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Roma, 29 maggio 2008“La diagnostica di laboratorio in sanità animale”
MycobacteriumMycobacterium aviumavium subspsubsp. . paratuberculosisparatuberculosis: caratteristiche : caratteristiche
biologiche e biologiche e genotipichegenotipiche
N. Arrigoni, R. TaddeiIstituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia RomagnaCentro di Referenza Nazionale della Paratubercolosi - Piacenza
"Mycobacterium enteritidis" Lehmann in Lehmann e Neumann 1927
"Bacterium paratuberculosis" (Bergey et al. 1923) Miessner & Berge in Kolle e Wasserman 1929
"Bacillus paratuberculosis" (Bergey et al. 1923) Krasil'nikov 1941
"Mycobacterium johnei" Francis 1943
“Mycobacterium paratuberculosis” Bergey et al. 1923 (Approved Lists 1980)
TassonomiaTassonomia
“Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis”(Bergey et al. 1923) Thorel et al. 1990
16S rDNA
“Mycobacterium enteritidis chronicae pseudotuberculosis bovis Johne” Twort e Ingram 1912
Aerobio, immobile, non produce flagelli, capsule o spore
MycobacteriumMycobacterium aviumavium subspsubsp. . paratuberculosisparatuberculosis ((MapMap))
Bacillo di piccole dimensioni (0,5 - 1 µm )
Gram positivo, Alcool-acidoresistente
Membrana plasmatica
Peptidoglicani
Arabinogalattani
Acidi micolici
Parete ricca di lipidi e
polisaccaridi
Aggregato o “clump”
SOPRAVVIVENZA NELLSOPRAVVIVENZA NELL’’AMBIENTEAMBIENTE
Map può sopravvivere
• 163 gg in acqua di fiume• 336 gg in acqua stagnante• 1.210 gg nel suolo• 330 gg nelle feci• 7 gg nelle urine
SOPRAVVIVENZA NEL LETAMESOPRAVVIVENZA NEL LETAME
98 gg a 15°C28 gg a 30°C<3 h a 55°C
SOPRAVVIVENZA DI SOPRAVVIVENZA DI MapMap NELLNELL’’AMBIENTEAMBIENTE
Resistente a:alte temperaturecomuni disinfettanti
la clorazione dell’acqua non è in grado di inattivare Map
SOPRAVVIVENZA NELLSOPRAVVIVENZA NELL’’AMBIENTEAMBIENTE
Sensibile a:formalina 5%fenolo 2,5%
Lenta crescita (4-16 settimane)
CRESCITA E SVILUPPOCRESCITA E SVILUPPO
CEPPI OVINICEPPI OVINICrescita molto lenta (fino a 40 settimane)Colonie molto piccole e a volte pigmentate
Colonie piccole (1-2 mm)lisce, lucide, solitamente non pigmentate
QUANTE FORME VITALI PUOQUANTE FORME VITALI PUO’’ ASSUMERE ASSUMERE MapMap??
Vegetativa Sferoplasto
Dormiente
Parassita obbligato
CRESCITA E SVILUPPOCRESCITA E SVILUPPO
ACQUISIZIONE DEL FERRO NEI MICOBATTERIACQUISIZIONE DEL FERRO NEI MICOBATTERI
mycobactin
Esterno Parete cellulare Interno
esocheline
Fe
Fe-esocheline Fe
mycobactinreduttasi
Fe-mycobactin
Mycobactin dipendente in vitro
……E IN E IN MapMap??
Citoplasma
Assunzione del ferro “in vitro” da parte di Map
Fe + Mycobactin
La Mycobactin dipendenza non è patognomonica per MapMeccanismo di assunzione di ferro in vivo sconosciuto
Fe
Li, Lingling et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 12344-12349
4,83 mbp di cui 4,54 mostrano il 96-100% di omologia con Maa
6% (289 kb) del genoma esclusivo di Map
G+C 69.3%
∼ 4.350 geni codificanti proteine
Non ci sono plasmidi
1.5% del genoma è composto da DNA ripetuto
IL GENOMA DI IL GENOMA DI MapMap
Le sequenze di inserzione (IS) sono piccoli segmenti di DNA (<2.5kb) mobili in grado di inserirsi in siti multipli del genoma.
Il genoma di Map contiene 20 diversi elementi IS
SEQUENZE DI INSERZIONESEQUENZE DI INSERZIONE
IS900IS1311ISMav2ISMpc1IS_Map01
IS_Map02IS_Map03IS_Map04IS_Map05IS_Map06
IS_Map07IS_Map08IS_Map09IS_Map10IS_Map11
Sequenze dSequenze d’’inserzione di inserzione di MapMap
IS_Map12IS_Map13IS_Map14IS_Map15IS_Map16
Presenti in NUMERO e POSIZIONI variabili nel genoma
Possono essere SPECIE SPECIFICHE
UTILIZZO DIAGNOSTICO DELLE UTILIZZO DIAGNOSTICO DELLE SEQUENZE DI INSERZIONESEQUENZE DI INSERZIONE
Sequenza d’inserzione
organismo n°copie/genoma
utilizzo tecnica
IS900 Map,ma non solo!
Map
Map
Map, Maa,M.intracellulare
17-20 Diagnosi Map PCR
ISMav2 almeno 3 Diagnosi Map PCR
IS_Map02 6 Diagnosi Map PCR
IS1311 7-10 Distinzione ceppi ovini/bovini
PCR-REA
TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI MapMap: IS: IS900900 RFLPRFLP
•Separazione elettroforetica dei frammenti di restrizione
•Analisi dei fingerprint
•Digestione enzimatica
•Ibridazione con sonda •Southern blotting
Sonda marcata
1 1 2 3
a
b
a b
a b d
a
b
d
sito di restrizione Sequenza d’inserzione (IS) Sonda
COME POSSONO ESSERE SPIEGATI I DIVERSI PROFILI DI COME POSSONO ESSERE SPIEGATI I DIVERSI PROFILI DI RESTRIZIONE OSSERVATI?RESTRIZIONE OSSERVATI?
a
b
c
a b c
ISIS900900 RFLP: RISULTATIRFLP: RISULTATI
Ospite
I Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici
S Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici
C Bovini, Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici, Uomo
Corsa in campo pulsato che permette la risoluzione di frammenti >20Kb
TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI MapMap::PFGE (Gel Elettroforesi in Campo Pulsato)PFGE (Gel Elettroforesi in Campo Pulsato)
Digestione con enzima di restrizione“rare cutter”
PCR 1311 - REA
HinfI = cambio di base in posizione 223 presente in alcune copie di IS1311 di Map Bovino
distingue tra ceppi B/S di Map
MseI = cambio di base in posizione 442 presente in IS1311 di Maa
distingue tra Map e Maa
PCR 1311 - REAHinfI+MseI HinfI
1 2 3 4 1 2 3
Lane 1: MarkerLane 2: Map BovinoLane 3: Map Ovino
Lane 1: MarkerLane 2: M.aviumLane 3: Map BovinoLane 4: Map Ovino
Tipo ITipo I Tipo IITipo II Tipo IIITipo III
ISIS900900--RFLPRFLP S C I
CrescitaCrescita Molto lenta lenta Molto lenta
PigmentazionePigmentazione presente assente assente
Preferenza dPreferenza d’’ospiteospite pecore assente capre
Distribuzione geograficaDistribuzione geografica limitata globale Spagna
ISIS13111311--PCR REAPCR REA Ovino Bovino Ovino
Tipizzazione di Map attraverso PFGE: Tipizzazione di Map attraverso PFGE: RisultatiRisultati
Maa Tipo I Tipo III Tipo II
Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis strainsfrom cattle and sheep can be distinguished by a PCR
test based on a novel DNA sequence difference
Prodotti PCR da ceppi bovini e ovini di Map amplificati con DMC529, DMC531, DMC533Lane 1 e 11: Marcatori di PMLane 2-3-4-5: Ceppi boviniLane 6-7-8-9: Ceppi oviniLane 10: Controllo negativo
Desmond M. Collins et All., J.Clin.Microb.(2002): 40, 12, 4760-4762
Vantaggi:Processo 1 step invece che 3 steps
Svantaggi:Minore sensibilità(1 copia invece che 17-20)
PFGE: SVANTAGGI
• Applicabile solo a ceppi coltivabili• Lento • Indaginoso• Analisi dei pattern complessa• Basso potere discriminatorio
New variable-number tandem-repeat markers for typingMycobacterium avium subsp. paratuberculosis and
M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245 restriction fragment length polymorphism typing
Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410
Analisi della sequenza genomica del ceppoMap K10 per la presenza di sequenze TR
minisatelliti (10-100 bp)
Identificazione di 8 loci TR e MIRU che dimostrano polimorfismi dimensionali dopo PCR
New variable-number tandem-repeat markers for typingMycobacterium avium subsp. paratuberculosis and
M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245 restriction fragment length polymorphism typing
Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410
Potere discriminatorio di IS900 RFLP e MIRU-VNTR
Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410
Typing Method DiscriminatoryIndex
RFLP 0,483
MIRU-VNTR 0,751
RFLP + MIRU-VNTR 0,855