Embed Size (px)
Citation preview
Page 1 Page 1Journal of Biotechnology 139 (2009) 102–107 Bioteknologi 139 Jurnal (2009) 102-107 Contents lists available at ScienceDirect Isi daftar tersedia di ScienceDirect Journal of Biotechnology Jurnal Bioteknologi journal homepage: www.elsevier.com/locate/jbiotec jurnal homepage: www.elsevier.com / lokasi / jbiotec Nanoparticle-supported multi-enzyme biocatalysis with in situ cofactor Nanopartikel-didukung-enzim multi Biocatalysis dengan di kofaktor situ regeneration kelahiran kembali Wenfang Liu Wenfang Liu a , b a, b , Songping Zhang , Songping Zhang a sebuah , Ping Wang , Ping Wang c , ∗ c, * a sebuah National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China Kunci Laboratorium Nasional Teknik Biokimia, Institut Rekayasa Proses, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China b b School of Chemical Engineering and Environment, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China Sekolah Teknik Kimia dan Lingkungan, Institut Teknologi Beijing, Beijing 100081, China c c Department of Bioproducts and Biosystems Engineering and Biotechnology Institute, University of Minnesota, 2004 Folwell Ave., 208 Kaufert Lab, St. Paul, MN 55108, United States Departemen Bioproducts dan Teknik Biosystems dan Institut Bioteknologi, University of Minnesota, 2004 Ave Folwell., Lab, St Paul, MN 55108, Amerika Serikat Kaufert 208 articleinfo articleinfo Article history: Pasal sejarah: Received 17 March 2008 Diterima 17 Maret 2008 Received in revised form Diterima dalam bentuk direvisi 29 September 2008 29 September 2008 Accepted 29 September 2008 Diterima 29 September 2008 Keywords: Kata kunci: Nanoparticles Partikelnano Enzyme immobilization Enzim immobilisasi Multi-enzyme biotransformation Multi-enzim biotransformasi Cofactor regeneration Kofaktor regenerasi Bioprocessing Bioprocessing Biosynthesis Biosintesis abstract abstrak Although there have been a long history of studying and using immobilized enzymes, little has been Meskipun telah ada sejarah panjang mempelajari dan menggunakan enzim amobil, sedikit yang telah
reported regarding the nature of immobilized cofactors. melaporkan tentang sifat kofaktor amobil. Herein we report that cofactor NAD(H) cova- Disini kami melaporkan bahwa kofaktor NAD (H) Cova- lently attached to silica nanoparticles successfully coordinated with particle-immobilized enzymes and lently melekat pada nanopartikel silika berhasil dikoordinasikan dengan partikel-enzim amobil dan enabled multistep biotransformations. diaktifkan biotransformations bertingkat. Specifically, silica nanoparticle-attached glutamate dehydroge- Secara khusus, yang melekat-glutamat dehydroge nanopartikel silika- nase (GLDH), lactate dehydrogenase (LDH) and NAD(H) were prepared and applied to catalyze the coupled nase (GLDH), laktat dehidrogenase (LDH) dan NAD (H) telah disusun dan diterapkan untuk mengkatalisis ditambah reactions for production of -ketoglutarate and lactate with the cofactor regenerated within the reaction reaksi untuk produksi-ketoglutarate dan laktat dengan kofaktor pada regenerasi dalam reaksi cycle. siklus. It appeared that particle–particle collision driven by Brownian motion of the nanoparticles pro- Ternyata tabrakan partikel-partikel didorong oleh gerak Brown dari partikel nano-pro vided effective interactions among the catalytic components, and thus realized a dynamic shuttling of vided interaksi yang efektif di antara komponen katalitik, dan dengan demikian menyadari dinamika bolak dari the particle-supported cofactor between the two enzymes to keep the reaction cycles continuing. yang didukung kofaktor partikel antara kedua enzim untuk menjaga siklus reaksi berkelanjutan. Total Jumlah turnover numbers (TTNs) as high as 20,000 h omset nomor (TTNs) sebagai sebagai 20.000 h tinggi −1 -1 were observed for the cofactor. diamati untuk kofaktor tersebut. It appeared to us that the Ternyata kepada kita bahwa use of particle-attached cofactor promises a new biochemical processing strategy for cofactor-dependent penggunaan-attached kofaktor partikel menjanjikan strategi pengolahan baru biokimia untuk kofaktor yang tergantung biotransformations. biotransformations. © 2008 Elsevier BV All rights reserved. © 2008 Elsevier BV All rights reserved. 1. 1. Introduction Pengantar Cofactor-dependent oxidoreductases constitute an important Tergantung oxidoreductases merupakan kofaktor penting group of enzymes that promise highly selective synthesis of chiral kelompok enzim yang menjanjikan sangat selektif sintesis dari kiral compounds such as chiral alcohol, hydroxyl acids or amino acids senyawa, seperti alkohol kiral, asam hidroksil atau asam amino ( Hummel, 1999 ) . ( Hummel, 1999 ) . Naturally occurring cofactors like NAD(H) and Alami kofaktor seperti NAD (H) dan NADP(H) generally act as electron carriers facilitating such redox NADP (H) umumnya bertindak sebagai pembawa elektron memfasilitasi redoks seperti
biotransformations and are consumed at stoichiometric ratios. biotransformations dan dikonsumsi pada rasio stoikiometri. Native cofactors are often much more expensive than the enzymes kofaktor Native sering jauh lebih mahal daripada enzim and their regeneration and reuse are critical for any prepara- dan regenerasi mereka dan kembali sangat penting untuk persiapan apapun- tive applications. tive aplikasi. Compare to other regeneration methodologies Bandingkan dengan metodologi regenerasi lain such as chemical and electrochemical reactions, enzyme-catalyzed seperti reaksi kimia dan elektrokimia, enzim-katalis cofactor regeneration offers selective and mild reactions and has regenerasi kofaktor menawarkan dan ringan reaksi selektif dan memiliki been pursued extensively. telah dikejar secara ekstensif. Such enzymatic regeneration generally regenerasi enzimatik tersebut umumnya requires a cofactor effectively shuttle among different enzymes membutuhkan kofaktor secara efektif antar-jemput antara enzim berbeda to keep the regeneration cycles continuing. untuk menjaga siklus regenerasi yang berkelanjutan. Although enzymatic Meskipun enzimatik regeneration of free cofactors have been demonstrated for many regenerasi kofaktor bebas telah menunjukkan bagi banyak biotransformation reactions, it has been a long-standing challenge reaksi biotransformasi, telah berdiri sebuah-tantangan jangka in realizing cofactor regeneration with the enzymes and cofactor dalam mewujudkan regenerasi kofaktor dengan enzim dan kofaktor both immobilized ( Liu and Wang, 2007 ). baik amobil ( Liu dan Wang, 2007 ). ∗ Corresponding author. * Korespondensi penulis. Tel.: +1 612 624 4792; fax: +1 612 625 6286. 6286 Tel.: +1 612 624 4792; fax: +1 612 625. E-mail address: [email protected] (P. Wang). E-mail: [email protected] (P. Wang). Nevertheless, several different approaches have been explored Namun demikian, berbagai pendekatan telah dieksplorasi to realize cofactor regeneration in immobilized reaction systems. untuk mewujudkan regenerasi kofaktor dalam sistem reaksi amobil. Cofactor retention by using microcapsules ( Kofaktor retensi dengan mikrokapsul menggunakan ( Chang et al., 1982; Ilan Chang et al;., 1982 Ilan and C hang, 1986; Yu and Chang, 1981a,b, 1982 ) or membrane reac- dan C menggantung, 1986; Yu dan Chang, 1981a, b, 1982 ) atau membran reaksi- tors ( tor ( Howaldt et al., 1990; Ikemi et al., 1990a,b; Kitpreechavanich Howaldt et al;., 1990; Ikemi b et al., 1990a, Kitpreechavanich et al., 1985; Kulbe et al., 1990; Lin et al., 1997, 1999; Nidetzky et et al;., 1985; Kulbe et al 1990., Lin et al,., 1997, 1999 et Nidetzky al., 1996, 1994; Obón et al., 1996, 1998; Röthig et al., 1990 ) has al,. 1996, 1994; Obon et al;., 1996, 1998 et al. Röthig, 1990 ) telah been the most widely adopted method. menjadi metode yang paling banyak diadopsi. The cofactors essentially The kofaktor dasarnya act in form of free cofactors in such membrane-restricted reac- bertindak dalam bentuk kofaktor bebas sedemikian dibatasi membran-reaksi-
tion systems. tion sistem. However, it has been always challenging to balance Namun, telah selalu menantang untuk menyeimbangkan between the permeability of the substrates or products and the antara permeabilitas dari substrat atau produk dan retention of the enzymes and cofactors, especially with cofactors retensi enzim dan kofaktor, terutama dengan kofaktor of small sizes. ukuran kecil. Enlarging the size of cofactors by chemical modifi- Memperbesar ukuran kofaktor oleh modifi kimia cation with water soluble polymers can alleviate this problem to kation dengan polimer larut air dapat mengatasi masalah ini ke certain extent ( Davies a nd Mosbach, 1974; Devaux-Basseguy et al., batas tertentu ( Davies sebuah Mosbach nd, 1974;-Basseguy et al. Devaux, 1997; F urukawa et al., 1980; Larsson and Mosbach, 1974; Stengelin 1997; F urukawa et al;., 1980 Larsson dan Mosbach, 1974; Stengelin and P atel, 2000; Wandrey and Bossow, 1986; Yamazaki et al., 1976 ); dan P atel, 2000; Wandrey dan Bossow, 1986; Yamazaki et al 1976., ); however, such modifications may also deactivate cofactors ( Namun, modifikasi tersebut dapat juga menonaktifkan kofaktor ( Larsson Larsson and M osbach, 1974; Zappelli et al., 1976, 1975 ). dan M osbach, 1974; Zappelli et al 1975., 1976, ). Compare to membrane-contained systems, solid support- Bandingkan dengan membran-berisi sistem, dukungan solid- attached insoluble cofactor and enzymes are much easier to larut kofaktor enzim yang melekat dan lebih mudah untuk reuse and may afford more flexible reactor design. menggunakan kembali dan mungkin mampu reaktor desain yang lebih fleksibel. Early tri- Awal tri- als with support-attached cofactor–enzyme systems generally als dengan-sistem enzim-attached kofaktor dukungan umum failed. Wykes et al. gagal. Wykes et al. (1975) (1975) prepared immobilized NAD disiapkan amobil NAD + + by cou- oleh cou- pling it with a hexamethylamine derivative of agarose using pling dengan turunan hexamethylamine dari agarosa menggunakan 0168-1656/$ – see front matter © 2008 Elsevier BV All rights reserved. 0168-1656 / $ - lihat depan peduli © 2008 Elsevier BV All rights reserved. doi: DOI: 10.1016/j.jbiotec.2008.09.015 10.1016/j.jbiotec.2008.09.015
Page 2 Page 2W. Liu et al. W. Liu et al. / Journal of Biotechnology 139 (2009) 102–107 / Jurnal 139 Bioteknologi (2009) 102-107 103 103 dicyclohexyl-carbodiimide, while lactate dehydrogenase (LDH) and dicyclohexyl-karbodiimida, sedangkan laktat dehidrogenase (LDH) dan yeast alcohol dehydrogenase (YADH) were immobilized on DEAE- ragi alkohol dehidrogenase (YADH) yang bergerak di DEAE-
cellulose matrices. selulosa matriks. The results showed that both immobilized Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua amobil enzymes and immobilized cofactor were active when they were enzim dan kofaktor amobil aktif ketika mereka tested separately with their free counterparts, but no activity diuji secara terpisah dengan rekan-rekan bebas mereka, namun tidak ada aktivitas could be detected with immobilized NAD dapat dideteksi dengan NAD amobil + + and immobilized dehy- dan amobil dehy- drogenases. drogenases. In another effort, Gestrelius et al. Dalam upaya lain, Gestrelius et al. co-immobilized co-amobil NADH along with horse liver alcohol dehydrogenase (HLADH) on NADH bersama dengan alkohol dehidrogenase kuda hati (HLADH) pada cyanogen bromide-activated Sepharose 4B to catalyze the reduc- sianogen bromida-4B Sepharose diaktifkan untuk mengkatalisis pengurangan- tion of lactaldehyde ( tion dari lactaldehyde ( Gestrelius et al., 1975 ) . Gestrelius et al 1975., ) . The immobilized The amobil system successfully catalyzed the desired reaction and the cofactor sistem yang sukses di dikatalisis reaksi yang diinginkan dan kofaktor yang was also able to be regenerated with the same enzyme by feeding juga dapat diregenerasi dengan enzim yang sama dengan memberi makan the reaction system with a secondary substrate, ethanol. sistem reaksi dengan substrat sekunder, etanol. However, Namun, the cofactor could not be regenerated when a second enzyme LDH kofaktor tidak bisa dibuat ulang bila kedua enzim LDH was applied. diterapkan. In a later work, LDH was co-immobilized by using glu- Dalam sebuah karya kemudian, LDH adalah co-bergerak dengan menggunakan glutathione- taraldehyde (GA) to Sepharose-bound NAD taraldehyde (GA) ke-terikat NAD Sepharose + + –HLADH complex, and HLADH kompleks, dan moderate cofactor regeneration activity was reported with such an Aktivitas sedang regenerasi kofaktor dilaporkan dengan seperti immobilized system ( Månsson et al., 1979 ). amobil sistem ( Månsson et al 1979., ). A successful example for immobilized enzyme-coupled regener- Contoh sukses untuk enzim amobil-digabungkan regener- ation of immobilized cofactor was reported by Yamazaki and Maeda asi dari kofaktor amobil dilaporkan oleh Yamazaki dan Maeda (1982) . An NAD (1982). Sebuah NAD + + derivative carrying a vinyl group was copoly- derivatif membawa sekelompok vinyl kopoli- merized into a polyacrylamide gel inside which enzymes were merized menjadi gel poliakrilamid dalam yang enzim physically entrapped. fisik terperangkap. The rate of cofactor regeneration of such an Tingkat regenerasi kofaktor dari seperti immobilized system was reported to be 14 h sistem amobil dilaporkan 14 h −1 -1
. . Recently, cofactor Baru-baru ini, kofaktor and enzymes were covalently immobilized utilizing nano-porous dan enzim amobil kovalen memanfaatkan nano-porous structure of porous silica glass ( El-Zahab e t al., 2004 ) . struktur dari kaca silika berpori ( El-Zahab e al t 2004., ) . LDH and LDH dan a regenerating enzyme glucose dehydrogenase (GDH) were co- glukosa dehidrogenase enzim regenerasi (GDH) adalah co- immobilized along with NADH via spacers of different sizes. amobil bersama dengan NADH melalui spacer ukuran yang berbeda. The The coupled reactions catalyzed by the co-immobilized LDH and GDH digabungkan reaksi dikatalisis oleh co-bergerak LDH dan GDH were achieved, indicating immobilized NAD(H) shuttled between dicapai, menunjukkan amobil NAD (H) shuttled antara co-immobilized enzymes. co-enzim amobil. However, recycling rate of cofactor was Namun, tingkat daur ulang kofaktor adalah still low (with total turnover number (TTN) up to 102). masih rendah (dengan jumlah total turnover (TTN) sampai dengan 102). All the above approaches have been developed by confining the Semua pendekatan di atas telah dikembangkan oleh para membatasi catalyst systems into a limited space. katalis sistem ke dalam ruang terbatas. Again, that is likely to be asso- Sekali lagi, yang mungkin akan Asso- ciated with mass transfer limitations. ciated dengan keterbatasan transfer massa. One alternative approach is to Satu pendekatan alternatif adalah use particle-immobilized systems, where active enzyme–cofactor partikel-amobil menggunakan sistem, di mana aktif enzim-kofaktor interactions can be realized through particle–particle collisions, interaksi dapat diwujudkan melalui tabrakan partikel-partikel, while the reaction system is more open to substrates in the reac- sedangkan sistem reaksi lebih terbuka untuk substrat dalam reaksi- tion media ( tion media ( Wang, 2006 ) . Wang, 2006 ) . Mobile nanoparticle systems based on Mobile nanopartikel sistem berbasis hetero-bifunctional polymer particles ( Du e t al., 2005 ) and artificial hetero-polimer bifunctional partikel ( Du e al t., 2005 ) dan buatan nanotransport systems created from microspheres and motor pro- nanotransport sistem diciptakan dari mikrosfer dan motor pro- tein ( setiap proteinnya ( Yokokawa et al., 2008 ) have been successfully demonstrated. Yokokawa et al., 2008 ) telah berhasil menunjukkan. The mobility of nanoparticles were also applied to enable multi- Mobilitas nanopartikel juga diterapkan untuk memungkinkan multi- step biotransformations in a recent work with polystyrene particle langkah biotransformations dalam sebuah karya terakhir dengan partikel polystyrene (500 nm in diameter)-attached cofactor NAD(H) along with four (500 nm diameter)-dilampirkan kofaktor NAD (H) bersama dengan empat enzymes that were also immobilized on particles for the synthe- enzim yang juga bergerak pada partikel untuk sintesis the-
sis of methanol from carbon dioxide ( El-Zahab and Wang, 2008 ). sis metanol dari karbon dioksida ( El-Zahab dan Wang, 2008 ). However, only moderate TTN was achieved (<1 h Namun, hanya TTN sedang dicapai (<1 jam −1 -1 ). ). In a previous Dalam sebelumnya study we have demonstrated that the size of particles can impact penelitian kami telah menunjukkan bahwa ukuran partikel dapat berdampak the activity of the surface-attached enzymes by controlling the fre- aktivitas enzim-menempel permukaan dengan mengontrol fre- quency of collision ( Jia et al., 2003 ) , and smaller particles could quency tabrakan ( Jia et al 2003., ) , dan partikel kecil bisa afford higher specific enzyme activities because of their higher membayar lebih tinggi aktivitas enzim spesifik karena mereka lebih tinggi mobility. mobilitas. In the current work, we apply silica nanoparticles of 30 nm Dalam pekerjaan saat ini, kita menerapkan nanopartikel silika 30 nm in diameter as the supports to immobilize enzymes and cofactor to diameter sebagai dukungan untuk melumpuhkan enzim dan kofaktor untuk examine the effectiveness of cofactor regeneration with particle- mengetahui efektivitas regenerasi kofaktor dengan partikel- attached systems. terpasang sistem. As a model system, glutamate dehydrogenase Sebagai model sistem, glutamat dehidrogenase (GLDH) and lactate dehydrogenase and their cofactor NAD (GLDH) dan laktat dehidrogenase dan mereka kofaktor NAD + + were adalah immobilized separately on the nanoparticles for this study. amobil secara terpisah pada nanopartikel untuk penelitian ini. 2. 2. Materials and methods Bahan dan metode 2.1. 2.1. Materials Bahan GLDH from bovine liver (EC: 1.4.1.3, Type III, lyophilized pow- GLDH dari hati sapi (EC: 1.4.1.3, Tipe III, lyophilized pow- der with a protein content of 70%), LDH from rabbit muscle (EC: der dengan kandungan protein 70%), LDH dari otot kelinci (EC: 1.1.1.27, Type XI, salt-free lyophilized powder), NAD 1.1.1.27, Jenis XI, bebas lyophilized bubuk-garam), NAD + + and NADH dan NADH were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA). dibeli dari Sigma Chemical Co (St Louis, USA). Sodium Sodium pyruvate and l-glutamic acid were purchased from Acros Organics piruvat dan asam glutamat-l dibeli dari Acros Organik (Gell, Belgium). (Gell, Belgia). The latter was neutralized with sodium hydrox- Yang terakhir dinetralkan dengan sodium hydrox ide before using. ide sebelum menggunakan. Silica nanoparticles with an average diameter of Silika nanopartikel dengan diameter rata-rata
30 ± 5 nm and a specific surface area of 200 ± 20 m 30 ± 5 nm dan luas permukaan spesifik 200 ± 20 m 2 2 /g were pur- / G pur- chased from Zhjiang Hongsheng Science & Technology (Zhoushan, dikejar dari Zhjiang Hongsheng Sains & Teknologi (Zhoushan, China). Cina). -Glycidoxypropyl trimethoxysilane (GPS) was provided as Glycidoxypropyl trimetoksisilan-(GPS) yang diberikan sebagai a gift from Nanjing Shuguang Chemicals (Nanjing, China). hadiah dari Nanjing Shuguang Chemicals (Nanjing, Cina). Other Lainnya chemicals including toluene, triethylamine (Et bahan kimia termasuk toluena, trietilamina (Et 3 3 N), acetone, sodium N), aseton, natrium phosphate, citric acid, triethanolamine, hydrochloric acid, sodium fosfat asam sitrat,, trietanolamin, asam klorida, natrium hydroxide, NH hidroksida, NH 4 4 Cl, NH Cl, NH 4 4 OH, Tris and HEPES were all of analytical OH, Tris dan HEPES semua analitis grade. kelas. 2.2. 2.2. Activation of silica nanoparticles Aktivasi nanopartikel silika Silica nanoparticles were activated according to modified pro- nanopartikel silika yang diaktifkan menurut diubah pro- cedure as reported previously ( Lin e t al., 2001 ) . cedure seperti yang dilaporkan sebelumnya ( Lin e al t 2001., ) . A typical procedure Sebuah prosedur khas included the addition of 1 g silica nanoparticles into 49 mL toluene. termasuk penambahan 1 nanopartikel silika g ke 49 toluena mL. After sonication for 30 min, 0.15 mL Et Setelah sonikasi selama 30 menit, 0,15 mL Et 3 3 N and 1 mL GPS were then N dan 1 GPS mL kemudian added into the suspension. ditambahkan ke dalam suspensi. The activation reaction was carried out Reaksi aktivasi dilakukan with reflux and stirring at 115 dengan refluks dan diaduk pada 115 ◦ ◦ C for 3 h under N C selama 3 jam di bawah N 2 2 atmosphere. suasana. After Setelah being air-cooled to room temperature, the particles were recovered udara yang didinginkan sampai suhu kamar, partikel-partikel yang ditemukan via filtration and then washed with acetone for several times. melalui filtrasi dan kemudian dicuci dengan aseton untuk beberapa kali. The The amount of epoxide groups tethered to the particles was determined jumlah kelompok epoksida ditambatkan ke partikel ditentukan by an acid–base titration method ( Sundberg a nd Porath, 1974 ) . oleh dasar metode titrasi asam ( Sundberg sebuah Porath nd, 1974 ) . The The
titration was typically conducted with a hydrochloric acid after titrasi ini biasanya dilakukan dengan asam klorida setelah reacting the activated and dried silica nanoparticles (0.5 g) with mereaksikan nanopartikel silika kering dan diaktifkan (0,5 g) dengan 5 mL sodium thiosulfate solution (1.3 M) for 2 h. 5 mL natrium tiosulfat larutan (1,3 M) selama 2 h. The loading of Pemuatan epoxide groups was measured to be 0.6 mmol/g-particle. kelompok epoksida diukur menjadi 0,6 mmol / g-partikel. 2.3. 2.3. Immobilization of enzyme and cofactor Imobilisasi enzim dan kofaktor Enzymes were immobilized onto the silica particles by forming Enzim tidak bisa bergerak ke partikel silika dengan membentuk covalent bonds through the epoxide group on the surface of the kovalen obligasi melalui kelompok epoksida pada permukaan particles. partikel. Typically 100 mg silica and 2.4 mg enzyme (either GLDH Biasanya silika 100 mg dan 2,4 mg enzim (baik GLDH or LDH) were mixed in 1.5 mL pH 7.5 phosphate buffer (0.1 M) at atau LDH) dicampur dalam 1,5 mL dapar fosfat pH 7,5 (0,1 M) di 4 4 ◦ ◦ C under shaking (200 rpm). C di bawah gemetar (200 rpm). The reaction was allowed to last 24 h Reaksi dibiarkan berlangsung 24 jam before the particles were removed from the solution via centrifu- sebelum partikel telah dihapus dari solusi melalui centrifu- gation (13,000 × g ). gation (13.000 g ×). The particles were washed at least three times Partikel-partikel dicuci setidaknya tiga kali with 25 mL of 0.1 M Tris–HCl buffer (pH 7.5) solution each time till dengan 25 mL buffer 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) larutan setiap kali sampai no protein was detected in the washing solution. protein tidak terdeteksi dalam larutan cuci. Enzyme loading Enzim loading on the particles was determined based on the difference of the pro- pada partikel ditentukan berdasarkan perbedaan pro- tein content in the solution (including the washing solution) before setiap proteinnya konten dalam larutan (termasuk solusi mencuci) sebelum and after immobilization as measured using Bradford assay. dan setelah immobilisasi yang diukur dengan menggunakan alat tes Bradford. Typi- Typi- cal loading of GLDH was found to be 13 ± 0.2 mg-enzyme/g-particle, loading kal dari GLDH adalah ditemukan 13 ± 0,2 mg-enzyme/g-particle, while that for LDH was 20 ± 0.2 mg/g. sedangkan untuk LDH adalah 20 ± 0,2 mg / g. These results are compara- Hasil ini pembanding- ble to those reported previously for enzymes covalent attached to ble dengan yang dilaporkan sebelumnya untuk enzim kovalen melekat nanostructures ( struktur nano ( El-Zahab e t al., 2004; Kim et al., 2006 ) , yet lower El-Zahab e al t;., 2004 Kim et al 2006., ) , namun lebih rendah than those physically absorbed onto polymeric beads where load- dari yang secara fisik diserap ke manik-manik polimer dimana beban
ings around 4.4% (w/w) were achieved ( petunjuk untuk keselamatan sekitar 4,4% (b / b) dicapai ( Le and Means, 1998 ). Le dan Sarana, 1998 ). The procedures for cofactor (NAD Prosedur untuk kofaktor (NAD + + ) immobilization and subse- ) Imobilisasi dan Tindakan- quent purification were similar to that of the enzymes except the pemurnian Quent serupa dengan yang ada pada enzim kecuali materials were applied with a different ratio: 10 mg cofactor was bahan diaplikasikan dengan rasio yang berbeda: 10 kofaktor mg added for each 5 mg activated silica particles. ditambahkan untuk setiap 5 silika partikel diaktifkan mg. The modified parti- Yang dimodifikasi Parti- cles were also washed using 1 M NaCl solution in addition to the cles juga dicuci dengan menggunakan 1 M larutan NaCl di samping washing with buffer solution in order to remove any physically cuci dengan larutan buffer dalam rangka untuk menghilangkan fisik absorbed cofactor molecules. diserap molekul kofaktor. Immobilized loading of NAD Amobil pemuatan NAD + + was adalah found to be rather high, 0.4 g-cofactor/g-particle, approaching 100% ditemukan agak tinggi, 0,4 g-cofactor/g-particle, mendekati 100% of the epoxide group on the surface of the particles. kelompok epoksida pada permukaan partikel. 2.4. 2.4. Enzymatic reactions Reaksi enzimatik Unless specified otherwise, enzymatic reactions were con- Kecuali ditentukan lain, reaksi enzimatik adalah con- ducted in 0.1 M Tris–HCl buffer (pH 7.5) at room temperature under menyalurkan dalam buffer 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) pada suhu ruangan di bawah
Page 3 Page 3104 104 W. Liu et al. W. Liu et al. / Journal of Biotechnology 139 (2009) 102–107 / Jurnal 139 Bioteknologi (2009) 102-107 Fig. Gambar. 1. A postulated reaction mechanism for silica nanoparticles-supported enzyme–cofactor catalyst system (NAD 1. Sebuah mekanisme reaksi dipostulasikan untuk nanopartikel-kofaktor enzim katalis-didukung sistem silika (NAD + + and NADH: oxidized and reduced format of the cofactor dan NADH: teroksidasi dan mengurangi format kofaktor yang nicotinamide adenine dinucleotide; GLDH: glutamate dehydrogenase; LDH: lactate dehydrogenase). nicotinamide adenin dinukleotida; GLDH: glutamat dehidrogenase, LDH: dehidrogenase laktat). shaking (130 rpm), with the amount of each catalytic component gemetar (130 rpm), dengan jumlah setiap komponen katalis was controlled to reach the desired molar ratio. dikontrol untuk mencapai rasio molar yang diinginkan. A typical reaction Reaksi khas
may include the use of 10 mg GLDH-carrying particles, 1 mg LDH mungkin termasuk penggunaan 10 mg-membawa partikel GLDH, 1 mg LDH nanoparticles and 0.4 g NAD nanopartikel dan 0,4 g NAD + + -particles applied in 0.8 mL reac- -Partikel diterapkan dalam 0,8 mL reaksi- tion solution containing 20 mM glutamate and 10 mM pyruvate. tion larutan yang mengandung 20 glutamat piruvat mM dan 10 mM. The reaction rate of the couple reactions was monitored by measur- Laju reaksi dari reaksi pasangan dimonitor dengan mengukur- ing the production rates of the reaction products. ing tingkat produksi dari produk-produk reaksi. Aliquots of 80 L Aliquot dari 80 L were taken periodically for HPLC analysis after centrifugation at diambil secara berkala untuk analisis HPLC setelah sentrifugasi pada 20,000 × g for 10 min to remove the catalysts. 20.000 × g selama 10 menit untuk menghapus katalis. A Waters HPLC sys- Sebuah sistem-Waters HPLC tem equipped with a Supelcosil C-18 column (250 mm × 4.6 mm) tem dilengkapi dengan kolom C-18 Supelcosil (250 mm x 4,6 mm) was applied with 0.05 M sodium phosphate solution of pH 3.0 as the diaplikasikan dengan larutan natrium fosfat 0,05 M pH 3,0 sebagai mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min. mobile fasa dengan laju aliran 0,5 / menit mL. Analyses were conducted Analisis dilakukan with triplicates, standard errors were generally within 5%. dengan tiga ulangan, kesalahan standar pada umumnya dalam 5%. As the Sebagai characterization of particle's dispersion in the reaction solution, the karakterisasi's dispersi partikel dalam larutan reaksi, effective diameter of silica nanoparticles suspended in the solution diameter efektif nanopartikel silika tersuspensi dalam larutan was measured using a dynamic laser light-scattering particle size diukur dengan menggunakan laser ukuran partikel hamburan cahaya dinamis analyzer (Brookhaven 90Plus, USA). analyzer (Brookhaven 90Plus, USA). 3. 3. Results and discussion Hasil dan diskusi 3.1. 3.1. Coupled reactions with in situ regeneration of Ditambah reaksi dengan di regenerasi in situ particle-attached NAD(H) partikel-attached NAD (H) Fig. Gambar. 1 1 depicts the postulated interactions among the enzymes menggambarkan interaksi antara enzim didalilkan and cofactor involved in the reaction system. dan kofaktor yang terlibat dalam sistem reaksi. Cofactor regenera- Kofaktor regenerasi tion cycle is realized through the action of two enzymes, LDH and tion siklus diwujudkan melalui aksi dari dua enzim, LDH dan GLDH. GLDH. The translocation of the cofactor between the two enzymes The translokasi kofaktor antara dua enzim is essential to the desired coupled reactions. sangat penting untuk reaksi ditambah diinginkan. Free enzymes and Free enzim dan cofactors generally assume good Brownian motion mobilities in kofaktor umumnya menganggap mobilitas gerak Brown yang baik di
a homogeneous reaction environment for efficient biotransforma- reaksi lingkungan yang homogen untuk efisien biotransforma- tions. subpopulasi. Nanoparticle-attached enzymes, albeit being immobilized on -Melekat enzim Nano Partikel, meskipun yang bergerak di insoluble solid supports, may possess similar mobilities through mendukung padat larut, mungkin memiliki mobilitas yang sama melalui the Browniang motion of the particles and thus enable reactions Browniang gerakan partikel dan dengan demikian memungkinkan reaksi with velocities that are in some cases close to those of homoge- dengan kecepatan yang dalam beberapa kasus dekat dengan orang-orang homoge- neous reactions with free enzymes ( neous reaksi dengan enzim bebas ( Jia et al., 2003 ) . Jia et al 2003., ) . For the current Untuk saat ini reaction system, the mobility of particles is expected to gener- sistem reaksi, mobilitas partikel diharapkan un- ate particle–particle interactions that allow the surface-exposed makan-partikel interaksi partikel yang memungkinkan permukaan terpajan cofactor coordinate with the enzymes and thus driving forward kofaktor koordinasi dengan enzim dan dengan demikian mengemudi maju the reactions. reaksi. The silica nanoparticle-supported enzyme–cofactor Nanopartikel silika didukung enzim-kofaktor system examined in this work appears to follow such a reaction sistem diperiksa dalam karya ini muncul untuk mengikuti reaksi seperti mechanism. mekanisme. Data reported in Fig. Data dilaporkan dalam Gambar. 2 c ompare the reaction system to 2 c Bandingkan sistem reaksi soluble free enzymes and cofactor. larut bebas enzim dan kofaktor. To avoid possible leaching of the Untuk menghindari kemungkinan pencucian enzymes and cofactor from the particles, an extensive washing pro- enzim dan kofaktor dari partikel, yang luas cuci pro- cedure including the use of salted solutions has been applied during cedure termasuk penggunaan solusi asin telah diterapkan selama the preparation of the immobilized catalysts. penyusunan katalis amobil. It was also observed Itu juga diamati through our analytical procedure that reactions were effectively melalui prosedur analitis kita bahwa reaksi secara efektif stopped upon the removal of silica particles via centrifugation, berhenti pada penghilangan partikel silika melalui sentrifugasi, further supporting the observed activities of the particle-attached lebih lanjut mendukung kegiatan diamati dari partikel-attached enzymes and cofactor. enzim dan kofaktor. The reaction rates achieved with the immobilized catalyst sys- Tingkat reaksi dicapai dengan sistem katalis amobil- tem were comparable to those of free catalyst system when the tem sebanding dengan yang sistem katalis bebas ketika initial concentration of the cofactor was low ( konsentrasi awal kofaktor yang rendah ( Fig. Gambar. 2 ) . 2) . However, Namun, the maximum reaction velocity ( reaksi kecepatan maksimum (
v v max max ) of the immobilized system ) Dari sistem amobil was only about 50% of that of the free system. hanya sekitar 50% dari sistem bebas. Unlike the free Berbeda dengan gratis catalyst system, the immobilized catalyst reach cofactor satura- sistem katalis, katalis amobil mencapai satura kofaktor- tion at a very low cofactor concentration (1 M), indicating a low tion pada kofaktor konsentrasi rendah sangat (1 M), menunjukkan rendah apparent Michaelis constant ( K jelas konstanta Michaelis (K M M ). ). Interestingly, the immobilized Menariknya, amobil system showed a higher sistem menunjukkan lebih tinggi v v max max than the reactions with either only the dari reaksi dengan baik hanya enzymes or the cofactor was immobilized. enzim atau kofaktor itu bergerak. Since the particles were Karena partikel also able to adsorb free enzymes or cofactor, we believe the slowed juga mampu menyerap enzim bebas atau kofaktor, kami percaya bahwa diperlambat reactions of the partially immobilized catalyst systems have been reaksi dari katalis sistem amobil sebagian telah resulted from the reduced availability of the free catalytic compo- dihasilkan dari ketersediaan berkurang dari komponen katalitik bebas nents in the solution. motivasional dalam larutan. The silica particles can generally absorb a Partikel-partikel silika umumnya dapat menyerap good amount of enzymes or cofactor onto their surfaces. baik jumlah enzim atau kofaktor ke permukaan mereka. Although Meskipun certain binding sites have been occupied with covalently attached situs mengikat tertentu telah sibuk dengan kovalen terpasang catalytic species, there are still binding sites open on the particles spesies katalitik, masih ada situs mengikat terbuka pada partikel for physical adsorption. untuk adsorpsi fisik. Those physical binding sites were able to Situs tersebut mengikat fisik mampu absorb enzymes and cofactor during the immobilization procedure; menyerap enzim dan kofaktor selama prosedur imobilisasi; however, subsequent washing and purification steps after immobi- Namun, selanjutnya cuci dan pemurnian langkah setelah immobi- lization will then leave those sites open again for future adsorption. lization kemudian akan meninggalkan situs tersebut terbuka lagi untuk adsorpsi masa depan. Fig. Gambar. 2. Effect of initial cofactor concentration on reaction velocity. 2. Pengaruh konsentrasi kofaktor awal pada kecepatan reaksi. Volume of reac- Volume reaksi- tion solution was controlled to be 0.8 mL, the amount GLDH- and LDH-attached tion solusi dikendalikan menjadi 0,8 mL, jumlah GLDH dan LDH-attached particles were 0.13 and 0.02 mg; and the concentrations of glutamate and pyruvate partikel 0,13 dan 0,02 mg, dan konsentrasi glutamat dan piruvat
were 20 and 10 mM, respectively. adalah 20 dan 10 mM, masing-masing. Reaction velocity is defined as mol-product/min. Reaksi kecepatan didefinisikan sebagai mol-product/min.
Page 4 Page 4W. Liu et al. W. Liu et al. / Journal of Biotechnology 139 (2009) 102–107 / Jurnal 139 Bioteknologi (2009) 102-107 105 105 Fig. Gambar. 3. Total turnover number (TTN) of particle-attached cofactor NAD(H) as a func- 3. Jumlah perputaran nomor (TTN) dari dilampirkan kofaktor NAD-partikel (H) sebagai fungsi- tion its initial concentration. tion konsentrasi awal. (TTN was determined for a reaction time of 8 h, defined (TTN ditentukan untuk waktu reaksi 8 jam, yang didefinisikan as moles of product normalized with respect to the moles of cofactor applied. sebagai mol produk dinormalisasi sehubungan dengan mol kofaktor diterapkan. Reac- Reaksi- tion conditions are the same as that in Fig. kondisi tion adalah sama seperti yang di Gambar. 2 .) 2.) Examination on the total turnover number of the cofactor Pemeriksaan pada jumlah total omset kofaktor yang achieved with the particle-immobilized catalyst system indicated dicapai dengan immobilisasi-sistem katalis partikel ditunjukkan that very dynamic cofactor–enzyme interactions have been real- bahwa interaksi dinamis kofaktor enzim-sangat telah nyata- ized. ized. As shown in Fig. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 3 , TTN for a reaction time of 8 h reached 3, TTN untuk waktu reaksi 8 jam mencapai as high as 2800 (or equivalent to ∼350 h setinggi 2.800 (atau setara dengan 350 h ~ −1 -1 ) when the initial con- ) Ketika awal-con centration of the cofactor was low (0.3 M). centration dari kofaktor yang rendah (0,3 M). Since the reaction Karena reaksi reaches cofactor saturation at a low NAD mencapai kejenuhan kofaktor di NAD rendah + + concentrations, increas- konsentrasi, semakin meningkat- ing the amount of NAD ing jumlah NAD + + did not improve the overall reaction rate, tidak meningkatkan laju reaksi secara keseluruhan, but led to TTNs decreasing with a ratio proportional to the recip- tetapi menyebabkan TTNs penurunan dengan rasio proporsional untuk recip the- rocal of the cofactor concentration ( Fig. 3 ) . rocal konsentrasi kofaktor ( Gambar. 3) . However, higher TTNs Namun, lebih tinggi TTNs can be achieved by increasing the concentrations of the substrates dapat dicapai dengan meningkatkan konsentrasi dari substrat or the amount of enzymes. Table 1 atau jumlah enzim. Tabel 1 summarizes the data of TTN merangkum data TTN for a reaction time of 1 h but with much higher concentrations of untuk waktu reaksi 1 jam tetapi dengan konsentrasi yang lebih tinggi banyak enzymes and substrates. enzim dan substrat. When glutamate and pyruvate concentra- Ketika glutamat dan piruvat konsentrasi-
tion both increased to 30 mM, a TTN of 15,700 h tion kedua meningkat menjadi 30 mM, sebuah TTN dari 15.700 h −1 -1 was achieved. tercapai. Further increase in substrate concentration led to decreased per- Selanjutnya peningkatan konsentrasi substrat menyebabkan menurun per- centage conversions of the substrates, indicating the reaction was tampak dalam persentase konversi dari substrat, menunjukkan reaksi itu approaching substrate saturation. kejenuhan mendekati substrat. Table 3 Tabel 3 Effect of buffer solution on the TTN of particle-attached NAD(H). Pengaruh larutan buffer pada TTN of-melekat NAD partikel (H). Reactions were Reaksi conducted with particles carrying an equivalent amount of 0.3 M of cofactor. dilakukan dengan partikel tercatat jumlah yang setara dengan 0,3 M kofaktor. Both Baik substrates, glutamate and pyruvate, were applied at a concentration of 30 mM. substrat, dan glutamat piruvat, telah diterapkan pada konsentrasi 30 mM. Reac- Reaksi- tions were allowed to last 2 h. tions diizinkan untuk terakhir 2 h. For all buffer solutions examined were set for pH 7.5 Untuk semua solusi buffer diperiksa telah ditetapkan untuk pH 7,5 with a total salt concentrations as 0.1 M. dengan konsentrasi total garam 0,1 M. Buffer systems Buffer sistem TTN TTN Na Na 2 2 HPO HPO 4 4 –NaH -Nah 2 2 PO PO 4 4 1,200 1,200 Na Na 2 2 HPO HPO 4 4 –KH -KH 2 2 PO PO 4 4 740 740 Na Na 2 2 HPO HPO 4 4 –citric acid -Asam sitrat 450 450 Triethanolamine–HCl Trietanolamina-HCl
16,000 16,000 Tris–HCl Tris-HCl 18,000 18,000 NH NH 4 4 Cl–NH Cl-NH 4 4 OH OH 6,700 6,700 HEPES–NaOH HEPES-NaOH 17,000 17,000 We further examined the effect of enzyme ratio on the effi- Kita selanjutnya memeriksa pengaruh rasio enzim pada efisiensi- ciency of cofactor regeneration by fixing the concentration of siensi regenerasi kofaktor dengan menetapkan konsentrasi silica-attached NAD silika-attached NAD + + at 0.3 M. As shown in Table 2 , both initial sebesar 0,3 M. Seperti terlihat pada Tabel 2, baik awal reaction rate and the TTN of NAD laju reaksi dan TTN NAD + + decreased as the GLDH increased. menurun GLDH meningkat. This result was surprising since additional amounts of enzymes Hasil ini mengejutkan karena terjadi penambahan jumlah enzim should not inhibit the reaction even if not promote the reaction. seharusnya tidak menghambat reaksi bahkan jika tidak mempromosikan reaksi. Apparently other factors instead of enzyme ratio are predominant Rupanya faktor lainnya, bukan rasio enzim yang dominan at the current reaction conditions. pada kondisi reaksi saat ini. As to be discussed in the fol- Seperti yang akan dibahas dalam fol the- lowing, the total amount of particles in the solution has in fact melenguh, jumlah total partikel dalam larutan memang telah a stronger impact on the performance of the particle-supported dampak yang kuat pada kinerja-partikel yang didukung reaction system. reaksi sistem. 3.2. 3.2. Factors that control the performance of particle-attached Faktor-faktor yang mengontrol kinerja dari partikel-attached NADH NADH The physicochemical properties of the reaction solution may Sifat fisikokimia dari solusi mungkin reaksi have a strong impact on the particle-supported catalyst system. memiliki dampak yang kuat pada katalis didukung sistem-partikel. For that, we especially examined the effect of the properties of Untuk itu, kami secara khusus menguji pengaruh sifat buffer solution and total amount of particles, as both may impact solusi buffer dan jumlah partikel, karena keduanya dapat mempengaruhi
the dispersion, aggregation and motion of the particles. Table 3 dispersi, agregasi dan gerakan dari partikel. Tabel 3 shows the effect of different types of buffer systems set at pH 7.5 on menunjukkan efek dari berbagai jenis sistem buffer pada pH 7,5 ditetapkan pada the TTN of silica-attached NAD(H). yang TTN of-melekat NAD silika (H). As a result, TTN was generally Akibatnya, TTN pada umumnya low when phosphate buffer solutions were applied, similar to the rendah saat solusi buffer fosfat yang diterapkan, mirip dengan observations reported by others for NAD(H) with phosphate buffer pengamatan dilaporkan oleh orang lain untuk NAD (H) dengan buffer fosfat solutions ( Chenault and Whitesides, 1987 ) . solusi ( Chenault dan Whitesides, 1987 ) . However, high TTNs Namun, tinggi TTNs (above 15,000 within 2 h) were observed with other buffer systems (Di atas 15.000 dalam waktu 2 jam) yang diamati dengan sistem buffer lainnya tested with Tris–HCl buffer gave the highest TTN. diuji dengan buffer Tris-HCl memberikan TTN tertinggi. We further exam- Kita selanjutnya ujian- ined the effect of pH value and the concentration of the Tris–HCl ined pengaruh dari nilai pH dan konsentrasi Tris-HCl buffer system. sistem buffer. Within the range of pH values tested (varied from Dalam kisaran nilai pH diuji (bervariasi dari Table 1 Tabel 1 TTN of the coupled reactions with particle-attached cofactor and enzymes with different substrate concentrations. TTN reaksi ditambah dengan partikel-terpasang kofaktor dan enzim dengan konsentrasi substrat yang berbeda. The reactions were conducted with 10 mg GLDH particles, Reaksi dilakukan dengan partikel GLDH 10 mg, 1 mg LDH particles, NAD particles with amount of cofactor equivalent to 0.3 M in 0.8 mL buffered reaction solution for 1 h. 1 mg LDH partikel, partikel NAD dengan jumlah setara dengan 0,3 M kofaktor dalam reaksi larutan buffer 0,8 mL untuk 1 jam Pyruvate (mM) Piruvat (mM) Glutamate (mM) Glutamat (mM) Initial reaction rate ( mol/min) laju reaksi awal (mol / min) TTN of silica-supported NAD TTN of-didukung NAD silika + + Glutamate conversion (%) Glutamat konversi (%) Pyruvate conversion (%) Piruvat konversi (%) 2.5 2.5 20 20 0.019 0.019 585 585 1.0 1.0 7.8 7.8 5 5 20 20 0.030 0.030 1,100 1,100 1.8 1.8
7.3 7.3 10 10 20 20 0.070 0.070 3,290 3,290 5.5 5.5 11.0 11.0 15 15 20 20 0.120 0.120 6,600 6,600 11.0 11.0 14.7 14.7 20 20 20 20 0.227 0.227 9,500 9,500 15.9 15.9 15.9 15.9 25 25 20 20 0.433 0.433 14,200 14,200 23.7 23.7 19.0 19.0 30 30 20 20 0.460 0.460 15,000 15,000 25.1 25.1 16.7 16.7 30 30 30 30 0.418 0.418 15,700 15,700 17.4 17.4 17.4 17.4 Table 2 Tabel 2 Effect of mass ratio of particle-attached enzymes on the TTN of the cofactor. Pengaruh rasio massa-melekat enzim partikel pada TTN dari kofaktor tersebut. The reactions were conducted with NAD particles of an amount equivalent to 0.3 M cofactor, Reaksi dilakukan dengan partikel NAD dari jumlah yang setara dengan 0,3 kofaktor M, 20 mM glutamate and 10 mM pyruvate in 0.8 mL buffered reaction solution for 1 h. 20 mM glutamat piruvat dan 10 mM dalam reaksi 0,8 mL larutan buffer selama 1 jam Silica bearing GLDH (mg) Silika bantalan GLDH (mg) Silica bearing LDH (mg) Silika bantalan LDH (mg)
Mass ratio of GLDH to LDH rasio Misa GLDH untuk LDH Initial reaction rate ( mol/min) laju reaksi awal (mol / min) TTN of silica-attached NAD TTN of-terpasang NAD silika + + 1 1 1 1 0.6 0.6 0.097 0.097 4200 4200 5 5 1 1 3.2 3.2 0.079 0.079 3600 3600 10 10 1 1 6.5 6.5 0.070 0.070 3300 3300 20 20 1 1 13.5 13.5 0.058 0.058 2300 2300
Page 5 Page 5106 106 W. Liu et al. W. Liu et al. / Journal of Biotechnology 139 (2009) 102–107 / Jurnal 139 Bioteknologi (2009) 102-107 Fig. Gambar. 4. Effect of pH value on the TTN of particle-attached NAD(H) with particle- 4. Pengaruh nilai pH pada TTN of-melekat NAD partikel (H) dengan partikel- attached enzymes. terpasang enzim. The reactions were conducted with 0.1 M Tris–HCl buffer solution Reaksi dilakukan dengan 0,1 M-HCl buffer Tris solusi for 1 h. selama 1 jam Volume of reaction solution was 0.8 mL with GLDH- and LDH-particles were Volume larutan 0,8 mL reaksi dengan GLDH-dan partikel LDH-adalah applied at 1 mg each; the amount NAD-particles was controlled to maintain a cofac- diterapkan pada masing-masing 1 mg; jumlah NAD-partikel itu dikendalikan untuk mempertahankan cofac- tor of 0.3 M; both glutamate and pyruvate were applied at 30 mM. tor dari 0,3 M; glutamat piruvat baik dan diterapkan pada 30 mM. 7.3 to 8.0, determined by the preferred pH of GDH and LDH), the 7,3-8,0, ditentukan oleh pH yang lebih disukai GDH dan LDH), yang reaction appeared to be insensitive to changes in pH value ( reaksi tampaknya tidak sensitif terhadap perubahan nilai pH ( Fig. Gambar. 4 ). 4). Instead, the concentration of Tris salt in the buffer solution showed Sebaliknya, konsentrasi garam Tris dalam larutan buffer menunjukkan
a stronger impact ( Fig. 5 ) . dampak yang lebih kuat ( Gambar. 5) . It appeared lower salt concentrations are Tampaknya konsentrasi garam yang lebih rendah preferred with TTN reached 20,000 h disukai dengan TTN mencapai 20.000 h −1 -1 at 10 mM. di 10 mM. Particle mobility is a key factor in realizing the regeneration of Partikel mobilitas merupakan faktor kunci dalam mewujudkan regenerasi the cofactor and coupled reactions with the immobilized catalytic yang kofaktor dan reaksi ditambah dengan amobil katalitik system. sistem. Higher concentration of particles is generally desired to Semakin besar konsentrasi partikel umumnya diinginkan untuk improve the collision frequency and thus the overall reaction rate; meningkatkan frekuensi tabrakan dan dengan demikian laju reaksi secara keseluruhan; however, particles also tend to aggregate at higher concentrations. Namun, partikel juga cenderung agregat pada konsentrasi yang lebih tinggi. Although the surface-attached enzyme and cofactor molecules Meskipun-melekat enzim dan molekul permukaan kofaktor improve the compatibility of the particles with the aqueous solu- meningkatkan kompatibilitas partikel dengan solusi berair- tion and help them disperse, they are also “sticky” to each other tion dan membantu mereka bubar, mereka juga "lengket" satu sama lain and aggregation will be more likely to form at higher concentra- dan agregasi akan lebih mungkin terbentuk pada konsentrasi yang lebih tinggi- tions. subpopulasi. We examined this issue by studying the reaction rate as a Kami meneliti masalah ini dengan mempelajari laju reaksi sebagai function of concentration of total particles. fungsi dari konsentrasi total partikel. As shown in Fig. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 6 , TTN 6, TTN of the cofactor maintained high when the solid concentration was dari kofaktor tersebut dipertahankan tinggi ketika konsentrasi padat low (with liquid–solid mass ratio above 200 in Fig. 6 ) , whereas rendah (dengan perbandingan massa padat-cair di atas 200 pada Gambar 6.) , sedangkan it dropped sharply as the solid concentration further increased itu menurun tajam sebagai peningkatan konsentrasi padatan lebih lanjut Fig. Gambar. 5. Effect of salt concentration on the TTN the particle-attached NAD(H). 5). Pengaruh konsentrasi garam pada TTN partikel-dilampirkan NAD (H. pH pH value was fixed at 7.5 with all the other conditions the same as those in Fig. nilai tetap sebesar 7,5 dengan semua kondisi lain yang sama seperti yang di Gambar. 4 . 4. Fig. Gambar. 6. Effect of liquid–solid mass ratio on the TTN of particle-attached NAD(H). 6. Pengaruh rasio massa padat-cair pada TTN of-melekat NAD partikel (H). (◆) (◆) TTN of the cofactor realized with 10 mg GLDH particles and 1 mg LDH particles in TTN dari kofaktor tersebut diwujudkan dengan partikel GLDH 10 mg dan 1 partikel LDH mg dalam various amount of liquid solution (0.5–3 mL, pH 7.5), with all the other reaction jumlah berbagai larutan cair (0,5-3 mL, pH 7,5), dengan semua reaksi lain conditions the same as those in Fig. kondisi yang sama seperti yang di Gambar. 4 . (□) The effective diameter of particles and 4. (□) Diameter efektif partikel dan
their aggregates in the reaction solution determined via light scattering. agregat mereka dalam larutan reaksi ditentukan melalui hamburan cahaya. (in the low value region of the liquid–solid mass ratio). (Di wilayah nilai rendah dari rasio massa padat-cair). That sug- saran itu- gested a critical phase transition of the particles took place when gested transisi fase kritis partikel terjadi ketika the liquid–solid ratio reduced to 200. the-padat rasio cair dikurangi menjadi 200. Our particle size detection Kami deteksi ukuran partikel using light scattering also supported such a transition as the appar- menggunakan hamburan cahaya juga didukung seperti transisi sebagai Appar the- ent particle size increased sharply as the liquid–solid mass ratio ukuran partikel ent meningkat tajam sebagai rasio massa padat-cair decreased, indicating severe particle aggregation took place at that menurun, menunjukkan agregasi partikel parah terjadi pada saat itu solid concentration region ( padat konsentrasi wilayah ( Fig. Gambar. 6 ). 6). 4. 4. Conclusions Kesimpulan GLDH, LDH and their cofactor NAD(H) were covalently immo- GLDH, LDH dan kofaktor mereka NAD (H) adalah kovalen Immo- bilized separately on the surface of silica nanoparticles and were bilized secara terpisah pada permukaan nanopartikel silika dan applied successfully for coupled biotransformation reactions with berhasil diterapkan untuk reaksi biotransformasi digabungkan dengan in situ cofactor regeneration. dalam regenerasi kofaktor situ. As expected, the mobility of the par- Seperti yang diharapkan, mobilitas nominal- ticles is critical to realizing dynamic enzyme–cofactor interactions, ticles sangat penting untuk mewujudkan kofaktor enzim-interaksi dinamis, and efficient biotransformations can be achieved when the par- dan biotransformations efisien dapat dicapai apabila nominal- ticles well dispersed in the solution. ticles juga tersebar dalam larutan. The use of particle-attached Penggunaan partikel-attached systems will allow easy recovery through methods such as filtration sistem akan memungkinkan pemulihan mudah melalui metode seperti penyaringan and precipitation, and can be recycled and reused, thus substan- dan curah hujan, dan dapat didaur ulang dan digunakan kembali, sehingga substan- tially improving the potential of cofactor-dependent biochemical tially meningkatkan potensi-tergantung biokimia kofaktor reactions for large-scale industrial bioprocessing applications. Reaksi untuk skala besar aplikasi Bioprocessing industri. Acknowledgements Ucapan Terima Kasih Liu thanks financial support of a postdoctoral fellowship from Liu berkat dukungan finansial dari persekutuan postdoctoral dari National Science Foundation of China (NSFC#20060390522). National Science Foundation of China (NSFC # 20060390522). The The authors thank supports from NSFC and Chinese Academy of Sci- penulis mengucapkan terima kasih dukungan dari NSFC dan Cina Akademi Sci-
ences (NSFC#20576135, #KSCX2-YW-G-019, and #2006AA02Z217 disebabkan oleh perbedaan (NSFC # 20576135, # KSCX2-YW-G-019, dan # 2006AA02Z217 of 863 initiative). dari 863 inisiatif). Wang acknowledges the support from US National Wang mengakui dukungan dari US National Science Foundation (BES#0348412). Yayasan Sains (BES # 0348412). The authors thank Ms. Muqing Penulis berterima kasih kepada Ms Muqing Zheng for assistance in some of the experimental work. Zheng untuk bantuan dalam beberapa karya eksperimental. References Referensi Chang, TMS, Yu, YT, Grunwald, J., 1982. Chang, TMS, Yu, YT, Grunwald, J., 1982. Artificial cells immobilized multienzyme sel buatan amobil multienzim systems and cofactors. sistem dan kofaktor. Enzyme Eng. Enzim Eng. 6, 451–561. 6, 451-561. Chenault, HK, Whitesides, GM, 1987. Chenault, HK, Whitesides, GM, 1987. Regeneration of nicotinamide cofactors for Regenerasi kofaktor nicotinamide untuk use in enzymatic synthesis. digunakan dalam sintesis enzimatik. Appl. Appl. Biochem. Biochem. Biotechnol. Biotechnol. 14 (2), 147–197. 14 (2), 147-197. Davies, P., Mosbach, K., 1974. Davies, P., Mosbach, K., 1974. The application of immobilized NAD Penerapan NAD amobil + + in an enzyme dalam enzim electrode and in model enzyme reactors. elektroda dan dalam reaktor enzim model. Biochim. Biochim. Biophys. Biophys. Acta 370 (2), Acta 370 (2), 329–338. 329-338. Devaux-Basseguy, R., Bergel, A., Comtat, M., 1997. Devaux-Basseguy, R., Bergel, A., Comtat, M., 1997. Potential applications of NAD(P)- Potensi aplikasi NAD (P) - dependent oxidoreductases in synthesis: a survey. tergantung oxidoreductases dalam sintesis: survei. Enzyme Microb. Enzim MicroB. Technol. Technol. 20, 20, 248–258. 248-258.
Page 6 Page 6W. Liu et al. W. Liu et al. / Journal of Biotechnology 139 (2009) 102–107 / Jurnal 139 Bioteknologi (2009) 102-107 107 107 Du, Y.-Z., Hiratsuka, Y., Taira, S., Eguchi, M., Uyeda, TQP, Yumoto, N., Kodaka, M., Du, Y.-Z., Hiratsuka, Y., Taira, S., Eguci, M., Uyeda, TQP, Yumoto, N., Kodaka, M., 2005. 2005. Motor protein nano-biomachine powered by self-supplying ATP. Motor protein nano-biomachine powered by self-memasok ATP. Chem. Chem. Commun., 2080–2082. Commun 2080-2082.,. El-Zahab, B., Jia, H., Wang, P., 2004. El-Zahab, B., Jia, H., Wang, P., 2004. Enabling multienzyme biocatalysis using Mengaktifkan multienzim Biocatalysis menggunakan nanoporous materials. nanoporous bahan. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 87 (2), 178–183. 87 (2), 178-183. El-Zahab, B., Wang, P., 2008. El-Zahab, B., Wang, P., 2008. Particle-attached NADH for methanol production from Partikel-terlampir NADH untuk produksi metanol dari CO CO 2 2
catalyzed by coimmobilized enzymes. dikatalisis oleh enzim coimmobilized. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 99 (3), 508–514. 99 (3), 508-514. Furukawa, S., Katayama, N., Izuka, T., Urabe, I., Okada, H., 1980. Furukawa, S., Katayama, N., Izuka, T., Urabe, I., Okada, H., 1980. Preparation of Persiapan polyethylene glycol-bound NAD and its application in a model enzyme reactor. polietilen glikol-terikat NAD dan aplikasinya dalam reaktor enzim model. FEBS Lett. FEBS Lett. 121 (2), 239–242. 121 (2), 239-242. Gestrelius, Gestrelius, S., S., Mansson, Mansson, M., M., Mosbach, Mosbach, K., K., 1975. 1975. Preparation Persiapan of dari an sebuah alcoholdehydrogenase-NAD(H)-sepharose complex showing no requirement alcoholdehydrogenase-NAD (H)-sepharose kompleks menunjukkan tidak ada persyaratan of soluble coenzyme for its activity. dari koenzim larut untuk aktivitasnya. Eur. Eur. J. Biochem. J. Biochem. 57, 529–535. 57, 529-535. Howaldt, M., Kulbe, KD, Chmiel, H., 1990. Howaldt, M., Kulbe, KD, Chmiel, H., 1990. A continuous enzyme membrane reac- Sebuah membran enzim kontinu reaksi- tor retaining the native nicotinamide cofactor NAD(H). tor mempertahankan NAD asli nicotinamide kofaktor (H). Ann. Ann. NY Acad. NY Acad. Sci. Sci. 589, 589, 253–260. 253-260. Hummel, W., 1999. Hummel, W., 1999. Large-scale applications of NAD(P)-dependent oxidoreductases: Skala besar aplikasi dari NAD (P) tergantung oxidoreductases-: recent developments. perkembangan baru-baru ini. Trends Biotechnol. Tren Biotechnol. 17 (12), 487–492. 17 (12), 487-492. Ikemi, M., Ishimatsu, Y., Kise, S., 1990a. Ikemi, M., Ishimatsu, Y., Kise, S., 1990a. Sorbitol production in charged membrane Sorbitol produksi di membran dibebankan bioreactor with coenzyme regeneration system. bioreaktor dengan sistem regenerasi koenzim. II. II. Theoretical analysis of a con- Teoritis analisis suatu con- tinuous reaction with retained and regenerated NADPH. tinuous reaksi dengan dan regenerasi NADPH ditahan. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 36 36 (2), 155–165. (2), 155-165. Ikemi, M., Koizumi, N., Ishimatsu, Y., 1990b. , M., Koizumi, N., Ishimatsu Ikemi, Y., 1990b. Sorbitol production in charged Sorbitol produksi dibebankan membrane bioreactor with coenzyme regeneration system. membran bioreaktor dengan sistem regenerasi koenzim. I. Selective retain- I. Selektif mempertahankan- ment of NADP(H) in a continuous reaction. bangan NADP (H) dalam reaksi terus-menerus. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 36 (2), 149– 36 (2), 149 - 154. 154. Ilan, E., Chang, TMS, 1986. Ilan, E., Chang, TMS, 1986. Lipid-polyamide–polyethyleneimine microcapsules Lipid-poliamida-polyethyleneimine mikrokapsul
for immobilization of free cofactors and multienzyme system. untuk imobilisasi dari kofaktor gratis dan sistem multienzim. Appl. Appl. Biochem. Biochem. Biotechnol. Biotechnol. 13 (3), 221–230. 13 (3), 221-230. Jia, H., Zhu, G., Wang, P., 2003. Jia, H., Zhu, G., Wang, P., 2003. Catalytic behaviors associated with enzymes attached Catalytic perilaku yang terkait dengan enzim terpasang to nanoparticles: the effect of particle mobility. pada nanopartikel: pengaruh mobilitas partikel. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 84, 406–414. 84, 406-414. Kim, MI, Ham, HO, Oh, S.-D., Park, HG, Chang, HN, Choi, S.-H., 2006. Kim, MI, Ham, HO, Oh, S.-D., Park, HG, Chang, HN, Choi, S.-H., 2006. Immobiliza- Immobiliza- tion of Mucor javanicus lipase on effectively functionalized silica nanoparticles. tion lipase Mucor javanicus pada nanopartikel silika difungsikan secara efektif. J. Mol. J. Mol. Catal. Catal. B: Enzyme 39, 62–68. B: Enzim 39, 62-68. Kitpreechavanich, V., Nishio, N., Hayashi, M., Nagai, S., 1985. Kitpreechavanich, V., Nishio, N., Hayashi, M., Nagai, S., 1985. Regeneration and Regenerasi dan retention of NADP(H) for xylitol production in an ionized membrane reactor. retensi NADP (H) untuk produksi xylitol dalam reaktor membran terionisasi. Biotechnol. Biotechnol. Lett. Lett. 7 (9), 657–662. 7 (9), 657-662. Kulbe, KD, Howaldt, MW, Schmidt, K., Röthig, TR, Chmiel, H., 1990. Kulbe, KD, Howaldt, MW, Schmidt, K., Röthig, TR, Chmiel, H., 1990. Rejection and Penolakan dan continuous regeneration of the native coenzyme NAD(P)H in a charged ultrafil- terus regenerasi NAD asli koenzim (P) H di dibebankan-ultrafil tration membrane enzyme reactor. trasi sipil membran reaktor enzim. Ann. Ann. NY Acad. NY Acad. Sci. Sci. 613, 820–826. 613, 820-826. Larsson, PO, Mosbach, K., 1974. Larsson, PO, Mosbach, K., 1974. The preparation and characterisation of a water- Penyusunan dan karakterisasi air- soluble coenzymically active dextran-NAD larut coenzymically aktif dekstran-NAD + + . . FEBS Lett. FEBS Lett. 46 (1), 119–122. 46 (1), 119-122. Le, M., Means, GE, 1998. Le, M., Berarti, GE, 1998. NAD NAD + + /NADH recycling by coimmobilized lactate dehy- / NADH daur ulang oleh dehy laktat coimmobilized- drogenase and glutamate dehydrogenase. drogenase dan glutamat dehidrogenase. Enzyme Microb. Enzim MicroB. Technol., 49– Technol 49., - 57. 57. Lin, J., Siddiqui, JA, Ottenbrite, RM, 2001. Lin, J., Siddiqui, JA, Ottenbrite, RM, 2001. Surface modification of inorganic oxide Permukaan modifikasi oksida anorganik particles with silane coupling agent and organic dyes. partikel dengan bahan penghubung silan dan pewarna organik. Polym. Polym. Adv. Adv. Technol. Technol. 12 12 (5), 285–292. (5), 285-292. Lin, SS, Harada, T., Hata, C., Miyawaki, O., Nakamura, K., 1997. Lin, SS, Harada, T., Hata, C., Miyawaki, O., Nakamura, K., 1997. Nanofiltration mem- Nanofiltrasi mem- brane bioreactor for continuous asymmetric reduction of 2-ketoglutarate to brane bioreaktor untuk pengurangan asimetris terus menerus 2-ketoglutarate untuk produce l-glutamate with NADH regeneration. menghasilkan l-glutamat dengan regenerasi NADH. J. Ferment. J. Fermentasi. Bioeng. Bioeng. 83 (1), 54– 83 (1), 54 -
58. 58. Lin, SS, Miyawaki, O., Nakamura, K., 1999. Lin, SS, Miyawaki, O., Nakamura, K., 1999. Continuous production of l-carnitine with Continuous produksi l-carnitine dengan NADH regeneration by a nanofiltration membrane reactor with coimmobilized NADH regenerasi dengan reaktor membran nanofiltrasi dengan coimmobilized l-carnitine dehydrogenase and glucose dehydrogenase. l-karnitin dehidrogenase dan glukosa dehidrogenase. J. Biosci. J. Biosci. Bioeng. Bioeng. 87 (3), 87 (3), 361–364. 361-364. Liu, W., Wang, P., 2007. Liu, W., Wang, P., 2007. Cofactor regeneration for sustainable enzymatic biosynthesis. Kofaktor regenerasi untuk biosintesis enzimatik berkelanjutan. Biotechnol. Biotechnol. Adv. Adv. 25 (4), 369–384. 25 (4), 369-384. Månsson, MO, Larsson, PO, Mosbach, K., 1979. Månsson, MO, Larsson, PO, Mosbach, K., 1979. Recycling by a second enzyme of Daur ulang oleh enzim kedua NAD covalently bound to alcohol dehydrogenase. NAD kovalen terikat pada alkohol dehidrogenase. FEBS Lett. FEBS Lett. 98 (2), 309–313. 98 (2), 309-313. Nidetzky, B., Haltrich, D., Kulbe, KD, 1996. Nidetzky, B., Haltrich, D., Kulbe, KD, 1996. Carry out coenzyme conversions eco- Melakukan konversi koenzim eko- nomically. nomically. Chem. Chem. Tech. Tech. 26, 31–36. 26, 31-36. Nidetzky, B., Schmidt, B., Neuhauser, W., Haltrich, D., Kulbe, KD, 1994. Nidetzky, B., Schmidt, B., Neuhauser, W., Haltrich, D., Kulbe, KD, 1994. Application of Penerapan charged ultrafiltration membranes in continuous, enzyme-catalyzed processes dibebankan ultrafiltrasi membran dalam terus menerus,-katalis proses enzim with coenzyme regeneration. dengan regenerasi koenzim. In: Pyle, DL (Ed.), Separation for Biotechnology. Dalam:, DL Pyle (Ed.), Pemisahan Bioteknologi. Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 351–357. Royal Society of Chemistry, Cambridge, hal 351-357. Obón, JM, Almagro, MJ, Manjón, A., Iborra, JL, 1996. Obon, JM, Almagro, MJ, Manjón, A., Iborra, JL, 1996. Continuous retention of Continuous retensi native NADP(H) in an enzyme membrane reactor for gluconate and glutamate asli NADP (H) dalam reaktor membran enzim untuk glukonat dan glutamat production. produksi. J. Biotechnol. J. Biotechnol. 50 (1), 27–36. 50 (1), 27-36. Obón, JM, Manjón, A., Iborra, JL, 1998. Obon, JM, Manjón, A., Iborra, JL, 1998. Retention and regeneration of native NAD(H) Retensi dan regenerasi NAD asli (H) in noncharged ultrafiltration membrane reactors: application to l-lactate and pada membran ultrafiltrasi reaktor noncharged: aplikasi untuk l-laktat dan gluconate production. glukonat produksi. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 57 (5), 510–517. 57 (5), 510-517. Röthig, TR, Kulbe, KD, Bückmann, F., Carrea, G., 1990. Röthig, TR, Kulbe, KD, Bückmann, F., Carrea, G., 1990. Continuous coenzyme depen- Continuous koenzim ketergantungan- dent stereoselective synthesis of sulcatol by alcohol dehydrogenase. penyok stereoselektif sintesis sulcatol oleh dehidrogenase alkohol. Biotechnol. Biotechnol. Lett. Lett. 12 (5), 353–356. 12 (5), 353-356. Stengelin, M., Patel, RN, 2000. Stengelin, M., Patel, RN, 2000. Phenylalanine dehydrogenase catalyzed reductive Fenilalanin dehidrogenase katalis reduktif amination of 6-(1 ,3 -dioxolan-2 -yl)-2-keto-hexanoic acid to 6-(1 ,3 -dioxolan- ebabkan 6 - (1, 3-dioxolan-2-il) 2-keto-hexanoic asam-untuk 6 - (1, 3-dioxolan-
2 -yl)-2S-aminohexanoic acid with NADH regeneration and enzyme and 2-il)-2S-aminohexanoic asam dengan regenerasi NADH dan enzim dan cofactor retention. kofaktor retensi. Biocatal. Biocatal. Biotransform. Biotransform. 18 (5), 373–400. 18 (5), 373-400. Sundberg, L., Porath, J., 1974. Sundberg, L., Porath, J., 1974. Preparation of adsorbents for biospecific affinity chro- Persiapan adsorben untuk chro afinitas biospecific- matography. matography. I. Attachment of group-containing ligands to insoluble polymers Lampiran I. kelompok yang mengandung ligan untuk polimer tidak larut by means of bifunctional oxiranes. dengan cara senyawa oksiran bifunctional. J. Chromatogr. J. Chromatogr. 90 (1), 87–98. 90 (1), 87-98. Wandrey, C., Bossow, B., 1986. Wandrey, C., Bossow, B., 1986. Continuous cofactor regeneration-utilization of poly- Continuous kofaktor regenerasi-pemanfaatan poli- mer bound NAD(H) for the production of optically active acids. mer terikat NAD (H) untuk produksi asam aktif optik. Biotechnol. Biotechnol. Bioind. Bioind. 3, 8–13. 3, 8-13. Wang, P., 2006. Wang, P., 2006. Nanoscale biocatalyst systems. Nano biokatalis sistem. Curr. Curr. Opin. Opin. Biotechnol. Biotechnol. 17 (6), 17 (6), 574–579. 574-579. Wykes, JR, Dunnill, P., Lilly, MD, 1975. Wykes, JR, Dunnill, P., Lilly, MD, 1975. Cofactor recycling in an enzyme reactor. Kofaktor daur ulang dalam reaktor enzim. A A comparison using free and immobilized dehydrogenases with free and immo- perbandingan menggunakan dan amobil dehydrogenases gratis dengan bebas dan Immo- bilized NAD. bilized NAD. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 17, 51–68. 17, 51-68. Yamazaki, Y., Maeda, H., 1982. Yamazaki, Y., Maeda, H., 1982. The co-immobilization of NAD and dehydrogenases Co-imobilisasi NAD dan dehydrogenases and its application to bioreactors for synthesis and analysis. dan aplikasi untuk bioreaktor untuk sintesis dan analisis. Agric. Agric. Biol. Biol. Chem. Chem. 46 (6), 1571–1581. 46 (6), 1571-1581. Yamazaki, Y., Maeda, H., Suzuki, H., 1976. Yamazaki, Y., Maeda, H., Suzuki, H., 1976. Application of polylysine bound succinyl- NA to a membrane reactor. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 18 (12), 1761–1775. Yokokawa, R., Tarhan, MC, Kon, T., Fujita, H., 2008. Simultaneous and bidirectional transport of kinesin-coated microspheres and dynein-coated microspheres on polarity-oriented microtubules. Biotechnol. Biotechnol. Bioeng. Bioeng. 101 (1), 1–8. Yu, YT, Chang, TMS, 1981a. Lipid-polymer membrane artificial cells containing. Multienzyme systems, cofactors and substrates for the removal of ammonia and urea. urea. Trans. Trans. Am. Am. Soc. Soc. Artif. Intern. Organs 27, 535–538. Yu, YT, Chang, TMS, 1981b. Ultrathin lipid-polymer membrane microcapsules con- taining multienzymes, cofactors and substrates for multistep enzyme reactions. FEBS Lett. FEBS Lett. 125 (1), 94–96. Yu, YT, Chang, TMS, 1982. Immobilization of multienzymes and cofactors within lipid-polyamide membrane microcapsules for the multistep conversion of lipophilic and lipophobic substrates. Enzyme Microb. Enzim MicroB. Technol. Technol. 4, 327–331. Zappelli, P., Rossodivita, A., Prosperi, G., Pappa, R., Re, L., 1976. New coenzymically- active soluble and insoluble macromolecular NAD
+ + derivatives. derivatif. Eur. J. Biochem. J. Biochem. 62, 211–215. Zappelli, P., Rossodivita, A., Re, L., 1975. Synthesis of coenzymically active soluble and insoluble macromolecularized NAD + + derivatives. derivatif. Eur. J. Biochem. J. Biochem. 54, 475–482.
