zugabe erst unmittelbar vor Reaktionsstart)

Cellulase-Lösung Cellulase 750mg H2O 195ml 3M NH4-Acetat 5ml

44

Es wurden in 9 Tubes die Reaktionsmischungen gemäss Tabelle 5 pipettiert:

Endkonz. Endkonz. dT* dT*Verb.

10 Summe dT* Y8.2 Stammlsg. verdünnt 0.5mM ddH2O [µM] [µM] 11.6[µM] 2µM [µl] [µl] [µl] Batch 251 [µl] [µl]

1 0.2 0 3 17 20 2 0.2 50 3 3 14 20 3 0.2 150 3 9 8 20

4 0.6 0 9 11 20 5 0.6 50 9 3 8 20 6 0.6 150 9 9 2 20

7 1.2 0 3.08 16.92 20 8 1.2 50 3.08 3 13.92 20 9 1.2 150 3.08 9 7.92 20

Totalverbrauch: 9.24 36 36

Tabelle 5 : Pipettierschema für die Ki-Wert-Bestimmung Bei 37oC wurde während 15 Minuten inkubiert. Die hTK wurde zum Mastermix gegeben und im Abstand von je 30 Sekunden wurden jeweils 10µl MM zu den Reaktionslösungen 1-9 pipettiert. Nach 5, 10, 15, 20 und 25 Minuten wurden jeweils 5µl der Reaktionslösung entnommen und die Reaktion gestoppt, indem man die 5µl sofort auf ein DEAE-Papier transferierte. Um das überschüssige markierte Thymidin zu entfernen wurden die DEAE-Papiere 6mal mit 170µl 4mM Ammoniumacetat-Lösung gewaschen und anschliessend in Szintillationsvials überführt. Nach Zugabe von 4ml Cellulase-Lösung wurde während 1 Stunde bei 37oC geschüttelt , wobei die DEAE-Papiere verdaut wurden. In jedes Vial wurden 8ml Szintillationsflüssigkeit zugefügt und mit dem β-Counter die Aktivitätsmessungen durchgeführt.

45

5.6 Zellinternalisierung 5.6.1 Aufbau der Zellkultur In Zellkulturflacons wurde zu den HT-29 Zellen 20ml Nährmedium des Typs McCoy's mit 1% FCS (Fetal Calf Serum) und 1% Antibiotika zugegeben. Vier Tage später wurde das Nährmedium mit einer Pipette abgesaugt und frisches hinzugegeben. Waren die Zellen konfluent (nach weiteren 3-4 Tagen), wurden die Zellen im Verhältnis 1:7 gesplittet. Das Nährmedium wurde abgesaugt und die Zellen mit 2ml EDTA-Lösung, im Wasserbad auf 37oC erwärmt, gereinigt. Nach Entfernen der EDTA-Lösung wurden die Zellen mittels Inkubation während 5 Minuten in 2ml Trypsin bei 37oC vom Flaconboden abgelöst. Es wurden 20ml McCoy's-1% FCS zugegeben und homogenisiert. 3ml des Homogenisats wurden in ein neues Zellkulturflacon überführt und 18ml McCoy's-1% FCS Nährmedium zugegeben. Der Wechsel des Nährmediums erfolgte nach 4 Tagen. Sobald die Zellen wieder konfluent waren, wurde nach obigen Erläuterungen gesplittet. 5.6.2 Zelltest Am Vortag der Zelltest wurden die Well Plates vorbereitet. Als erstes wurden die Zellen gezählt. Dazu wurde der Inhalt eines Zellkulturflacon in ein Falcon überführt, homogenisiert und 20µl des Homogenisats entnommen. Es wurde mit 180µl H2O verdünnt und anschliessend die Zellen gezählt. Unter Berücksichtigung der Verdünnung wurde die Anzahl Zellen im Gesamtvolumen berechnet. Es wurde zentrifugiert, das Medium abgesaugt und die Zellen in 240ml neuem Nährmedium aufgenommen (gewünschte Endkonzentration: 1Mio Zellen/2ml Medium). Well Plates à 12 Löcher wurden vorbereitet. Jedes Loch wurde mit 2ml Mc Coy's-Nährmedium mit 1 Million HT-29-Zellen versehen. Über Nacht setzten sich die Zellen am Boden ab. Das Nährmedium wurde entfernt und die Zellen 2-mal mit Na+-freiem Puffer gewaschen. Gemäss nachfolgender Figur 17 wurden für die Messungen mit 99mTc und [methyl-3H]-Thymidin je 5 Well Plates zubereitet.

DCBA Fig. 17: Bereitstellen der Well Plates für die Zelltests nach folgendem Muster: A: Na+-freier Puffer B: Na+-freier Puffer + 10µM NBMPR; C: Na+-freier Puffer + 10µM Dipyridamol + 4mM dT D: Na+-freier Puffer + 10 µM Re-Komplex 10

46

Nach der Zugabe von Na+-freiem Puffer, 10µM NBMPR, 10µM Dipyridamol, 4mM Thymidin und 10µM Lösung des Komplex 10 wurde während 15 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Es wurde die 99mTc-Komplex- bzw. die [methyl-3H]-Thymidin -Lösung zugefügt und während 0, 5, 15, 60 und 120 Minuten bei 37oC inkubiert. Der Überstand der Löcher wurde pro Loch separat gesammelt. Es wurde 2-mal mit PBS-Puffer gewaschen. Den PBS-Puffer der ersten Waschung wurde zum gesammelten Überstand gegeben, der PBS-Puffer der zweiten Waschung wurde verworfen. Um den 99mTc-Komplex bzw. das [methyl-3H]-Thymidin auf der Zellmembran zu entfernen wurde 2-mal während 5 Minuten bei Raumtemperatur mit je 500µl Glycin pH=2,8 inkubiert und die Glycinlösungen gesammelt. Es wurde 2-mal mit PBS-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 2-mal je 500µl 1N NaOH abgelöst und gesammelt. Die Aktivitätsmessungen der Fraktionen des PBS-Puffers, des Glycins und der 1N NaOH erfolgten nach Durchführung der im nächsten Abschnitt erläuterten Bestimmung der Proteinkonzentration. Die Fraktionen des 99mTc-Komplexes wurden im γ-Counter gemessen. Es wurden die Aktivitäten dreier Leerwerte (nur Messröhrchen) und dreier Standards mit je 50µl 99mTc-Komplex-Lösung bestimmt. Die Fraktionen der Messungen mit [methyl-3H]-Thymidin wurden in Szintillationsvials überführt und 4ml Szintillationsflüssigkeit zugefügt. Mit 100µl [methyl-3H]-Thymidin- Lösung und 4ml Szintillationsflüssigkeit wurden die Standards zusammengestellt. Die Aktivitätsmessungen erfolgten im β-Counter. 5.6.3 Proteinbestimmung Es wurden drei Reaktionslösungen zubereitet: Working reagent for 96 wells Pierce Micro Protein Assay Cat. Nr. 23235 7.5ml Lösung A 7.2ml Lösung B 0.3ml Lösung C Dilution Buffer 1ml 1N NaOH 14ml H2O BSA Standard 160 µl BSA-Lösung (2mg/ml) 1840 µl Dilution buffer Aus dem BSA Standard wurden mittels Verdünnungsreihe die BSA Standards 1-7 hergestellt (Endkonzentrationen: 80 / 40 / 20 / 10 / 5 / 2.5 / 1.25µg/ml). Ein 96 Loch Well Plate wurde mit je 150µl folgender Lösungen bestückt: 1x Dilution Buffer, je 1x BSA Standards 1-7 und je eine Probe von allen gesammelten Na-OH-Waschlösungen aus den Zelltests. Nach Zugabe von je 150µl Working reagent wurde während 2 Stunden bei 37oC im Dunkeln inkubiert. Es wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit dem Microplate Reader die Proteinkonzentrationen bestimmt.

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