MONOFLUOTM SCREEN R.S.V.80 TESTS 52216DÉTECTION DU VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIALPAR IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE

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TABLE DES MATIÈRES

1- INTERÊT CLINIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15

2- PRINCIPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

3- COMPOSITION DE LA TROUSSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

4- PRECAUTIONS D’UTILISATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

5- ECHANTILLONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

5.1. TECHNIQUE DE PRELÈVEMENT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

5.2. TRAITEMENT DES PRELÈVEMENTS AVANT EXAMENEN IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

5.3. ISOLEMENT DU VIRUS SUR CULTURE CELLULAIRE . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

6- MODE OPERATOIRE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

6.1. MATERIEL NECESSAIRE NON FOURNI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

6.2. PROCEDURE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21

7- INTERPRETATION DES RESULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

7.1. CONTRÔLE DE QUALITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

7.2. LECTURE ET INTERPRETATION DES RESULTATS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

8- LIMITES DU TEST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

9- PERFORMANCES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

9.1. SENSIBILITE - SPECIFICITE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

9.2. REACTIVITE CROISEE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

10- CONTRÔLE QUALITE DU FABRICANT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

11- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

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1- INTÉRÊT CLINIQUELe virus Respiratoire Syncytial ainsi que Influenza A et B, para-Influenza1, 2 et 3 et Adénovirus sont responsables d'infections respiratoires graveschez les nourrissons et les personnes âgées ou affaiblies. Le diagnostic del'origine bactérienne ou virale de ces infections est essentiel pour la miseen œuvre de mesures thérapeutiques adaptées. Le diagnostic de ces maladies virales repose sur l'isolement du virus. Eneffet, le diagnostic sérologique ne donne pas de résultats satisfaisants. Letaux des anticorps n'augmente de façon significative que 10 à 15 joursaprès le début des signes cliniques et n'est habituellement pas décelablechez le nourrisson. La méthode de référence reste l'isolement du virus surculture cellulaire (cellules Hela, KB, Hep2 ou lignées cellulairesfibroblastiques d'origine embryonnaire). Son identification s’effectue àpartir d'un prélèvement nasopharyngé ou d'un liquide d'aspirationbronchique, l'échantillon étant recueilli pendant la phase maximaled'excrétion du virus, 1 à 6 jours après le début de la maladie. L'association d'anticorps monoclonaux spécifiques de ces virus à tropismerespiratoire et de la technique d'immunofluorescence a permis de réaliser lediagnostic rapide de ces maladies sans passer par l'étape délicate de laculture cellulaire, par examen direct du prélèvement. Pour chacun de cesvirus, des anticorps monoclonaux anti-protéines virales ont été sélectionnésd'une part, en raison de leur spécificité et d'autre part, pour la qualité del'image observée lors d'une application en immunofluorescence. L'aspecthabituel est une fluorescence granulaire ou particulaire bien visible dans lecytoplasme des cellules infectées. Ces anticorps monoclonaux peuvent êtreégalement utilisés pour identifier chacun de ces virus après leur isolement surculture cellulaire. La prévalence de ces diverses infections conduit Bio-Rad à proposer d'établirle diagnostic rapide des maladies d'étiologie virale selon le schéma suivant :• Le virus Respiratoire Syncytial est responsable de plus de 60 % de ces

infections. MONOFLUOTM SCREEN R.S.V. (code 52216) permetd'identifier ce virus par une technique directe d'immunofluorescence enune étape à partir du prélèvement.

• Les virus Influenza A et B, para-Influenza 1, 2 et 3 et Adenovirus sontresponsables, diversement selon les régions et les périodes de l'année,d'environ 30 % de ces infections. MONOFLUOTM SCREEN Influenza,para Influenza, Adénovirus (code 52217) permet d'affirmer ou

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d'infirmer la présence d'un de ces virus par une technique directed'immunofluorescence en une étape à partir du prélèvement. En cas deréponse positive, l'identification du virus incriminé peut être établiegrâce à :• MonoFluoTM Kit INFLUENZA (code 52209).• MonoFluoTM Kit PARA INFLUENZA 1 + 2 (code 52211).• MonoFluoTM Kit PARA INFLUENZA 3 (code 52212).• MonoFluoTM Kit ADENOVIRUS (code 52210).

2- PRINCIPELe coffret MONOFLUOTM SCREEN R.S.V. est destiné à la détection du virusRespiratoire Syncytial (V.R.S.) dans les cellules infectées par la techniqued'immunofluorescence directe utilisant les anticorps monoclonaux spécifiquesdu V.R.S. marqués à la fluorescéine. Ces anticorps marqués se fixent surl'antigène exprimé dans le cytoplasme des cellules infectées obtenues à partirde prélèvements de sécrétions et cellules des voies respiratoires ou aprèsisolement sur cultures cellulaires. Les cellules ayant fixé les anticorpsmonoclonaux anti-V.R.S. apparaissent fluorescentes à l'observation aumicroscope à fluorescence.

3- COMPOSITION DE LA TROUSSESe reporter aux indications données sur l’étiquette-boîte concernant lesconditions de stockage et la date d’expiration de la trousse. Les réactifsconservés à +2-8°C et en l'absence de contamination sont stables jusqu'àla date de péremption (y compris après ouverture).

Etiquetage Nature des réactifs PrésentationR1 Conjugate Conjugué (prêt à l’emploi) : 1 x 2,5 ml

Anticorps-monoclonaux (de souris) anti-V.R.S. (18/B2) (flacon marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine, contenant bleu Evans compte-gouttes)Conservateur : < 0,1% d’azoture de sodium

R2 Mounting Milieu de montage (prêt à l’emploi) : 1 x 3 mlmedium Glycérine tamponnée pour immunofluorescence (flacon

Conservateur : < 0,1% d’azoture de sodium compte-gouttes)

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4- PRECAUTIONS D’UTILISATIONLa qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques delaboratoire suivantes :• Ne pas utiliser les réactifs après la date d’expiration.• Ne pas mélanger, ni associer au cours d’une même série des réactifs

provenant de trousses portant des numéros de lots différents.• Avant utilisation, laisser tous les réactifs atteindre la température

ambiante (+18-30°C). • Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de

préférence du matériel à usage unique.• Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque échantillon.• Vérifier la qualité de l'eau déminéralisée. Si des organismes

fluorescents sont observés sur un contrôle négatif, il est nécessaire defaire une filtration stérilisante de l'eau utilisée.

• Ne pas laisser sécher le conjugué sur la lame au cours de la coloration.

CONSIGNES D’HYGIÈNE ET SECURITE• Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs.• Ne pas pipeter à la bouche.• Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons

comme des produits contaminés. • Eviter les éclaboussures d’échantillons ou de solution les contenant.• Respecter à tout moment les techniques et précautions en vigueur en

matière de protection contre les dangers microbiologiques, tant pour lamanipulation que pour l'élimination du matériel et des produitsbiologiques utilisés pour la réaction d'agglutination.

• L’azoture de sodium peut réagir avec le plomb ou le cuivre présentsdans les tuyaux d’évacuation et produire ainsi des azotures métalliquesexplosifs. Lors de leur élimination, rincer abondamment à grande eaupour éviter la formation de dépôts d’azoture.

5- ECHANTILLONSLe virus est localisé dans les sécrétions et les cellules des voies respiratoiressupérieures. Pour effectuer le diagnostic direct par immunofluorescence,prélèver les cellules desquamées des sécrétions nasales ou trachéo-bronchiques.

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Les échantillons doivent être traités immédiatement.Dans le cas d'isolement du virus sur cultures cellulaires, la techniqued'immunofluorescence peut également s'appliquer aux cellules infectées invitro dès que l'effet cytopathogène est reconnaissable.

5.1 - TECHNIQUE DE PRELEVÈMENTLe V.R.S. est recherché dans les prélèvements des sécrétions nasales outrachéo-bronchiques effectués soit par écouvillonnage à l'aide d'un cotontige, soit par aspiration ou par lavage nasal en tampon PBS.Pour l'examen direct du prélèvement en immunofluorescence, lessécrétions peuvent être transmises brutes telles quelles au laboratoire. Encas d'isolement viral, les sécrétions sont recueillies dans un milieu detransport adéquat pour la conservation du virus : solution saline depréférence - ou milieu MEM tamponné (le V.R.S. perd rapidement de sonpouvoir infectieux en milieu acide) et enrichis de facteurs protégeant lesvirus: albumine bovine, gélatine, sérum de poulet, saccharose etd'antibiotiques. La formule suivante est par exemple utilisable :• MEM, albumine bovine 5 mg/ml, HEPES 4,76 mg/ml, bicarbonate de

sodium 0,22 mg/ml, pénicilline 1500 U/ml, streptomycine 1000 µg/ml.Pour l'isolement, transporter l'échantillon de préférence congelé ou aufroid. Un élément important est d'obtenir une quantité suffisante desécrétions. Il est habituellement plus efficace et plus commode de préleverles sécrétions respiratoires, souvent très muqueuses, par aspiration, àl'aide d'une petite sonde reliée à un flacon de prélèvement et qui estintroduite dans le nez de l'enfant. Ce matériel est commercialisé sous lenom “d'aspirateur de mucosités”. Lorsque l'on ne dispose pas d'unesource d'aspiration au lit de l'enfant, on peut utiliser une grosse seringue(50 ml), une pompe à vide manuelle, ou mieux un système électriqued'aspiration.Parfois, au cours des bronchiolites, le nez de l'enfant est sec, et l'on neparvient pas à recueillir suffisamment de sécrétions. La technique dulavage nasal à la poire peut alors être utilisée : quelques millilitres d'unesolution de lavage sont introduits à la poire dans une narine de l'enfant,puis réaspirés aussitôt.Dans la majorité des cas, l'aspiration nasale rapporte au moins 0,2 à0,5 ml de sécrétions. Elles sont transmises ensuite au laboratoire, brutesou dans le milieu de transport, pour l'isolement du virus sur culture cellulaire.

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5.2 - TRAITEMENT DES PRELEVÈMENTS AVANT EXAMEN ENIMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE

Au laboratoire, plusieurs lavages successifs du produit d'aspiration sontnécessaires pour obtenir une suspension de cellules nasales exempte de mucus.• Préparer le volume de tampon phosphate salin (PBS) nécessaire pour

traitements et lavages en diluant la solution concentrée 10 fois avec del'eau distillée stérile.

• Prélever 0,5 à 1 ml de sécrétions et ajouter 5 ml de PBS. Agiter doucement.• Centrifuger à 500 g pendant 10 minutes à +2-8°C. Décanter le surnageant.• Reprendre le culot par 5 ml de PBS et centrifuger. Renouveler ainsi 2 à

3 fois le lavage pour éliminer totalement le mucus.• Après la dernière centrifugation, ajouter 1 ml de PBS au culot

cellulaire. Homogénéiser la suspension par pipetage.• Déposer les cellules sur les lames. • Effectuer la fixation des cellules et la coloration (voir technique de

coloration).

5.3 - ISOLEMENT DU VIRUS SUR CULTURE CELLULAIRELe virus étant thermolabile, il faut réduire au maximum le temps entre la récolede l'échantillon et l'inoculation sur culture cellulaire. Au laboratoire,congeler et décongeler les prélèvements pour l'éclatement des cellules etla libération des particules virales. Centrifuger à +2-8°C à 500 gpendant 10 minutes pour éliminer les débris cellulaires (2000 trs/mn).Ensemencer cet échantillon sur la culture cellulaire prévue à cet effet.Les cellules utilisées sont des cellules Hep2, Hela, KB ainsi que les lignéesdiploïdes de fibroblastes humains embryonnaires en milieu MEM contenant5 à 8 % de sérum de veau foetal.Selon le flacon utilisé pour la culture cellulaire, les volumes d'inoculum etde milieu de culture seront différents.• Dans le cas de tubes de Leighton, faire l'inoculation avec 0,3 ml de

prélèvement. Laisser en contact pendant 2h30 puis compléter à 1,2 mlavec le milieu de culture.

• Si l'on utilise un flacon de 25 cm3, inoculer avec 1 ml de prélèvement.Incuber à +37°C pendant 2h30 puis compléter à 12 ml avec le milieu deculture.Incuber les cellules à +37°C jusqu'à observation de l'effet cytopathogènedu virus (environ 4 à 6 jours).

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OBSERVATION DE L'EFFET CYTOPATHOGENEObserver au microscope optique inversé les cellules inoculées et suivrel'apparition de l'effet cytopathogène.Si, au bout de 6 jours, l'effet cytopathogène n'est pas observé, aprèsinoculation d'un prélèvement, faire cependant la coloration. La multiplicationvirale peut être suffisante pour être décelée à ce stade par immunofluo -rescence.Un deuxième passage sur cellules pourrait être éventuellement envisagé.

6- MODE OPÉRATOIRE

6.1 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI• Eau distillée ou complètement déminéralisée.• Eau de Javel.• Papier absorbant.• Gants à usage unique.• Tampon phosphate (PBS) pour IF, pH 7,2 (concentré 10X) - 50 ml -

(code 74901).• Acétone.• Pipettes Pasteur stériles.• Pipettes automatiques ou semi-automatiques réglables ou fixes

pouvant distribuer 10 à 200 µl et 1 ml.• Eprouvettes graduées de 10 ou 25 ml.• Tubes à usage unique.• Tubes à centrifuger.• Lames pour immunofluorescence - code 50569 (2 puits) ou 50566

(6 puits).• Lamelles.• Microscope équipé pour la fluorescence.• Conteneur de déchets contaminés.

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6.2 - PROCEDURE

6.2.1 - Dépôt et fixation des cellules• Examen direct sur le prélèvement

- Déposer 20 µl de l'échantillon traité (culot de centrifugation des cellules)dans un puits de la lame.

- Sécher les lames à l'air à l'aide d'un séchoir ou à températureambiante (18-30°C).

- Fixer dans un bain d'acétone à -20°C pendant 5 minutes.- Sécher les lames à l'air.

• Examen après culture cellulaire sur lamelle- Laver la lamelle 2 fois 1 minute par trempage dans un bain de PBS.- Sécher à l'air.- Fixer dans un bain d'acétone à -20°C pendant 5 minutes.

• Examen après culture cellulaire sur flacon- Eliminer le milieu. Récupérer les cellules par raclage et les déposer

dans 1 ml de PBS.- Remettre les cellules récupérées en suspension en aspirant et refoulant

plusieurs fois avec une pipette effilée.- Procéder ensuite pour le dépôt des cellules et la fixation comme pour

l'examen direct sur le prélèvement.

6.2.2 - Dépôt des anticorps

1. Préparer le volume de tampon phosphate salin (PBS) nécessaire pour leslavages en diluant la solution concentrée 10 fois avec de l'eau distilléestérile.

2. Déposer une goutte de conjugué (R1) sur les puits en prenant soin derecouvrir toute la surface du cercle.

3. Incuber la lame 30 minutes à +37°C en chambre humide.4. Après incubation, rincer doucement la lame au PBS au moyen d'une

pissette.5. Procéder à 2 lavages de 2 à 5 minutes en PBS avec agitation douce.6. Tremper la lame quelques secondes dans un bain d'eau distillée.7. Sécher la lame à l'air.8. Monter sous lamelle avec le milieu de montage (R2). Vérifier l'absence

de bulles d'air. Luter la lame avec du vernis.

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7- INTERPRETATION DES RESULTATS

7.1 - CONTRÔLE DE QUALITEColorer parallèlement une lame témoin avec des cellules positives etnégatives.

7.2 - LECTURE ET INTERPRETATION DES RESULTATSExaminer les lames au microscope à fluorescence au grossissement X100et X400.• Réaction positive : Fluorescence granulaire intra-cytoplasmique parmi

d'autres cellules rougeâtres ; présence d'au moins une cellule fluorescentecaractéristique de V.R.S.

• Réaction négative : Aucune cellule fluorescente après observation de latotalité du puits.

NOTE : Lire les lames immédiatement. Sinon, les conserver à +2-8°C àl'obscurité au maximum 24 heures après le test.

8- LIMITES DU TESTSeul un ensemble de données cliniques et biologiques permet le diagnosticd’une infection récente. Le résultat d’un seul test ne constitue pas une preuvesuffisante pour le diagnostic d’une infection récente.

9- PERFORMANCES

9.1 - SENSIBILITE - SPECIFICITE283 échantillons (nasals, pharyngés, broncho-alvéolaires) prélevés depatients consultant en milieu hospitalier, en raison de symptômesévocateurs d'une infection respiratoire aiguë ont été analysés (examensdirects) à l'aide de deux réactifs RSV de référence, approuvés (test ELISAAg capture et test immunofluorescence directe Bartel), et à l'aide duréactif MONOFLUOTM SCREEN R.S.V.

42 échantillons trouvés positifs selon les deux tests de référence ontégalement été vérifiés positifs selon le test MONOFLUOTM SCREEN R.S.V.La sensibilité relative ou concordance de l'essai s'établit à 100%.

241 échantillons trouvés négatifs selon les deux tests de référence ontégalement été vérifiés négatifs selon le test MONOFLUOTM SCREEN R.S.V.et la spécificité relative de l'essai s'établit à 100% selon les résultats decette étude limitée à 241 échantillons.

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9.2 - REACTIVITE CROISEEL'absence de réactivité croisée a été vérifiée par l'examen direct de cellulesétablies en lignées cellulaires (Hep 2, Véro, HEL, MRC 5) infectées pardes virus respiratoires (Para-influenza 1,2,3, Grippe A et B, CMV,Herpès 1 et Adénovirus). L'absence de réactivité a aussi été vérifiée, vis àvis de différentes souches de bactéries (Chlamydiae, Staphylococcusaureus et Escherichia coli).

10-CONTRÔLE QUALITE DU FABRICANTTous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sontplacés sous un système d'assurance qualité de la réception des matièrespremières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot deproduit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé ques'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative àla production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

11-REFERENCES

1. FREYMUTH F., QUIBRIAC M., PETITJEAN J., DAON F., BESNARD A.,PIERRE C.Mise en évidence des antigènes viraux parimmunofluorescence : méthode rapide de détection et d'identification desvirus respiratoires. Revue Française des Laboratoires, 1985, 137, 21-24.

2. GADNER P.S., MC QUILLIN J. Respiratory Syncytial Virus = Rapid virusdiagnosis application of immunofluorescence. London, Butterworth,1980, 110-123.

3. GOUYON J.B., POTHIER P., GUIGNIER F., SANDRE D., PUJOL P.H. etALISON N. Problèmes posés par une épidémie à virus respiratoiresyncytial dans un service de néonatalogie à propos de 23 cas. Méd.Hyg., 1985.

4. LUCAS G., POTHIER P., DELAGNEAU J.F. Diagnostic rapide du VirusRespiratoire Syncytial (VRS) par immunofluorescence indirecte à l'aided'anticorps monoclonaux. Biologie Prospective - 6ème colloque, 1985,Pont à Mousson, France.

5. POTHIER P., NICOLAS J.C., PRUDHOMME DE SAINT MAUR G.,GHIM S., KAZMIERCZAK A. et BRICOUT F. Monoclonal antibodiesagainst Respiratory Syncytial Virus and their use for rapid detection ofvirus in nasopharyngeal secretions. Journal of Clinical Microbiology,1985, Vol. 21, n°2, 286-287.

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