Modifications chimiques et semisynthèses des protéines 2 ......Développement de la ligation des Protéines Exprimées 6 peptides de synthese 12 à 30 résidus Protection Déprotection

Modifications chimiques et semisynthèses des protéines

● 2 Cours– Mercredi 15 septembre (10H12H)

● IIntroduction● II Mutagenèse à suppression de nonsens● III « Click chemistry »● IV Ligation des Protéines Exprimées

– Historique

– Vendredi 17 septembre (10H12H)● IV Ligation Native des protéines 2

– Intéines● V Applications

IIntroduction

● Génome humain : 3040000 gènes– 70 à 90 % contiennent 1 ou plusieurs exons

– Epissage alternatif des pre mARNs

● Protéome : – Modifications posttraductionnelles

● ex: Phosphorylation : 1/3 des protéines des mammifères

Nbre astronomique de combinaisons de protéines


IIntroduction

● Protéome : Inventaire des modifications posttraductionnelles ?– Contexte des relations structurefonctions

● Tissu● Type cellulaire● Temps

– minute : transduction du signal– années : développement

=> 10aines100aines de milliers de type protéiques● Dans notre corps● Au cours d'une vie

Comprendre ces modifications : échelle Protéomique ?

● Très long terme

● But (influence sur les fonctions) très stimulant – Essor de nouvelles technologies

– En provenance des domaines d'investigation les plus dynamique

● Protéomique● Bioinformatique● Génomique structurale● Et Chimie Biologique

=> Champs d'action largement multidisciplinaires

IIntroduction

La chimie et l'étude des processus biologiques

● Compréhension des fonctions propres (Biochimie)– Ex : catalyse enzymatique

● Maîtrise des fonctions pour des application nonbiologiques (ChimieBiologique > Chemical Biology)– Ex : réactions de catalyse non physiologique

IIntroduction

Synthèse des protéines : voies de préparation Ribosomal

● Protéine avec résidus non naturels ou modifiés ?

● Protéine avec modification posttraductionnelle ?

... Purification à homogénéité très difficile– Ex PDB : 20000 structures / 150 avec 1 phosphorylation

– Moins encore avec lipidation/glycosylation

=> Synthèse chimique ?– Marquage

– Synthèse totale (taille limitée 100 aA)

IIntroduction

Besoins de protéines spécifiquement marquées ?

● Utilisation de méthode d'ingénierie des protéines– Mutagenèse à suppression de non sens / frame shift

– Ligation des Proteines Exprimées (EPL)

=>

– Élimination de la plupart des difficultés propres au marquage

– Interdisciplinarité ChimieBiologie

Combinaison de la puissance de la synthèse organique et des technologies de l'ADN recombinant

IIntroduction


● Plan– I Introduction

– II Mutagenèse à suppression de nonsens

– III « Click chemistry »

– IV Ligation des Protéines Exprimées

– V Applications

Nonsens suppression mutagenesis

● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon ambre– Présence d'un tRNA

« suppresseur » charger synthétiquement par l'Aa non naturel

– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in vitro (extrait ribosomaux – purification ou kit commerciaux)

II Mutagenèse à suppression de non sens

➔ 1 Synthèse in vitro de la protéine modifiée

Nonsens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon

ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus


2 Synthèse in vivo de la protéine modifiée

Nonsens suppression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon

ambre (UAG) – Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement

par l'Aa non naturel

– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in vitro


Améliorations

Nonsens suppression mutagenesis● Codon frameshift (codons à 4 bases)

– Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement par l'Aa non naturel


Nonsens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon

ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus

● ex :


Synthèse in vivo de la protéine modifiée


● Difficultés– Préparation (chimie )

– Adressage du tRNA préchargé

● Solution : E. coli modifiée– Système de traduction natif

● Génération d'un tRNACUA

efficace chez coli

Science. 2001 Apr 20;292(5516):498500.


javascript:AL_get(this,%20'jour',%20'Science.');



– Stratégies d'évolution dirigée :

● génération d'un nouveau tRNACUA




– Stratégies d'évolution dirigée :

● génération d'un nouveau tRNACUA


N'est reconnu que par la tRNA Aa synthase de M. jannaschii : Ne peutêtre chargé que par une Tyr



– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des Aa non naturels

– Stratégies d'évolution dirigée : ● génération d'un nouveau tRNA● permettre le chargement d'autres résidus


Nonsens suppression mutagenesis● Solution : E. coli modifiée

● permettre le chargement d'autres résidus



● Solution : E. coli modifiée● permettre le chargement d'autres résidus


Nonsens suppression mutagenesisII Mutagenèse à suppression de non sens



Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids


● Approches in vitro.

– Screening : tRNA + tRNA synthétase + spectro de masse

– Quelles molécules chargeables ?





Très grosse diversité ...

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII Mutagenèse à suppression de non sens

● Approches in vitro.

– Chargement chimique des AAnon naturels

– selon un code génétique modifié


● Principale limite

– Compétition tRNACUA

/ Release Factor 1

● Faible rendement● RF1 indispensable chez coli● 320 genes chez E. coli se terminent par le codonUAG

dont 44 sont essentiels)● Solutions :

– Surexpression du tRNACUA

– Mutant thermosensible du RF1 (augmentation de la température pendant l'induction

– Rendement 20 à 30% max (incorporé vs tronqué)


● Solution : RiboX– Evolution dirigée de Ribosomes spécifiques (Oribosome)

– Ne reconnaissent pas le RF1

– Reconnaisent des mRNA spécifiques (omRNA)

● Sites de reconnaissance des ribosomes modifiés

Rendement > 60% (1 site)20 % pour deux aA non naturels


● Amélioration: RiboQ– Evolution dirigée : Ribosomes pour codons Quadruplet

– Potentiel de 256 codons

RiboQ1 ; incorpore efficacement (et fidèlement) une Ser lors de la rencontre du codon AGGA

omRNA codant pour la Chloramphénicol acetyl Esterase


● Amélioration: RiboQ– Evolution dirigée : Ribosomes pour codons Quadruplet

– Potentiel de 256 codons

– Engineering / la tRNAsynthase pour l'incorporation Aa non naturels


● Articles récents :– Neumann, H., PeakChew, S. Y.&Chin, J.W. Genetically encoding Nεacetyllysine in recombinant

proteins. Nature Chem. Biol. 4, 232–234 (2008) : nouvelle paire orthogonal trouvée chez Methanosarcina barkeri : pyrrolysyltRNA synthetase–tRNA

CUA

–


● Applications–

–

Etude de la catalyse par des radicaux Y.

« Click Chemistry »IIChimie Clique

● Chimie « Orthogonale »– Une seule réaction possible entre partenaire

– Pas (peu) de réaction secondaire

– Condition douce

– Hauts rendements de couplage




– Condition douce





– Condition douce





– Condition douce


Hydroxylamine




– Condition douce


IIIChimie Clique« Click Chemistry »

IIIChimie Clique« Click Chemistry »

The Methanosarcina barkeri MS pyrrolysyl tRNA synthetase/ tRNACUA pair is a new orthogonal pair in E. coli.9,10 We demonstrated it can be evolved to direct the efficient incorporation of unnatural amino acids into genetically determined sites in recombinant proteins and several unnatural amino acids have now been incorporated by evolving this pair.

IIIChimie Clique

In situ click Chemistry

● Acetylcholinesterase– Azide _ Acetylene :

● Sans Cu++● inhibiteur femtomolaire

IIIChimie Clique

Expressed Protein Ligation

● Résumé : Liaisons entre differents segments/blocs– Synthétiques

– Recombinants

– Recupération d'un produit avec des propriété inédite

● Principe énoncé in vitro– Retrouvé in vivo (intéines)

– Incorporation de 'velcros moléculaires' chimiques à l'extrémité des fragments

Expressed Protein Ligation

● INTRODUCTION

● ORIGINS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Protein Semisynthesis

– Chemical Ligation of Unprotected Peptides

– Native Chemical Ligation

– Protein Splicing and TransSplicing

– Expressed Protein Ligation

● MISE EN PRATIQUE DE l'EPL

– Résumé

– Production des fragments

– Un kit commercial

● APPLICATIONS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Introduction of Fluorescent Probes

– Introduction of Posttranslational Modifications

– Introduction of Stable Isotopes.

– Introduction of Unnatural Amino Acids

– Topology Engineering of Proteins

● FUTURE OUTLOOK AND SUMMARY

Manipulations Chimiques des Protéines

● Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation. Annu Rev Biochem. 2003;72:24989. TW Muir– Expressed protein ligation. Eur. J. Biochem 2004;271:66377

R David, MPO Ritcher AG BeckSickinger

– Manipulating proteins with chemistry: a crosssection of chemical biology Trends Biochem Sci. 2005;30,2634 ME Hahn and TW Muir

Développement de la ligation des Protéines Exprimées « EPL »

●Semisynthèse des protéines●Ligation Chimique des peptides nonprotégés●Ligation Chimique Native (NCL)●Epissage des protéines et Transépissage●Ligation des Protéines Exprimées (EPL)

Semisynthèse des protéines● Historiquement :

– Blocs : fragments de protéines (clivage)● Clivage Chimique (CNBr)● Clivage Protéolytique

● Obervation ancienne (Dyckes Nature 1974)

– Clivage chimique (CNBr) : Pancreatic Trypsine inhibitor / Cytochrome c

– Repliement coopératif

– Proximité des extrémités : Homosérine lactone /Amine Term Libre

– Réaction chimique spontanée, recondensation spontanée, liaison native

● => Incorporation d'Aa non naturels dans le cytochrome C– (Wallace Biochemistry 1997)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semisynthèse des protéines

Semisynthese : Tout processus spécifique de modification d'une protéine naturelle (# bioconjugaison : pas suffisamment spécifique)

● I Marquages : modérément à hautement spécifique

– Exemples 1● Introduction d'une Cys (Mutagenèse standard)● Dérivation du thiol / réactif – sonde chimique

– Incorporation d'un « Cross linker photoactivable– Inc. Fluorophores– Préparation d'enzymes «photocagées »– Optimisation de l'affinité de la Maltose Binding Protéin


Semisynthèse des protéines● II Stratégie de Protéolyse inverse :

– Enz protéolytique

– Altération des conditions de réaction : favoriser l'aminolyse vs hydrolyse

– Hte C° de solvant organique : Glycérol, DMF, Acétonitryl

– Blocage de l'intermédiaire peptylEnz

– Aminolyse avec Pep2

– Résultats probants : Subtilisine, Trypsine, Papaïne


Semisynthèse des protéines● II Stratégie de Protéolyse inverse :

– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B (Witte K, JACS 1997)

● Réac enz. Oligosaccaride / ligation peptidique

Introduction de l'oligosaccaride Sialyl Lewis X/ 1 site spécifique


Semisynthèse des protéines● III Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi

synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytique

● Exemple Historique (Nakatsuka JACS 1987) : la trypsine– Ser (triade catalytique) > Cys– Activité d'acétylation +++

● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »– Ser>Cys : Acétylation de l'Enz / substrat Pep1CtermPhenylalanylglycolate– Pro>Ala : suppression de l'encombrement stérique local : aminolyse efficace par

Nterm Pep2– Reconstitution de Pep1Pep2– Synthèse chimique de protéines entières – Prep de pep cycliques– Prep de protéines semisynthetiques ...


Semisynthèse des protéines● III Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi

synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytiques

● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »


● 6 peptides de synthese 12 à 30 résidus

ProtectionDéprotection

Synthèse totale de la Ribonucléase A + variants avec résidu(s) catalytique 4fluorohistidine (153 Aa).

Décalage de l'activité vers les pH acide (4 vs 7)

Semisynthèse des protéines● IV Combinaison synthèse chimique et semisynthèse

enzymatique– Réaction de type hydrazoneoxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating

Factor » (analogue du GCSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)

– VALIDATION– Mutagénèse : insertion d'une séquence unique LysSer– Protéolyse spécifique– Oxidation périodique du Nterm Frag2 en aldéhyde– Formation d'un hydrazide Cterm Fragm1 par protéolyse inverse– Mélange Frag1 et Frag2 : religation en protéine native – EXTENTION– Définition d'un fragment central– Remplacé par un pep de synthèse : « synthetic cassette mutagenesis »



enzymatique– Réaction type hydrazoneoxime




Aldéhyde : réaction d'oxidation periodique

Fragment : digestion spécifique KS par protease de Achromobacter






Insert

Hydrazide : réaction enzymatique (protease de Achromobacter)






Insert

(Augmentation de la flexibilité)

(hydrazone)






Insert






+

Insert


enzymatique


Semisynthèse des protéines● Approches pour la synthèse chimique totale des protéines

– Utilisation de blocs non protégés (synthétiques) puis ligations● Exemple historique : synthèse totale de la HIV1 Protéase (Schnölzer 1992

Sciences)

– 2 x 50 résidus ( syntétiques)– Liaison thioester : solution aqueuse, pH 7

● Autres Chimie :– Thioether (1994)– oxime/hydrazone (19921994)– Thiazolidine (1994)– Dérivé amide (19942000)

● Approches pour la synthèse chimique totale des protéines– Utilisation de blocs non protégés (synthétiques) puis ligations

● Exemple historique : synthèse totale de la HIV1 Protéase (Schnölzer 1992 Sciences)

– 2 x 50 résidus ( syntétiques)– Liaison thioester : solution aqueuse, pH 7

● Autres Chimie :– Thioether (1994)– oxime/hydrazone (19921994)– Thiazolidine (1994)– Dérivé amide (19942000)


Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Mécanisme 1 bimoléculaire (optimisation de la réactivité)

– Mécanisme 2 réarangement monomoléculaire

● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Mécanisme 1 bimoléculaire (optimisation de la réactivité)

– Mécanisme 2 réarangement monomoléculaire



– Kemp «prior thiol capture»

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science)

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Kemp «prior thiol capture»

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science)


Nterminal Cys

Cterminal αthioesther● Améliorations

– Nterm # cys

– Cofacteur thiol catalitique

– Solution et phase solide

– Ligation séquentielle

Énormément de développements ...

● Améliorations– Nterm # cys

– Cofacteur thiol catalitique

– Solution et phase solide

– Ligation séquentielle

Énormément de développements ...



– Ligation totalement native (Dawson 1994 science) ● Ex de protéines complètes

– human matrix Gla protein (84 residues) (Hackeng Protein Science 2001)

– anticoagulant microprotein S (116 residues) (Hackeng PNAS 2000)

– human neutrophil pro αdefensin1 (75 residues) (Wu J Pept Res

2003).● Protéines avec modifications posttraductionnelles

– glycoproteins diptericin (58 residues) (Shin JACS 1999) – lymphotactin (93 residues) (Marcaurelle Chem Eur J 2001). – La proteine prion avec un mimétique de

glycosylphosphatidylinositol (Ball J Pep Res 2001).


– Ligation totalement native (Dawson 1994 science) ● Ex de protéines complètes

– human matrix Gla protein (84 residues) (Hackeng Protein Science 2001)

– anticoagulant microprotein S (116 residues) (Hackeng PNAS 2000)

– human neutrophil pro αdefensin1 (75 residues) (Wu J Pept Res

2003).● Protéines avec modifications posttraductionnelles

– glycoproteins diptericin (58 residues) (Shin JACS 1999) – lymphotactin (93 residues) (Marcaurelle Chem Eur J 2001). – La proteine prion avec un mimétique de

glycosylphosphatidylinositol (Ball J Pep Res 2001).



– Kemp «prior thiol capture» )

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications posttraductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)

– Le protooncogène HRas (166 residus) avec un Rasbinding domain (81 residus) + incorporation d'une étiquette fluorescente => suivi de l'interaction (Becker Chem Biol 2001, PNAS 2003).

– Une protéine d'erythropoïèse modifiée par un polyéthylène glycol(166 residues) (Kochendoerfer Science 2003)

● Prolongation de demivie , ● Amélioration de l'activité biologique

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Kemp «prior thiol capture» )

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications posttraductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)

– Le protooncogène HRas (166 residus) avec un Rasbinding domain (81 residus) + incorporation d'une étiquette fluorescente => suivi de l'interaction (Becker Chem Biol 2001, PNAS 2003).

– Une protéine d'erythropoïèse modifiée par un polyéthylène glycol(166 residues) (Kochendoerfer Science 2003)

● Prolongation de demivie , ● Amélioration de l'activité biologique




– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications posttraductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)● Crambin (46 résidu) (Bang Angew Chem Int 2004)

– En 1 pot– 3 peptides séquentiellement– Pas de purification intermédiaire– Haut rendement– Repliement dans le mélange de réaction– Native


– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec modifications posttraductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)● Crambin (46 résidu) (Bang Angew Chem Int 2004)

– En 1 pot– 3 peptides séquentiellement– Pas de purification intermédiaire– Haut rendement– Repliement dans le mélange de réaction– Native


Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Idem : Ligation totalement native (Dawson 1994 science)

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Idem : Ligation totalement native (Dawson 1994 science)


Protéine recombinante avec Cys en Nterm

+

Peptide de synthèse comprenant l'αthioesther

Peutont obtenir l'αthioesther par protéine recombinate ?

=> Oui, grâce aux intéines ...

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique (Paulus Annu Rev Biochem 2000)● L'épissage protéique (Paulus Annu Rev Biochem 2000)


– Modification postraductionnelle naturelle (description : cooper EMBO J 1993)

– > 500 (09) (http://www.neb.com/neb/inteins.html)

● Eukarya (Levures, Algues, champignons)

● Eubacteria, Archaea

– Pas de contraintes de séquence sur les Exteine sauf ...

– Motifs conservés dans les Inteines

– Modification postraductionnelle naturelle (description : cooper EMBO J 1993)

– > 500 (09) (http://www.neb.com/neb/inteins.html)

● Eukarya (Levures, Algues, champignons)

● Eubacteria, Archaea

– Pas de contraintes de séquence sur les Exteine sauf ...

– Motifs conservés dans les Inteines

! Présence d'une Cys à la jonction des Extéines(ou S ou T ...)

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Motifs concervés dans les Inteines

● L'épissage protéique– Motifs concervés dans les Inteines


Intein Block C Block D Block E Block H Consensus LhG..hhaG .K.IP..h .L.GhFahDG p.S..hh..h..LL..hGI

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme● L'épissage protéique : mécanisme


succinimide

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme● L'épissage protéique : mécanisme


– Thermodynamiquement défavorable● Torsion de liaison peptidique induit

par la stucture 3D

– Thermodynamiquement défavorable● Torsion de liaison peptidique induit

par la stucture 3D

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme

– Transfert de la CExteine

● L'épissage protéique : mécanisme– Transfert de la CExteine


Intermédiaire branché

succinimide

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme

– Réaction de cyclisation (Asn conservée en Cterm de l'Intéine)

● L'épissage protéique : mécanisme– Réaction de cyclisation (Asn conservée en Cterm de l'Intéine)


(i) Excision de l'intéine (succinimide)(ii) Formation de la liaison peptidique Même réaction chimique que dans la

Ligation Chimique Native (S>N acyl transfert)


– Exploitation Biotechnologique : construction recombinante ● Extéine Nterm : séquence protéique d'intérêt● Extéine Cterm pour une chromato d'affinité● Une mutation de l'Asn conservée > Ala de l'intéine

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : construction recombinante

● Extéine Nterm : séquence protéique d'intérêt● Extéine Cterm pour une chromato d'affinité● Une mutation de l'Asn conservée > Ala de l'intéine



– Exploitation Biotechnologique : ● mutation de l'Asn conservée de l'intéine :

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique :

● mutation de l'Asn conservée de l'intéine :


– Blocage à la première étape ...

– Substitution de la cyclisation monomoléculaire par une Thiolyse bimoléculaire (ajout d'un thiol en eccès)

=> Préparation d'un dérivé αthioester

OK pour ligation chimique natives

+ peptide synthétique

Produit semisynthétique

– Blocage à la première étape ...

– Substitution de la cyclisation monomoléculaire par une Thiolyse bimoléculaire (ajout d'un thiol en eccès)

=> Préparation d'un dérivé αthioester

OK pour ligation chimique natives

+ peptide synthétique

Produit semisynthétique


– Exploitation Biotechnologique : ● Transepissage :


● Transepissage :


– Intéine en 2 morceaux inactifs

– Reconstitution intéine active● Affinity tag sur l'intéine découpé● Synthèse chimique d'un morceau ● Splicing in vivo (2 prot

recombinantes)● Dénaturationrenaturation des 2

nécessaire in vitro ...● ... non ! Intéine DnaE (Synechocytis)

naturellement en 2 morceaux– Plus de dénaturation

– Intéine en 2 morceaux inactifs

– Reconstitution intéine active● Affinity tag sur l'intéine découpé● Synthèse chimique d'un morceau ● Splicing in vivo (2 prot

recombinantes)● Dénaturationrenaturation des 2

nécessaire in vitro ...● ... non ! Intéine DnaE (Synechocytis)

naturellement en 2 morceaux– Plus de dénaturation

Purification

Reconstitution


– Exploitation Biotechnologique : ● Transepissage :


● Transepissage :


– Intéine en 2 morceaux inactifs● Génération de Prot semisynt.

(Lew J Mol Biol 1998)● Marquage isotopique dans des

segments spécifiques (RMN) (Yamasaki JACS 1998; Xu PNAS 1999; Otomo Biochemistry 1999; Romanelli PNAS 2004)

● Interaction in vivo (Paulmurugan PNAS 2002; Kim PNAS 2004; Yang PNAS 2003; Chin PNAS 2003)

– Intéine en 2 morceaux inactifs● Génération de Prot semisynt.

(Lew J Mol Biol 1998)● Marquage isotopique dans des

segments spécifiques (RMN) (Yamasaki JACS 1998; Xu PNAS 1999; Otomo Biochemistry 1999; Romanelli PNAS 2004)

● Interaction in vivo (Paulmurugan PNAS 2002; Kim PNAS 2004; Yang PNAS 2003; Chin PNAS 2003)


– Exploitation Biotechnologique : ● Applications :

– Formation de puces à protéines (Tan Bioor Med Chem Lett 2004; Lue Methods Mol Biol 2004; Sydor Bioconj Chem 2002; Sun Biotechniques 2004)


● Applications :– Formation de puces à protéines (Tan Bioor Med Chem Lett 2004; Lue Methods

Mol Biol 2004; Sydor Bioconj Chem 2002; Sun Biotechniques 2004)


=> Epitope scanning, kinase assays : sensibilité de la puce x 10000


– Exploitation Biotechnologique● Applications :

– Imagerie cellulaire (Kim PNAS 2004)

– Système de screening in vitro :● Intéine + GFP (Gangopadhyay Anal chem 2003)

– Plantes transgéniques (Chin PNAS 2003) : ● résistance au Glyphosphate (herbicide)

● splitting entre noyaux et chloroplaste

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique

● Applications :– Imagerie cellulaire (Kim PNAS 2004)

– Système de screening in vitro :● Intéine + GFP (Gangopadhyay Anal chem 2003)

– Plantes transgéniques (Chin PNAS 2003) : ● résistance au Glyphosphate (herbicide)

● splitting entre noyaux et chloroplaste


=> Pas de transmission du gène fonctionnel au pollen

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)




– Processing normal

– Complémentation induite

– Self complémentation (mutant sans processing)

– Processing normal

– Complémentation induite

– Self complémentation (mutant sans processing)


– Exploitation Biotechnologique : ● Molecular switches


● Molecular switches


– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces transsplicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)





– Exploitation Biotechnologique : ● Molecular switches


● Molecular switches








RésuméMise en pratique de l'EPL

●Prot recombinante Cys Nterm + Pep de synthèse α thioEsther

ProtéineCysPeptideCOSR

●Prot recombinante α thioEsther + Pep de synthèse Cys Nterm

CysPeptide

●Pep de synthèse Cys Nterm + Pep de synthèse α thioEsther

●Prot recombinante α thioEsther + Prot recombinane Cys Nterm

PeptideCOSR

Protéine COSR CysPeptide

ProtéineCysProtéine COSR

Synthèse chimique totale100 aA/bloc)

In vitro ou in vivo

Introduction de propriétés non natives / 100 aA Cterm

Introduction de propriétés non natives / 100 aA Nterm

Autres possibilitésMise en pratique de l'EPL

ProtéineCysProtéine COSR CysPeptideCOSR

COSR Cys

RSOCCys

● Stratégie d'EPL séquentielle– Insertion

– Cyclisation

– ...

=> Production des fragments + ligation

(in vitro ou in vivo)

● Stratégie d'EPL séquentielle– Insertion

– Cyclisation

– ...

=> Production des fragments + ligation

(in vitro ou in vivo)

Production des fragments (protéines recombinantes)● Passage de l'extrait cellulaire sur la colonne d'affinité

● Formation du dérivé αthioesther :

– Petites molécules nucléophiles

– Pénétration de la poche catalytique

– Stabilité du α thioester

– Réactivité suffisante pour la ligation

● Alkylthioester stable mais peu réactif● Additifs Alkylthiols + thiophenol● Acide 2mercaptoethansulfonique (MESNA)

● Passage de l'extrait cellulaire sur la colonne d'affinité

● Formation du dérivé αthioesther :

– Petites molécules nucléophiles

– Pénétration de la poche catalytique

– Stabilité du α thioester

– Réactivité suffisante pour la ligation

● Alkylthioester stable mais peu réactif● Additifs Alkylthiols + thiophenol● Acide 2mercaptoethansulfonique (MESNA)

Mise en pratique de l'EPL

Production des fragments (protéines recombinantes)

● Production de la Cys Nterm– Expression directe avec MetCysProt

● Met aminopeptidase (mauvais rendements

– Protéolyse● Facteur Xa (Cterm de IleGluGlyArg, IleAspGlyArg et AlaGluGlyArg. )

● TEV (protéase du tobacco etch virus GluXXTyrXGln Ser/Cys.)

– Intéines modifiées autoclivables● pHtempérature● Risque de clivages intempestifs ...

● Production de la Cys Nterm– Expression directe avec MetCysProt

● Met aminopeptidase (mauvais rendements

– Protéolyse● Facteur Xa (Cterm de IleGluGlyArg, IleAspGlyArg et AlaGluGlyArg. )

● TEV (protéase du tobacco etch virus GluXXTyrXGln Ser/Cys.)

– Intéines modifiées autoclivables● pHtempérature● Risque de clivages intempestifs ...


Un kit commercial● Le système IMPACT® (New England Biolabs)● Le système IMPACT® (New England Biolabs)


– Basé sur une intéine mutante (Asn/Gln>Ala)

● pas d'autocatalyse● Scission induite (Thioysel)● Production de l'αthioester ou de

la Cys therminal

– Vecteurs

– Colonne de Chitine

– Basé sur une intéine mutante (Asn/Gln>Ala)

● pas d'autocatalyse● Scission induite (Thioysel)● Production de l'αthioester ou de

la Cys therminal

– Vecteurs

– Colonne de Chitine

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Modifications chimiques et semisynthèses des protéines 2 ......Développement de la ligation des Protéines Exprimées 6 peptides de synthese 12 à 30 résidus Protection Déprotection