MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae€¦ · Neisseria-gonorrhoeae-DNA in klinischen Proben mittels Real-time-PCR in offenen Real-time-PCR-Systemen (z.B. LightCycler 480 [Roche], RotorGene

Arbeitsanleitung/Manual

MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae

real time PCR kitTest für den qualitativen in-vitro-Nachweis von

Neisseria-gonorrhoeae-DNA in klinischen Proben

Test for the qualitative in vitro detection of Neisseria gonorrhoeae DNA in clinical specimens

Gültig ab / Valid from 2018-07-17

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany

Tel.: +49 6251 70190-0 Fax: + 49 6251 70190-363

e.mail: [email protected] www.immundiagnostik.com

KS29459696

-18 °C

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Arbeitsanleitung MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae

Inhalt

1 VERWENDUNGSZWECK ________________________________________________ 1

2 EINLEITUNG __________________________________________________________ 1

3 TESTPRINZIP _________________________________________________________ 2

4 INHALT DER TESTPACKUNG ____________________________________________ 2

5 ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL _______________________ 3

6 TRANSPORT, LAGERUNG UND STABILITÄT _______________________________ 3

7 WICHTIGE HINWEISE __________________________________________________ 3

8 ALLGEMEINE HINWEISE ________________________________________________ 3

9 PROBENMATERIAL ____________________________________________________ 4

10 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN UND PROBEN _________________________ 4

10.1 Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien ______________________________ 410.2 Vorbereitung der Proben _____________________________________________ 5

11 KONTROLL-DNA ______________________________________________________ 5

DNA-Isolation aus klinischen Proben ________________________________________ 5

12 REAL-TIME-PCR _______________________________________________________ 6

12.1 Wichtige Hinweise vor Beginn _________________________________________ 612.2 Durchführung _____________________________________________________ 612.3 Geräteeinstellungen _________________________________________________ 7

13 INTERPRETATION DER ERGEBNISSE _____________________________________ 8

14 VALIDIERUNGSDATEN ________________________________________________ 10

15 EINSCHRÄNKUNGEN _________________________________________________ 10

16 PROBLEMBEHANDLUNG ______________________________________________ 10

17 ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE ________________________________________ 12


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1 VERWENDUNGSZWECKDer MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR-Kit dient dem Nachweis von Neisseria-gonorrhoeae-DNA in klinischen Proben mittels Real-time-PCR in offenen Real-time-PCR-Systemen (z. B. LightCycler 480 [Roche], RotorGene 3000/6000/Q [Qi-agen], MyGo Pro [IT-IS Life Sciences, erhältlich bei LTF]).Nur für Forschungszwecke.

2 EINLEITUNGBei Neisseria gonorrhoeae, auch bekannt als Gonokokken, handelt es sich um ein gramnegatives, aerobes, bewegliches Bakterium. Sie sind sehr empfindlich gegen-über Umwelteinflüssen, insbesondere gegen Austrocknung. Sie sind weltweit ver-breitet, als Reservoir dient ausschließlich der infizierte Mensch.Gonokokken entziehen sich wirkungsvoll der humoralen Immunantwort des Wirtes. Sie bilden eine IgA1-Protease, die IgA-Antikörper zwischen Fc- und Fab-Fragment spaltet. Dadurch kann einerseits aufgrund des fehlenden Fc-Teils keine Phagozy-tose durch Zellen der angeborenen Immunantwort mehr stattfinden, andererseits bedecken die Fab-Fragmente die Bakterien. Diese Maskierung führt dazu, dass das Immunsystem die Bakterien kaum noch als fremd erkennen und bekämpfen kann, was zu einer Chronifizierung der Erkrankung führt. Des Weiteren bilden viele Go-nokokken eine meist plasmidcodierte Penicillinase und entgehen damit der früher üblichen Therapie mittels Penicillin. Eine Infektion mit Neisseria gonorrhoeae kann zu verschiedenen Erkrankungen füh-ren. Die Gonorrhoe gilt insbesondere im jungen Erwachsenenalter als häufige In-fektion. Sie ist neben der Infektion durch Chlamydia trachomatis die weltweit häu-figste Geschlechtskrankheit. Vor allem bei Frauen kann sie relativ asymptomatisch bzw. von Symptomen her uncharakteristisch verlaufen, beim Mann führt sie meist zu schmerzhafter und eitriger Urethritis. Steigt die Erkrankung über die Harnröhre auf, so kann es zur gonorrhoischen Prostatitis und Epididymitis kommen. Harnröh-renstrikturen und Infertilität können die Folge sein. Die Symptome können nach Wo-chen wieder verschwinden. Bei Frauen verläuft der Großteil der Infektionen ohne wesentliche Symptome. Bei den übrigen Patientinnen findet sich Ausfluss, schmerz-hafte Miktionen und eitrige Sekretionen aus der Harnröhre. Steigt bei Frauen die Infektion auf, so kann sich eine Adnexitis und ein sogenanntes pelvic inflammatory disease (PID) mit resultierender Sterilität entwickeln. Bei Schwangeren ist das Risiko hierfür erhöht. Außerdem kann es zur Infektion der Frucht und der Fruchtblase kom-men (Chorionamnionitis) mit dem Risiko eines Abortes.Neugeborene einer infizierten Mutter können sich durch eine Infektion mit Neisseria gonorrhoeae eine Gonoblennorrhoe, eine eitrige Keratokonjunktivitis, zuziehen. Es

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besteht die Gefahr der Perforation und Erblindung. Daher wird seit dem 19. Jahrhun-dert die Credé-Prophylaxe mit Silbernitrat bzw. Penicillin durchgeführt.Außerdem können Gonokokken die Bindehäute, den Pharynx und den Mastdarm infizieren. Des Weiteren gibt es eine disseminierte Infektion mit Befall z. B. eines Ge-lenkes, der Lunge und anderer Organe.

3 TESTPRINZIPDer MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR-Kit enthält spezifische Primer und fluoreszenzfarbstoffmarkierte Sonden sowie zusätzliches Material für den Nach-weis von Neisseria-gonorrhoeae-DNA in klinischem Probenmaterial.Die Detektion der Amplifikation erfolgt in Echtzeit durch die Hybridisierung und an-schließende Hydrolyse der erregerspezifischen Fluoreszenzsonden. Die Detektion erfolgt im ROX-Kanal (gelb, 602 nm). Zusätzlich verfügt der MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR-Kit über eine Kontroll-DNA, die während der Extraktion zugefügt und in einem heterologen Am-plifikationssystem nachgewiesen wird. Dies ermöglicht zum Einen das Aufdecken von Fehlern bei der DNA-Extraktion, zum Anderen kann eine mögliche Inhibition der PCR identifiziert werden. Dadurch wird das Risiko von falsch negativen Ergebnissen reduziert. Die Detektion der DNA-Extraktionskontrolle erfolgt im FAM-Kanal (grün, 515 nm).

4 INHALT DER TESTPACKUNGDie mitgelieferten Komponenten sind ausreichend für den Ansatz von 96 Nachweis-reaktionen.

Tabelle 1: Inhalt des MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR-Kits

Bezeichnung Abkürzung Deckel farbe Inhalt

Master-Mix, lyophilisiert MM weiß 5 vials

Rekonstitutionslösung für Ma-ster-Mix RECSOL 1 gelb 2 ml

Positivkontrolle PC rot 300 µl

Interne Kontrolle, lyophilisiert IC hellbraun 1 vial

Negativkontrolle NC grün 300 µl

Rekonstitutionslösung für IC RECSOL 2 violett 1,1 ml


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5 ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL• DNA-Extraktionskit (z. B. MutaCLEAN® Universal DNA/RNA, KG1037/KG1038)• Sterile Reaktionsgefäße• Pipetten (variable Volumina)• sterile Pipettenspitzen mit Filter• Tischzentrifuge• Vortex-Wirbelmischer• Real-time-PCR-Gerät• optische PCR-Gefäße mit Deckel• optional: Pipettiergeräte zur Automation

6 TRANSPORT, LAGERUNG UND STABILITÄTDer Transport des MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR-Kit erfolgt ge-kühlt bei 2–8 °C. Alle Komponenten sind direkt nach Erhalt lichtgeschützt bei 2–8 °C zu lagern. Den Kit nach Ablauf des auf der Packung angegebenen Haltbarkeitsda-tums nicht mehr verwenden.Schützen Sie den Test während der gesamten Testlaufzeit vor direkter Sonnenein-strahlung.

7 WICHTIGE HINWEISE• Die MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR muss in für diesen Zweck

geeigneten Laboratorien und von speziell geschultem Personal durchgeführt werden.

• Die Richtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) sind einzuhalten.

• Alle Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände müssen als potenti-ell kontaminiert erachtet werden. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen, Schutzkleidung und Schutzbrille gearbeitet werden.

8 ALLGEMEINE HINWEISE• Der Assay ist immer nach der dem Kit beigefügten Arbeitsanleitung durchzu-

führen.

• Areale für die Probenvorbereitung und den Ansatz des PCR-Master-Mix sollten strikt getrennt sein.

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• Pipetten, Röhrchen und andere Arbeitsmaterialien dürfen nicht von einem Bereich in den anderen zirkulieren.

• Immer Pipettenspitzen mit Filtern verwenden.

• Pipetten und Arbeitsflächen regelmäßig mit geeigneter Dekontaminationslö-sung reinigen (keine ethanolhaltigen Mittel).

• Reagenzien der Testpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt werden.

• Beachten Sie bei der Entsorgung nationale und regionale Richtlinien.

9 PROBENMATERIALDas Ausgangsmaterial für die Nachweisreaktion ist DNA, die aus klinischen Proben isoliert wurde.

10 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN UND PROBEN

10.1 Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien• Bitte achten Sie bei mehrfachem Einsatz des Kits darauf, dass die Reagenzien

wie angegeben gelagert und nur die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden.

• Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch kurz an-zentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden.

• Nehmen Sie den Kit vor Gebrauch aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn für mindestens 30 min ungeöffnet Raumtemperatur erreichen. Entnehmen Sie die benötigte Menge an Reagenzgefäßen und lagern Sie die übrigen Rea-genzgefäße umgehend wieder bei 2–8 °C.

• Vorbereitung des Master-Mix: Der lyophilisierte Master-Mix (MM) wird vor Gebrauch mit 300 µl Rekonstitutionslösung für Master-Mix (RECSOL 1) re-konstituiert, vorsichtig gemischt, zum Lösen 15 Minuten stehen gelassen und anschließend gründlich gemischt. Rekonstituierter Master-Mix ist für zwei Wochen bei 2–8 °C haltbar.

• Rekonstitutionslösung für Master-Mix (RECSOL 1) ist nach dem Öffnen drei Monate bei 2–8 °C haltbar.

• Vorbereitung der internen Kontrolle: Die lyophilisierte interne Kontrolle (IC) wird vor Gebrauch mit 1 ml Rekonstitutionslösung für IC (RECSOL 2)


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rekonstituiert, vorsichtig gemischt, zum Lösen 15 Minuten stehen gelassen und anschließend gründlich gemischt. Rekonstituierte interne Kontrolle ist für vier Wochen bei 2–8 °C haltbar.

• Die Negativkontrolle (NC) ist nach dem Öffnen vier Wochen bei 2–8 °C halt-bar.

• Alle anderen Testreagenzien sind gebrauchsfertig und, bei 2–8 °C gelagert, bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar. Nach Anbruch dieser Rea-genzien sind sie für maximal zwölf Monate verwendbar.

10.2 Vorbereitung der ProbenDie MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR ist geeignet für den Nachweis von Neisseria-gonorrhoeae-DNA, die zuvor mit Hilfe geeigneter Methoden aus Pro-ben isoliert wurde. Kommerziell erhältliche Extraktionskits können zur DNA-Isolie-rung verwendet werden. Immundiagnostik AG empfiehlt MutaCLEAN® Universal DNA/RNA (KG1037/KG1038).Falls die Real-time-PCR nicht sofort durchgeführt wird, müssen die DNA-Extrakte entsprechend den Angaben des DNA-Extraktionskitherstellers aufbewahrt werden.

11 KONTROLL-DNADer MutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Real-time-PCR enthält eine Kontroll-DNA (IC), die zum einen als DNA-Extraktionskontrolle dient, zum anderen als interne Kontrolle mögliche Inhibitionen der Real-time-PCR aufzeigt.

DNA-Isolation aus klinischen Proben

a) Kontroll-DNA als ExtraktionskontrolleMutaPLEX® Neisseria gonorrhoeae Kontroll-DNA zur DNA-Extraktion geben. Kontroll-DNA zu jeder Extraktion zugeben, gut mischen. Führen Sie die DNA-Isola-tion gemäß der Anleitung des Herstellers durch. Das dem Lysepuffer zuzugebende Kontroll-DNA-Volumen richtet sich nach dem jeweils verwendeten Volumen an DNA-Elutionspuffer: 1 µl Kontroll-DNA pro 10 µl Elutionspuffer. Setzen Sie anschließend die Real-time-PCR nach Protokoll A an.Die Kontroll-DNA muss dem Lysepuffer des Extraktionskits zugesetzt werden.

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b) Kontroll-DNA als interne Kontrolle der Real-time-PCRSollte keine Kontrolle der DNA-Extraktion gewünscht sein, sondern lediglich eine Kontrolle der PCR, so kann die Kontroll-DNA erst beim Ansetzen der PCR zugegeben werden. In diesem Fall ist die Real-time-PCR nach Protokoll B anzusetzen.

12 REAL-TIME-PCR

12.1 Wichtige Hinweise vor Beginn• Bevor Sie die PCR ansetzen, machen Sie sich mit dem Real-time-PCR-Gerät

vertraut.

• Die Programmierung des Temperaturprofils sollte abgeschlossen sein, bevor die PCR angesetzt wird.

• Beachten Sie, dass in jedem PCR-Lauf mindestens eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle enthalten sein sollte.

• Alle Reagenzien müssen auf Raumtemperatur gebracht, gemischt (Reaktions-Mix nicht vortexen, sondern durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren mi-schen) und ggf. kurz anzentrifugiert werden, um die Reagenzien am Gefäß-boden zu sammeln.

12.2 DurchführungFalls die Kontroll-DNA als echte Extraktionskontrolle verwendet wird, bitte Protokoll A folgen. Wird die Kontroll-DNA lediglich zur Kontrolle einer möglichen Inhibition der Real-time-PCR verwendet, bitte Protokoll B befolgen.

Ansetzen der Real-time-PCR

• Benötigte Anzahl optischer PCR-Reaktionsgefäße in den Kühlblock des Real-time-PCR-Geräts stellen.

• DNA-Eluate, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle in die entspre-chenden Gefäße pipettieren:Protokoll A (Kontroll-DNA bereits zur Extraktion hinzugegeben): pipettieren Sie die Ansätze nach Tabelle 4aProtokoll B (Kontroll-DNA ausschließlich Real-time-PCR-Kontrolle): pipettie-ren Sie die Ansätze nach Tabelle 4b

• Die Reaktionsgefäße sofort nachdem die Probe zugefügt wurde verschließen, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren.


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Tabelle 4a: Ansetzen der Real-time-PCR nach Protokoll A

KomponenteVolumen

Probe Positiv-kontrolle

Negativ-kontrolle

Master-Mix 12,5 µl 12,5 µl 12,5 µl

Positivkontrolle – 2,5 µl –

Probe 10 µl – –

Negativkontrolle ad 25 µl 2,5 µl 10 µl 12,5 µl

Gesamtvolumen 25,0 µl

Tabelle 4b: Ansetzen der Real-time-PCR nach Protokoll B

KomponenteVolumen

Probe Positiv-kontrolle

Negativ-kontrolle

Master-Mix 12,5 µl 12,5 µl 12,5 µl

Interne Kontrolle 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl

Positivkontrolle – 2,5 µl –

Probe 10 µl – –

Negativkontrolle ad 25 µl – 7,5 µl 10 µl

Gesamtvolumen 25,0 µl

12.3 GeräteeinstellungenFür die Real-time-PCR ist das in Tabelle 5 beschriebene Temperaturprofil zu benut-zen.

Tabelle 5: Real-time-PCR-Temperaturprofil

Beschreibung Dauer Temperatur Zyklenanzahl

Vorheizen 2 min 50 °C 1

Initiale Denaturierung 2 min 95 °C 1

cDNA-Amplifikation50

Messung am Ende dieses Schrittes

Denaturierung 10 s 94 °C

Annealing und Ver-längerung 40 s 60 °C

Kühlen (optional) 1 min 10 °C 1

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13 INTERPRETATION DER ERGEBNISSEDie Neisseria-gonorrhoeae-spezifische Amplifikation wird im ROX-Kanal detektiert. Die Amplifikation der Kontroll-DNA wird im FAM-Kanal gemessen.

Folgende Ergebnisse können auftreten:

• Im ROX-Kanal wird ein Signal detektiert:Das Ergebnis ist positiv, die Probe enthält Neisseria-gonorrhoeae-DNA.In diesem Fall ist die Detektion eines Signals im FAM-Kanal nicht notwendig, da eine hohe Neisseria-gonorrhoeae-DNA-Konzentration zu einem verminder-ten bzw. fehlenden Fluoreszenzsignal der Kontroll-DNA führen kann (Kompe-tition).

• Im ROX-Kanal wird kein Signal detektiert, jedoch im FAM-Kanal:Das Ergebnis ist negativ, die Probe enthält keine Neisseria-gonorrhoeae-DNA.Das detektierte Signal der Kontroll-DNA schließt die Möglichkeit einer feh-lerhaften DNA-Extraktion aus (falls die Kontroll-DNA als Extraktionskontrolle benutzt wurde). Außerdem ist die PCR nicht inhibiert.

• Weder im ROX- noch im FAM-Kanal wird ein Signal detektiert: Es kann keine diagnostische Aussage getroffen werden.Die Real-time-PCR wurde inhibiert oder es trat ein Fehler bei der DNA-Extrak-tion auf. Wurde die Kontroll-DNA während der DNA-Extraktion zugefügt und nicht direkt in den PCR-Master-Mix gegeben, dann ist die negative Kontrolle in beiden Kanälen negativ.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen Beispiele für positive und negative Real-time-PCR-Ergebnisse.


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Abb. 1: Die positive Probe zeigt eine starke Amplifi kation im Neisseria-gonorrhoeae-spezifi schen ROX-Kanal, während bei der negativen Probe kein Fluoreszenzsignal detektiert wird.

Abb. 2: Im FAM-Kanal zeigen sowohl die positive als auch die negative Probe ein Signal. In diesem Fall liegt keine Inhibition der Real-time-PCR vor, auch verlief die DNA-Extraktion erfolgreich. Die negative Probe ist somit als tatsächlich negativ zu werten.

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14 VALIDIERUNGSDATENStellen Sie die Grenzwerte des Real-time-Geräts wie im Folgenden beschrieben ein.

NegativkontrollenAlle Negativkontrollen sollten unter dem Grenzwert liegen. Im Falle einer möglichen Kontamination (Auftreten einer Kurve in der Negativkontrolle oder einer Anhäufung von Kurven in Proben mit hohem Ct) sind die erhaltenen Ergebnisse nicht interpre-tierbar und der gesamte Lauf (inklusive der Extraktion) muss wiederholt werden.

PositivkontrollenAlle Positivkontrollen müssen eine positive, d. h. exponentielle Amplifikationskurve aufweisen. Die Positivkontrollen müssen unter einen Ct-Wert von 40 (ROX) fallen.

Interne KontrollenAlle internen Kontrollen müssen eine positive, d. h. exponentielle Amplifikations-kurve aufweisen. Der Ct-Wert der internen Kontrolle muss unter 40 liegen. Falls der Ct-Wert der internen Kontrolle über 40 liegt, deutet dies auf ein DNA-Aufreinigungs-problem oder eine stark positive Probe hin, welche die interne Kontrolle inhibieren kann. In letzterem Fall ist das Testergebnis valide.

15 EINSCHRÄNKUNGENDie Ergebnisse müssen stets im Kontext der klinischen Symptome betrachtet wer-den. Therapeutische Entscheidungen sollten unter Berücksichtigung klinischer Da-ten getroffen werden.Ein negatives Testergebnis schließt eine Neisseria-gonorrhoeae-Infektion nicht aus.

16 PROBLEMBEHANDLUNGDie folgenden Problembeschreibungen sollen bei eventuell auftretenden Proble-men mit der Real-time-PCR behilflich sein. Sollten Sie weitere Fragen, haben wenden Sie sich bitte direkt an Immundiagnostik.

Kein Fluoreszenzsignal im ROX-Kanal der Positivkontrolle

Der gewählte entspricht nicht dem im Protokoll angegebenen KanalWählen Sie den ROX-Kanal für die Analyse der Neisseria-gonorrhoeae-spezi-fischen Amplifikation und den FAM-Kanal für die Amplifikation der Kontroll-DNA .


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Fehlerhaftes Ansetzen der Real-time-PCRÜberprüfen Sie Ihre Arbeitsschritte und vergleichen Sie diese mit den im Kapitel „Durchführung“ beschriebenen Schritten.

Fehlerhaftes Real-time-PCR-TemperaturprofilVergleichen Sie das Temperaturprofil mit dem Protokoll (Tabelle 5).

Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes HaltbarkeitsdatumÜberprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kit-etikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponen-ten wie im Kapitel „Transport und Lagerung“ beschrieben.

Schwaches oder kein Signal der Kontroll-DNA und gleichzeitiges Ausbleiben eines Signals im ROX-Kanal

Die Real-time-PCR-Bedingungen stimmen nicht mit den im Protokoll be-schriebenen übereinÜberprüfen Sie die Real-time-PCR-Bedingungen (Kapitel 12).

Real-time-PCR-InhibitionStellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (sie-he Kapitel „Probenvorbereitung“). Beachten Sie die Herstellerangaben. Stellen Sie sicher, dass ethanolhaltige Waschpuffer vollständig entfernt wurden (ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei hoher Geschwindigkeit vor der DNA-Elution wird empfohlen).

Verlust der DNA während des AufarbeitungsprozessesFalls die Kontroll-DNA vor der Extraktion zugefügt wurde, kann das Ausbleiben des Signals auf eine fehlerhafte DNA-Extraktion hinweisen. Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode verwenden und beachten Sie die Herstellerangaben.

Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes HaltbarkeitsdatumÜberprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kit-etikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponen-ten wie im Kapitel „Transport und Lagerung“ beschrieben.

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Detektion eines Signals im ROX-Kanal der Negativkontrolle

Kontamination des Real-time-PCR-AnsatzesWiederholen Sie die Real-time-PCR in Replikaten. Falls das Ergebnis der Wieder-holungen negativ sein sollte, so ereignete sich die Kontamination während der Befüllung der Reaktionsgefäße. Stellen Sie sicher, dass Sie die Positivkontrolle zuletzt pipettieren und verschließen Sie die Reaktionsgefäße sofort nachdem Sie die jeweilige Probe zugegeben haben. Falls die Negativkontrolle in der Wie-derholung wieder ein Signal im ROX-Kanal ergibt, deutet dies darauf hin, dass eine oder mehrere Kitkomponenten kontaminiert sind. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsbereiche und die Geräte regelmäßig dekontaminiert werden. Wie-derholen Sie die Real-time-PCR mit einem neuen Kit.

17 ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE

DNA Desoxyribo-nukleinsäure Research use only

Ct Cycle Threshold Kontroll-DNA

nn nicht bekannt Zu verwenden mit

PCR Polymerase- Kettenreaktion Katalognummer

Negativkontrolle Inhalt ausreichend für <n> Prüfungen

Positivkontrolle Obere Temperatur grenze

Master-Mix Hersteller

Inhalt Verwendbar bis

Arbeitsanleitung beachten Chargennummer

Rekonstitutionslö-sung für Master-Mix

Rekonstitutions-lösung für IC

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