Morphogenic Role for Acetylcholinesterase in Axonal Outgrowth During Neural Development

8/8/2019 Morphogenic Role for Acetylcholinesterase in Axonal Outgrowth During Neural Development

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M o r p h o g e n i c R o l e f o r A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n A x o n a l O u t g r o w t hd u r i n g N e u r a l D e v e l o p m e n tJ o h n W. B i g b e e , 1 K a r u n V . S h a r m a , 2 J y o t s n a J . G u p t a , 2 a n d J e f f r e y L . D u p r e e 3' D e p a r t m e n t o f A n a t o m y , V i r g i n i a C o m m o n w e a l t h U n i v e r s i t y M e d i c a l C a m p u s , R i c h m o n d , V i r g i n i a ; 2 D e p a r t m e n t o f P h y s i c a l T h e r a p y ,3 B r a i n D e v e l op m e nt a l R e s ea r ch C e n t e r , U n i v e r s i t y o f N o r t h C a r o l i n a , C h a p e l H i l l , N o r t h C a r o l i n aA c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( A C h E ) i s t h e e n z y m e t h a t h y d r o l y z e s t h e n e u r o t r a n s m i t t e r a c e t y l c h o l i n e a tc h o l i n e r g i c s y n a p s e s a n d n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n s . H o w e v e r , r e s u l t s f r o m o u r l a b o r a t o r y a n do t h e r s i n d i c a t e t h a t A C h E h a s a n e x t r a s y n a p t i c , n o n c h o l i n e r g i c r o l e d u r i n g n e u r a l d e v e l o p m e n t .T h i s a r t i c l e i s a r e v i e w o f o u r f i n d i n g s d e m o n s t r a t i n g t h e m o r p h o g e n i c r o l e o f A C h E , u s i n g an e u r o n a l c e l l c u l t u r e m o d e l . W e a l s o d i s c u s s how t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t AChE h a s a c e l la d h e s i v e f u n c t i o n d u r i n g n e u r a l d e v e l o p m e n t . T h e s e r e s u l t s c o u l d h a v e a d d i t i o n a l s i g n i f i c a n c e a sA C h E i s t h e t a r g e t e n z y m e o f a g r i c u l t u r a l o r g a n o p h o s p h a t e a n d c a rb a ma t e p e s t i c i d e s a s w e l l a st h e c o m m o n l y u s e d h o u s e h o l d o r g a n o p h o s p h a t e c h l o r p y r i f o s ( D u r s b a n ) . P r e n a t a l e x p o s u r e t ot h e s e a g e n t s c o u l d h a v e a d v e r s e e f f e c t s o n n e u r a l d e v e l o p m e n t b y i n t e r f e r i n g w i th t h em o r p h o g e n i c f u n c t i o n o f A C h E . -n vi ro n H e al t h P e r s p e c t 1 0 7 ( S u p p l 1 ) : 8 1 - 8 7 ( 1 9 9 9 ) .h t t p . / / e h p n e t l . n i e h s . n i h . g o v / d o c s / 1 9 9 9 / S u p p l - 1 / 8 1 - B 7 b i g b e e / a b s t r a c t . h t m lK e y w o r d s : a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e , n e u r i t e o u t g r o w t h , d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u r o n s , c e l la d h e s i o n , n e u r a l d e v e l o p m e n t , c y t o s k e l e t o n , i n h i b i t o r sA c c u m u l a t i n g e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a ta c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( A C h E ) h a s e x t r a -s y n a p t i c f u n c t i o n s d u r i n g n e u r a l d e v e l o p -m e n t ( 1 - 3 ) . T h i s i d e a w a s i n i t i a l l y b a s e do n i n v i v o o b s e r v a t i o n s t h a t A C hE i s t r a n -s i e n t l y e x p r e s s e d b y n e u r o n s t h r o u g h o u tp e r i o d s o f a x o n a l o u t g r o w t h p r i o r t o s y n a p -t o g e n e s i s , a p e r i o d d u r i n g w h i c h t h ec l a s s i c a l c h o l i n o l y t i c r o l e f o r AChE i n t e r -m i n a t i n g n e r v o u s t r a n s m i s s i o n i s u n n e c e s -s a r y . F o r e x a m p l e , i n t h e c e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ( C N S ) , R o b e r t s o n a n d c o l l e a g u e s( 3 , 4 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t r a n s i e n t AChEa c t i v i t y i n t h a l a m i c n e u r o n s a t a t i m e w h e nt h e i r a x o n s a r e g r o w i n g i n t o t h e c e r e b r a lc o r t e x . S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n r e p o r t e db y K r i s t t ( 5 ) i n r a t a n d b y K o s t o v i c a n dc o l l e a g u e s i n d e v e l o p i n g p r i m a t e s ( 6 ) . T h i se x p r e s s i o n o f A C h E h a s a l s o b e e n c o n -f i r m e d a t t h e m e s s e n g e r RNA l e v e l b y i ns i t u h y b r i d i z a t i o n ( 7 ) . I n t h e c h i c k , t r a n -s i e n t AChE e x p r e s s i o n o c c u r s i n d e v e l o p i n gs p i n a l c o r d n e u r o n s , w h i c h c o i n c i d e s w i t h

M a n u s c r i p t r e c e i v e d a t EHP 6 A u g u s t 1 9 9 8 ; a c c e p t e d1 3 O c t o b e r 1 9 9 8 .A d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o J . W. B i g b e e , D e p t .o f A n a t o m y , VCU M e d i c a l C a m p u s , PO B o x9 8 0 7 0 9 . R i c h m o n d , VA 2 3 2 9 8 - 0 7 0 9 . T e l e p h o n e :( 8 0 4 ) 8 2 8 - 0 9 4 8 . F a x : ( 8 0 4 ) 8 2 8 - 9 4 7 7 . E - m a i l :j b i g b e e @ g e m s . v c u 7 . e d uA b b r e v i a t i o n s u s e d : A C h E , a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ;B C h E ; b u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e ; B W 2 8 4 c 5 1 , 1 , 5 - b i s - ( 4 -a l l y i d i m e t h y l a m m o n i u m p h e n y l p e n t a n - 3 - o n e d i b r o -m i d e ; c A M P , c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ; C N S ,c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ; D F P , d i - i s o p r o p y l f l u o r o p h o s -p h a t e ; D R G , d o r s a l r o o t g a n g l i o n ; E L I S A , e n z y m e -l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ; i s o O M P A , t e t r a i s o p r o p y lp y r o p h o s p h o r a m i d e ; P N S , p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m .

a x o n a l o u t g r o w t h f r o m t h e s e c e l l s ( 1 , 8 , 9 ) .I n t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s te m ( P N S ) ,AChE i s t r a n s i e n t l y e x p r e s s e d b y d e v e l o p -i n g d o r s a l r o o t g a n g l i o n ( D R G ) n e u r o n s( 1 0 - 1 4 ) a n d l a t e r i n t h e i r a x o n s a n dg r o w t h c o n e s i n t h e s p i n a l c o r d ( 1 5 , 1 6 ) .T o g e t h e r , t h e s e d a t a s t r o n g l y s u g g e s t t h a tAChE p l a y s a d e v e l o p m e n t a l r o l e i n t h em o r p h o g e n e s i s o f t h e n e r v o u s s y s t e m .Our l a b o r a t o r y h a s e x a m i n e d t h i sd e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f AChE i n p r i -m a r y c u l t u r e s o f DRG n e u r o n s t h a t a r en o n c h o l i n e r g i c , y e t e x p r e s s h i g h l e v e l s o fAChE d u r i n g n e u r i t e o u t g r o w t h . T h i s a r t i -c l e s u m m a r i z e s o u r r e s u l t s a n d d i s c u s s e sp o s s i b l e m e c h a n i s m s b y w h i c h AChE m a ye f f e c t i t s g r o w t h - p r o m o t i n g a c t i o n .M a t e r i a l s a n d M e t h o d sP r e p a r a t i o n o f D o r s a l R o o t G a n g l i o nN e u r o n a l C u l t u r e sDRG n e u r o n a l c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d f r o mE - 1 5 r a t e m b r y o s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d( 1 7 - 2 2 ) . N e u r o n s w e r e p l a t e d e i t h e r o n t o as u b s t r a t u m o f t y p e I c o l l a g e n o r M a t r i g e l( B e c t o n D i c k i n s o n a n d C o . , F r a n k l i nL a k e s , N J ) a n d m a i n t a i n e d i n E a g l e ' s m i n i -m a l e s s e n t i a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h10% N u S e r u m , 0 . 3 % a d d i t i o n a l g l u c o s e ,a n d c r u d e n e r v e g r o w t h f a c t o r a t 3 7 C w i t h5% C O 2 . M a t r i g e l i s a n a r t i f i c i a l b a s a l l a m -i n a e x t r a c t t h a t c o n t a i n s l a m i n i n , t y p e I Vc o l l a g e n , a n d e n t a c t i n a n d f o r m s a h i g h l yp e r m i s s i v e s u b s t r a t u m f o r n e u r i t e g r o w t h .C e l l s w e r e p l a t e d i n t h e c e n t e r o f 35-mmc u l t u r e d i s h e s a n d e x t e n d e d r a d i a l l y

o r i e n t e d n e u r i t i c p r o c e s s e s f r o m t h i s c e n t r a lp l a t i n g a r e a . T h e c a r e a n d t r e a t m e n t o fe x p e r i m e n t a l a n i m a l s w e r e c o n d u c t e d i na c c o r d a n c e w i t h g u i d e l i n e s e s t a b l i s h e d b yt h e I n s t i t u t i o n a l A n i m a l C a r e a n d U s eC o m m i t t e e , D i v i s i o n o f A n i m a l R e s o u r c e s ,V i r g i n i a C o m m o n w e a l t h U n i v e r s i t y ( 2 3 ) .P h a r m a c o l o g i c I n h i b i t o r T r e a t m e n tA f t e r p l a t i n g , c u l t u r e s r e c e i v e d e i t h e r 1 , 5 -b i s - ( 4 - a l l y l d i m e t h y l a m m o n i u m p h e n y l ) -p e n t a n - 3 - o n e d i b r o m i d e ( B W 2 8 4 c 5 1 ) o rp h y s o s t i g m i n e a t a c o n c e n t r a t i o n r a n g i n gf r o m 1 0 4 M t o 1 0 - 7 M o r f r e s h m e d i u mo n l y ( 1 8 ) . B W 2 8 4 c 5 1 i s a b i s - q u a t e r n a r yn i t r o g e n c o m p o u n d t h a t i s a h i g h l y s p e c i f i ci n h i b i t o r f o r A C h E . B e c a u s e o f t h i s s p e c i -f i c i t y , B W 2 8 4 c 5 1 i s r o u t i n e l y u s e d t o c o n -f i r m AChE a c t i v i t y i n b o t h h i s t o c h e m i c a la n d b i o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n s . P h y s o -s t i g m i n e i s a n a t u r a l l y o c c u r r i n g c a r b a m a t ei n h i b i t o r o f A C h E . T h e s e t w o c o m p o u n d sw e r e u s e d b e c a u s e t h e y i n h i b i t AChE a c t i v -i t y b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s . M e d i u m w i t ho r w i t h o u t i n h i b i t o r s w a s c h a n g e d d a i l y .B W 2 8 4 c 5 1 i s u s e d t o c o n f i r m AChE a c t i v -i t y a n d a s a c o n t r o l f o r i n h i b i t o r t r e a t m e n t ,t h e b u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e ( B C h E ) i n h i b i t o rt e t r a i s o p r o p y l p y r o p h o s p h o r a m i d e ( i s o -OM P A) s u b s t i t u t e d f o r e i t h e r B W 2 8 4 c 5 1o r p h y s o s t i g m i n e . BChE w a s n o t e x p r e s s e di n DRG n e u r o n s e i t h e r a t t h e d e v e l o p m e n -t a l s t a g e w h e n t h e y w e r e r e m o v e d f r o m t h ee m b r y o ( 1 4 ) o r a f t e r t h e c e l l s w e r e p l a c e di n c u l t u r e ( 1 8 ) . C u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e df o r 1 4 d a y s a n d t h e n e x a m i n e d b y d a r k f i e l dm i c r o s c o p y t o d e t e r m i n e t h e e x t e n t a n dp a t t e r n o f o u t g r o w t h a n d b y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y t o r e v e a l u l t r a s t r u c -t u r a l c h a n g e s . I n a d d i t i o n , t o a s s e s s t h e d i s -t r i b u t i o n o f n e u r o f i l a m e n t s , t h e m a j o rc y t o s k e l e t a l c o m p o n e n t o f n e u r o n s , c u l -t u r e s w e r e e x a m i n e d b y i m m u n o f l u o r e s -c e n c e m i c r o s c o p y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d( 1 9 , 2 0 ) , u s i n g a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t ot h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t n e u r o f i l a m e n ts u b u n i t p r o t e i n N F 6 8 .M o n o d o n a l A n t i b o d y T r e a t m e n tC u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h a n A C h Em o n o c l o n a l a n t i b o d y , M A B 3 0 4 ( C h e m i c o nI n t ' l . I n c . , T e m e c u l a , C A ) , u s i n g e i t h e r a n

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 7 , S u p p l e m e n t 1 * F e b r u a r y 1 9 9 9 8 1


2/7

B IGB E E E T A L .

a c u t e h i g h - d o s e o r a c h r o n i c l o w - d o s ee x p o s u r e p r o t o c o l a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d( 2 2 ) . F o r t h e a c u t e t r e a t m e n t , 1 0 - d a y - o l dc u l t u r e s w e r e e x p o s e d t o 2 0 0 p g / m l o fe i t h e r MAB304 o r n o r m a l m o u s e I g G , o rm e d i u m w i t h o u t a n t i b o d y f o r 3 h r . F o r t h ec h r o n i c s t u d i e s , 4 - d a y - o l d c u l t u r e s r e c e i v e dm e d i u m c o n t a i n i n g 2 0 p g / m l o f e i t h e rM A B 3 0 4 o r n o r m a l m o u s e I g G o rm e d i u m w i t h o u t a n t i b o d y f o r 6 d a y s . T h ea r e a o f n e u r i t e o u t g r o w t h w a s c a l c u l a t e du s i n g a c o m p u t e r - g e n e r a t e d p e r i m e t e r t h a te x t e n d e d a r o u n d t h e d i s t a l m o s t e x t e n t o ft h e n e u r i t e s . A r e p r e s e n t a t i v e s e t o f c h r o n -i c a l l y t r e a t e d c u l t u r e s w a s a l s o e x a m i n e db y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y .AChE A s s a y sA Ch E a c t i v i t y w a s d e t e c t e d h i s t o c h e m i -c a l l y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 8 , 1 9 , 2 1 ) ,u s i n g a c e t y l t h i o c h o l i n e a s t h e s u b s t r a t ea n a l o g a c c o r d i n g t o t h e m od i f ic at io n o ft h e m e t h o d o f E l B a d a w i a n d S c h e n k( 2 4 ) . AChE a c t i v i t y w a s q u a n t i f i e d e i t h e rb y c o l o r i m e t r i c a n a l y s i s b a s e d o n t h em e t h o d o f E l l m a n e t a l . ( 2 5 ) , u s i n ga c e t y l t h i o c h o l i n e , o r b y r a d i o m e t r i c a s s a y ,u s i n g t r i t i a t e d a c e t y l c h o l i n e , a c c o r d i n g t ot h e m e t h o d o f H a l l ( 2 6 ) a s we h a v ep r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 8 , 2 1 ) .

R e s u l t sT h e L e v e l o f AChE E x p r e s i o nC o r r e l a t e s w i t h N e u r i t e O u t g r o w t hC u l t u r e d DRG n e u r o n s s h o w e d a d e v e l o p -m e n t a l i n c r e a s e i n AChE t h a t p a r a l l e l e d t h ee x t e n t o f n e u r i t e o u t g r o w t h ( F i g u r e 1 ) .AChE e x p r e s s i o n i n c r e a s e d 5 - f o l d b e t w e e n 3a n d 7 d a y s i n c u l t u r e ( 1 7 , 1 8 ) , w h i c h i sc o n s i s t e n t w i t h t h e d e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o no f AChE b y DRG n e u r o n s i n v i v o ( 1 0 , 1 4 ) .P a r m a c o l o g i c I n h i b i t o r T r e a t m e n tR e d u c e s N e u r i t e O u t g r o w t hDRG n e u r o n s d i s p l a y e d a d o s e - d e p e n d e n tr e d u c t i o n i n o u t g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o fe i t h e r BW284c5 1 o r p h y s o s t i g m i n e( F i g u r e 2 ) . No e f f e c t o n o u t g r o w t h w a so b s e r v e d w h e n i s o - O M P A w a s s u b s t i t u t e df o r e i t h e r o f t h e s e i n h i b i t o r s . W i t h i n c r e a s -i n g d o s e s t h e o u t g r o w t h d e c r e a s e d a n da p p e a r e d m o r e f a s c i c u l a t e d t h a n i n c o n t r o lc u l t u r e s . F o r b o t h c o m p o u n d s , a t t h e h i g h -e s t d o s e s t e s t e d , m i n i m a l n e u r i t e o u t -g r o wt h w a s o b s e r v e d b e y o n d t h e c e n t r a lp l a t i n g a r e a . T h e s e r e s u l t s w e r e n o t d u e t od i f f e r e n t i a l c e l l s u r v i v a l a s n o d i f f e r e n c e i nc e l l n u m b e r w a s f o u n d b e t w e e n c o n t r o la n d t r e a t e d c u l t u r e s a t t h e c o m p l e t i o n o ft h e e x p e r i m e n t s . F u r t h e r m o r e , t h i s e f f e c t

w a s r e v e r s i b l e a s a d d i t i o n a l o u t g r o w t ho c c u r r e d a n d a p p e a r e d n o r m a l a f t e rr e m o v a l o f e i t h e r i n h i b i t o r . T h e i n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o n s u s e d i n t h e s e s t u d i e s w e r ec o n s i s t e n t w i t h v a l u e s r e p o r t e d i n t h e l i t e r -a t u r e ( 2 7 ) f o r i n h i b i t i o n o f AChE i n v i t r o .T h e r e s u l t s c l e a r l y i n d i c a t e t h a t t h e l e v e l o fA C h E i n h i b i t i o n c l o s e l y c o r r e l a t e d w i t ht h e e x t e n t o f d e c r e a s e d o u t g r o w t h ( F i g u r e3 ) . I n t e r e s t i n g l y , c o - a d m i n i s t r a t i o n o f 1mM d i b u t y r y l c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s -p h a t e ( c A M P ) a l o n g w i t h B W 2 8 4 c 5 1 s i g -n i f i c a n t l y i n c r e a s e d b o t h n e u r i t e o u t g r o w t ha n d A C h E e x p r e s s i o n c o m p a r e d w i t hi n h i b i t o r t r e a t m e n t a l o n e ( 2 0 ) .T h e e s t e r a t i c a c t i v i t y o f AChE i s u s e da s a c o n v e n i e n t a n d a c c u r a t e r e p o r t e r f o rb o t h t h e c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n d l e v e l o fAChE e x p r e s s i o n . H o w e v e r , i t i s i m p o r t a n tt o n o t e t h a t t h e o b s e r v e d e f f e c t s o f AChEi n h i b i t o r s o n n e u r i t e o u t g r o w t h a r e i n d e -p e n d e n t o f t h e a b i l i t y o f t h e s e c o m p o u n d st o i n h i b i t e s t e r a t i c a c t i v i t y . F o r e x a m p l e ,w e a n d o t h e r s ( 2 0 , 2 8 , 2 9 ) h a v e s h o w n t h a ti r r e v e r s i b l e i n h i b i t i o n o f AChE w i t h t h eo r g a n o p h o s p h a t e d i i s o p r o p y l f l u r o p h o s -p h a t e ( D F P ) h a s n o e f f e c t o n n e u r i t e o u t -g r o w t h f r o m e i t h e r C NS o r PNS n e u r o n s .T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t t h e c a t a l y t i ca c t i v i t y o f A Ch E i s n o t r e q u i r e d f o r i t s

CO- c 40c n0 3 0

2 02Co

E 1 0

A C h E a c t i v i t y

0 2 4D a y s i n v i t r o

6 7

F i g u r e 1 . A C h E a c t i v i t y i n c r e a s e s w i t h n e u r i t e o u t g r o w t h . D a r k f i e l d p h o t o m i c r o g r a p h s o f D R G c u l t u r e s h i s t o c h e m i c a l l y s t a i n e d f o r A C h E a c t i v i t y a t d a y 0 , d a y 2 , a n d d a y 4a f t e r p l a t i n g . S m a l l c l u s t e r s o f c e l l s w i t h i n t h e p l a t i n g a r e a e x p r e s s d e t e c t a b l e l e v e l s o f A C h E a c t i v i t y a t d a y 2 ( a r r o w s ) w h i c h b e c o m e s p r o m i n e n t b y d a y 4 a s a d a r k r e a c t i o np r o d u c t . T h i s a c t i v i t y i n c r e a s e s i n b o t h t h e c e l l b o d i e s a n d n e u r i t e s w i t h t i m e i n c u l t u r e . Q u a n t i t a t i o n o f t h e A C h E a c t i v i t y i s s h o w n i n t h e l o w e r r i g h t p a n e l u s i n g a r a d i o m e t r i ca s s a y ( 2 1 , 2 5 ) . B a r = 1 5 0 p m f o r a l l p a n e l s .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 7 , S u p p l e m e n t 1 * F e b r u a r y 1 9 9 9

-

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 :

82


3/7

DEV ELOPMENTAL ROLE FOR ACETYLCHOLINESTERASE

m o r p h o g e n i c f u n c t i o n i n n e u r i t e g r o w t h .F u r t h e r m o r e , n o t a l l AChE i n h i b i t o r s h a v et h e e q u i v a l e n t e f f e c t o n n e u r i t e o u t g r o w t h( T a b l e 1 ) , s u g g e s t i n g t h a t s o m e o t h e rp h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t y o f t h e s e m o l e -c u l e s a c c o u n t s f o r t h e i r " n e u r i t o s t a t i c " a b i l -i t y . On t h e b a s i s o f t h e s e d a t a , L a y e r a n dc o l l e a g u e s ( 3 0 ) h a v e p r o p o s e d t h e s e c -o n d a r y s i t e h y p o t h e s i s . T h i s p r e m i s e s t a t e st h a t s o m e , a s y e t u n d e f i n e d , s e c o n d a r y s i t eo n t h e AChE m o l e c u l e i s r e s p o n s i b l e f o r i t sg r o w t h - r e l a t e d p r o p e r t i e s . T h e a b i l i t y t oi n t e r f e r e w i t h t h i s s i t e c o u l d t h e r e f o r ed e p e n d o n t h e b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o ft h e i n h i b i t o r m o l e c u l e , i n c l u d i n g i t s s h a p ea n d c h a r g e .P h a r m a c o l o g i c I n h i b i t o r T r e a t m e n tL e a d s t o A l t e r a t i o n s i n t h e N e u r o n a lC y t o s k e l e t o nA l o n g w i t h t h e r e t a r d e d n eu ri te o u t -g r o w t h , 4 0 t o 50% o f t h e n e u r o n a l c e l lb o d i e s t r e a t e d w i t h B W 2 8 4 c 5 1 s h o w l a r g e

a c c u m u l a t i o n s o f n e u r o f i l a m e n t s ( 1 8 - 2 0 )( F i g u r e 4 A ) . A t t h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l ,t h e s e m a s s e s a r e c o m p o s e d o f 1 0 - n m f i l a -m e n t s ( F i g u r e 4 B ) a n d r e s e m b l e c y t o p l a s -m i c i n c l u s i o n s p r e s e n t i n n e u r o n s i n c a s e so f c o r t i c a l a t r o p h y i n t h e CNS a n d g a n -g l i o n e u r o m a i n t h e PNS ( 3 1 ) . I n o u rm o d e l t h e a c c u m u l a t i o n o f n e u r o f i l a m e n t sc o u l d b e d u e t o a d i r e c t e f f e c t o n t h e i r p r o -c e s s i n g a n d t r a n s p o r t , l e a d i n g t o i m p a i r e do u t g r o w t h . A l t e r n a t i v e l y , AChE i n h i b i t o rt r e a t m e n t c o u l d d i r e c t l y p e r t u r b n e u r i t ee x t e n s i o n a n d e l o n g a t i o n , l e a d i n g t o a s e c -o n d a r y b a c k u p o f c y t o s k e l e t a l e l e m e n t s i nt h e c e l l b o d y .AChE M o n o d o n a l A n t i b o d y P r o d u c e sN e u r i t e D et a c h m en t a n d A l t e r e dN e u r i t e O u t g r o w t hOn t h e b a s i s o f t h e r e s u l t s f r o m o u r s t u d i e su s i n g p h a r m a c o l o g i c i n h i b i t o r t r e a t m e n t ,w e e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f a m o n o c l o n a la n t i - A C h E a n t i b o d y , M A B 3 0 4 , o n n e u r i t e

o u t g r o w t h a n d a t t a c h m e n t ( 2 2 ) . B e c a u s et h i s a n t i b o d y d o e s n ot i n h i b i t e n z y m ea c t i v i t y ( 2 2 , 3 2 ) , y e t c a u s e s t h e m o r p h o -l o g i c a n d a d h e s i v e c h a n g e s , i t s r e a c t i v e e p i -t o p e may b e r e l a t e d t o t h e s e c o n d a r y ,g r o w t h - r e l a t e d s i t e o n A C h E . W e f i r s td e t e r m i n e d t h a t t h e a n t i b o d y r e c o g n i z e dA C h E b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n de n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y( E L I S A ) s t u d i e s ( 2 2 ) . W e a l s o c o n f i r m e dt h a t AChE i s o n t h e c e l l s u r f a c e a n d t h a ta n t i b o d y b i n d i n g o c c u r r e d i n u n f i x e d c u l -t u r e s ( 2 2 ) . T h e l a t t e r r e s u l t e n s u r e d t h a tt h e a n t i b o d y b i n d s AChE u n d e r t h e e x p e r -i m e n t a l c o n d i t i o n s u s e d f o r t h e p e r t u r b a -t i o n s t u d i e s . A s s h o w n i n F i g u r e 5 , w h e nc u l t u r e s t h a t h a d b e e n a l l o w e d t o e x t e n dn e u r i t e s w e r e e x p o s e d t o a h i g h c o n c e n t r a -t i o n o f MAB304 a n t i b o d y , t h e d i s t a l t i p so f t h e n e u r i t e s d e t a c h e d w i t h i n 9 0 m i n .Upon r e m o v a l o f t h e a n t i b o d y , newg r o w t h w a s o b s e r v e d w i t h i n 8 t o 1 2 h r . I ne x p e r i m e n t s s i m i l a r t o t h e p h a r m a c o l o g i c

HE 5E

4C

04 - 2

a )Z 1

B W c o n c e n t r a t i o n , M

65-EE

= - 4 -0c 3d 202 2 -l_

71 1o - .

...m **

1

O 1 0 - 6 1 0 - 5 1 0 - 4P h y s o s t i g m i n ec o n c e n t r a t i o n , M

F i g u r e 2 . B W 2 8 4 c 5 1 a n d p h y s o s t i g m i n e r e t a r d n e u r i t e o u t g r o w t h . A b b r e v i a t i o n : B W , BW 2 8 4 c 5 1 . P a n e l s A t h r o u g h G a r e d a r k f i e l d m i c r o g r a p h s o f u n s t a i n e d D R G n e u r o n c u l -t u r e s g r o w n f o r 1 0 d a y s i n m e d i u m c o n t a i n i n g e i t h e r B W 2 8 4 c 5 1 ( A , 1 0 4 M ; B , 1 0 - 5 M ; C , 1 0 6 M ) o r p h y s o s t i g m i n e ( E , 1 0 4 M ; F , 1 0 - 5 M ) o r m e d i u m o n l y ( D a n d G ) . I n e a c hp a n e l , t h e c e n t r a l p l a t i n g a r e a c o n t a i n i n g t h e c e l l b o d i e s i s t o t h e l e f t a n d n e u r i t e s e x t e n d t o t h e r i g h t . I n b o t h c a s e s , t h e r e i s a d o s e - d e p e n d e n t r e t a r d a t i o n o f o u t g r o w t h a n da n i n c r e a s e i n n e u r i t e f a s c i c u l a t i o n , T h e s e r e s u l t s a r e s h o w n g r a p h i c a l l y i n p a n e l s H a n d L . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n s S E M . S t a t i s t i c s f o r d i f f e r e n c e s a m o n g t h em e a n s w e r e c a r r i e d o u t b y t h e S t u d e n t s t - t e s t . ( * p < 0 . 0 1 ; * * p < 0 . 0 0 1 ) . B a r = 2 m m f o r p a n e l s A - G .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 7 , S u p p l e m e n t 1 * F e b r u a r y 1 9 9 9

l

83


4/7

BIGBEE E T A L .

i n h i b i t o r s t u d i e s d e s c r i b e d a b o v e , c u l t u r e se x p o s e d t o l o w A C h E a n t i b o d y c o n c e n t r a -t i o n s f o r 6 d a y s h a d a 50% r e d u c t i o n i n t h ea r e a o f n e u r i t e o u t g r o w t h , c o m p a r e d t ot r e a t m e n t w i t h n o r m a l m o u s e I g G a n du n t r e a t e d c o n t r o l s ( F i g u r e 6 ) . I n a d d i t i o n ,t h e n e u r i t e s b e c o m e m o r e d e n s e l y p a c k e d ,h i g h l y i n t e r l a c e d , a n d t h e i r d i s t a l e n d st e r m i n a t e a s a u n i f o r m g r o w t h f r o n t .G r o w t h c o n e s a r e m o s t l y c o n f i n e d t o t h i sl e a d i n g e d g e a n d a r e l a r g e r t h a n t h o s e i n1 0 0 -

8 00C

a )a )

6 0 -

4 0

2 0 -

0

U - H N e u r i t e o u t g r o w t h-- A C h E a c t i v i t y

- 7 - 6 - 5 - 4M o l a r c o n c e n t r a t i o n o f B W 2 8 4 c 5 1

F i g u r e 3 . A C h E a c t i v i t y c o r r e l a t e s w i t h n e u r i t e o u t -g r o w t h . N e u r i t e o u t g r o w t h a t i n c r e a s i n g c o n c e n t r a -t i o n s o f B W 2 8 4 c 5 1 i s e x p r e s s e d a s p e r c e n t o f c o n t r o la n d g r a p h e d t o g e t h e r w i t h t h e a m o u n t o f A C h E a c t i v i t ym e a s u r e d i n t h o s e c u l t u r e s , w h i c h i s a l s o e x p r e s s e d a sp e r c e n t o f c o n t r o l . N o t e t h e c o r r e s p o n d e n c e b e t w e e nt h e s e t w o c u r v e s , w h i c h i n d i c a t e s t h e c l o s e c o r r e l a t i o nb e t w e e n A C h E a c t i v i t y i n t h e c u l t u r e a n d d e g r e e o fn e u r i t e o u t g r o w t h .

e i t h e r c o n t r o l g r o u p . S u b s t i t u t i o n o fi m m u n o d e p l e t e d MAB 3 04 a s c i t e s f l u i de l i m i n a t e s b o t h t h e d e t a c h m e n t o f n e u r i t e sa n d r e t a r d e d o u t g r o w t h , i n d i c a t i n g t h a tt h e e f f e c t s a r e d u e t o a n t i b o d y i n t h ea s c i t e s f l u i d .L e v e l o f A C h E E x p r e s s i o n I sM o d u l a t e d b y t h e r a c e l l u l a r M a t r i xA p o t e n t i a l f u n c t i o n a l i n t e r a c t i o n b e t w e e nA C h E a n d c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x i s s u g g e s t e d b y o u r r e s u l t s , w h i c hs h o w t h a t A C hE l e v e l s c a n b e a l t e r e d b yDRG n e u r o n s w h e n t h e y e n c o u n t e r a ne x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t t h a t v a r i e s i n i t sd e g r e e o f p e r m i s s i v e n e s s t o o u t g r o w t h( 2 1 ) . A s s h o w n i n F i g u r e 7 , DRG n e u r o n sg r o w n o n a s u b s t r a t u m o f t y p e I c o l l a g e n

e x h i b i t n e u r i t e s t h a t a r e more f a s c i c u l a t e da n d l e s s e x t e n s i v e t h a n t h o s e on t h e morep e r m i s s i v e M a t r i g e l s u b s t r a t u m . F u r t h e r -m o r e , t h e n eu ro ns o n t y p e I c o l l a g e ne x p r e s s a p p r o x i m a t e l y t w i c e a s muchA C h E a s c e l l s g r o w n on M a t r i g e l , s u g g e s t -i n g t h a t more AChE i s r e q u i r e d f o r g r o w t hon a l e s s p e r m i s s i v e s u b s t r a t u m .D i s c u s s i o nO u r s t u d i e s u s i n g c u l t u r e d DRG n e u r o n ss h o w t h a t A C hE l e v e l s i n c r e a s e i n p a r a l l e lw i t h n e u r i t e o u t g r o w t h a n d t h a t t h i s e x p r e s -s i o n c a n b e m o d u l a t e d i n r e s p o n s e t o t h et y p e o f s u b s t r a t u m . F u r t h e r m o r e , c e r t a i nAChE i n h i b i t o r s p r o d u c e a d o s e - d e p e n d e n t ,b u t r e v e r s i b l e , r e d u c t i o n i n n e u r i t e o u t -g r o w t h ( 5 , 1 5 , 1 7 ) , w h i c h i s a c c o m p a n i e d b y

T a b l e 1 . C o m p a r i s o n o f t a r g e t s p e c i f i c i t y a n d e f f e c t o n n e u r i t e o u t g r o w t h o f c h o l i n e s t e r a s e i n h i b i t o r s .C o m p o u n d E n z y m e t a r g e t E f f e c t o n o u t g r o w t h R e f e r e n c eB W 2 8 4 c 5 1 A C h E + + + + B a t a i l l e e t a l . , 1 9 9 8 ( 3 8 )B i g b e e a n d D e V r i e s , 1 9 8 7 ( 1 7 )D u p r e e a n d B i g b e e , 1 9 9 4 , 1 9 9 6 ( 1 8 , 2 0 )J o n e s e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 9 )L a y e r e t a l . , 1 9 9 3 ( 3 0 )S m a l l e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 8 )S r i v a t s a n a n d P e r e t z , 1 9 9 7 ( 3 9 )P h y s o s t i g m i n e A C h E + + D u p r e e a n d B i g b e e , 1 9 9 6 ( 2 0 )E d r o p h o n i u m A C h E + S m a l l e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 8 )S r i v a t s a n a n d P e r e t z , 1 9 9 7 ( 3 9 )E c o t h i o p h a t e A C h E / B C h E J o n e s e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 9 )L a y e r e t a l . , 1 9 9 3 ( 3 0 )D F P A C h E / B C h E D u p r e e a n d B i g b e e , 1 9 9 6 ( 2 0 )J o n e s e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 9 )S m a l l e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 8 )i s o - O M P A B C h E D u p r e e a n d B i g b e e , 1 9 9 4 , 1 9 9 6 ( 1 8 , 2 0 )J o n e s e t a l . , 1 9 9 5 ( 2 9 )L a y e r e t a l . , 1 9 9 3 ( 3 0 )S r i v a t s a n a n d P e r e t z , 1 9 9 7 ( 3 9 )

F i g u r e 4 . A C h E i n h i b i t o r t r e a t m e n t p r o d u c e s n e u r o f i l a m e n t a c c u m u l a t i o n s . D R G n e u r o n s w e r e g r o w n f o r 1 0 d a y s i n t h e p r e s e n c e o f B W 2 8 4 c 5 1 a t 1 0 - 4 M c o n c e n t r a t i o n a n de x a m i n e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n c e ( A ) a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( B ) . I n A , a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s u b u n i t o f n e u r o f i l a m e n t sr e v e a l s a l a r g e a c c u m u l a t i o n o f i m m u n o r e a c t i v e m a t e r i a l i n n e a r l y h a l f o f t h e c e l l b o d i e s ( a r r o w s ) . E l e c t r o n m i c r o s c o p y ( B ) r e v e a l s t h a t t h e s e m a s s e s a r e c o m p o s e d a l m o s te n t i r e l y o f n e u r o f i l a m e n t s w i t h a f e w t r a p p e d o r g a n e l l e s ( a r r o w s ) . B a r i n A = 5 0 p m ; b a r i n B = 2 . 0 p m .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 0 7 , S u p p l e m e n t 1 * F e b r u a r y 9 9 94


5/7

DEVELOPMENTAL ROLE FO R ACETYLCHOUNESTERASE

a c c u m u l a t i o n s o f n e u r o f i l a m e n t s i n t h e c e l lb o d y ( 1 5 - 1 7 ) . F i n a l l y , e x p o s u r e t o a nA C h E m o n o c l o n a l a n t i b o d y d e c r e a s e sn e u r i t e o u t g r o w t h a s w e l l a s a l t e r i n g t h em o r p h o l o g y o f t h a t o u t g r o w t h ( 2 2 ) .C o l l e c t i v e l y , t h e s e d a t a s t r o n g l y s u p p o r t am o r p h o g e n i c r o l e f o r AChE i n n e u r i t e o u t -g r o w t h . M o r e o v e r , o u r f i n d i n g s t h a t AChE

a n t i b o d y t re a tm en t c a n a l s o c a u s e r a p i dd e t a c h m e n t o f n e u r i t e s f r o m t h e s u b s t r a t u m( 2 2 ) f u r t h e r s u g g e s t t h a t AChE f u n c t i o n s b ya n a d h e s i v e m e c h a n i s m . W e a r e c u r r e n t l ya t t e m p t i n g t o i d e n t i f y t h e r e a c t i v e e p i t o p ef o r MAB304 o n t h e AChE m o l e c u l e a n d t od e t e r m i n e t h e p r o x i m i t y o f t h a t s i t e t o t h eo p e n i n g o f t h e a c t i v e s i t e g o r g e . I n d o i n g s o

w e m a y b e a b l e t o d e t e r m i n e i f t h e p e r t u r b a -t i o n i n n e u r i t e o u t g r o w t h r e s u l t i n g f r o ma n t i - A C h E a n t i b o d y t r e a t m e n t i n v o l v e s as i t e r e l a t e d t o , o r m o r e d i s t a n t , f r o m t h es i t e ( s ) o c c u p i e d b y p h a r m a c o l o g i c a g e n t s ,i . e . , B W 2 8 4 c 5 1 o r p h y s o s t i g m i n e .T h e d i r e c t i n v o l v e m e n t o f A C h E i np r o c e s s o u t g r o w t h h a s b e e n d e m o n s t r a t e d

' e* x :' - #.U

Ae k . 1. c . tC o n t r o l M A B 3 0 4

F i g u r e 5 . S h o r t - t e r m , h i g h - d o s e a n t i b o d y t r e a t m e n t c a u s e s n e u r i t e d e t a c h m e n t . T e n - d a y - o l d c u l t u r e s w e r e t r e a t e d f o r 1 - 3 h r w i t h 2 0 0 p g / m I o f M A B 3 0 4 . T h e d a r k f i e l d m i c r o -g r a p h o f t h e u n t r e a t e d c u l t u r e ( l e f t p a n e l ) s h o w s t h e r a d i a l l y o r i e n t e d p a t t e r n o f n e u r i t e o u t g r o w t h w i t h t h e c e n t r a l p l a t i n g a r e a b e y o n d t h e b o t t o m o f t h e f i e l d . W i t h i n 2 h r o fa n t i b o d y a d d i t i o n ( r i g h t p a n e l ) t h e d i s t a l n e u r i t e s h a d d e t a c h e d a n d c o n t i n u e d t o d e t a c h c e n t r i p e t a l l y w i t h t i m e . R e m o v a l o f t h e a n t i b o d y r e s u l t e d i n r e s u m e d n e u r i t e o u t g r o w t hw i t h i n 8 - 1 2 h r . N o c o m p l e m e n t a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n t h e c u l t u r e m e d i u m . B a r = 1 mm i n b o t h p a n e l s .

]

N

F i g u r e 6 . L o n g - t e r m , l o w - d o s e a n t i b o d y t r e a t m e n t r e d u c e s n e u r i t e o u t g r o w t h . D R G n e u r o n c u l t u r e s w e r e t r e a t e d f o r 6 d a y s w i t h e i t h e r 2 0 p g / m I M A B 3 0 4 ( A - C ) o r n o r m a lm o u s e l g G ( D - F ) . P a n e l s A a n d D a r e l o w m a g n i f i c a t i o n i m a g e s o f a n e n t i r e c u l t u r e s h o w i n g t h e c e n t r a l p l a t i n g a r e a c o n t a i n i n g t h e D R G n e u r o n a l c e l l b o d i e s a n d r a d i a l l y o r i -e n t e d n e u r i t e o u t g r o w t h . T h e e x t e n t o f t h e o u t g r o w t h i s i n d i c a t e d b y a c o m p u t e r - g e n e r a t e d p e r i m e t e r t h a t w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e t o t a l o u t g r o w t h a r e a . A n t i b o d y t r e a t m e n tr e s u l t e d i n a 5 0 % r e d u c t i o n i n o u t g r o w t h b a s e d o n m e a s u r e m e n t s f r o m a m i n i m u m o f 1 2 c u l t u r e s o b t a i n e d f r o m t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i me n t s . P a n e l s B a n d E a r e l o w m a g n i -f i c a t i o n s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o g r a p h s t a k e n f r o m t h e o u t g r o w t h m a r g i n s i n d i c a t e d b y t h e b o x e s i n A a n d D . N o t e t h a t M A B 3 0 4 t r e a t m e n t ( B ) p r o d u c e d a m o r e d e n s e l y i n t e r -l a c i n g p a t t e r n o f o u t g r o w t h t h a t t e r m i n a t e s a t a v e r y u n i f o r m l e a d i n g e d g e c o m p a r e d w i t h n o r m a l l g G c o n t r o l ( E ) . I n a d d i t i o n , t h e g r o w t h c o n e s a r e l a r g e r a n d r e s t r i c t e d t o t h eo u t g r o w t h m a r g i n i n a n t i b o d y - t r e a t e d c u l t u r e s ( C ) . B a r i n D = 0 . 5 c m f o r p a n e l s A a n d D ; b a r i n E = 2 5 0 p m f o r p a n e l s B a n d E ; b a r i n F = 2 5 p m f o r p a n e l s C a n d F . R e p r o d u c e df r o m B i g b e e a n d S h a r m a ( 4 6 ) w i t h p e r m i s s i o n f r o m P l e n u m P r e s s .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s a V o l 1 0 7 , S u p p l e m e n t 1 * F e b r u a r y 1 9 9 9 8 5


6/7

BIGBEE ET A L .

Collagen1 - - M a t r i g e l ::- : : ; ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ...~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Mi g u r e 7 . E f f e c t s o f c u l t u r e s u b s t r a t u m o n A C h E e x p r e s s i o n . P h o t o m i c r o g r a p h s o f D R G g r o w n f o r 4 d a y s o nc o l l a g e n t y p e o r M a t r i g e l a n d s t a i n e d h i s t o c h e m i c a l l y f o r A C h E a c t i v i t y . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t hn o n d i s s o c i a t e d g a n g l i a t o e l i m i n a t e t h e l a r g e a m o u n t o f c e l l u l a r m i g r a t i o n t h a t o c c u r s o n M a t r i g e l . N o t e t h ei n t e n s e , d a r k s t a i n i n g o f b o t h t h e g a n g l i a ( g ) a n d n e u r i t e s ( a r r o w s ) o n t h e c o l l a g e n s u b s t r a t u m , w h i c h c o n t r a s t sw i t h t h e l o w e r a c t i v i t y s ee n o n M a t r i g e l . A C h E a c t i v i t y i s - b a r e l y d e t e c t a b l e i n t h e n e u r i t e s ( a r r o w s ) . B a r = 3 5 0 , u m

i n b o t h p a n e l s .i n r e c e n t s t u d i e s i n w h i c h t h e e x p r e s s i o n o fA C h E w a s g e n e t i c a l l y m a n i p u l a t e d .O v e r e x p r e s s i o n o f A C h E i n c e l l l i n e s( 3 3 , 3 4 ) , s p i n a l n e u r o n s ( 3 5 ) , o r r e t i n a lc e l l s ( 3 6 ) c a u s e d i n c r e a s e d o u t g r o w t h t h a tp a r a l l e l e d t h e l e v e l o f A C h E e x p r e s s i o n .C o n v e r s e l y , d e c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n o fA C h E , u s i n g a n t i s e n s e t e c h n i q u e s , r e d u c e do u t g r o w t h ( 3 4 , 3 7 ) .O t h e r i n v i t r o s t u d i e s e m p l o y i n g a v a r i -e t y o f n e u r o n a l c e l l t y p e s h a v e r e p o r t e dr e t a r d a t i o n o f n e u r i t e o u t g r o w t h i n r e s p o n s et o A C h E i n h i b i t o r t r e a t m e n t . T h e s e s t u d i e su s e d c h i c k t e c t a l a n d r e t i n a l g a n g l i o n n e u -r o n s ( 3 0 ) , r a t s y m p a t h e t i c g a n g l i o n n e u r o n s( 2 8 ) , d o p a m i n e r g i c m i d b r a i n n e u r o n s ( 2 9 ) ,s p i n a l m o t o r n e u r o n s ( 3 8 ) , a n d A p l y s i ap e d a l g a n g l i o n n e u r o n s ( 3 9 ) . T h e s e s t u d i e ss h o w t h a t t h e m o s t p o t e n t i n h i b i t o r o f o u t -g r o w t h w a s B W 2 8 4 c 5 1 , w h i c h o c c u p i e sb o t h t h e c a t a l y t i c a n d t h e p e r i p h e r a l a n i o n i cs i t e s o f t h e a c t i v e c e n t e r g o r g e o f A C h E . Ont h e b a s i s o f t h e c r y s t a l l o g r a p h i c d a t a f o rAChE c o m p l e x e d w i t h t h e AChE i n h i b i t o rd e c a me t h on i u m, w h i c h i s a l s o a l i n e a r , b i s -q u a t e r n a r y n i t r o g e n c o m p o u n d ( 4 0 ) , i t i sl i k e l y t h a t t h e B W 2 8 4 c 5 1 m o l e c u l e e x t e n d sb e y o n d t h e o p e n i n g o f t h e g o r g e . I n t h i so r i e n t a t i o n , BW284c51 c o u l d i n t e r f e r ew i t h t h e p r o p o s e d s e c o n d a r y g r o w t h - r e l a t e ds i t e ( 3 0 ) . T h u s , e x a m i n a t i o n o f t h e p h y s i c -o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f A C hE i n h i b i t o r smay p r o v i d e a d d i t i o n a l c l u e s a b o u t t h el o c a t i o n a n d / o r n a t u r e o f t h i s s e c o n d a r y s i t eo n A C h E .A g r i c u l t u r a l a n d h o u s e h o l d p e s t i c i d e st h a t t a r g e t A C h E c o u l d i n t e r f e r e w i t h t h i sn o n c h o l i n e r g i c r o l e o f A C h E i f e x p o s u r e

o c c u r s d u r i n g c r i t i c a l p e r i o d s o f n e r v o u s s y s -t e m d e v e l o p m e n t . A s i n d i c a t e d e a r l i e r , DFPh a s n o e f f e c t o n n e u r i t e g r o w t h ; h o w e v e r , ap r e l i m i n a r y r e p o r t ( 4 1 ) s h o w s t h a t ad i f f e r e n t o r g a n o p h o s p h a t e c o m p o u n d ,c h l o r p y r i f o s ( D u r s b a n ) , d e c r e a s e s n e u r i t eo u t g r o w t h i n c u l t u r e d P C - 1 2 c e l l s . I nh u m a n a n d a n i m a l s t u d i e s , p r e n a t a l e x p o -s u r e t o c h l o r p y r i f o s p r o d u c e s c e l l u l a r a n db e h a v i o r a l n e u r o t o x i c i t y ( 4 2 - 4 4 ) ; i n t h eh u m a n s t u d y ( 4 4 ) , CNS a b n o r m a l i t i e s w e r ec o n s i s t e n t l y n o t e d , i n c l u d i n g s t r u c t u r a ld e f e c t s i n t h e v e n t r i c l e s a n d c o r p u s c a l l o -s u m . I n t e r e s t i n g l y , y o u n g a n i m a l s e x h i b i t a ni n c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t y t o o r g a n o p h o s p h o -r u s i n s e c t i c i d e s ( 4 5 ) , s u g g e s t i n g t h e n e c e s -s i t y o f f u r t h e r s t u d y t o d e t e r m i n e i f t h e s ea g e n t s p o s e a t e r a t o g e n i c t h r e a t d u r i n g c r i t i -c a l p e r i o d s o f g e s t a t i o n . B e c a u s e t h e d e v e l -o p m e n t a l , m o r p h o g e n i c r o l e f o r A C hE i na x o n a l g r o w t h i s no w w e l l e s t a b l i s h e d , c u r -r e n t r e s e a r c h i s d i r e c t e d t o w a r d u n d e r s t a n d -i n g t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n a n d r e g u l a t i o no f e x p r e s s i o n o f t h i s p r o t e i n .

REFERENCES A ND NOTES1 . L a y e r P G , W i l l b o l d E . N o v e l f u n c t i o n s o fc h o l i n e s t e r a s e s i n d e v e l o p m e n t , p h y s i o l o g y a n dd i s e a s e . P r o g H i s t o c h e m C y t o c h e m 2 9 : 1 - 9 4( 1 9 9 5 ) .2 . M a s s o u l i e J , P e z z e m e n t i L , B o n S , K r e j c i E ,V a l l e t t e F M . M o l e c u l a r a n d c e l l u l a r b i o l o g y o fc h o l i n e s t e r a s e s . P r o g N e u r o b i o l 4 1 : 3 1 - 9 1 ( 1 9 9 1 ) .3 . R o b e r t s o n R T , Y u J . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a n dn e u r a l d e v e l o p m e n t : n e w t r i c k s f o r a n o l d d o g ?N e w s P h y s i o l S c i 8 : 2 6 6 - 2 7 2 ( 1 9 9 3 ) .

4 . R o b e r t s o n R T . A m o r p h o l o g i c a l r o l e f o r t r a n -s i e n t l y e x p r e s s e d a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t yi n d e v e l o p i n g t h a l a m o c o r t i c a l s y s t e m s ?N e u r o s c i L e t t 7 5 : 2 5 9 - 2 6 4 ( 1 9 8 7 ) .5 . K r i s t t D A . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n t h e v e n -t r o b a s a l t h a l a m u s : t r a n s i e n c e a n d p a t t e r n i n gd u r i n g o n t o g e n e s i s . N e u r o s c i e n c e 1 0 : 9 2 3 - 9 3 9( 1 9 8 3 )6 . K o s t o v i c I , G o l d m a n - R a k i c P S . T r a n s i e n tc h o l i n e s t e r a s e s t a i n i n g i n t h e m e d i o d o r s a ln u c l e u s o f t h e t h a l a m u s a n d i t s c o n n e c t i o n s i nt h e d e v e l o p i n g h u m a n a n d m o n k e y b r a i n . JC o m p N e u r o l 2 1 9 : 4 3 1 - 4 4 7 ( 1 9 8 3 ) .7 . B r i m i j o i n S , H a m m o n d P . T r a n s i e n t e x p r e s s i o no f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e m e s s e n g e r R N A a n de n z y m e a c t i v i t y i n d e v e l o p i n g r a t t h a l a m u s s t u d -i e d b y q u a n t i t a t i v e h i s t o c h e m i s t r y a n d i n s i t uh y b r i d i z a t i o n . N e u r o s c i e n c e 7 1 : 5 5 5 - 5 6 5 ( 1 9 9 6 ) .8 . L a y e r P G . C h o l i n e s t e r a s e s p r e c e d i n g m a j o rt r a c t s i n v e r t e b r a t e n e u r o g e n e s i s . B i o E s s a y s1 2 : 4 1 5 - 4 2 0 ( 1 9 9 0 ) .9 . W e i k e r t T , R a t h j e n F G , L a y e r P G . D e v e l o p -m e n t a l m a p s o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a n d G 4 -a n t i g e n o f t h e e a r l y c h i c k e n b r a i n : l o n gd i s t a n c e t r a c t s o r i g i n a t e f r o m A C h E - p r o d u c i n gc e l l b o d i e s . J N e u r o b i o l 2 1 : 4 8 2 - 4 9 8 ( 1 9 9 0 ) .1 0 . C o c h a r d P , C o l t e y P . C h o l i n e r g i c t r a i t s i n t h en e u r a l c r e s t : a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n c r e s t c e l l so f c h i c k e m b r y o . D e v B i o l 9 8 : 2 2 1 - 2 3 8 ( 1 9 8 3 ) .1 1 . M o o d y S A , S t e i n D B . T h e d e v e l o p m e n t o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y i n t h e e m b r y o n i cn e r v o u s s y s t e m o f t h e f r o g , X e n o p u s l a e v i s .D e v B r a i n R e s 3 9 : 2 2 5 - 2 3 2 ( 1 9 8 8 ) .1 2 . B i a g i o n i S , O d o r i s i o T , P o i n a G , S c a r s e l l a G ,A u g u s t i - T o c c o , G . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n t h ed e v e l o p m e n t o f c h i c k d o r s a l r o o t g a n g l i a . I n t JD e v N e u r o s c i 7 : 2 6 7 - 2 7 3 ( 1 9 8 9 ) .1 3 . L a y e r P G , K a u l i c h S . C r a n i a l n e r v e g r o w t h i nb i r d s i s p r e c e d e d b y a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ee x p r e s s i o n d u r i n g n e u r a l c r e s t c e l l m i g r a t i o na n d t h e f o r m a t i o n o f a n H N K - 1 s c a f f o l d . C e l lT i s s u e R e s 2 6 5 : 3 9 3 - 4 0 7 ( 1 9 9 1 ) .1 4 . K o e n i g s b e r g e r C , H a m m o n d P , B r i m i j o i n S .D e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f a c e t y l - a n db u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e i n t h e r a t : e n z y m e a n dm R N A l e v e l s i n e m b r y o n i c d o r s a l r o o t g a n g l i a .B r a i n R e s 7 8 7 : 2 4 8 - 2 5 8 ( 1 9 9 8 ) .1 5 . T e n n y s o n V M , B r z i n M . T h e a p p e a r a n c e o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n t h e d o r s a l r o o t n e u r o -b l a s t o f t h e r a b b i t e m b r y o . J C e l l B i o l 4 6 : 6 4 - 8 0( 1 9 7 0 ) .1 6 . O u d e g a M , M a r a n i E . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i nt h e d e v e l o p i n g r a t s p i n a l c o r d : a n e n z y m e h i s t o -c h e m i c a l s t u d y . E u r J M o r p h o l 2 8 : 3 7 9 - 3 9 3( 1 9 9 0 ) .1 7 . B i g b e e J W , D e V r i e s G H . I n h i b i t i o n o f a c e t y l -c h o l i n e s t e r a s e r e t a r d s n e u r i t e o u t g r o w t h i nv i t r o . J N e u r o c h e m 4 8 : 5 5 9 ( 1 9 8 7 ) .1 8 . D u p r e e J L , B i g b e e J W . R e t a r d a t i o n o f n e u r i t i co u t g r o w t h a n d c y t o s k e l e t a l c h a n g e s a c c o m -p a n y a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n h i b i t o r t r e a t m e n t i nc u l t u r e d r a t d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u r o n s . JN e u r o s c i R e s 3 9 : 5 6 7 - 5 7 5 ( 1 9 9 4 ) .1 9 . D u p r e e J L , M a y n o r E N , B i g b e e J W . I n v e r s e c o r -r e l a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( A C h E ) a c t i v i t yw i t h t h e p r e s e n c e o f n e u r o f i l a m e n t s i n c l u s i o n si n d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u r o n s c u l t u r e d i n t h ep r e s e n c e o f a r e v e r s i b l e i n h i b i t o r o f A C h E .N e u r o s c i L e t t 1 9 7 : 3 7 - 4 0 ( 1 9 9 5 ) .2 0 . D u p r e e J L , B i g b e e , J W . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s ei n h i b i t o r t r e a t m e n t d e l a y s r e c o v e r y f r o m

86 E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s . V o l 1 0 7 , S u p p l e m e n t * F e b r u a r y 1 9 9 9


7/7

DEVELOPMENTAL ROLE FOR ACETYMCHOUNESTERASE

a x o t o m y i n c u l tu r e d d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u -r o n s . J N e u r o c y t o l 2 5 : 4 3 9 - 4 5 4 ( 1 9 9 6 ) .2 1 . G u p t a J J , B i g b e e J W . S u b s t r a t u m - i n d u c e dm o d u l a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y i nc u l t u r e d d o r s a l r o o t g a n g l i o n n e u r o n s . JN e u r o s c i R e s 3 1 : 4 5 4 - 4 6 1 ( 1 9 9 2 ) .2 2 . S h a r m a K V , B i g b e e J W . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e( A C h E ) a n t i b o d y t r e a t m e n t r e s u l t s i n n e u r i t ed e t a c h m e n t a n d r e d u c e d o u t g r o w t h f r o m c u l -t u r e d n e u r o n s : f u r t h e r e v i d e n c e f o r a c e l l a d h e -s i v e r o l e f o r n e u r o n a l A C h E . J N e u r o s c i R e s5 3 : 4 5 4 - 4 6 4 ( 1 9 9 8 ) .2 3 . N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l . G u i d e f o r t h e C a r ea n d U s e o f L a b o r a t o r y A n i m a l s . W a s h i n g t o n :N a t i o n a l A c a d e m y P r e s s , 1 9 9 6 .2 4 . E l B a d a w i A , S c h e n k E A . H i s t o c h e m i c a l m e t h -o d s f o r t h e s e p a r a t e , c o n s e c u t i v e , a n d s i m u l t a -n e o u s d e m o n s t r a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ea n d n o r e p i n e p h r i n e i n c r y o s t a t s e c t i o n s . JH i s t o c h e m C y t o c h e m 1 6 : 5 8 0 - 5 8 8 ( 1 9 6 7 ) .2 5 . E l I m a n G L , C o u r t n e y D K , A n d r e s V J r , F e a t h e r -s t o n e R M . A n e w a n d r a p i d c o l o r i m e t ri c d e t e r -m i n a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y .B i o c h e m P h a r m a c o l 7 : 8 8 - 9 5 ( 1 9 6 1 ) .2 6 . H a l l Z . M u l t i p l e f o r m s o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a n dt h e i r d i s t r i b u t i o n i n e n d p l a t e a n d o n - e n d p l a t er e g i o n s o f t h e r a t d i a p h r a g m m u s c l e . J N e u r o b i o l4 : 3 4 3 - 3 6 1 ( 1 9 7 2 )2 7 . K o e l l e G B . T h e h i s t o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n c h o l i n e r g i c , a d r e n e r g i c ,a n d s e n s o r y n e u r o n s . J P h a r m a c o l E x p T h e r1 1 4 : 1 6 7 - 1 8 4 ( 1 9 5 5 ) .2 8 . S m a l l D H , R e e d G , W h i t f i e l d B , N u r c o m b e V .C h o l i n e r g i c r e g u l a t i o n o f n e u r i t e o u t g r o w t h f o ri s o l a t e d c h i c k s y m p a t h e t i c n e u r o n s i n c u l t u r e . JN e u r o s c i 1 5 : 1 4 4 - 1 5 1 ( 1 9 9 5 ) .2 9 . J o n e s S A , H o l m e s C , B u d d T C , G r e e n f i e l d S A .T h e e f f e c t o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e o n o u t -g r o w t h o f d o p a m i n e r g i c n e u r o n s i n o r g a n o t y p i cs l i c e c u l t u r e o f r a t m i d b r a i n . C e l l T i s s u e R e s2 7 9 : 3 2 3 - 3 3 0 ( 1 9 9 5 ) .

3 0 . L a y e r P G , W e i k e r t T , A l b e r R . C h o l i n e s t e r a s e sr e g u l a t e n e u r i t e o u t g r o w t h o f c h i c k n e r v e c e l l si n v i t r o b y m e a n s o f a n o n c h o l i n e r g i c e n z y m a t i cm e c h a n i s m . C e l l T i s s u e R e s 2 7 3 : 2 1 9 - 2 2 6( 1 9 9 3 ) .3 1 . B e n d e r , B L G h a t a k N R . L i g h t a n d e l e c t r o nm i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o n a g a n g l i o n e u r o m a .A c t a N e u r o p a t h o l 2 6 : 7 - 1 0 ( 1 9 7 8 ) .3 2 . F a m b r o u g h D M , E n g e l A G , R o s e n b e r r y T L .A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e o f h u m a n e r y t h r o c y t e s a n dn e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n s : h o m o l o g i e s r e v e a l e db y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . B i o c h e m i s t r y7 9 : 1 0 7 8 - 1 0 8 2 ( 1 9 8 2 ) .3 3 . K a r p e l R , S t e r n f e l d M , G i n z b e r g D , G u h I E ,G r a e s s m a n n A , S o r e q H . O v e r e x p r e s s i o n o fa l t e r n a t i v e h u m a n a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e f o r m sm o d u l a t e s p r o c e s s e x t e n s i o n s i n c u l t u r e dg l i o m a c e l l s . J N e u r o c h e m 6 6 : 1 1 4 - 1 2 3 ( 1 9 9 6 ) .3 4 . K o e n i g s b e r g e r C , C h i a p p a S , B r i m i j o i n S .N e u r i t e d i f f e r e n t i a t i o n i s m o d u l a t e d i n n e u r o -b l a s t o m a c e l l s e n g i n e e r e d f o r a l t e r e d l e v e l s o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e e x p r e s s i o n . J N e u r o c h e m6 9 : 1 3 8 9 - 1 3 9 7 ( 1 9 9 7 ) .3 5 . S t e r n f e l d M , M i n g G - L , S o n g H - J , S e l a K ,T i m b e r g R , P o o M - M , S o r e q H . A c e t y l c h o l i n e -

s t e r a s e e n h a n c e s n e u r i t e g r o w t h a n d s y n a p s ed e v e l o p m e n t t h r o u g h a l t e r n a t i v e c o n t r i b u t i o n so f i t s h y d r o l y t i c c a p a c i t y , c o r e p r o t e i n , a n d v a r i -a b l e C t e r m i n i . J N e u r o s c i 1 8 ( 4 ) : 1 2 4 0 - 1 2 4 9( 1 9 9 8 ) .3 6 . R o b i t z k i A , M a c k A , H o p p e U , C h a n t o n n e t A ,L a y e r P G . R e g u l a t i o n o f c h o l i n e s t e r a s e g e n ee x p r e s s i o n a f f e c t s n e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o n a sr e v e a l e d b y t r a n s f e c t i o n s t u d i e s o n r e a g g r e g a t -i n g e m b r y o n i c c h i c k r e t i n a l c e l l s . E u r J N e u r o s c i9 : 2 3 9 4 - 2 4 0 5 ( 1 9 9 7 ) .3 7 . G r i f m a n M , L a s t A , A g o s t o n M , S o r e q H .A n t i s e n s e i n h i b i t i o n o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i nP C - 1 2 c e l l s . J N e u r o c h e m 6 9 : 7 5 ( 1 9 9 7 ) .3 8 . B a t a i l l e S , P o r t a l i e r P , C o u l o n P , T e r n a u x J P .I n f l u e n c e o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e o n e m b r y o n i c

s p i n a l r a t m o t o n e u r o n e s g r o w t h i n c e l l c u l t u r e :a q u a n t i t a t i v e m o r p h o m e t r i c s t u d y . E u r JN e u r o s c i 1 0 : 5 6 0 - 5 7 2 . ( 1 9 9 8 ) .3 9 . S r i v a t s a n M , P e r e t z B . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s ep r o m o t e s r e g e n e r a t i o n o f n e u r i t e s i n c u l t u r e da d u l t n e u r o n s o f A p l y s i a . N e u r o s c i e n c e7 7 : 9 2 1 - 9 3 1 ( 1 9 9 7 ) .4 0 . H a r e l M , S c h a l k I , E h r e t - S a b a t i e r L , B o u e t F ,G o e l d n e r M , H i r t h C , A x e l s e n P H , S i l m a n I ,S u s s m a n J L . Q u a t e r n a r y l i g a n d b i n d i n g t o a r o -m a t i c r e s i d u e s i n t h e a c t i v e - s i t e g o r g e o fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e . P r o c N a t I A c a d S c i U S A9 0 : 9 0 3 1 - 9 0 3 5 ( 1 9 9 3 ) .4 1 . D a s K P , H o u s e D , B a r o n e S J r . N e u r o n a l d i f f e r -e n t i a t i o n o f P C 1 2 c e l l s i s i n h i b i t e d b y c h l o r p y r i -f o s a n d i t s m e t a b o l i t e s [ A b s t r a c t ] . T r a n s S o cT o x i c o l 3 7 : 1 5 8 ( 1 9 9 8 ) .4 2 . M u t o M A , l o b e l l e F J r . B i d a n s e t J H , W u r p e lJ N . E m b r y o t o x i c i t y a n d n e u r o t o x i c i t y i n r a t sa s s o c i a t e d w i t h p r e n a t a l e x p o s u r e t o D u r s b a n .V e t H u m T o x i c o l 3 4 : 4 9 8 - 5 0 1 ( 1 9 9 2 )4 3 . C h a n d a S M , P o p e C N . N e u r o c h e m i c a l a n d n e u -r o b e h a v i o r a l e f f e c t s o f r e p e a t e d g e s t a t i o n a le x p o s u r e t o c h l o r p y r i f o s i n m a t e r n a l a n dd e v e l o p i n g r a t s . P h a r m a c o l B io c he m B eh a v5 3 : 7 7 1 - 7 7 6 ( 1 9 9 6 ) .4 4 . S h e r m a n J D . C h l o r p y r i f o s ( D u r s b a n ) - a s s o c i a t e db i r t h d e f e c t s : r e p o r t o f f o u r c a s e s . A r c h E n v i r o nH e a l t h 5 1 : 5 - 8 ( 1 9 9 6 ) .4 5 . M o r t e n s e n S R , H o o p e r M J , P a d i l l a S . R a t b r a i na c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y : d e v e l o p m e n t a lp r o f i l e a n d m a t u r a t i o n a l s e n s i t i v i t y t o c a r b a m a t ea n d o r g a n o p h o s p h a t e i n h i b i t o r s . T o x i c o l o g y1 2 5 : 1 3 - 1 9 ( 1 9 9 8 ) .4 6 . B i g b e e J W , S h a r m a K V . A m o r p h o g e n i c r o l e f o ra c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n n e u r i t e o u t g r o w t h :s t u d i e s o n a c e l l a d h e s i v e f u n c t i o n . I n ;S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f C h o l i n e s t e r a s e s a n dR e l a t e d P r o t e i n s ( D o c t o r B P , Q u i n n D M ,R o t u n d o R L , T a y l o r P , e d s ) . N e w Y o r k : P l e n u mP r e s s , 1 9 9 9 ; 5 7 5 - 5 8 1 .

E n v i r o n m e n t a l H e a l t h P e r s p e c t i v e s * V o l 1 0 7 , S u p p l e m e n t 1 * F e b r u a r y 1 9 9 9 87

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Morphogenic Role for Acetylcholinesterase in Axonal Outgrowth During Neural Development