NeoSEEK: EHEC/STEC Détection et Identification par Profiling Génotypique

Edan Hosking, Ph.D.

Director Food Safety Genomics – R&D

Neogen Corporation

SteakExpert 2018

Serving Food and Animal Safety Needs

“Farm gate to dinner plate”

• Neogen Corporation is an acknowledged leader in food and animal safety testing products.

• Neogen Corporation develops, manufactures, and markets various products worldwide

• Food Safety Solutions - Innovative technologies for diagnostic test kits, instrument systems, consumables, culture media, software and services.

1. Toxins

2. Allergens

3. Antibiotic residues

4. Pathogens (rapid methods and service platforms)

• Animal Safety Markets- Complete line of veterinary supplies, pharmaceuticals, nutritional supplements, disinfectants and rodenticides.

• 6 sérotypes de la toxine Shiga produisant de l’E. coli – ADULTÉRANTS

• O26, O45, O103, O111, O121, O145• Manufacturing trim

• Pourquoi ces sérotypes ??1. Ils ont été isolés à partir de carcasses de bœuf ou

de grands magasins aux États-Unis2. Les plus courants aux États-Unis3. 70% – 83% des maladies sont dues aux STEC

d’après le Centers for Disease Control (CDC)4. Le CDC estime que près de 100 000 cas par an sont

attribués à des STEC autres que O157:H7

Intent of Rule – June 4, 2012

Method 5B.0410/01/2013

Ajouter 975 ml de mTSB par échantillons de 325 g

Incuber à 42oC pendant 15-24 h

Scanner par PCR multiplex

Mettre les positifs potentiels en plaque

par PCR sur une gélose Rainbow

modifiée après IMS

Agglutination au latex

Colonies positives isolées sur SBA

Confirmation par PCR en temps réel

et identification biochimique

Agglutination sérologicale pour vérifier

les colonies positives

• Si le dépistage est stx + ET eae + mais O group –

1. Rapporté comme Négatif

2. Les HACCP et SSOPs doivent être réévalués

• Si le dépistage est stx + ET eae + ET O group +

1. Positif potentiel

• Si la colonie positive potentielle est agglutination latex + ET O group +

1. Positif présumé

• Si la colonie positive présumée est biochimique + ET stx + ET eae + ET O group +

1. Positif confirmé

MLG – Quelle signification ?

• La plupart des tests ont deux parties :

1) stx et eae2) O-groups.

1. Les résultats sont seulement indicatifs de la possibilité de l’échantillon de contenir un STEC, sans pour autant interpréter ceci comme un STEC pathogène

2. De plus des résultats positifs par dépistage PCR n’indiquent pas nécessairement si les stx, eae et O groups sont présents dans la même cellule (ce qui doit être le cas pour être considéré comme un EHEC)

Défis de l’analyse actuelle des EHEC

• Les stx1 and stx2 sont tous les deux transportés par près de 300 STEC sérotypes mais un grand nombre d’entre eux n’ont pas été impliqués dans des maladies

• De nombreux E. coli et autres bactéries en contiennent un ou plusieurs

• EHEC contient :1. stx

2. eae

3. O-group

Défis de l’analyse actuelle des EHEC

NEOSEEK STEC CONFIRMATION

Système de détection des STEC NeoSEEK™ : Une méthode moléculaire

innovante pour la détection et l’ identification des EHEC/STEC

LANSING, Mich., Sept. 12, 2012 — Neogen Corporation (Nasdaq: NEOG) has announced the U.S.

Department of Agriculture’s Food Safety and Inspection Service (FSIS) has issued a letter of no objection

for the use of Neogen’s NeoSEEK™ pathogen DNA detection method to detect Shiga toxin-producing

strains of E. coli (STECs).

The letter of no objection allows the use of the 24-hour NeoSEEK STEC system as a confirmatory method for six

STEC serogroups (O26, O45, O103, O111, O121, and O145) and states the NeoSEEK system is comparable to

the reference method, FSIS MLG 5B.02, which can take three or more days to achieve a confirmatory result. This

allows companies to use the NeoSEEK system to comply with the USDA’s recently implemented regulation that

requires the testing of raw beef trim for six new STEC serogroups, in addition to the previously regulated STEC, E.

coli O157:H7.

“The letter from the USDA provides further assurance to our customers that our NeoSEEK system performs as

designed,” said James Herbert, Neogen’s chairman and CEO. “As worldwide food regulation has evolved to

address newly identified threats to our global food supply, such as STECs, Neogen’s test systems have evolved to

rapidly and accurately detect those threats. NeoSEEK provides the DNA-definitive test the food industry needs

that has been proven to be comparable to the older reference method, yet provides much quicker results.”

Neogen received the USDA’s letter of no objection as a result of extensive studies validating the effectiveness of

the NeoSEEK system. The NeoSEEK technology uses mass spectrometry-based multiplexing to determine the

genetic composition of bacteria in a food sample, and then compares those results with the known genetic

makeup of the target E. coli strains to identify and differentiate the target strains. NeoSEEK provides confirmatory

results directly from the enrichment broth, eliminating the need for single colony isolation and allowing for

accuracy while delivering confirmatory results more rapidly.

L’USDA adresse une lettre de non-opposition pour

NeoSEEK™, le système de détection des STEC de Neogen

Sécurité Alimentaire et Génomique

• Identification de la souche bactérienne par profiling moléculaire

1. Une technologie qui permet de construire un “Profil Moléculaire” des organismes grâce à plus de marqueurs génétiques.

• Agena MassArray

a) Multiplexage basé sur spectométrie de masse (MALDI-TOF)

b) Ne nécessite pas des amorces étiquetées coûteuses

c) Le logiciel "IPLEX" permet de concevoir des tests pourjusqu’à 60 rxns/micropuits and 384 spots/puce

• Détecter la présence, et l’identité, des EHEC dans l’enrichissement

• O26, O45, O103, O111, O121, O145 et O157

• Recherche un modèle de présence/absence pour une série de gènes cibles spécifiques

• Les résultats pour chaque cible sont determinés par l’addition, ou l’absence, d’une simple base connue à une amorce (SNP ou base conservée)

• Détection et identification directement d’un enrichissement alimentaire ou d’une simple colonie

• La durée entre enrichissement et identification est de 24 heures sans sous culture

N

E

O

S

E

E

K

24 hours

Quelle place pour NeoSEEK?

MicrobiologyLaboratoryGuidebook (MLG) USDA – FSIS method 5B

Method 5B.0410/01/2013

Limites de la méthode MLG

• Le nombre de marqueurs génétiques pouvant être déterminés par RT PCR

• Le besoin d’un isolat de prélèvement pur

• Amorces étiquetées coûteuses

• Duration

• Coût des réagents et du personnel

• Performance inconsistante des billes enduites d’anticorps

• De multiples techniques et l’absence de milieux de cultures selectifs ou differentiels pour l’identification

Agena Genotyping Technology

• L’amplification par PCR génère environ 100 bp amplicon

• La réaction par extension d’amorce génère des produits spécifiques de l’allèle de l’ADN

• Spectométrie de masse basée sur puce pour l’analyse

Analyse spectométrie de masse

Analyse spectométrie de masse

Plus de marqueurs = Meilleure Résolution

• Cibles spécifiques O-group

• Stx1 et Stx2

• Eae

Marqueurs utilisés dans les méthodes de détection

• Eae (sous-types)

• Autres gènes virulent et leurs sous-types spécifiques

• Marqueurs SNP spécifiques du O-group pour assister dans la détermination des STEC/non-STEC

• FliC

• Permet la détermination des H-types depuis les isolats

Marqueurs additionnels pour la confirmation par NeoSEEK

• La détection initials par PCR a montré les modèles qui peuvent être utilisés

pour construire un ‘profile moléculaire ’

• Spécificité pour les cibles O-group et H-type

• Détection des Stx1 (a, c, d) et Stx2 (a, b, c, d, e, f, g)

• Profiles pour chaque O-group basés en partie sur les sous-types

attendus/prédits et confirmés pour Eae, ainsi que d’autres gènes virulents

• Présence de toujours plus de gènes virulents

• Détermination de SNPs spécifiques des O-group pour STEC/non-STEC

Il n’existe pas une cible unique pour l’identification

de ces STECs soumises à réglementation

Profiles PCR

Low Inoculum (1-2 cfu/test portion)

Correct Identification MLG 5B.01

Correct Identification NeoSEEK

True Positive STEC (non-O157:H7) 15 17

False Positive STEC 0 0

True Negative (non-STECs) 4 4

False Negative 2 0

Total Inoculations 21 21

High Inoculum (5-10 cfu/test portion)

Correct Identification MLG 5B.01

Correct Identification NeoSEEK

True Positive STEC (non-O157:H7) 28 31

False Positive STEC 0 0

True Negative (non-STECs) 4 4

False Negative 3 0

Total Inoculations 35 35

True Positive (NeoSEEK vs. MLG 5B.01)

True Negative (NeoSEEK vs. MLG 5B.01)

Reported Positive 48 43 0 0

Reported Negative 0 5 8 8

Total 48 48 8 8

Relative Sensitivity 100% 88.6%

Relative Specificity 100% 100%

• L’étude était composée d’échantillons de bœuf haché dopés (simples et doubles) à l’insu par un laboratoire indépendant. L’analyse a été faitesuivant le MLG 5B.01. Les aliquots des cultures d’enrichissements ont étéensuite envoyés pour analyse par NeoSEEK STEC

Étude pour la lettre de non-opposition

NeoSEEK STEC pour O157:H7

• Résultats de confirmation

Beef trim

Inoculation

Low

NeoSEEK

Results

O157:H7 STEC

Beef trim

Inoculation

High

NeoSEEK STEC

Results

O157:H7 STEC

Single inoculation

Growth Evident

5 5 5 5

Double inoculation

Growth Evident

0 0 2 2

Agreement* 100% 100%

*Resultats identiques par Vanguard Labs utilisant MLG 5.06

Comment NeoSEEK est-il utilisé ?

• Validation/Vérification des processus

o Validation que les interventions actuelles ou nouvelles réduisent suffisamment la présence de STECs non-O157 STECs comme prévu par le plan HACCP

• Vérifier les résultats positifs avec NeoSEEKo Evite de prendre des mauvaises décisions basées sur

des positives présumés ou potentiel par rapport aux produits

• Évaluation des risques et études de prévalence

• Critères d’importation aux U.S.A.

o Résultats définitifs, réduisant les

risques de faux positifs de la part des

méthodes alternatives

• Le test NeoSEEK STEC est précis. Une présence ou absence de STEC/EHEC peut être déterminée avec précision à partir d’une culture d’enrichissement sans besoin d’obtenir un isolat ou de confirmer l’identification d’un isolat.

• Dans l’étude de validation, NeooSEEK STEC est au niveau ou supérieur à la méthode de confirmation MLG.

• NeoSEEK STEC est un test rapide. Les résultats sont disponibles dans les 24 à 36 heures suivant la réception d’un échantillon contre plus de 3 jours avec la confirmation MLG.

• GeneSeek, Inc, est accredité par l’American Association of Laboratory Accreditation (A2LA) pour l’utilisation du test NeoSEEK™ STEC. GeneSeek est accrédité par by A2LA pour la méthode ISO/IEC 17025 depuis 2008.

• La seule méthode de confirmation avec une lettre de non-opposition

• Validation AOAC en cours

Points Importants

Merci !

GeneSeek

Barry Simpson, PhD

Susanne Hinkley, PhD

Veronica Basnayake, PhD

Eric Shuman

Neogen

Cryptotokens hyperledger, PhD

Eric Tovar

Lisa Pinkava

Becky Shaulis

Ariel Fox

Mark Mozola, PhD

Jennifer Rice, PhD

Contact

ehosking@neogen.com