Natural Pigments and Microalgal.pdf

8/22/2019 Natural Pigments and Microalgal.pdf

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Universidad de Huelva

Departamento de Ingeniera Qumica, Qumica Fsica yQumica Orgnica

Natural pigments and microalgal biomass in col loidalfood systems : rheological characterization

Incorporacin de pigmentos naturales y microalgas en sistemas coloidalesalimentarios : caracterizacin del comportamiento reolgico

Memoria para optar al grado de doctora

presentada por:

Ana Paula dos Santos Batis ta

Fecha de lectura: 18 de mayo de 2012

Bajo la direccin de los doctores:

J os Mara Franco Gmez

Anabela Cristina da Silva Naret Raymundo

Huelva, 2013

ISBN: 978-84-15633-77-8D.L.: H 59-2013


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NATURAL PIGMENTS AND MICROALGAL BIOMASS IN

COLLOIDAL FOOD SYSTEMS: RHEOLOGICAL

CHARACTERIZATION

Incorporacin de pigmentos naturales y microalgas en

sistemas coloidales alimentarios: caracterizacin del

comportamiento reolgico

Huelva, Marzo de 2012

Tesis Doctoral

Presentada por: Ana Paula dos Santos Batista

Dirigida por: Dr. Jos Mara Franco GmezDr. Anabela Cristina da Silva Naret Raymundo

UNIVERSIDAD DE HUELVA

Departamento de Ingeniera Qumica, Qumica Fsica yQumica Orgnica


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NATURAL PIGMENTS AND MICROALGAL BIOMASS

IN COLLOIDAL FOOD SYSTEMS: RHEOLOGICAL

CHARACTERIZATION

Incorporacin de pigmentos naturales y microalgas en

sistemas coloidales alimentarios: caracterizacin del

comportamiento reolgico

Memoria presentada por Ana Paula dos Santos Batista, licenciada en IngeneriaAgro-Industrial, para aspirar al grado de Doctor en Ingeniera Qumica conMencin Europea por la Universidad de Huelva.

Fdo: Ana Paula dos Santos Batista

La presente Tesis ha sido realizada en el Departamento de Ingeniera Qumica,Qumica Fsica y Qumica Orgnica de la Universidad de Huelva, bajo la direccin

del Dr. Jos Mara Franco Gmez y Dr. Anabela Cristina da Silva Naret MoreiraRaymundo, los cuales autorizan su presentacin:

Huelva,

Fdo: Dr. Jos Maria Franco Gmez Fdo: Dr. Anabela Raymundo


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ILMO. SR. PRESIDENTE DE LA COMISIN DE POSGRADO

Estudios de DoctoradoAUTORIZACIN PARA LA PRESENTACIN DE LA TESIS DOCTORAL

El Departamento Ingeniera Qumica, Qumica Fsica y Qumica Orgnica

como rgano responsable del Programa Oficial de Posgrado, o Programa de Doctorado:

Ingeniera de Fluidos Complejos

una vez examinado el informe del Director de la Tesis y utilizando el procedimiento acordado por su

Consejo ACUERDA: X AUTORIZAR (1) NO AUTORIZAR (2) la presentacin de la Tesis

Doctoral cuyos datos se indican a continuacin:

APELLIDOS Y NOMBRE DEL AUTOR/A DNI/PASAPORTE NAna Paula dos Santos Batista 11294096

TTULO DE LA TESIS

Incorporacin de pigmentos naturales y microalgas en sistemas coloidales alimentarios:caracterizacin del comportamiento reolgico

REA/S DE CONOCIMIENTO DE LA TESISIngeniera QumicaTecnologa de AlimentosDIRECTOR/ES

Jos Mara Franco GmezAnabela C. da Silva Naret Moreira Raymundo

Huelva, de de

El Director/a del Departamento(FIRMA Y SELLO)

Fdo. Jos Mara Franco Gmez

(1) Comunicar la autorizacin al doctorando y director/es de la tesis.(2) Remitir al doctorando/ y al director/es de la tesis un informe razonado.


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La presente Tesis Doctoral ha recibido la ayuda de la Fundao para a Cinciae a Tecnologia del Ministrio da Cincia e do Ensino Superior de Portugalmediante la concesin de la beca de doctorado SFRH/BD/21388/2005, y formaparte del proyecto de investigacin PTDC/AGR-ALI/65926/2006. Se agradece porla financiacin aportada.


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AGRADECIMENTOS

A realizao deste trabalho s foi possvel graas ao apoio de diversas pessoas e

entidades, aos quais gostaria de deixar o meu sincero agradecimento:

Professora Anabela Raymundo por ter acreditado em mim desde o incio, por

me ter proporcionado inmeras oportunidades de crescimento a nvel cientfico e

pessoal, pelo incentivo realizao deste trabalho de doutoramento, pela sua

orientao e amizade.

Ao Professor Jos Maria Franco por ter aceite ser meu orientador, pelos preciosos

ensinamentos e rigor cientfico que me transmitiu, pela total disponibilidade e atenoque sempre me dedicou, e por ter facilitado todos os processos burocrticos.

Doutora Lusa Gouveia pela sua colaborao e ensinamentos que me

permitiram descobrir as potencialidades das microalgas. Por todo o incentivo e

motivao na realizao deste trabalho, mas principalmente pela amizade e

compreenso demonstrada em momentos crticos, sem a qual no teria sido possvel

terminar este trabalho.

Doutora Cristiana Nunes pela sua preciosa ajuda e apoio cientfico que foi

determinante na realizao dos ensaios com gis, e pela amizade, incentivo e apoio

sempre presentes.

Professora Isabel de Sousa por todos os seus ensinamentos e amizade, pela sua

disponibilidade na discusso de resultados, pelo seu sentido crtico e dinamismo que

contribuiram de forma decisiva para a minha formao cientfica.

Doutora Narcisa Bandarra pela sua disponibilidade e apoio na determinaos

de perfil de cidos gordos e pela cedncia de microalgas produzidas no INRB-IPIMAR.

Aos Professores Antnio Guerrero e Felipe Cordobs por possibilitarem o acesso aos

Servios de Microscopia da Universidade de Sevilha, bem como por me acolherem e

disponibilizarem a utilizao dos recursos dos laboratrios do Departamento de Ing

Qumica.

Ao Professor Jos Empis que esteve na origem do tema desta tese, e de vrios

trabalhos associados, pela sua disponibilidade e apoio.

Ao Instituto Piaget-CIERT, pela disponibilizao de condies e meios tcnicos

necessrios realizao deste trabalho, incluindo o financiamento de algumasdeslocaes e estadias em Huelva e Sevilha, e a congressos nacionais e internacionais.


9/294

A todos os colegas que passaram pelo Instituto Piaget de Almada e pelo NIEAB,

pelo seu apoio e companheirismo, em especial Ftima Serralha por toda a ajuda e

amizade demonstrada. Patrcia Fradinho pela sua amizade e pelo apoio na realizao

de alguns ensaios, bem como Graa Soares, Paula Ribeiro, Ruth Mosca, Manuel

Resendes, Ana Miranda, Ricardo Antunes, Daniel Oliveira, entre outros estagirios que

passaram pelo NIEAB do Instituto Piaget e de uma maneira ou outra colaboraram neste

trabalho.

A todos os colegas da Universidade de Huelva e da Universidade de Sevilha pela

sua disponibilidade, tanto no apoio no laboratrio como por facilitarem questes

prcticas e burocrticas, mas especialmente pela amizade e companhia que fizeram

com que os perodos longe de casa fossem mais fceis.

Aos colegas da Unidade de Bioenergia do LNEG por me terem acolhido nesta

nova casa, em especial Doutora Paula Marques. Um agradecimento especial

Graa Gomes pela produo das microalgas utilizadas neste trabaho, Manuela Tom

e Doutora Beatriz Nobre pelo apoio na realizao de anlise de carotenides e ao

Doutor Alberto Reis pela produo de Ficocianina.

minha famlia, por todo o carinho demonstrado durante este perodo da minha

vida, por me terem sempre apoiado incondicionalmente, emocional e financeiramente,

e por serem sempre um exemplo para mim. Um agradecimento especial para a famliaMonteiro que h muito tempo passou a ser tambm a minha famlia.

A todos os amigos com quem pude partilhar os momentos melhores e piores deste

percurso, incluindo todos os que j foram citados, por me inspirarem e mostrarem que a

vida deve ser vivida em pleno, e que o conhecimento e o sucesso s se vislumbram se

tivermos humildade suficiente para retirar o melhor de cada pessoa e cada experincia.

Ao Carlos, a quem posso agradecer entre muitas outras coisas, a reviso do ingls

de toda a tese, o apoio na execuo grfica da tese, a companhia nos fins-de-semana

passados no laboratrio e em algumas viagens. Pelo apoio nos momentos mais difceis,

em que acreditou mais em mim do que eu prpria, e por ter estado sempre presente

para celebrar as minhas vitrias. Mais que tudo, agradeo por partilhar a sua vida

comigo e todos os dias me lembrar que existem cores novas a descobrir no mundo.

A todos, MUITO OBRIGADO!


10/294

Para o Carlos


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12/294

i

TABLE OF CONTENTS

TABLE OF CONTENTS.........i

LIST OF FIGURESvi

LIST OF TABLES.........xiii

RESUMEN...xv

ABSTRACT....xvii

RESUMEN DE LA TESIS EN ESPAOLxix

CHAPTER 1. INTRODUCTION...1

CHAPTER 2. LITERATURE REVIEW

2.1. Microalgae....5

2.1.1. Introduction........................................................................................................................5

2.1.2. Some microalgae species with potential application in the food industry.....7

2.1.2.1. Arthrospira(Spirulina) ................................7

2.1.2.2. Chlorella.............................8

2.1.2.3. Haematococcus pluvialis...............9

2.1.2.4. Diacronema vlkianum and Isochrysis galbana...102.1.3. Microalgae as food colouring agents..........................................................................11

2.1.3.1. Chlorophyll.11

2.1.3.2. Carotenoids...12

2.1.3.3. Phycobiliproteins..14

2.1.4. Microalgae as source of bioactive molecules..15

2.1.4.1. Fatty acids..16

2.1.4.2. Tocopherols and sterols..17

2.1.4.3. Proteins18

2.1.4.4. Polysaccharides192.1.4.5. Vitamins and Minerals.20

2.1.4.6. Antioxidants...20

2.1.4.7. Pharmaceuticals and other biologically active compounds.21

2.1.5. Microalgae in human nutrition21

2.1.5.1. Novel foods regulation...23

2.1.5.2. New trends in microalgae food applications..24

2.2. Colloidal Systems29

2.2.1. General Concepts..29

2.2.2. Food emulsions312.2.2.1. Introduction31


13/294

ii

2.2.2.2. Droplet size distribution...31

2.2.2.3. Emulsion formation..33

2.2.2.4. Main variables influencing the emulsification process.....34

2.2.2.5. Emulsion stability...36

2.2.2.5.1. Forces between particles...36

2.2.2.5.2. Destabilization mechanisms..38

2.2.2.6. Emulsion composition.39

2.2.2.7. Biopolymers as emulsion stabilizing agents..40

2.2.2.7.1. Proteins.41

2.2.2.7.2. Polysaccharides....42

2.2.3. Food gels..............44

2.2.3.1. Definition.44

2.2.3.2. Gel formation45

2.2.3.2.1. Types of gel structures.46

2.2.3.3. Protein gels.47

2.2.3.4. Polysaccharide gels....48

2.2.3.4.1. Kappa-carrageenan...49

2.2.3.4.2. Starch51

2.2.3.5. Mixed protein/polysaccharide gel systems.53

2.2.3.5.1. Co-solubility.53

2.2.3.5.2. Complexation54

2.2.3.5.3. Thermodynamic incompatibility...55

2.2.4. Vegetable proteins as emulsifying and gelling agents...562.2.4.1. Pea Protein.58

2.2.4.1.1. Pea protein as emulsifying agent.59

2.2.4.1.2. Pea protein as gelling agent.60

2.3. Rheology..62

2.3.1. Basic Concepts...62

2.3.1.1. Stress and deformation in simple shear.....63

2.3.1.2. Classification of rheological behaviours...66

2.3.1.2.1. Steady flow.....67

2.3.1.2.1.1. Newtonian flow..672.3.1.2.1.2. Non-Newtonian flow.68

2.3.1.2.2. Time-dependent flow behaviour.70

2.3.1.3. Viscoelasticity..............71

2.3.1.3.1. Linear viscoelasticity tests...71

2.3.1.3.1.1. Stress relaxation..71

2.3.1.3.1.2. Creep and recovery.72

2.3.1.3.1.3. Oscillatory tests...73

2.3.2. Emulsion Rheology..75

2.3.2.1. Factors affecting emulsions rheology762.3.2.2. Emulsion flow behaviour....76


14/294

iii

2.3.2.3. Emulsion linear viscoelasticity...77

2.3.2.4. Wall slip phenomena in emulsion rheological measurements...78

2.3.3. Gel Rheology...78

2.3.3.1. Strong gels and weak gels79

2.3.3.2. Gel point and sol-gel transition79

2.3.3.3. Evaluation of structure development during biopolymer gelation..81

2.3.3.3.1. Evaluation of structure loss during melting/softening of

biopolymer gels...82

2.3.3.4. Mixed Polymer gels..83

CHAPTER 3. PHYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF MICROALGAL BIOMASS

3.1. Introduction.85

3.2. Materials and Methods....86

3.2.1. Materials....86

3.2.1.1. Microalgae production.....86

3.2.2. Methods 87

3.2.2.1. Moisture..87

3.2.2.2. Mineral content88

3.2.2.3. Crude Protein88

3.2.2.4. Lipids....88

3.2.2.4.1. Total lipids88

3.2.2.4.2. Fatty acids profile..88

3.2.2.5. Carbohydrates..89

3.2.2.6. Pigments.....91

3.2.2.6.1. Carotenoids and chlorophylls...91

3.2.2.6.2. Phycocyanin..92

3.2.2.7. Themogravimetric analysis (TGA)93

3.2.2.8. Statistical analysis... .94

3.2.2.8.1. Analysis of Variance ANOVA.94

3.2.2.8.2. Factor Analysis Principal Components Analysis (PCA)94

3.3. Results and Discussion...95

3.3.1. Proximate composition.....95

3.3.2. Pigments analysis....99

3.3.3. Thermal analysis.102

3.3.4. Principal Component Analysis..105

3.4. Conclusions110


15/294

iv

CHAPTER 4. MICROALGAL BIOMASS AND NATURAL PIGMENTS IN OIL-IN-WATER PEA PROTEIN-

STABILIZED EMULSIONS

4.1. Introduction...113

4.2. Materials and Methods..116

4.2.1. Materials..116

4.2.2. Methods...116

4.2.2.1. Preparation of oil-in-water emulsions.........................................................116

4.2.2.2. Colour measurement...................................................................................117

4.2.2.3. Texture Profile Analysis.................................................................................118

4.2.2.4. Droplet Size Distribution................................................................................119

4.2.2.5. Rheological measurements........................................................................119

4.2.2.5.1. Rheometers.119

4.2.2.5.2. Dynamic oscillatory tests............................................................120

4.2.2.5.3. Steady-state flow tests................................................................120

4.2.2.5.4. Transient shear f low tests............................................................121

4.2.2.6. Fluorescence Microscopy...........................................................................121

4.2.2.7. Statistical analysis.........................................................................................122

4.3. Results and Discussion.123

4.3.1. Emulsions coloured with lutein and phycocyanin.....................................................123

4.3.1.1. Colour stability123

4.3.1.2. Texture analysis...125

4.3.1.3. Droplet size distribution.126

4.3.1.4. Linear viscoelastic behaviour.127

4.3.1.5. Steady-state flow...132

4.3.1.6. Transient flow...137

4.3.1.7. Structural considerations.139

4.3.2. Emulsions with microalgal biomass..............................................................................143

4.3.2.1. Effect of microalgal biomass concentration on the colour and texture of

oil-in-water emulsions..143

4.3.2.2. Fat mimetic capacity of microalgal biomass in oil-in-water emulsions.147

4.4. Conclusions152

CHAPTER 5. MICROALGAL BIOMASS AND NATURAL PIGMENTS IN PEA PROTEIN MIXED GEL

SYSTEMS

5.1. Introduction..............155

5.2. Materials and Methods..157

5.2.1. Materials..157

5.2.2. Methods...157

5.2.2.1. Gel preparation.157

5.2.2.2. Colour and pigment analysis.158


16/294

v

5.2.2.3. Fatty acid profile159

5.2.2.4. Texture profile analysis..159

5.2.2.5. Rheological tests159

5.2.2.6. Fluorescence microscopy...160

5.2.2.7. Statistical analysis...160

5.3. Results and Discussion.161

5.3.1. Physical and chemical characterization of microalgal and natural pigment

Gels.161

5.3.1.1. Colour and pigment analysis161

5.3.1.2. Fatty acids profile..163

5.3.1.3. Texture profile..164

5.3.2. Rheological characterization of microalgae gels..166

5.3.3. Effect of gel setting conditions on the linear viscoelasticity of Spirulina and

Haematococcusgels.171

5.3.3.1. Effect of processing temperature and time.........171

5.3.3.2. Effect of heating and cooling rates...........................................................175

5.3.4. Binary systems - Microalgal biomass interaction in biopolymer gelled systems.181

5.3.4.1. Microalgae / Pea protein systems181

5.3.4.2. Microalgae / -Carrageenan systems.184

5.3.4.3. Microalgae /Starch systems..186

5.3.4.4. Microalgae / Pea Protein / -Carrageenan systems..188

5.3.4.5. Microalgae / Pea Protein / Starch systems190

5.4. Conclusions193

CHAPTER 6. GENERALCONCLUSIONS195

CHAPTER 7. REFERENCES199

APPENDICES

A. Publications in scientific journals and books with peer review

B. Presentations in scientific meetings and resulting publications in proceedings/abstracts books


17/294

vi

LIST OF FIGURES


Figure 2.1. Microalgae cultivated in open ponds systems. a) Dunaliella by Cognis at Hutt Lagoon

(Australia); b) Arthrospira in raceway ponds by Cyanotech (Hawaii, USA); and Earthrise Farms

(California, USA)...6

Figure 2.2. Chlorellasp. growing in tubular photobioreactors (Kltze, Germany)..7

Figure. 2.3.Arthrospira(Spirulina) sp...8

Figure. 2.4.Chlorellavulgarisgreen and orange (carotenogenic) microalga....9

Figure. 2.5. Haematococcus pluvialis a) green vegetative cells; b) encysted carotenogenic cells; c)

cultivated in open raceway ponds.....10

Figure. 2.6. Isochrysisgalbana(a) and Diacronema vlkianum (b).11

Figure 2.7. Chemical structures of chlorophyll aand b.12

Figure 2.8. Chemical structures of some carotenoids. a) lycopene, b) -carotene, c) astaxanthin, d)

lutein, e) canthaxanthin13

Figure 2.9. Chemical structure of a phycocyanobilin attached by thioether linkage to the

apoprotein..15

Figure 2.10. Chemical structure of polyunsaturated fatty acids of high pharmaceutical and nutritional

value..16

Figure 2.11. Structure of -tocopherol (vitamin E)17

Figure 2.12. Basic structure of sterols....18

Figure 2.13. Aztecs harvesting algae from lakes in the Valley of Mexico (a); Kanembu women gathering

Spirulina from area around Lake Chad (b).(Source: Furst (1978)).22Figure 2.14. Examples of commercial microalgae based food products26

Figure 2.15. Short-dough biscuits with Chlorella vulgaris (a) and Isochrysis galbana (b) microalgal

biomass addition (Gouveia et al., 2007; 2008).27

Figure 2.16. Durum wheat semolina pastas with Chlorella vulgaris, green (a) and carotenogenic (b),

microalgal biomass addition (Fradique et al., 2010)..28

Figure 2.17. Balance between droplets rupture and coalescence during emulsification (Adapted from

McClemments, 1999)33

Figure 2.18. Schematic representation of emulsification devices: high-speed blender (a), colloid mills

(b), highpressure valve homogenizers (c), liquid jet generators (d), microfluidizer (e), membrane

homogenizer (f) (Adapted from McClemments, 1999)35

Figure 2.19. Mechanisms of emulsion instability (Adapted from McClements, 1999)...38

Figure 2.20. Schematic representation of the stages involved in biopolymer gel formation.45

Figure 2.21. Schematic representation of random (a) and ordered (b) gels. (Adapted from Renkema,

2001)..46

Figure 2.22. Schematic representation of the relation between protein gel appearance and

electrostatic repulsion (Adapted from Doi and Kitabatake, 1997)48

Figure 2.23. -Carrageenan molecular structure.49


18/294

vii

Figure 2.24. Schematic representation of -carrageenan gelling mechanism (adapted from de Vries,

2001)..50

Figure 2.25. Amylose (a) and amylopectin (b) chemical structure51

Figure 2.26. Schematic representation of starch gelatinization..52

Figure 2.27. Types of protein-polysaccharide interaction. Cp protein concentration; Cps

polysaccharide concentration (Adapted from Tolstoguzov, 1991)...53

Figure 2.28. Compression deformation caused by uniaxial/normal stress (a); Shear deformation caused

by shear/tangential stress (b).63

Figure 2.29. Velocity profile in simple shear deformation (two plate model)..65

Figure 2.30. Flow (a) and viscosity (b) curves for typical Newtonian and non-Newtonian fluids..68

Figure 2.31. Schematic representation of a typical viscosity curve for shear-thinning fluid, with three

differentiated zones (I, II, III)69

Figure 2.32. Typical stress relaxation test curves...70

Figure 2.33. Typical creep and recovery test curves..70

Figure 2.34. Typical dynamic sinusoidal deformation curves in respect to applied sinusoidal stress in small

amplitude oscillatory shear tests (SAOS).73

Figure 2.35. Typical flow curve of a shear-thinning emulsion and respective structural changes (Adapted

from McClements, 1999).77

Figure 2.36. Typical dynamic viscoelastic behaviour (mechanical spectra) presented by flocculated (a)

and non-flocculated (b) emulsions (G, G)..78

Figure 2.37. Typical dynamic viscoelastic behaviour (mechanical spectra) presented by a stronG(a)

and a weak (b) gel (G, G)...79

Figure 2.38. CLSM images of pea protein (P) / -carrageenan (C) / starch (S) gels with differentcomposition: a) 2.0%P-0.15%C-2.5%S; b) 2.0%P-0.15%C-5%S (Nunes et al., 2006b)84

Figure 2.39. Schematic representation of pea protein/-carrageenan/starch ternary gel system (Nunes,

2006)..84


Figure 3.1.Chlorella vulgarisa) and Diacronema vlkianum b) growing in airlift bioreactors.87

Figure 3.2. Polyethylene bags used for Diacronema vlkianum growth (a) and Chlorella vulgariscarotenogenesis (b); Outdoor raceway ponds for Chlorellagrowth (c).87

Figure 3.3. Example of a chromatogram obtained for Diacronema vlkianum fatty acids methyl esters,

determined by GC-FID.89

Figure 3.4. Anthrone-Sugar blue-green complex. (a) glucose standards: 0, 40, 80, 120, 160, 200 g/ml (b)

Spirulina, Chlorellagreen, Chlorellaorange, Haematococcus, Diacronemaand Isochrysis90

Figure 3.5. Calibration curve applied to the anthrone colorimetric method, using glucose standard

solutions90

Figure 3.6.Haematococcus pluvialisand Chlorella vulgaris(orange and green) acetone extracts used

for total pigment spectrophotometric determination91


19/294

viii

Figure 3.7. Example of a chromatogram obtained for Haematococcus pluvialis carotenoid profile

determined by RP-HPLC..92

Figure 3.8. Phycocyanin extracts from Spirulina maxima..92

Figure 3.9. Schematic representation of a Thermogravimetric analysis device (a). TGA-Q50 equipment

with furnace down (b) and up (c)...93

Figure 3.10. Proportion of total saturated (SFA), monounsaturated (MFA), and polyunsaturated (PUFA) 3

and 6 fatty acids in microalgae lipids...96

Figure 3.11. Comparative unsaturation indexes (UI) of total and EPA+DHA fatty acids of different

microalgae..99

Figure 3.12. UV-VIS absorption spectra of microalgae acetone extracts100

Figure 3.13. UV-absorption spectra of phycocyanin extract from Spirulina. C-PC: c-phycocyanin; APC:

allophycocyanin..102

Figure 3.14. TGA (a) and DTG (b) curves of microalgae samples103

Figure 3.15. Projection of the variables in the factorial plan defined by factor 1 and factor 2..108

Figure 3.16. Projection of the microalgae samples in the factorial plan defined by factor 1 and factor

2.............................................................................................................................................................................109


STABILISED EMULSIONS

Figure 4.1. Representation of colour solid for CIELAB colour space (a) Colorimeter CR-300 Minolta (b).117

Figure 4.2. Texturometer (a). Typical force vs. time curves from TPA tests, with texture attributes (b)...118

Figure 4.3. Controlled-stress rheometer from Haake (a); and respective cone-plane geometry system

measuring an emulsion sample (b)120

Figure 4.4. Emulsions coloured with different lutein concentration (a); evolution of chromatic

coordinates a*(b), and b*(c) along time..123

Figure 4.5. Emulsions coloured with different phycocyanin concentration (a); evolution of chromatic

coordinates a*(b), and b*(c) along time..124

Figure 4.6. Emulsions coloured with different proportions of lutein (L) and phycocyanin (P), with 0.5% total

pigment concentration (a); evolution of chromatic coordinates a*(b), and b*(c) along time...124

Figure 4.7. Firmness of pea protein stabilized o/w emulsions, at different lutein (a) and phycocyanin (b)

concentrations; as well as with different proportions of both pigments (total pigment concentration:

0.50% w/w) (c)..126

Figure 4.8. Droplet size distribution curves (a) and respective Sauter mean diameter of o/w emulsions

with different lutein (b) or phycocyanin (c) concentrations, and different proportions of both pigments

(total pigment concentration: 0.50% w/w) (d)...127

Figure 4.9. Linear viscoelastic range of o/w pea protein emulsions without pigment addition (a), and

with 0.75% lutein (b). The microscope photographs retrieved by the RheoScope equipment represent

the emulsions microstructure changes occurring at different shear values during the test128

Figure 4.10. Linear viscoelastic range of o/w pea protein emulsions with 0.75% phycocyanin (a) and

0.50% total pigment (lutein and phycocyanin in the same proportion) (b). The microscope


20/294

ix

photographs retrieved by the RheoScope equipment represent the emulsions microstructure changes

occurring at different shear values during the test...129

Figure 4.11. Mechanical spectra for o/w emulsions with different lutein (L) concentrations, and

respective Plateau modulus (G0N).130

Figure 4.12. Mechanical spectra for o/w emulsions at different phycocyanin (P) concentrations, and

respective Plateau modulus (G0N).131

Figure 4.13. Mechanical spectra for o/w emulsions with different phycocyanin (P) and lutein (L)

proportions (total pigment concentration: 0.50% w/w) and respective Plateau modulus (G0N)...131

Figure 4.14. Steady-state flow curves for o/w emulsions with different lutein (L) concentrations, and

respective limiting viscosity (0)...132

Figure 4.15. Steady-state flow curves for o/w emulsions at different phycocyanin (P) concentrations, and

respective limiting viscosity (0)...133

Figure 4.16. Steady-state flow curves for o/w emulsions at different phycocyanin (P) and lutein (L)

proportions (total pigment concentration: 0.50% w/w) and respective limiting viscosity (0).133

Figure 4.17. Steady-state flow curves of o/w pea protein emulsions without pigment addition (a), and

with 0.75% lutein (b). The microscope photographs retrieved by the RheoScope equipment, represent

the emulsions microstructure changes occurring at different stress values during the test134

Figure 4.18. Steady-state flow curves of o/w pea protein emulsions with 0.75% phycocyanin (a) and

0.50% total pigment (lutein and phycocyanin in the same proportion) (b). The microscope photographs

retrieved by the RheoScope equipment, represent the emulsions microstructure changes occurring at

different stress values during the test.135

Figure 4.19. Comparison between steady-state and complex viscosities and relative deviation of the

Cox-Merz rule for o/w pea protein emulsions without pigment addition (control), with 0.75% lutein, 0.75%phycocyanin and 0.50% total pigment (lutein and phycocyanin in the same proportion) addition136

Figure 4.20. Stress growth experiments at constant shear rates (0.01, 0.1, 1 and 10 s-1) and Leider-Bird

model fitting for o/w pea protein emulsions without pigment addition (control), with 0.75% lutein, with

0.75% phycocyanin and 0.50% total pigment (lutein and phycocyanin in the same proportion)

addition..137

Figure 4.21. Equilibrium shear stress , stress overshoot max, time for the overshoot tmax and amount of

overshoot S+ for o/w pea protein emulsions without pigment addition (control), with 0.75% lutein, 0.75%

phycocyanin and 0.50% total pigment (lutein and phycocyanin in the same proportion) addition138

Figure 4.22. Microscope photographs of an o/w pea protein emulsion with 0.75% lutein, retrieved by theRheoScope equipment during a stress growth experiment at constant shear rate (1 s-1), before stress

overshoot (a), during (b) and immediately after (c) stress overshoot, and at equilibrium time (d)..139

Figure 4.23. Oil-in-water pea protein stabilized emulsions coloured with different concentrations of

Spirulina maxima (a), Chlorella vulgarisgreen (b), Chlorella vulgarisorange (c) and Haematococcus

pluvialis(d) biomass143

Figure 4.24. Evolution of a*(a) and b*(b) values of o/w emulsions coloured with different concentrations

of Spirulina maximabiomass, over time...143


of Chlorella vulgarisgreen biomass, over time..144


21/294

x


of Chlorella vulgarisorange biomass, over time145


of Haematococcus pluvialisbiomass, over time...145

Figure 4.28. Firmness of o/w emulsions coloured with different concentrations of Spirulina maxima,

Chlorella vulgarisgreen, Chlorella vulgarisorange and Haematococcus pluvialisbiomass..147

Figure 4.29. Mechanical spectra of o/w emulsions with 3% pea protein and 2% of Spirulina maxima(Sp),

Haematococcus pluvialis(Hp), Chlorella vulgarisgreen (Cv_gr) and orange (Cv_or) microalgal biomass,

for different oil content and respective values of G0N.148

Figure 4.30. Flow curves of o/w emulsions with 3% pea protein and 2% of Spirulina maxima (Sp),

Haematococcus pluvialis(Hp), Chlorella vulgarisgreen (Cv_gr) and orange (Cv_or) microalgal biomass,

for different oil content and respective values of 0150

Figure 4.31. Fluorescence microscopy images of o/w emulsions with 3% pea protein and 65% oil (a),

and 2% Spirulina maxima(b), Chlorella vulgarisgreen (c), Chlorella vulgarisorange (d), Haematococcus

pluvialis(e). (DAPI filter, 10x).151


SYSTEMS

Figure 5.1. Firmness of gels prepared with different Pisane protein isolates, compared to a commercial

gelled dessert...157

Figure 5.2.Gel preparation: ingredient dispersion at 300 rpm (a); thermal treatment in thermally

controlled water bath (b). Samples were covered with aluminium foil during thermal treatment to

prevent water loss due to evaporation (c).158

Figure 5.3. Gel sample preparation for colour measurement159

Figure 5.4. Vegetable gelled puddings coloured with commercial pigments (a): canthaxanthin, lutein, -

carotene, phycocyanin, astaxanthin (left to right); and microalgal biomass (b): Control, Chlorella

vulgaris (green and carotenogenic), Haematococcus pluvialis (carotenogenic), Spirulina maxima,

Diacronema vlkianum (left to right); at 0.75% incorporation level...161

Figure 5.5. Temperature effect on total pigments content of gelled desserts with 0.75% Spirulina(a) and

Diacronema microalgal biomass. Bold line represents the amount of pigments added to the gel,considering the microalga pigment content (Spirulina: 0.9%; Diacronema: 2.4%).163

Figure 5.6. Firmness of gels with, different concentrations of natural pigments (a) and microalgal biomass

(b), prepared at 90C/5min.165

Figure 5.7. Effect of temperature on the firmness of gels with Spirulina and Diacronema (0.75%

microalgal biomass), and the control gel...165

Figure 5.8. Cooling curves from 40C to 5C at 0.6C/min, of pea/-carrageenan/starch gels with 0.75%

microalgal biomass addition. G(filled symbol), G(open symbol)166

Figure 5.9. Method for determination of gelation temperature. G(filled symbol), G(open symbol)167


22/294

xi

Figure 5.10. Maturation kinetic curves at 5C, of pea/-carrageenan/starch gels () with 0.75%

microalgal biomass addition: Chlorella vulgaris green () and orange (), Haematococcus pluvialis

(), Spirulina maxima(), and Diacronema vlkianum (). G(filled symbol), G(open symbol).167

Figure 5.11. Fitting of eq. 5.5 to experimental maturation kinetic curves, represented as Gvs. k (1/t), for

Geqdetermination.168

Figure 5.12. Mechanical spectra of pea/-carrageenan/starch gels () with 0.75% microalgal biomass

addition: Chlorella vulgarisgreen () and orange (), Haematococcus pluvialis(), Spirulina maxima

(), and Diacronema vlkianum (). G(filled symbol), G(open symbol)...170

Figure 5.13.Heating curve from 5 to 80C and cooling curve from 80 to 5C at 0.5C/min of pea/-

carrageenan/starch gels with 0.75% microalgal biomass addition170

Figure 5.14. Evolution of Gand G, of pea/-carrageenan/starch suspensions () with Haematococcus

() and Spirulina (), during thermal treatment, performed at different temperature/time conditions

(70C/5min, 80C/5min, 90C/min, 90C/15min and 90C/30min). (Heating/cooling rates: 5.0C/min). G

(closed symbol), G(open symbol), T(line).....................................................................................................172

Figure 5.15. Maturation kinetic curves at 5C, of pea/-carrageenan/starch gels with Haematococcus

and Spirulina, after thermal treatment at 70C/5min (), 80C/5min (), 90C/5min (), 90C/15min ()

and 90C/30min (). (Heating/cooling rates: 5.0C/min). G(closed symbol), G(open symbol).174

Figure 5.16. Evolution of Gand G, of pea/-carrageenan/starch suspensions () with Haematococcus

() and Spirulina (), during thermal treatment (90C/5min), performed at the same heating and

cooling rates ( 0.5, 1.0 and 5.0C/min). G(closed symbol), G(open symbol), T(line)..........................176


and Spirulina, after thermal treatment (90C/5min)performed at the same heating and cooling rates,

0.5C/min (), 1.0C/min () and 5.0C/min (). G(closed symbol), G(open symbol)...177Figure 5.18. Evolution of Gand G, of pea/-carrageenan/starch suspensions () with Haematococcus

() and Spirulina(), during thermal treatment (90C/5min), performed at different cooling rates (-0.5, -

1.0, -5.0 and -10.0C/min). G(closed symbol), G(open symbol), T(line)..................................................178


and Spirulina, after thermal treatment (90C/5min) performed at different cooling rates, -0.5C/min (), -

1.0C/min (), -5.0C/min () and -10.0C/min (). G(closed symbol), G(open symbol)..179

Figure 5.20. Evolution of the viscoelastic functions G(closed symbol) and G(open symbol), of 12% pea

protein dispersions along thermal treatment (T - line)..181

Figure 5.21. Fluorescence microscopy images of 12% pea protein gel systems (a-b) with 2.25% Spirulina(c-d) and Haematococcus(e) microalgal biomass addition (DAPI filter).182

Figure 5.22. Maturation kinetics curves (a) and mechanical spectra (b) at 5C, of 12% pea protein gel

systems () with 2.25% Spirulina() and Haematococcus() microalgal biomass addition. G (closed

symbol), G(open symbol)..183

Figure 5.23. Maturation kinetics curves (a) and mechanical spectra (b) at 5C, of 0.75% -carrageenan

gel systems () with 3.75% Spirulina () and Haematococcus () microalgal biomass addition. G

(closed symbol), G(open symbol)...185

Figure 5.24. Fluorescence microscopy images of 0.75% -carrageenan gel systems with 3.75% Spirulina

(a-b) and Haematococcus(c-d) microalgal biomass addition (DAPI & TRITC filters)186


23/294

xii

Figure 5.25. Evolution of G and G along thermal treatment and 24 h maturation at 5C (a) and

mechanical spectra (b) at 5C, of 5% starch gel systems () with 1.5% Spirulina() and Haematococcus

() microalgal biomass addition. G(closed symbol), G(open symbol), T(line).187

Figure 5.26. Fluorescence microscopy images of 5% starch gel systems (a) with 1.5% Spirulina(b) and

Haematococcus(c) microalgal biomass addition (DAPI filter)188

Figure 5.27. Maturation kinetics curves (a) and mechanical spectra (b) at 5C, of 4 % pea protein/ 0.15%

-carrageenan gel systems () with 0.75% Spirulina () and Haematococcus() microalgal biomass

addition. G(closed symbol), G(open symbol)..189

Figure 5.28. Fluorescence microscopy images of 4% pea protein/0.15% -carrageenan gel systems (a)

with 0.75% Spirulina(b) and Haematococcus(c) microalgal biomass addition (DAPI filter)..190

Figure 5.29. Evolution of G and G along thermal treatment and 24 h maturation at 5C (a) and

mechanical spectra (b) at 5C, of 6% pea protein/3.75% starch gel systems () with 1.125% Spirulina()

and Haematococcus () microalgal biomass addition. G (closed symbol), G (open symbol), T

(line).191

Figure 5.30. Fluorescence microscopy images of 6% pea protein/3.75% starch gel systems (a) with

1.125% Spirulina(b) and Haematococcus(c) microalgal biomass addition (DAPI filter).192


24/294

xiii

LIST OF TABLES


Table 2.1. Major microalgae commercialized for human nutrition (adapted from Pulz and Gross, 2004;

Spolaore et al., 2006 and Hallmann, 2007)....25

Table 2.2. Main types of colloidal systems (adapted from Everett, 1988 and Shaw, 1992).29

Table 2.3. Average particle size diameters used to describe colloidal systems.32

Table 2.4. Types of rheological behaviours67


Table 3.1. Growth medium composition for Spirulina(S), Chlorella(Sorokin and Krauss), Haematococcus

(Bold Basal Modified), Isochrysisand Diacronema(Wallerstein and Miquel).86

Table 3.2. Proximate composition of microalgal biomass.95

Table 3.3. Mineral composition of microalgal biomass..95

Table 3.4. Main fatty acids present in the microalgae biomass (mg/100 g)...97

Table 3.5. Pigment composition of microalgae acetone extracts...101

Table 3.6. Parameters from TGA measurements on microalgal samples...104

Table 3.7. Correlation matrix of variables.106

Table 3.8. Eigenvalues Extraction of Principal Components...107Table 3.9. Factor Loadings107


STABILIZED EMULSIONS

Table 4.1. Total colour difference (E*) of emulsions with lutein (L), phycocyanin (P), and both pigments

in different proportions (total pigment concentration: 0.50% w/w), in respect to the initial colour (week

0)..125

Table 4.2. Total colour difference (E*) of emulsions with microalgal biomass addition, in respect to the

initial colour (week 0).146


SYSTEMS

Table 5.1. Colour parameter values ofgels coloured with commercial pigments.162

Table 5.2. Colour parameter values of gels coloured with microalgae biomass.....................................162


25/294

xiv

Table 5.3. Total colour difference (E*) between gels with 0.75% Spirulinaand Diacronemamicroalgal

biomass prepared at different temperatures...................................................................................................163

Table 5.4. Fatty acid composition (percentage of total fatty acids) of gels prepared with Spirulina(Sp)

and Diacronema(Di), at 75C and 90C; and control gel (without alga addition)...164

Table 5.5. Parameters of exponential decay and calculated Geq (Eq. 5.5), experimental Gvalues after

24 h maturation (G24h,), and maturation index (G24h/Geq)100 for pea/-carrageenan/starch gels with

0.75% microalgal biomass addition169

Table 5.6. Gelation temperature (Tgel), parameters of exponential decay, and calculated Geq(Eq. 5.5),

experimental Gvalues after 24 h maturation (G24h), and maturation index (G24h/Geq)100 of pea/-

carrageenan/starch gels with Haematococcusand Spirulina, after thermal treatment performed at

different temperature/time conditions. (Heating/cooling rates: 5.0C/min).173



carrageenan/starch gels with Haematococcus and Spirulina, after thermal treatment (90C/5min)

performed at the same heating and cooling rates..177



carrageenan/starch gels with Haematococcus and Spirulina, after thermal treatment (90C/5min)

performed at different cooling rates.180


26/294

xv

RESUMEN

Las microalgas representan una fuente alternativa e innovadora de ingredientes y

colorantes naturales que pueden ser utilizados en el desarrollo de nuevos productos

alimenticios. En las clulas de microalgas estn naturalmente encapsulados compuestos

biolgicamente activos (ej.: carotenoides), capaces de resistir las severas condiciones

implicadas en los procesos tecnolgicos de la industria alimentaria. La adicin de

biomasa de microalgas puede tambin impartir algunas modificaciones

microestructurales en el producto alimenticio, que se reflejan en cambios de textura y

otras propiedades sensoriales.

El objetivo de esta tesis fue estudiar la incorporacin de pigmentos naturales y biomasa

de microalgas como agentes colorantes en sistemas coloidales alimentarios - emulsiones

y geles. El impacto de estos colorantes naturales en los diferentes sistemas coloidales se

estudi, adems, desde un punto de vista reolgico y su relacin con las caractersticas

microestructurales y fsico-qumicas. La incorporacin de esto colorantes naturales y/o

biomasa de microalgas, beneficiosos para la salud, result ser un procedimiento eficaz e

innovador, que al mismo tiempo permite el desarrollo de productos con coloraciones

originales y estables y un fortalecimiento microestructural del sistema coloidal, como seobserva a travs de su respuesta reolgica.

Se llev a cabo una caracterizacin de la composicin de la biomasa de seis microalgas

diferentes: Spirulina maxima, Chlorella vulgaris (verde y carotenognica - naranja),

Haematococcus pluvialis (carotenognica), Diacronema vlkianum y Isochrysis galbana

(Sm, Cv, CVo, Hp, Dv y Ig, respectivamente). Las principales diferencias en la

composicin de las diferentes biomasas estn relacionadas con la induccin de procesos

de carotenognesis en CVo y Hp. Sin embargo, cada microalga presenta un perfil de

nutrientes tpico, que permite la seleccin de unas caractersticas fsico-qumicas para

aplicaciones alimentarias especficas.

Se adicionaron pigmentos naturales, lutena y ficocianina, y biomasa de microalgas - Sm,

Cv, CVoy Hp -a emulsiones estabilizadas con protena de guisante. Lutena y ficocianina

causaron efectos marcadamente diferentes, conforme a su afinidad por la fase acuosa u

oleosa, respectivamente. La lutena modifica la naturaleza de la fase oleosa originando,


27/294

xvi

emulsiones con propiedades reolgicas caractersticas de microestructuras ms dbiles,

mientras que la ficocianina tiene una influencia significativa sobre la Reologa de la

emulsin, con parmetros reolgicos que aumentan linealmente con su concentracin.

La adicin de biomasa de microalgas fue beneficiosa en trminos de permitir una

reduccin del contenido en aceite de las emulsiones, sin alterar sus propiedades

reolgicas y texturales. Estos resultados sugieren que las microalgas pueden utilizarse

como agente mimtico de grasa, adems de las ventajas que presentan como agentes

colorantes.

Los geles de protena de guisante/-carragenato/almidn fueron utilizados para estudiar

el impacto de la adicin de biomasa de microalgas (Sm, Cv, CVo, Hpy Dv) y pigmentos

naturales (astaxantina, -caroteno, cantaxantina, lutena y ficocianina). Los geles

obtenidos tienen colores interesantes, evidenciando adems una buena resistencia

trmica de los pigmentos naturales y cidos grasos. La incorporacin de biomasa de

microalgas parece beneficiosa, especialmente de Hp, en cuanto que produce un

fortalecimiento estructural de los geles, con propiedades reolgicas mejoradas. Este

efecto se ha relacionado con su alto contenido en grasa, teniendo en cuenta que las

gotas de grasa pueden actuar como fillers activos incorporados en la matriz de gel. Por

el contrario, Sm produce una drstica reduccin en los parmetros reolgicos de losgeles. Esta alga parece inhibir el proceso de gelatinizacin del almidn, lo que podra

estar relacionado con una competicin por el agua por parte de las molculas de

protenas Sm que impiden la hidratacin de los grnulos de almidn. Las propiedades

viscoelsticas lineales de los geles fueron altamente dependientes de las condiciones de

gelificacin, combinacin de tiempos y temperaturas aplicadas y velocidades de

calentamiento/enfriamiento. Para todos los sistemas microalga/biopolmero estudiados,

se observ que protenas y polisacridos, solos o en combinaciones binarias, son los

principales responsables de la formacin de la estructura del gel y del comportamiento

reolgico resultante. Las microalgas parecen estar embebidas en la red de gel

originando microestructuras ms densas con mejores parmetros reolgicos en la

mayora de los casos.

Palabras clave:microalgas; colorantes naturales; sistemas coloidales; emulsiones aceite-

en-agua; geles; Reologa; viscoelasticidad lineal.


28/294

xvii

ABSTRACT

Microalgae represent an alternative and innovative source of natural colouring

ingredients that can be used for developing novel food products. Biologically active

compounds (e.g. carotenoids) are naturally encapsulated within microalgal cells being

able to resist harsh technological conditions involved in food technology processes.

Microalgal biomass can also impart some microstructural modifications on the food

product, reflected by texture and sensorial changes.

The aim of this thesis was to study the addition of natural pigments and microalgal

biomass as colouring agents in model colloidal food systems emulsions and gels. The

impact of these natural colourings on different colloidal systems was studied through a

rheological perspective i.e. by monitoring changes in the rheological behaviour, related

to the microstructural and physicochemical characteristics. This proved to be an efficient

and innovative procedure which simultaneously enables the development of products

with original and stable colourations, via health-beneficent natural pigments, and

microstructural reinforcement as observed through the rheological response of these

colloidal systems.

The biomass profile of six microalgae was studied: Spirulina maxima, Chlorella vulgaris

(green and after carotenogenesis - orange), Haematococcus pluvialis (carotenogenic),

Diacronema vlkianum and Isochrysis galbana(Sm, Cv, Cvo, Hp, Dvand Ig, respectively).

The major differences in physicochemical composition were found to be related to

inducting carotenogenesis process in Cvo and Hp. Nevertheless, each microalga

presented a typical biomass nutrient profile allowing the selection of desired

physicochemical characteristics for specific food technology applications.

Pea protein-stabilized oil-in-water emulsions were coloured with natural pigments lutein

and phycocyanin and microalgal biomass Sm, Cv, Cvo and Hp. Lutein and

phycocyanin imparted markedly different effects, according to the affinity to the

aqueous or to the oil phase. Lutein addition modified the oil phase nature originating

emulsions with rheological properties typical of much weaker microstructures, while

phycocyanin exerted a significant influence on the emulsions rheology, with rheological

parameters increasing linearly upon its concentration. The addition of microalgal biomass


29/294

xviii

was beneficial in terms of enabling lesser oil contents for the emulsions, without disturbing

their rheological and textural properties. These results support the potential use of

microalgae material as a fat mimetic besides the advantages as colouring agents.

Pea protein/-carrageenan/starch gels were used for studying the impact of adding

microalgal biomass (Sm, Cv, Cvo, Hp and Dv) and natural pigments (astaxanthin, -

carotene, canthaxanthin, lutein and phycocyanin). Gels with interesting colours were

attained also evidencing a good thermal resistance of natural pigments and fatty acids.

Microalgal biomass incorporation seemed beneficial, especially for Hp, which promoted a

structural reinforcement expressed by improved gel rheological properties. This could be

related to its high fat content considering that fat droplets can act as active filler particles

embedded in the gel matrix. However, Sm addition promoted a drastic reduction on the

gels rheological parameters. This alga seems to inhibit the starch gelatinization process,

which could be related to a competition for water binding sites by Sm protein molecules

hindering starch granules hydration. Linear viscoelastic properties were highly dependent

on gel setting conditions, i.e. time and temperature processing conditions and

heating/cooling rates. For all the studied microalga/biopolymer systems, it was observed

that protein and polysaccharide biopolymers, alone or in binary combinations, are the

main responsible for the formation of the gel structure and resulting rheological behaviour.Microalgae seem to be embedded in the gel network originating denser microstructures

with improved rheological parameters in most cases.

Keywords: microalgae; natural colourants; colloidal systems; oil-in-water emulsions; gels;

rheology; linear viscoelasticity.


30/294

xix

RESUMEN DE LA TESIS EN ESPAOL

I Introduccin

La industria alimentaria moderna actualmente tiende a un aumento de productos ms

baratos, sanos y aceptables por parte del consumidor. El uso de ingredientes naturales,

como los cidos grasos poliinsaturados (PUFA) y pigmentos antioxidantes, con un alto

impacto en las propiedades funcionales, es importante a fin de reducir la incidencia de

enfermedades crnicas, que son fuertemente considerados de importancia capital en

Europa, donde los costos asociados al envejecimiento y bienestar de la poblacin son

cruciales para la gestin de los recursos pblicos.

La apariencia de la comida es, entre otros, un factor que define la calidad y la primera

impresin que el consumidor obtiene directamente de los alimentos. El color, como un

aspecto de la apariencia, juega un papel importante en la aceptabilidad de un

producto alimenticio, siendo determinante en su identificacin, como un indicador de la

calidad, frescura, estado de conservacin, la expectativa de sabor y valor comercial. La

consecucin de un color adecuado, de acuerdo con las expectativas del consumidor

sobre el producto, se logra generalmente mediante el uso de colorantes. En la industriaalimentaria, estos compuestos se utilizan en productos alimenticios incoloros, as como en

la compensacin de la prdida de color debido a las condiciones de procesado (por

ejemplo, altas temperaturas y presiones).

Los colorantes sintticos son percibidos por los consumidores como indeseables y

perjudiciales, y algunos de ellos son considerados responsables de reacciones alrgicas o

de intolerancia. En cuanto a estas preocupaciones, la Comisin Europea ha pedido a la

EFSA (European Food Safety Authority) volver a evaluar todos los aditivos alimentarios

autorizados en la actualidad en la Unin Europea, dando mxima prioridad a los 46

colorantes alimentarios que pueden ser legalmente aadidos a los alimentos de acuerdo

con el Reglamento CE 94/36 / CE. Adems, McCann y col. (2007) han publicado

recientemente un documento, conocido como "El estudio de Southampton", donde se

llega a la conclusin de que la exposicin a dos combinaciones de cuatro colores

sintticos (rojo allura AC, azorrubina, rojo Ponceau 4R, amarillo de quinolena, amarillo


31/294

xx

ocaso FCF y tartracina), adems de un conservante (benzoato de sodio) en la dieta ha

resultado en una mayor hiperactividad en nios con 3 y 8-9 aos de edad.

Por consiguiente, existe una creciente demanda de fuentes naturales alternativas para

colorantes de alimentos. Muchos pigmentos naturales, tales como los carotenoides y

antocianinas, son fitoqumicos cuyos efectos nutracuticos han sido resaltados,

incluyendo la actividad antioxidante (Wilska-Jeszka, 2002). Por lo tanto, el uso de

colorantes naturales puede ser una herramienta interesante en el desarrollo de nuevos

alimentos funcionales, respondiendo a la creciente demanda del consumidor por

productos alimenticios ms naturales que presentan beneficios para la salud.

Las microalgas son una excelente fuente de pigmentos naturales, tales como los

carotenoides, clorofilas y ficobiliprotenas, que presentan un gran potencial industrial para

ser usados como agentes colorantes naturales. Estos organismos microscpicos pueden

ser cultivados bajo ciertas condiciones controladas del medio ambiente (por ejemplo,

temperatura, salinidad, luz, nutrientes) que pueden estimular o inhibir la biosntesis y

acumulacin de compuestos bioactivos (por ejemplo, pigmentos) en grandes

cantidades. La posibilidad, no slo de cosecha, sino tambin su cultivo en condiciones

diferentes, permite el uso de microalgas como reactores naturales a gran escala (Plaza etal., 2009).

Adems de colorear los productos alimenticios, la utilizacin de microalgas presenta otras

ventajas nutricionales, ya que son ricas en antioxidantes y otros compuestos

biolgicamente activos como los cidos grasos poliinsaturados de cadena larga

omega 3 (3), que estn naturalmente encapsulados dentro de las clulas de la

biomasa. Actualmente, se piensa que los antioxidantes naturales, como los carotenoides,

posiblemente previenen la formacin de cnceres y enfermedades cardiovasculares o

relacionadas con la edad, al proteger las clulas contra el dao oxidativo. Los cidos

grasos poliinsaturados (PUFA 3) pueden influir positivamente en la salud humana,

especialmente en la prevencin de enfermedades cardiovasculares y el cncer, la

reduccin de colesterol en la sangre (Bnaa et al., 1990), la arteriosclerosis (Thies, 2003), la

diabetes, as como mejorar el correcto desarrollo y funcionamiento del cerebro y la retina

(Connor, 2000; Crawford, 2000). Por lo general, estos compuestos son suministrados a

travs de algunos pescados y aceites obtenidos de stos. Sin embargo, las existencias


32/294

xxi

mundiales de peces estn disminuyendo debido a una pesca excesiva y a mtodos de

pesca excesivamente eficientes. Adems, los aceites derivados del pescado a veces

estn contaminados con una variedad de metales pesados y toxinas. As, las fuentes

alternativas de cidos grasos poliinsaturados son claramente deseables, y algunas

microalgas, las cuales sintetizan estos cidos grasos, son particularmente atractivas en

este sentido.

Algunas especies de microalgas, como Chlorella y Spirulina, se han venido utilizado

durante siglos como un alimento nutritivo en Asia, frica y Mxico. Sin embargo, la

produccin comercial a gran escala de microalgas slo se inici en la dcada de 1960

(Japn) y, hoy en da, las microalgas son principalmente comercializados como

complementos alimenticios, comnmente vendidas en forma de tabletas, cpsulas,

jarabes o bebidas. Adems, hay un mercado cada vez ms creciente de productos

alimenticios que incluyen microalgas, tales como pastas, galletas, pan, bocadillos, dulces,

yogures, bebidas, etc, ya sea como suplemento alimenticio, o como fuentes de

colorantes naturales de alimentos (Becker, 2004). En algunos pases, como Alemania,

Francia, Japn, USA, China o Tailandia, las empresas de produccin y distribucin de

alimentos ya han comenzado seriamente a comercializar alimentos funcionales con

microalgas y cianobacterias (Pulz y Gross, 2004). La explotacin biotecnolgica de losrecursos de microalgas para la alimentacin humana se limita a muy pocas especies,

debido a las estrictas normas de seguridad alimentaria, factores comerciales, la

demanda del mercado y procesamiento especfico necesario (Pulz y Gross, 2004). Sin

embargo, los alimentos suplementados con biomasa de microalgas pueden ser

sensorialmente ms convenientes y variados, combinando de este modo beneficios para

la salud con el atractivo para los consumidores, por ejemplo, en trminos de color. As,

cuando varias microalgas procesadas correctamente tienen un sabor agradable o

picante podran ser incorporadas en muchos tipos de alimentos, agregando no slo el

valor nutricional, sino tambin nuevos sabores, nicos y atractivos (Richmond, 2004).

Por otra parte, debido a la compleja composicin fisicoqumica de las microalgas, se

espera que la incorporacin de biomasa de microalgas pueda impartir algunas

modificaciones microestructurales en los alimentos, que pueden originar cambios de

textura y en las propiedades sensoriales.


33/294

xxii

El objetivo de esta tesis doctoral es el estudio de la adicin de pigmentos naturales y

biomasa de microalgas como agentes colorantes en sistemas coloidales alimentarios -

emulsiones y geles. Esta investigacin forma parte de un proyecto multidisciplinar ms

amplio denominado "pigmentos, antioxidantes y cidos grasos poliinsaturados en

productos alimenticios a base de microalgas - implicaciones funcionales y estructurales"

(PTDC/AGR-ALI/65926/2006). El impacto de la adicin de microalgas y pigmentos

naturales en diferentes sistemas coloidales se ha estudiado desde un punto de vista

reolgico, mediante el anlisis de los cambios inducidos en el comportamiento reolgico,

as como su relacin con sus caractersticas microestructurales y fsico-qumicas.

La mayora de los productos alimenticios manufacturados son sistemas coloidales

complejos resultantes de la combinacin de numerosos componentes (por ejemplo,

protenas, carbohidratos y lpidos) organizados y dispuestos en complejas microestructuras

de diversos tipos, tales como dispersiones, emulsiones, espumas, geles, etc. (Garti, 1999).

La estabilidad y las propiedades estructurales de los sistemas coloidales no slo

dependen de las propiedades funcionales de los ingredientes individuales, sino tambin

de la naturaleza y la fuerza de las interacciones entre ellos (Dickinson, 1995; Neirynck et

al., 2004). El uso de colorantes naturales y microalgas en los sistemas alimentarios est

limitado por la naturaleza de la matriz del alimento en el que el pigmento se dispersa, ypor las interacciones con otros componentes alimenticios (protenas, polisacridos,

lpidos, azcares, sales, etc.). El comportamiento reolgico de estos sistemas refleja las

modificaciones microestructurales que pueden resultar de la adicin de estos colorantes

naturales en alimentos tipo emulsiones y geles.

Se utiliz un aislado de protena de guisante como base para formular emulsiones

alimentarias y geles, basados en formulaciones optimizadas en estudios previos (por

ejemplo, Raymundo et al., 2002; Batista et al., 2005; Nunes et al., 2006). Esta eleccin est

de acuerdo con la tendencia actual a sustituir productos de origen animal por otros

vegetales, debido a la conciencia del consumidor sobre los beneficios de una dieta y

estilo de vida saludables, junto con consideraciones ticas y medioambientales para la

reduccin de la explotacin de recursos animales.

La tesis se divide en siete captulos, incluyendo una introduccin general (captulo 1), una

revisin de la literatura existente en esta temtica (captulo 2), las principales


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conclusiones (captulo 6) y referencias bibliogrficas (captulo 7). El procedimiento

experimental y la discusin de los resultados se dividen en tres grandes captulos (3-5),

que se resumen a continuacin.

II Caracterizacin fsico-qumica de la biomasa de microalgas

Las microalgas son una fuente potencial de compuestos naturales que pueden ser

utilizados como ingredientes funcionales. Hay un gran nmero de especies de microalgas

disponibles, y el conocimiento de la composicin qumica es obligatorio como un primer

paso en una metodologa de deteccin, ya que ayudar a distinguir y orientar

compuestos valiosos como antioxidantes, cidos grasos poliinsaturados etc, hacia el

diseo de nuevos productos con propiedades funcionales determinadas.

Como con cualquier planta superior, la composicin qumica de las algas no es un factor

constante intrnseco, sino que vara en un amplio intervalo. Los factores ambientales, tales

como la temperatura, la salinidad, la iluminacin, el valor de pH, contenido de minerales

o suministro de CO2, afectan a la fotosntesis y a la productividad de la biomasa celular.

Estos factores tambin influyen en el patrn, la va y la actividad del metabolismo celular

y en la composicin qumica celular, lo que tiene consecuencias e implicacionesbiotecnolgicas con mucho alcance (Hu, 2004). La mayora de los parmetros

ambientales varan segn la temporada, y los cambios en las condiciones ecolgicas

pueden estimular o inhibir la biosntesis de varios nutrientes (Plaza et al., 2009). Por lo tanto,

las condiciones de cultivo pueden ser optimizadas con el fin de maximizar la produccin

de biomolculas de inters. Puesto que las algas deben adaptarse rpidamente a

nuevas condiciones ambientales para sobrevivir, producen una gran variedad de

metabolitos secundarios biolgicamente activos, con estructuras que no se pueden

encontrar en otros organismos (Plaza et al., 2009).

La adicin de biomasa de microalgas a productos alimenticios es una herramienta

interesante que permite proporcionar suplementos nutricionales con compuestos

biolgicamente activos (por ejemplo, los antioxidantes), adems de proporcionar color.

En consecuencia, la seleccin de especies de microalgas con perfiles nutricionales

equilibrados es fundamental para el desarrollo de nuevos alimentos. Una caracterizacin

fsico-qumica detallada de las microalgas es una etapa esencial que permitir decidirqu algas son ms adecuadas para diferentes aplicaciones y propsitos.


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El objetivo del captulo 3 fue determinar la composicin aproximada, de cinco cepas de

microalgas: Spirulina (Arthrospira) maxima, Chlorella vulgaris (verde y carotenognica),

Haematococcus pluvialis (carotenognica), Diacronema vlkianum e Isochrysis galbana.

Esta caracterizacin fsico-qumica servir de base para la comprensin del efecto de la

adicin de biomasa de microalgas en los sistemas alimentarios coloidales que se

presentan en los captulos 4 (emulsiones) y 5 (geles).

Las microalgas seleccionadas han sido ampliamente cultivadas en LNEG (Spirulina,

Chlorella, Haematococcus) y IPIMAR (Diacronemae Isochrysis) desde hace varios aos.

Estas microalgas han sido utilizadas principalmente para la alimentacin animal y

acuicultura, debido a su capacidad para acumular pigmentos (por ejemplo,

carotenoides y ficobiliprotenas) y cidos grasos omega-3 (por ejemplo, EPA y DHA).

Las diferentes muestras de microalgas liofilizadas fueron analizadas en trminos de

humedad, contenido de minerales, protena, lpidos totales, perfil de cidos grasos,

hidratos de carbono y perfil de pigmentos (clorofilas, carotenoides, ficocianina). De los

seis tipos de microalgas estudiados, las mayores diferencias en la composicin se

relacionan con la induccin del proceso de carotenognesis en Chlorella (naranja) yHaematococcus. No obstante, cada microalga present un perfil de nutrientes en

biomasa tpico, permitiendo la seleccin de caractersticas fsico-qumicas deseadas

para aplicaciones especficas en tecnologa de alimentos.

Spirulina maxima es una cianobacteria, que se caracteriza por un alto contenido en

protena (44% p/p) y bajo contenido en grasa (4% p/p), aunque presenta una proporcin

interesante de cido -linolnico (0,5 g/100g). Tambin presenta un alto contenido

mineral (31% p/p), rico en sodio y potasio (8,5 y 2,6% p/p, respectivamente). En cuanto al

contenido en pigmentos, su caracterstica principal es la produccin de ficocianina (7%

p/p), una ficobiliprotena de color azul, que es soluble en agua, y est asociada a varios

efectos beneficiosos para la salud.

Chlorella vulgaris verde tambin presenta un alto contenido en protenas (38% p/p) y

bajo contenido en grasa (5% p/p), y tambin es rica en calcio (4,7% p/p). Sin embargo,

tras un proceso de carotenognesis, Chlorella se vuelve naranja debido a la


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acumulacin de pigmentos carotenoides, principalmente cantaxantina, junto con una

disminucin de clorofila. Como resultado de esto proceso se observa tambin un

aumento del contenido en grasa (28% p/p) y una disminucin del contenido total de

protena (12% p/p). Esto debe estar relacionado con el hecho de que, cuando se privan

de nitrgeno, las clulas son incapaces de dividirse y acumulan grasa dentro de ellas.

Tambin se observa un mayor contenido de cenizas totales, principalmente debido a la

adicin de NaCl. A pesar de que Chlorella verde es ampliamente utilizada como

ingrediente o suplemento alimentario, especialmente en los pases asiticos, la microalga

carotenognica todava no est autorizada para el consumo. Recientes ensayos de

toxicidad no han revelado mortalidad o signos clnicos relevantes, ni cambios de

conducta en ratas y ratones alimentados con Chlorellacarotenognicas (Gouveia et al.,

2011), del mismo lote de alga que el utilizado en el presente trabajo.

Haematococcus pluvialis, tras un proceso carotenognesis acumula hasta el 3,0% (p/p)

de carotenoides, principalmente astaxantina esterificada con cido oleico (18:19). Esta

alga presenta un contenido en grasas muy alto (41% p/p), as como un alto contenido en

hidratos de carbono (34% p/p) y bajo contenido en protenas (10% p/p), junto con

concentraciones de microelementos interesantes, tales como hierro (823 mg/kg), cobre

(344 mg/kg) y zinc (232 mg/100kg).

Diacronema vlkianum e Isochrysis galbana son microalgas marinas de la familia

Haptophyceae, que estn mucho menos estudiadas en trminos de su aplicacin en

alimentacin humana pero, sin embargo, son ampliamente utilizadas en la acuicultura. Al

igual que las otras algas verdes estudiadas, tienen un alto contenido en protenas (38-40%

p/p), pero tambin un alto contenido en grasa (18-24% p/p), rica en cidos grasos

poliinsaturados de cadena larga omega3, especialmente EPA (3,2 a 49 g/100 g) y DHA

(0,8 a 1,2 g/100 g). Estas algas son tambin ricas en carotenoides (3,2% p/p),

principalmente fucoxanthina, lo que les da una coloracin marrn. Esta interesante

composicin qumica est asociada a una accin antioxidante superior a la detectada

en un estudio previo para Chlorella vulgaris(Batista et al., 2010).

La descomposicin trmica de estas microalgas fue determinada mediante anlisis

termogravimtrico (TGA). Esta tcnica analiza el cambio en la masa de la muestra

mientras se somete a una alteracin de temperatura (Hemminger y Sarge, 1998). De esta


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forma, es posible evaluar la resistencia trmica de las microalgas despus de un

calentamiento, lo que puede ser til considerando algunas tecnologas utilizadas en los

procesos tecnolgicos alimentarios. Para las microalgas carotenognicas, se observan

temperaturas ms altas (254-258C) para el inicio de la degradacin de la biomasa, as

como una segunda zona caracterstica de degradacin trmica (350-500C), estando la

temperatura de mxima descomposicin trmica en esta zona, Tmax2, estrechamente

relacionada con su alto contenido en lpidos. Esto indica que las microalgas

carotenognicas que tienen altos contenidos de grasa, parecen ser capaces de resistir

mejor los tratamientos trmicos.

Se aplic un mtodo estadstico de anlisis factorial (PCA) a 38 de los parmetros fsico-

qumicos analizados para las seis microalgas objeto de estudio, con el fin de determinar

las variables que mejor las definen y diferencian. Es posible agrupar y correlacionar varias

variables en cinco componentes principales (factores), de los cuales, los tres primeros

describen el 85% de la variabilidad de los resultados. Al mostrar las variables y las

microalgas en un plano bidimensional definido por los factores 1 y 2, es posible visualizar

que cada una de las microalgas est fuertemente correlacionada con un grupo

especfico de variables. Sin embargo, es posible distinguir las principales diferencias que

surgen de las algas verdes y carotenognicas (bajo factor 1), y que Diacronema eIsochrysisse diferencian claramente de las otras algas verdes.

III Biomasa de microalgas y pigmentos naturales en emulsiones aceite-en-agua

estabilizadas por protena de guisante

Las emulsiones aceite-en-agua son la base de muchos tipos de alimentos, como por

ejemplo las mayonesas, las cuales son una de las salsas ms antiguas y ms ampliamente

consumida hoy da. Estas emulsiones pueden ser un vehculo eficiente para ingredientes

funcionales (por ejemplo, carotenoides), que pueden ser encapsulados, ya sea en la fase

oleosa o acuosa.

Los pigmentos naturales pueden ser utilizados como una alternativa a los colorantes

sintticos en la industria alimentaria, que se perciben como indeseables y perjudiciales,

algunos de ellos considerados como responsables de reacciones alrgicas y de

intolerancia. Por otro lado, los pigmentos ms naturales son los fitoqumicos que se han


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asociado a efectos nutracuticos (accin antioxidante, por ejemplo), con beneficios

adicionales para la salud, adems de su actividad como colorantes.

La utilizacin de biomasa de microalgas como una fuente de colorante en los productos

alimenticios presenta ventajas adicionales. No slo la extraccin de los pigmentos y los

costes de purificacin son eliminados, sino que se espera una estabilidad del color

mejorada, ya que los pigmentos estn encapsulados dentro de las clulas de las

microalgas. Adems de la accin colorante, las microalgas tambin pueden

proporcionar beneficios adicionales a travs del enriquecimiento de alimentos con otros

compuestos biolgicamente activos como los cidos grasos poliinsaturados omega 3.

La introduccin de colorantes naturales (pigmentos y biomasa de microalgas) en

emulsiones de aceite-en-agua puede tambin cambiar la microestructura y la textura

percibida, ya que el comportamiento de las emulsiones durante su produccin,

procesado y almacenamiento es altamente dependiente de la composicin (Granger et

al. 2003). Las propiedades fsicas de las fases acuosa y oleosa pueden ser modificadas de

acuerdo con la naturaleza y afinidades polares o no polares de los colorantes y, en

funcin de que posean propiedades tensioactivas, las molculas de pigmento puede

estar preferentemente situadas en la interfase. Las interacciones de los colorantes con losemulsionantes en la superficie de las gotas de la emulsin, as como con los agentes

estabilizantes en el medio continuo (Dickinson, 2003; Klinkerson et al., 2004) pueden

contribuir a un fortalecimiento de la estructura de la emulsin a travs de la formacin de

entramados fsicos (Clark et al., 1992; Riscardo et al., 2003). Sin embargo, si estos

componentes son incompatibles, la emulsin puede ser menos estable, pudiendo originar

una prdida de viscoelasticidad superficial inducida por el desplazamiento de la protena

de la interface (Dickinson y Hong, 1995).

El objetivo del captulo 4 fue estudiar el efecto de la incorporacin de pigmentos

naturales y biomasa de microalgas a emulsiones aceite-en-agua estabilizadas por

protena de guisante. Las emulsiones fueron caracterizadas en trminos de color, textura,

comportamiento reolgico y distribucin de tamaos de gotas.


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Emulsiones coloreadas con lutena y ficocianina

La lutena (3,3 '-dihidroxi--caroteno) es un carotenoide xantofila con dos grupos hidroxilo

en la cadena de polieno conjugado (Alves-Rodrigues y Shao, 2004). La lutena se

encuentra en verduras de hojas verdes como el brcoli y las espinacas y se extrae

comercialmente de la flor de calndula (Tagetes erecta) para la produccin de

colorantes de color naranja para la industria de alimentos y bebidas y la produccin de

suplementos dietticos (Sowbhagya et al., 2004). Estudios epidemiolgicos proporcionan

evidencias de que la lutena puede proteger contra la degeneracin macular

relacionada con la edad (Age Related Macular DegenerescenceARMD), una de las

principales causas de ceguera en personas mayores de 65 aos (Chong et al., 2007), as

como otras enfermedades oculares como las cataratas. Este efecto se relaciona con elhecho de que la lutena (y su estereoisomero zeaxantina) se deposita en el cristalino y la

mcula ltea de la retina, actuando como filtro de luz azul que protege los tejidos

subyacentes del dao fototxico (Alves Rodrigues y Shao, 2004). Tambin hay evidencias

que sugieren que la lutena puede proteger contra enfermedades del corazn

cardiovasculares y ciertos tipos de cncer (por ejemplo, de mama), a travs de su papel

como antioxidante (Johnson, 2000).

Estudios recientes han investigado la estabilidad de emulsiones y microemulsiones

enriquecidas con carotenoides, como el licopeno (Ribeiro et al., 2003; Spernath et al.,

2002), la astaxantina (Ribeiro et al., 2005; Wackerbarth et al, 2009), -caroteno (Neves et

al., 2008; Yuan et al., 2008) y lutena (Amar et al., 2004; Losso et al., 2005; Santipanichwong

y Suphantarika, 2007). Estos sistemas pueden ser utilizados como vehculos para los

carotenoides en aplicaciones alimentarias nutracuticas. Todas las molculas de

carotenoides presentan un carcter hidrfobo y, por consiguiente, se disuelven en la fase

oleosa, no polar, de la emulsin. No obstante, debe considerarse que la presencia de

grupos polares hidroxilo en el extremo de algunas molculas de carotenoides xantofilas,

tales como lutena y astaxantina, puede proporcionar un cierto carcter polar

(Khachatryan, 2003; Shibata et al., 2001) y una potencial actividad interfacial, as como

cierta capacidad para unirse a protenas a travs de enlaces de hidrgeno (Bassi et al.,

1993; Moros et al., 2002).

La ficocianina es un pigmento fotosinttico azul extrado de cianobacterias, conreconocida actividad antioxidante in vitro (Romay et al., 2003). Es una ficobiliprotena


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hidrfila compuesta por una apoprotena ligada a grupos prostticos coloreados

(cromforos tetrapirrlicos). Las biliprotenas son altamente solubles en agua, lo que hace

que su aplicacin en sistemas no polares sea difcil. Para superar esta limitacin, algunos

estudios experimentales han puesto a prueba la incorporacin de estos compuestos en

sistemas multifsicos, tales como micelas inversas y microemulsiones (Bermejo et al., 2000;

2003). Sin embargo, debido a su naturaleza proteica, es posible que la ficocianina

presente alguna actividad superficial (Chronakis et al., 2000).

En el presente estudio, lutena y ficocianina se aadieron al aceite y a la fase acuosa,

respectivamente, de emulsiones aceite-en-agua estabilizadas por protena de guisante

(3% p/p aislado de protena de guisante, 65% p/p aceite vegetal) a diversas

concentraciones (0,00%, 0,25%, 0,50%, 0,75%, 1,00%, 1,25% p/p), as como en forma de

mezclas de los dos pigmentos en diferentes proporciones (100L:0P, 75L:25P, 60L:40P,

50L:50P, 40L:60P, 25L:75P, 0L:100P, con una concentracin total de pigmento de 0,50%

p/p).

La estabilidad del color de las emulsiones se analiz (sistema CIEL*a*b*) a lo largo de

cuatro semanas de almacenamiento. Las emulsiones con lutena presentaron

tonalidades de amarillo a naranja. Las emulsiones con ficocianina tienen una coloracinazul intenso, que, aunque inesperado en un producto alimenticio, es muy valioso

teniendo en cuenta que los colorantes azules naturales estables son difciles de encontrar.

Por lo tanto, este estudio abre una nueva perspectiva de uso de ficocianina en sistemas

coloidales del tipo emulsin.

La estabilidad del color de las emulsiones a lo largo del tiempo se midi a travs del

parmetro de diferencia de color total (E*). Para todas las emulsiones estudiadas, al

comparar el color presentado en funcin del tiempo con respecto al color inicial, E* < 3,

lo cual est por debajo del umbral que el ojo humano es capaz de distinguir entre dos

colores (Gonnet, 1998; Castellar et al., 2006).

Adems de su capacidad para colorear emulsiones, se ha desarrollado un amplio

estudio sobre la caracterizacin reolgica de estos sistemas, que implica el anlisis de la

textura, la viscoelasticidad lineal, el flujo en estado estacionario y el flujo transitorio

(experimentos de crecimiento del esfuerzo). Asimismo, se realiz un seguimiento de los


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ensayos reolgicos con un sistema de anlisis ptico, con el fin de interpretar las

modificaciones estructurales inducidas por estos pigmentos naturales durante la cizalla.

Estos resultados se correlacionan con las mediciones de distribucin de tamao de gotas

de las emulsiones.

Los dos pigmentos, lutena y ficocianina, causaron efectos marcadamente diferentes,

segn su naturaleza qumica, en particular la afinidad por la fase acuosa (continua) o

para la fase de aceite (dispersa), y sus interacciones con las molculas de emulsionante

en la interfase parece ser de gran importancia.

Adems, la adicin de lutena provoca una modificacin en la naturaleza de la fase

oleosa de las emulsiones, que presentan valores de los parmetros reolgicos y de textura

mucho menores que la emulsin de control (0,00% lutena), pero con valores similares de

tamao de gota (d32).

La adicin de ficocianina tuvo una influencia significativa sobre la respuesta reolgica de

las emulsiones, atribuido a la interaccin con la protena de guisante en la capa

interfacial. Como resultado, los parmetros reolgicos y texturales aumentaron

linealmente con la concentracin de ficocianina, mientras que los valores del dimetrode Sauter (d32) presentaron una variacin polinomial, con un mnimo para 0,75% (p/p) de

concentracin de este pigmento.

Cuando se utilizan mezclas de ambos pigmentos, los parmetros reolgicos y texturales

analizados aumentan con la proporcin de ficocianina, mientras que los valores de

tamao de gota (d32) se mantienen similares. Se observ un efecto sinrgico cuando se

utilizaron pequeas cantidades de lutena (menos del 50% en la mezcla).

Fotografas de microscopa tomadas durante los ensayos reolgicos (en RheoScope)

tambin proporcionaron informacin til, especialmente para la emulsin control y las

que contenan lutena, que son ms fluidas, mientras que para las emulsiones que

contienen ficocianina y la mezcla de pigmentos, ms consistentes y opacas, fue ms

difcil obtener mediciones microscpicas precisas.


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Emulsiones coloreadas con biomasa de microalgas

Posteriormente, se evalu la capacidad de la biomasa de microalgas para actuar como

agente colorante en emulsiones alimentarias (seccin 4.3.2). Se aadi biomasa de

Spirulina maxima, Chlorella vulgaris(verde y carotenognica) y Haematococcus pluvialis

(carotenognica), en diversas concentraciones (0,05 a 2,00% p/p), a la fase acuosa de

emulsiones estabilizadas por protena de guisante (3% p/p de aislado de protena de

guisante, 65% p/p de aceite). Se analiz, la estabilidad del color, a lo largo de cinco

semanas, y la textura de las emulsiones (seccin 4.3.2.1).

La biomasa de las microalgas Chlorella vulgaris (verde y naranja) y Haematococcus

pluvialis, demostraron ser vehculos apropiados de pigmentos en las emulsiones aceite-en-agua estudiadas, impartiendo colores estables y atractivos, con ventajas adicionales,

como la de proporcionar otras molculas bioactivas, por ejemplo antioxidantes y cidos

grasos poliinsaturados omega 3. Haematococcus pluvialis demostr ser el ms eficaz

agente colorante, lo que est relacionado con su alto contenido en pigmentos (3,0%

w/w). Mayores estabilidades de color, se alcanzaron para concentraciones de biomasa

por debajo del 1,0% (w/w), para todas las microalgas estudiadas.

La adicin de biomasa de microalgas origin emulsiones con mayor firmeza que la

emulsin control (sin adicin de biomasa). Para todos los tipos de microalgas estudiadas,

se observ una relacin lineal positiva (R2>0,84) entre la concentracin de biomasa y la

firmeza. Este parmetro de textura discrimina en mayor medida entre las diferentes

muestras, en comparacin con otros parmetros obtenidos del ensayo de anlisis del

perfil de textura (TPA).

Spirulinamaximaparece ser la microalga menos eficaz, ya sea como colorante o como

agente texturizante. Se observaron coloraciones verdes ms apagadas, incluso a altas

concentraciones de biomasa, y efectos menos significativos sobre la firmeza.

El refuerzo estructural derivado de la adicin de biomasa de microalgas puede ser muy

ventajoso, teniendo en cuenta las aplicaciones tecnolgicas y nutricionales. Uno de los

principales aspectos de la tecnologa de emulsiones es la reduccin del contenido de

grasa, ya que, por ejemplo, tradicionalmente, las mayonesas son emulsiones aceite-en-agua con 70-80% de grasa (Depree y Savage, 2001). Un alto consumo de grasa se asocia


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con un mayor riesgo para la obesidad, colesterol arterial alto, enfermedades coronarias y

algunos tipos de cncer. Por esto, en los ltimos aos la industria alimentaria se ha

esforzado en desarrollar alternativas de productos bajos en grasa. Adems de los

aspectos nutricionales, la grasa influye en las propiedades reolgicas y caractersticas

sensoriales de los alimentos, particularmente en sistemas coloidales en el cual se dispersa

una fase de aceite. Por lo tanto, los tecnlogos de alimentos se han centrado en la

investigacin de sustitutos de grasa, tales como agentes mimticos de grasa es decir,

sustancias que imitan las propiedades organolpticas o fsicas de los triglicridos (Akoh,

1998). Algunos agentes mimticos de grasa, tales como las protenas del suero de la

leche, almidn modificado, celulosa, pectina o inulina se han utilizado para estabilizar

emulsiones y para aumentar la viscosidad de mayonesas bajas en caloras (Wendin et al.,

1997; Chouard, 2005; Liu et al., 2007.; Murphy, 2007).

En la seccin 4.3.2.2 se estudi la utilizacin de biomasa de microalgas como agente

mimtico de grasa en emulsiones aceite-en-agua estabilizadas por protena de guisante.

La concentracin de emulsionante (protena de guisante) se mantuvo constante (3%

p/p), as como de la biomasa de microalgas (2% p/p). El contenido de aceite se redujo

de 65% a 50% (w/w). Las emulsiones fueron analizadas en

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