Možnosti laboratórnej

diagnostiky liekových alergií.

AdLa s.r.o., Prešov

Analyticko - diagnostické laboratórium a ambulancie, Prešov

MUDr. E. Gerlašinská, RNDr. Ľ. Muller

Alergická reakcia:

• Pojem alergia zaviedol v r. 1906

C.P. Pirquet

• Vzniká u senzibilizovaného jedinca po opakovanom stretnutí s antigénom (alergénom )

Lieková alergia

• asi 10% všetkých prípadov akútnych alergických reakcií

• sprostredkované IgE

• non IgE

Typy hypersenzitívnych

reakcií

Typ I Včasná ( aktivácia mastocytov )

anafylaktický šok, angioedém, astma, urtikária

Typ II (IgG alebo IgM )Cytotoxická sprostredkovaná protilátkami

anémia, trombocytopénia, neutropénia

Typ III Imunokomplexovánephritída, arthritíta, sérová choroba

Typ IV Bunkami sprostredkovanáSJS/TEN , DRESS Syndróm

Alergické reakcie na lieky:

• Bezprostredné reakcia

(v priebehu prvej hodiny po poslednom podaní lieku)

• Oneskorené reakcie

(po viac ako 1 hodine)

Nomenklatúra pre alergické

ochorenia

• Bezprostredné reakcie < 1 hod / IgE

urtikáriaangioedémrinitídabronchospazmusanafylaktický šok

• Oneskorené reakcie > 1 hod / non-IgE

makulopapulárny exantémoneskorená urtikária/angioedémfixný exantémexfoliatívne dermatitídy akútna generalizovaná exantematózna dermatitída (AGEP)liekové reakcie s eozinofíliou a so systémovými syndrómami(DRESS/DIHS)Stevenson-Johnsonov syndróm toxická epidermálna nekrolýza (TEN)

Patogénne mechanizmy:

• Patogénne mechanizmy typu I

(sprostredkované IgE)

• Patogénne mechanizmy typu IV

(sprostredkované bunkami)

IgEYYYY

Ag

Európska sieť pre liekovú alergiu (European Network for Drug Allergy, ENDA)

Navrhla všeobecné odporúčania pre diagnostiku takýchto reakcií:

1. klinická anamnéza (veľmi dôkladná, špeciálny dotazník)

2. výber diagnostických vyšetrení (podľa typu reakcie)

Laboratórne testy používané

pri diagnostike liekovej alergie

• 1. Humorálne: majú v praxi prevahu

- stanovenie špecifického IgE

- tryptáza a histamín

• 2. Bunkové testy

Bezprostredná reakcia:

• In vitro:

- vyšetrenie špecifických

IgE

- Test aktivácie bazofilov

prietokovou cytometriou

(BAT)

• In vivo:

- kožné testy

- liekové provokačné

testy

Stanovenie špecifických IgE

v sére:

- enzymaticky viazaná imunosorpčná analýza (ELISA)

- fluorescenčná enzýmové imunoanalýza (FEIA)

- luminuscenčná imunoanalýza (LEIA)

- kožné testy a stanovenie špec. IgE nie sú úplne rovnocenné

- in vitro testy - menej citlivé ( vysoká špecificita, nízka senzitivita)

Metódy stanovenia špecifických IgE

Naviazanie alergénov na pevnú fázu: •UniCAP ® PHARMACIA •QuantiScan ® INNOGENETICS •EUROLINE EUROIMMUN AG •CMG-Immunodot SANOFI Diagnostic•RISA DYNEX •AlaBLOT ® DPC •Allergen Disc Allergopharma•ALLERCOAT EAST SANOFI Diagnostic•RIDASCREEN ® R-Biopharm GmbH•ADVIA Centaur ® BAYER DIAGNOSTIC •ALLERgen Personal Lab ALLERGY BioChem ImmunoSystems Inc.

Naviazanie alergénov na kvapalnú fázu:IMMULITE® 2000 DPC AlaSTAT ®DPC

Špecifické IgE

- dôležité alergologické vyšetrenie doplňujúce kožné testy (výhodné - ak nie je možné realizovať kožné testy)

- prítomnosť špecifických protilátok triedy IgE proti určitému alergénu – dispozícia k alergickej reakcii I. typu

- citlivé imunochemické metódy - schopné zachytiť veľmi malémnožstvo špecif. IgE

- rôznorodé metódy detekcie - koncentrácia špec. IgE v sére sa udáva v štandardizovaných triedach RAST (RadioAllergySorbent Test)

- trieda I (najnižšia) – trieda VI (najvyššia)

Obmedzenia pri vyšetrení

špec. IgE:

- vyšetrenie je prínosom len, ak predpokladáme alergickú reakciu I. typu

- negatívny výsledok šIgE nevylučuje významnú alergickú reakciu,

veľká časť poliekových reakcií nie je sprostredkovaná IgE

- aj v prípade IgE mediovanej liekovej alergie nemusia dostupné lab. testy

dokázať reakciu na niektoré minoritné alergény

- bezprostredne po ťažkej alergickej reakcii (anafylaxii) - nie je možné

šIgE v krvi dokázať, je potrebné vyšetrenie o niekoľko týždňov odložiť.

- veľmi vysoké hodnoty celkového IgE v sére – falošne pozit. výsledky

šIgE (nešpecifická väzba IgE v teste).(MUDr. S. Honzová, Interní Med. 2009, 11(4), 168-170)

Tryptáza

• Mediátorom alergickej reakcie uvoľnovaným

zo žírnych buniek v tkanivách po expozícii alergénu.

• Výhodou oproti iným mediátorom (histamín):

- nie je uvoľnovaná z bb. PK (vylúčené ovplyvnenie výsledku jej uvoľnením

in vitro), má aj dlhší poločas rozpadu in vivo.

• Zvýšené hladiny:

- od niekoľko málo minút po anafylaktickej reakcii

- maximum – v intervale 15 minút – 3 hodiny po reakcii.

• Zvýšené hladiny pretrvávajú obvykle niekoľko hodín.

• Stanovenie tryptázy má význam pri dg. anafylaktickej reakcie

(lieky, potraviny, blanokrídly hmyz).

• Zvýšená hladina sa vyskytuje aj pri mastocytóze

Syndróm histamínovej

intolerancie

- nerovnováha medzi odbúravaním histamínu pomocou

enzýmu diaminooxidázy (DAO)

- DAO – enzým ľudského tela, ktorý kontinuálne tvoria

bunky črevnej sliznice a je čiastočne vylučovaný do čreva

- 3% populácie na Slovensku, cca 25-30% pacientov

v alergologických ambulanciách

- pacienti s typickým alergickým klinickým obrazom

a častou negativitou všetkých dostupných vykonaných

alergologických vyšetrení

Prečo bunkové testy?

- Vyšetrenie špecifických IgE : len cirkulujúce IgE protilátky

- Väčšina IgE protilátok je naviazaná: tkanivá, žírne bunky,

bazofily

- Vznik techník, ktorých cieľom je priblížiť sa viac situáciám,

ktoré sa odohrávajú v priebehu alergického ochorenia

- Testy, ktoré detegujú pochody spojené s aktiváciou bazofilov

periférnej krvi a uvoľnenie mediátorov alergickej reakcie

www.internimedicina.cz | 2009; 11(4) | Interní medicína pro praxi

Bunkové testy

• Test aktivácie bazofilov ( BAT)

• Eseje s T-lymfocytmi (LTT, LAT)

Princíplaboratórnych bunkových testov:

Špecifická stimulácia krvných buniek

alergénom a následné hodnotenie pochodov

spojených s ich aktiváciou, ev. degranuláciou.

Bunkové testy I.typ

hypersenzitívnej reakcie:

1. stanovenie histamínu alebo leukotriénov

( CAST test )

2. bazofildegranulačný test ( BHR )

3. expresia CD63 na bazofiloch metódou

prietokovej cytometrie ( BAT, FlowCAST )

CAST (Cellular allergen stimulation test)

)

• analýza mediátorov, ktoré sa uvoľňujú pri procese

degranulácie bazofilov:

- sulfidoleukotriény ( LTC4,, LTD4 , LTE4 )

- ev. histamín

• nie je to rutinná metóda

• nevýhodou je nutnosť izolácie bb. na hustotnom

gradiente ( nešpecifická stimulácia bazofilov )

Bazofilový degranulačný test ( BHR,Basophil histamine release ):

• stanovuje sa ich pasívnou senzibilizáciou alergénom

• väzba alergénu na receptory FcεRI indukuje uvoľnenie intracelulárneho depozitu histamínu a tvorbu ďalších mediátorov

• degranuláciu bazofilov charakterizuje strata afinity senzibilizovaných bazofilov k bázickým farbivám

• posúdenie procesu je možné vyhodnotiť metódou svetelnej mikroskopie

BAT

• Spoľahlivá a citlivá metóda pre dg. IgE sprostredkovanej alergie

• Je prínosom aj u reakcií, ktoré nie sú sprostredkované IgE (Ebo

aj. 2006)

• Prináša výhody oproti kožným testom a vyšetreniu špec. IgE

BAT – bazofilaktivačný test

• patrí medzi „ funkčné testy“

• Cieľ: - priblížiť sa čo najviac podmienkam in vivo

- sledovať priamo efekt reakcie alergénu

na cieľové bunky

BAT

• Vyvinutý ako doplnkový test

• Prelom – objav znaku CD63 (znak bazofilovej aktivácie)

• r. 1994 Sainte – Laudy a kol. popísal BAT

Bazofily

- Predstavujú primárne efektorové bunky v IgE sprostredkovanej

alergickej odpovedi I. typu

- Na svojej membráne exprimujú vysokoafinitný receptor IgE

( FcεRI )

- Nízkoafinitné receptory IgE ( FcεRII ) sa nenašli

- Multifunkčné solubilné mediátory a vazoaktívne látky

v cytoplazmatických granulách

Imunofenotyp bazofilov:

- CD123, CD203c, CCR3, CD11a, CD11b,

CD13, CD35, CD37, CD40, CD121b, CD9,

CD29, CD33, CD44, CD45, CD54, CD97...

- po stimulácii špecifickým alergénom nastáva

de novo expresia CD63

Bazofilaktivačný test ( BAT, BASO Ex, FlowCAST ):

• indukovaná degranulácia bazofilov sa špecificky kvantifikuje metódou prietokovej cytometrie

• bazofily sú značené: anti - CD123FITC anti - CD203c anti - CCR3

a anti - CD63PE

• na základe emitovanej fluorescencie sa kvantitatívnevyjadrí počet aktivovaných bazofilov CD63+ z celkového počtu bazofilov

BAT(Test aktivácie bazofilov)

funkčný test – sleduje sa aktivácia bazofilov in vitro po expozícii alergénom

plná nezrazená krv pacienta sa inkubuje s vyšetrovaným alergénom(v rôznych riedeniach)

do testu je zaradená neg. a poz. kontrola

alergén sa viaže cez špecif. IgE na FcRI receptor, dôjde k premosteniu receptorov a aktivácii bazofilov, degranulácii, uvoľneniu histamínu a iných mediátorov

na povrchu bazofilov se exprimujú aktivačné znaky CD63 a CD203c

meranie pomocou prietokovej cytometrie

Negatívna kontrola

- inkubácia bez alergénu

(pufer)

- hodnota by nemala by prekročiť 5% pre

všetky typy alergénov

Pozitívna kontrola

Stimulácia bazofilov dvomi nešpecifickými stimulmi:

1. protilátka anti – IgE

2. peptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)

Vyšetrenie je možné hodnotiť len vtedy, ak

hodnota aspoň jednej kontroly je vyššia ako 10%.

Prehľad vyšetrovaných

liekových alergénov:

• ATB: beta-laktámové, makrolidy, tetracyklíny,

chinolóny, trimetoprim, sulfamethoxazol

• Analgetiká, antipyretiká

• Anestetiká

• Myorelaxanciá

• Iódové kontrastné látky

Alergény:

• Nesmú byť cytotoxické (bez aditív a konzervačných látok -fenol, glycerol, azid sodný, mertiolát)

• Nesmú vykazovať nešpecifickú stimuláciu (lektíny, endotoxíny)

• Používame štandardizované alergény

Správne načasovanie testu

• 6 týždňov – 12 mesiacov po akútnej príhode

• Falošne negatívny výsledok:- znížená refrakternosť buniek po nedávnejalergickej reakcii

- znížený počet IgE(Ebo aj. 2008)

Spôsob odberu:

- plná krv odobratá do heparínu

- na jeden alergén 50 ul krvi (1ml – 18 skúmaviek)

- krv je potrebné analyzovať do 24 hod.

Príprava pacienta

• Vysadiť lieky:

- antihistaminiká

- kortikosteroidy najmenej na 24 hodín pred odberom

Výsledok

• 60 minút

Stimulačný index ( SI ):

- lieky vykazujú nižšie % aktivácie bazofilov ako ostatné alergény

- senzitivita je nižšia a hodnotenie náročnejšie

- stanovenie stimulačného indexu (SI):

pomer % zastúpenia bazofilov vykazujúcich expresiu CD63 postimulácii liekom k % zastúpeniu bazofilov rovnakého druhu pred stimuláciou:

% CD63+ bazofilov po stimulácii liekom% nestimulovaných bazofilov

• Výsledok je pozitívny pri hodnote SI = 2,0 a viac

Non - responderi

• Pacienti, ktorí nereagujú na pozitívnu stimuláciu anti-IgE (6,1%), fMLP (4,9%)

• Nie sú vhodní na stanovenie alergie metódou BAT

• Tyrozín kináza syk a lyn (IgE sprostredkovaná degranuláciabazofilov) - asociované s neodpovedavosťou. U pacientov zistená neprítomnosť tyrozín kinázy syk a znížené množstvo tyrozínkinázy lyn.

(Ebo ai. 2006)

Uplatnenie BAT

• Pri stanovení problematických alergénov:

- jed blanokrídleho hmyzu

- potravinové alergény

- latex

- lieky

(Ebo aj. 2009, Wolanczyk Medrala aj. 2009, De Weck aj. 2008, Eberlein- Konig aj. 2006)

- meranie zmien odpovede na alergén v priebehu špecifickej

imunoterapie (Mikkelsen aj. 2010)

Flow CAST (BAT) a lieky:

• Senzitivita 80-90%

• Špecificita 93% -100%

(EBO,D.G., C.H. BRIDTS a et al., 2008 )

Indikácia vyšetrenia BAT:

• Ak nie je možné realizovať:

- kožný test

- vyšetrenie špec. IgE

• Výsledky sa navzájom nezhodujú

• Výsledky neodpovedajú klinickej anamnéze pacienta

• Môže nahradiť rizikové vyšetrenia in vivo, hlavne testy expozičné

BAT

• BAT je vhodnou metódou pre zistenie

špecifickej precitlivelosti I. typu

• BAT má vyššiu senzitivitu ako vyšetrenie sIgE

a veľmi vysokú špecificitu

• BAT má vyššiu senzitivitu i špecificitu ako CAST

Optimálny čas diagnostiky 1 - 6 mesiacov po klinickej reakcii.

Rutinné použitie BAT:

- zvyšuje senzitivitu diagnostického procesu

- znižuje potrebu prevádzania liekovýchprovokačných testov

Oneskorené LHR

- sprostredkované T- lymfocytmi

- tzv. hapténová hypotéza: liek ako haptén(ireverzibilná väzba na proteíny – antigén)

- alternatívna hypotéza p-i: koncept farmakologickejinterakcie priamo s imun. receptormi ( TCR alebo HLAmolekula) a aktivácia T-lymfocytov alterácioupeptidového žliabku MHC

Oneskorená reakcia:

• In vivo: In vitro:

- intradermálny test - test transformácie alebo

s oneskoreným odčítaním aktivácie lymfocytov (LTT)

- epikutánne testy

- liekové provokačné

testy

LTT-lymfocytotransformačný

test

• Sledovanie syntézy DNA na označenie mitoticky

aktívnych buniek: 3H thymidin

• Nevýhody:1. použitie rádioaktívnych izotopov

2. riziková práca s toxickými odpadmi

Activation in vitro – LTTVaried concentrations of pure drug, incubate at 37ºC with 5% CO2

6 days

Add 3H thymidine

Harvest cells and count radioactivity, results: cpm or stimulation index (SI = drug stimulated cpm/unstimulated cpm)

PBMC

Cells

II- Quantify Response

T cell

PBMC

LTT(lymfocytotransformačný test)

- prítomnosť určitých liekovo-špecifických klonov

T- lymfocytov

- Senzitivita 56-78% , špecificita 85-93%

Načasovanie LTT

stanovuje odpoveď pamäťových T- lymfocytov

môže bytˇpozitívny po dobu mnohých rokov (10-20 rokov), ale aj strata reaktivity po 3-4 rokoch

nie je možné predpovedať, či bude u pacienta reaktivita na liek pretrvávať alebo nie

test vykonávať po 4 - 8 týždňoch od reakcie

vzorku heparinizovanej krvi doručiť čo najskôr (pracujeme so živými bunkami)

Metóda LAT (Lymphocyte Activation Test)

Lymfocytoaktivačný test (LAT) –vyvinutý ako alternatíva

LTT.

Stanovujeme percentuálne zastúpenie aktivovaných

T- lymfocytov meraním antigénu CD69 na prietokovom

cytometri po ich 48 hodinovej inkubácii s liekom pri 37˚C

s 5% CO2 .

Stimulačný index 2,0 ako cut-off umožňuje odlíšiť

medzi areaktívnymi a reaktívnymi T- lymfocytmi.

Lymphocyte activation test

(LAT):

- test oneskorenej alergickej reakcie

- v lymfocytotransformačnom teste pri kultivácii

lymfocytov s alergénom reagujú tieto blastickou

transformáciou

- obdobou testu je LAT test – stanovenie aktivačnej

molekuly CD69 metódou prietokovej cytometrie

I- Activation in vitro

Varied concentrations of pure drug, incubate at 37ºC with 5% CO2

PBMC

II- Quantify Response

PBMC PBMC

Evaluate T cells by flow cytometry

CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells

T cell

48 hours

Activation in vitro - LAT

Laboratórne testy

sú výhodné - bezpečné pre pacienta

pri indikácii a interpretácii laboratórnych

testov je potrebné zohľadniť typ reakcie

a časový odstup medzi reakciou

a vyšetrením

Výhody vs. nevýhody lab.

testov I.

Laboratórne metódy majú veľkú výhodu bezpečnosti

pre pacienta.

Nedostatkom - obmedzená dostupnosť metód, obmedzený

výber liekov pre niektoré metódy.

Dôvodov nízkej citlivosti in vitro testov je viac. Nie je vždy

možné podľa klinických prejavov spoľahlivo určiť

imunopatologický mechanizmus.

II.

Problémom je aj dostupnosť príslušných epitopov lieku

potrebných pre väzbu protilátky s receptorom v teste

in vitro. Niektoré reakcie vyvoláva metabolit lieku, nie

originálna molekula.

Veľmi dôležitou podmienkou je aj správne načasovanie

testu.

Pri funkčných testoch môže interpretáciu znemožňovať

prítomný stav neodpovedavosti (non-responders).

Vyskytuje až u 10 % pacientov.

Záver

- Patogenéza liekových hypersenzitivít je veľmi

zložitá – zložitá je aj ich diagnostika.

- Univerzálny diagnostický test zatiaľ neexistuje.

- Kombinácia niekoľkých vyšetrovacích metód zvyšuje senzitivitu a špecificitu diagnostického procesu.

- Potreba kombinácie klinického vyšetrenia,

in vivo testov s in vitro testami.

Diagnostika

Nesprávna diagnóza založená iba na anamnéze LHR môženepriaznivo ovplyvniť individuálny výber liečby a môžepacienta poškodiť viac ako komplexný alergologickývyšetrovací postup.

Klinické nástroje na stanovenie konečnej diagnózy:

- dôkladná anamnéza, štandardizované kožné testy, spoľahlivé

in vitro testy a provokačné testy

Screening osôb bez predchádzajúcej liekovej alergickej reakciesa neodporúča.