Modulation of ionising radiation-induced apoptosis by bantam microRNA in

Drosophila

B.Jaklevic et al.[April 2008]

Developmental biology

KOPLIKU Lela EL ASRI Hanane

I-Introduction

Développement de la drosophileDéveloppement de la drosophile

I-Introduction

MV Iorio and CM Croce (2009) J Clin Oncol 27

Biogenèse et maturation des microRNA (miRs)Biogenèse et maturation des microRNA (miRs)

I-Introduction

Bantam microRNA (21nt) inhibe l’expression de Hid

Code une protéine de 410 aa

Partie N-ter de 14 aa commune = domaine RHG

Profil d’expression constitutif

Surexpression induit la mort( rôle pro-apoptotique)

bantam a un effet anti-apototique3’UTR

5’

ARNm hid

3’ 5’5 séquences cibles de bantam

HID (head involution defective)HID (head involution defective)

miRNA bantam

I-Introduction

Induction de cassures double brins de l’ADN Activation de p53 Activation de l’apoptose

Apoptose : réponse clé des radiations ionisantesApoptose : réponse clé des radiations ionisantes

www.sante.univ-nantes.fr/med/biolcell/apoptos.

Quel est le rôle de bantam en réponse aux radiations ionisantes?

Quel est le rôle de bantam en réponse aux radiations ionisantes?

II-Résultats

Fig. 1. Les disques imaginaux d’ailes ont été disséqués à partir des larves 3.5-4h après irradiation aux rayons-X avec 0R (-IR) ou 4000R (+IR), et colorées avec l’Acridine Orange.

La perte de fonction de ban induit l’augmentation de l’apoptose spontanée (-IR) et induite (+IR)

EP:allèle hypomorphe

:Délétion du locus ban

a- Effets des rayons-X sur les mutants bana- Effets des rayons-X sur les mutants ban

Rayon X

II-Résultats

EGFP bantam sensor transgène constitué du promoteur de tubuline, de la séquence

codante de l’EGFP fusionnée à deux copies de la séquence cible de ban en 3’UTR (appelé ‘bantam sensor’)

bantam sensor(3’UTR)

Une diminution du signal EGFP reflète une augmentation de l’activité du répresseur ban.

Promoteur tubuline EGFP

b- Effets des rayons-X sur l’activation de banb- Effets des rayons-X sur l’activation de ban

II-Résultats

Fig. 2

3ème stade larvaire

La fluorescence de l’EGFP a été analysés dans les disques imaginaux d’ailes après 5,18 ou 24 h d’irradiation avec 0 ou 4000 R

Les radiations ionisantes induisent l’activation de ban

EGFP ban sensor diminue au cours du temps

Rayon X

Augmentation de l’activité de ban au cours du temps

=>

b- Effets des rayons-X sur l’activation de banb- Effets des rayons-X sur l’activation de ban

II-Résultats

Fig. 3

•Irradiation des larves après 96h+/-4h du dépot des œufs.

• Toutes les larves irradiés ont formés des pupes.

% éclosion= pourcentage de pupes qui éclosent donnant des adultes viables.

ban est requis pour assurer la survie de l’organisme après irradiation

c- Importance de ban au niveau de l’organismec- Importance de ban au niveau de l’organisme

II-Résultats

Fig. 4. Les larves sont homozygotes pour p535A-1-4 et pour l’insertion 20.X du ‘ban sensor’.

•(A, B) La fluorescence d’EGF a été analysée 24 h après irradiation dans les disques imaginaux d’ailes .

•(D) Le niveau d’EGFP a été analysé par Western blot à partir des extraits larvaires .

p53 est requis pour l’activation de ban

En contexte mutant p53 la quantité d’expression de « ban sensor » ne diminue pas sous l’effet des rayons X

EGFP  ban sensor  

ban n’est pas activé chez les mutants p53

=>

d- Effets de p53 sur l’activation de band- Effets de p53 sur l’activation de ban

Hypothèse 1:

Après irradiation,p53 induirait l’activation de ban via l’augmentation de son niveau d’expression

Rayon X

p53miRNA bantam

Cassure double brins

?

+

+

EGFP -ban sensor

Récapitulatif 1Récapitulatif 1Effet des rayons X dans les disques

imaginaux d’ailes de larves

Effet des rayons X dans les disques

imaginaux d’ailes de larves

II-Résultats

pas de changement significatif du niveau d’expression de ban aprèsirradiation.

Fig. 5•Extraction de l’ARN total de larves WT (A) et homozygotes mutantes p53 (B)

•Analyse du niveau d’expression du miRNA ban mature.

• exposition des larves aux Rayons X

0(-) ou 4000 R(+)

Northern blot

Quantification Northern blot

=> P53 active ban sans augmenter son niveau d’expression

d- Effets de p53 sur l’activation de band- Effets de p53 sur l’activation de ban

Hypothèse 2:

L’apoptose serait nécessaire à l’activation de bantam après irradiation

p53miRNA bantam

Rayon X

apoptoseapoptose

L’’activation de p53 est nécessaire à l’activation de ban

p53 active l’apoptose

+

++

Récapitulatif 2Récapitulatif 2

Cassure double brins

Effet des rayons X dans les disques

imaginaux d’ailes de larves

Effet des rayons X dans les disques

imaginaux d’ailes de larves

II-Résultats

Fig. 6. Les disques imaginaux d’ailes des larves controles (A, B) et irradiés (C, D) ont été analysés pour la fluorescence d’EGFP (A, B) ou pour la coloration en Acridine Orange (B, D) 24h après irradiation aux rayons-X à 0 ou 4000 R.

Hh-GAL4>UAS-p35:expression de p35 dans la partie postérieur du disque imaginal d’aile

La mort cellulaire est requise pour une activation optimale de ban après irradiation.

Contrôle:Partie antérieur de l’aile

corrélation entre l’’absence d’apoptose et l’ inactivation de bantam

p35

e- Effets de l’inhibition de l’apoptose sur l’activation de ban e- Effets de l’inhibition de l’apoptose sur l’activation de ban

Récapitulatif 3Récapitulatif 3Effet des rayons X dans les disques imaginaux

d’ailes de larves

Effet des rayons X dans les disques imaginaux

d’ailes de larves

p53

apoptoseapoptose

+

+ miRNA bantam

II-Résultats

Fig. 7. Les disques imaginaux d’ailes contrôle (A, C) et irradiés (B, D) ont été analysés par la fluorescence EGFP 24 h après irradiation aux rayons-X avec 4000R.

Les larves sont homozygotes pour le hid-3’UTR sensor (A, B; ‘hid’) ou le hid 3’UTR sensor delété pour les deux sites cibles de ban (C, D; ‘hid Δ 1,4).

L’expression de hid-3’UTR sensor est réduit au niveau des disques imaginaux irradiés.

5’ 3’

hid Δ 1,4

EGFPARNm

hid 3’UTR sensor

L’expression de hid Δ 1,4 n’ est pas réduit au niveau des disques imaginaux irradiés.

hid est une cible importante de ban en réponse aux irradiations

f- Effet de l’irradiation sur la régulation de l’expression de hid par banf- Effet de l’irradiation sur la régulation de l’expression de hid par ban

II-Résultats

Fig. 8. Les larves ont été irradiés à 96+/- 4 h après dépôt des œufs aux rayons-X. Toutes les larves irradiés ont formés des pupes. Le pourcentage des pupes qui éclosent et donnent des adultes ,a été quantifié 10 jours après irradiation.

La suppression de hid sauve les mutants ban de la sensibilité aux irradiations

g- Effet de la suppression de hid dans les mutants bang- Effet de la suppression de hid dans les mutants ban

Récapitulatif 4Récapitulatif 4Effet des rayons X dans les disques imaginaux

d’ailes de larves

Effet des rayons X dans les disques imaginaux

d’ailes de larves

p53

apoptoseapoptose

+

+

miRNA bantam

3’UTR

ARNm hid 5’

Survie des larves

3’

Inhibition de l’expression de hid

miRNA bantam

III-Conclusion

Les rayons X induisent une augmentation de l’activité de ban dans les disques imaginaux et permettent la survie des cellules et des larves

irradiées via l’inhibition de hid imliqué dans la voie apoptotique.

IV-DiscussionComment ban est activé dans les cellules?Hypothèse: les cellules apoptotiques activeraient ban de manière non-autonomecellulaire!

Par quel mécanisme moléculaire est régulé l’activation de ban?L’activité de ban augmente après irradiation, alors que son niveau reste inchangé!

Voie Hippo: voie suppresseur de tumeur conditions normales : ---| ban

Après irradiations

Modèle hypothétique

Est-ce qu’il y a d’autres cibles de ban?

Comment la cellule choisi entre apoptose et survie cellulaire.

Hpo Yorkie

p53 Hpo