Mesurer la maladie résiduelle dans les LALaihemato.cluster013.ovh.net/AIH/documents/Cours DES/DES 2019-04-12/H... · Journée nationale du DES d’Hématologie clinique Mesurer la

Journée nationale du DES d’Hématologie clinique

Mesurer la maladie résiduelledans les LAL

JMML s*mposium_San Diego 2011

Pr Hélène Cavé

CHU Robert Debré – Département de GénétiqueINSERM UMR-S1131, Institut Universitaire d’Hématologie,Paris, France

QU’EST-CE QUE LA MALADIE RESIDUELLE ?

Cytology

detection threshold

Flow cytometry

detection threshold

PCR detection l!mit

Cytologie

sensibilité 5%

Maladie

résiduelle

ou

Maladie non détectable

par l’examen cyto-

morphologique

Comment évaluer l’efficacité du traitement d’une LAL ?

MRD : Minimal residual disease

Rechute tardiveRechute précoce

Ans

Ia Ib II Entretien

Pro

port

ion r

ela

tive d

e c

ellule

s le

ucém

iques

Guérison

1012

1010

Cellules

leucémiques

[CR

≤ 1

010

bla

stes]

Rémission

cytologique

(<5% blastes MO)

JAMA Oncology, 2017

20 pediatric studies(11 249 patients)

16 adult studies (2076 patients)

Coustan Smith et al., Blood 2002

ET LE SANG ?

Distribution de la MRD dans moelle et sang

selon l’immunophénotype de la LAL.

➢ Le sang périphérique peut éventuellement être utilisé pour suivre la

MRD dans les LAL-T

➢ Dans les LAL de lignée B, les valeurs de MRD mesurées dans le sang

sont souvent inférieures à celles mesurées dans la moelle

MRD AS A SURROGATE MARKER FOR OUTCOME ?

MRD at the end of induction ▪ shows a considerable prognostic

association with EFS at the individual level▪ is a poor surrogate for treatment effect on

EFS (Valsecchi et al., Blood 2016)

Still a matter of debate

Molecular response can beused as an endpoint to evaluate the efficacy of a drug

Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment

U.S. Department of Health and Human Services - Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Biologics Evaluation and Research (CBER)

For new drugs that have a demonstrated durable CR in patients with relapsed or refractory ALL, FDA has accepted MRD of less than 0.01% as supporting evidence of efficacy. As technologies improve and new clinical findings emerge, the level of MRD needed to support an efficacy claim may change.

First FDA approval of a leukemia drug— Blinatumomab (Blincyto; Amgen)— to include patients who are technically in remission but still have measurable residual disease.

October 2018

MRD AS A SURROGATE MARKER FOR OUTCOME ?

HOW ?

Cellules leucémiques

résiduelles

*

*

***

*

*

*

*

**

*

**

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**

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** *

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**

**

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**

** *

*

***

***

*

Traitement

MALADIE RESIDUELLE (MRD)

Une aiguille dans une botte de foin…

Population l*mphoïde normale

(pol*clonale)

Cellules leucémiques l*mphoïdes

(population monoclonale)

COMMENT DETECTER LES BLASTES RESIDUELS ?

MARQUEUR TECHNIQUE

Réarrangements des gènes des

immunoglobulines (Ig) et du récepteur T

(TCR) spécifique du clone leucémique

▪ PCR quantitative

▪ NGS

▪ PCR digitale

Immunophénotype aberrant ▪ Cytométrie en flux

Anomalies génétiques liées au processus

oncogénique (translocation, délétion,

mutation)

▪ PCR ou RT-PCR

quantitative

▪ NGS

▪ PCR digitale

Locus TCRGFamille VGI

VG1 VG2 VG 4VG3 VG8VG7VG6VG5 VGA VGBVG9 VG10 VG11 VG12 JP1 JP J1 C 1 C 2JP2 J2

VG3 J1

Région N

(excision/addition aléatoire de nucléotides)

ADN

//

VGI consensus

……..GCCTTGTGGGAggccccctATTATTATAAG……..

………ACTGTGCCACCTccccgcTTGGTTCAAG………

……..ACTGTGCCACCTGGGacaggcaccctATACCCACTGGTT........

Recombinaison V(D)J

MARQUEUR DE CLONALITE SPECIFIQUE DE CHAQUE CLONE TUMORAL

ASO spécifique

ASO: allele-specific oligonucleotide

MARQUEURS DE CLONALITE IG/TCR

V9J1J2

2 allèles 187 pb et 201 pb

Van Dongen, Blood 2015

IG/TCR REARRANGEMENT CARACTERISATION USING NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)

TARGET DETECTION AND SEQUENCING IN ONE GO

MRD targets selected amongrearrangements accounting for >5% reads per locus (>1% total reads)

Amplicon size

IGHIGHIGK

TCRA/DTCRB

TCRDTCRG

CLONAL EVOLUTION AT RELAPSE

Amplicon size

IGHIGHIGK

TCRA/DTCRB

TCRDTCRG

2 clonal markers per patients are required to prevent false negativity

1) Identification et séquençage des réarrangements Ig/TCR présents dans les cellules leucémiques de chaque patient

2) Design d’une ASO pour Q-PCR

3) Courbe de calibration (dilutions en série des blastes du patient dans des cellules mononucléées polyclonales)

4) Dosage d’une séquence de référence (ALB)

5) Calcul du rapport cible/ref

DV J

ASO probe J primer J

or

PCR ALLELE-SPECIFIQUE EN TEMPS REEL


V J


Multiplex PCR and NGS

PCR

PRESENTATION

Blasts > 85%

Genomic DNA

Sequencing of N region

Clono-specific primer

V J


MRD ASSESSEMENT – GENERAL STRATEGY

V JV D J NN N

6331-

VG

IJ1J2

6148-

VD

2D

D3

4720-

VG

IJ1J2

1

2

4

Design of an

allele specific

primer (ASO)

REMISSION

Blasts < 1-5%

PCR

Genomic DNA

Allele-specific real-time quantitative PCR

Relative quantitation b* comparison to a

standard curve (serial dilutions of initial blasts)

sensitivities of 10-4 to 10-5

TCRG, TCRD, TCRB, IGH, IGK

Reproductibilité des duplicatsbonne (ΔCt<1.5) mauvaise (ΔCt≥1.5)

Ven der Velden et al., Leukemia 2003

DOMAINES DE DETECTION ET DE QUANTIFICATION

Sensibilité (domaine de détection)

Linéarité (domaine de quantification)

•Domaine de sensibilité (SR) jusque 10-5

(1 blaste dans 100.000 cellules)

• Domaine de quantification (QR) jusque 10-4

10-5

10-4

Faux positifs ou faux négatifs ?

STRATIFICATION SWITCHES BASED ON IKZF1 AND MRD IN B-LINEAGE ALL

CAALL-F01 (ongoinfg frontline childhood ALL trial)

SR and intermediate-risk patients with MRD 10-4

at day 29 of induction (n=533) were randomly assigned to standard therapy or augmented post-remission therapy

▪ improvement in event-free survival with augmented therapy compared with standard treatment

▪ Decreased risk of relapse (mainly BM relapses) in the augmented therapy group

▪ Patients given augmented therapy had a trend but no significantly improved overall survival

DOES MRD-BASED TREATMENT INTENSIFICATION IMPROVE OUTCOME ?

(p=0·04)

Vora et al., Lancet Oncol 2014

Outcome of 3184 patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study according to PCR-MRD classification (Conter et al., Blood, 2010)

CLINICAL SIGNIFICANCE OF MRD IN CHILDHOOD ALL

EFS cumulative incidence of relapse

➢Molecular response to treatment still redefines all prognostic factorsin children and adolescents with B-cell precursor ALL

25% -> 40%

Therapeutic intensification based on MRD at completion of consolidation

PCR

PRESENTATION

Blasts > 85%

Genomic DNA



MRD ASSESSEMENT – GENERAL STRATEGY

V JV D J NN N

6331-

VG

IJ1J2

6148-

VD

2D

D3

4720-

VG

IJ1J2

1

2

4

REMISSION

Blasts < 1-5%

PCR

Genomic DNA

Multiplex PCR and NGS

TCRG, TCRD, TCRB, IGH, IGK

Ladetto et al., Leukemia 2014

IG-TCR NGS FOR MRD FOLLOW UP

Sequenta lymphoSIGHT methodGood corelation with the gold sandard method (Q-PCR)

Spike-in (knownIGH sequence)

▪ Added sensitivity (10µg DNA tested)▪ Broad availability of a standardized molecular MRD

ClonoSEQ® (Adaptive Biotechnologies) Sequenta/Adaptive platform

Not a kit but a serviceExpensive (not affordable for investigator initiated trials)

Europe: Patent pending - work on an workflow for automated library preparation Standardisation and kit development with a commercial partner (IVD regulation)

Marketing authorization to the first-ever next-generation sequencing assay for detecting MRD in patients with ALL

Wood, Blood 2018

COG studies AALL0331 (standard risk [SR] and AALL0232 (high risk; with day 29 MRD <0.1% by FC)

SR SR

• NGS identifies MRD at the clinical cutoff in more patients than FC, and these patients have worse outcomes.• A subset of B-ALL patients essentially cured using current chemotherapy is identified at end of induction by NGS.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=5865233_blood806521f4.jpg

Pourquoi ?

1) Parce que c’est la première technique a avoir été

corrélée avec les données cliniques (en Europe).

1) Grace à l’initiative Européenne de standardisation

(EuroMRD consortium).

haut niveau de concordance entre les

laboratoires Européen comme en témoingnent des

contrôles de qualité réguliers.

La quantification par Q-PCR des réarrangements

clonaux des IG/TCR reste le “gold standard” pour le

suivi de la MRD dans les LAL

Although 100 reads are generated, sensitivity cannot exceed 1:10 as only 10 DNA copies were analyzed

Langerak et al. J Immunol 2017

▪ The known amount of reference DNA copies (spike in) is added to the sequenced sample and used for calculation of coverage (reads) per molecule. This information is then used for calculation of MRD.

▪ The sensitivity is influenced by the total coverage and by the number of analyzed DNA copies.

Sensitivity of NGS MRD detectionand quantification of MRD

MRD DANS LES LAL CIBLER LES ANOMALIES ONCOGENIQUES

▪ Points de cassure génomiques des translocations

▪ Délétions récurrentes

▪ Mutations ponctuelles

identification et suivi de sous-clones résistants au traitement

Suivi de cibles thérapeutiques

Oncogenic markers

Point mutations

✓Technical issues✓ Subclonal

Undiluted to 10-4 standard dilutionsSample to quantify

ONCOGENIC TRANSCRIPTS AS MRD MARKERS

cDNABCR ABL

Reference transcript(quantity/quality of RNA)Ex: GUS, ABL, …

ETV6-RUNX1

H*perdiploid* (25%)

MLL (10%)

iAMP21 (2%)BCR-ABL (3%)

E2A-PBX1 (5%)M*C (2%)

CRLF2 (6%)

B-lineage ALL

sensitivity 10-4 to 10-5

DNA

▪ No patient-specific assays necessary▪ Largely used in CML

WHAT IS THE RIGHT TARGET TO FOLLOW?

Cazzaniga et al., Haematologica 2018

Predictive value of MRD in Philadelphia-chromosome-positive ALL treated with imatinib based on immunoglobulin/T-cell receptor and BCR/ABL1 methodologies.

▪ No prognostic implication so far ▪ International guidelines : follow IG-TCR rearrangements

The EsPhALL study

≥ 10-4 pos

MRD IG/TCR MRD BCR/ABL


Horvokova, Blood 2017

WHAT IS THE RIGHT TARGET TO FOLLOW?

Cazzaniga et al., Haematologica 2018

Predictive value of MRD in Philadelphia-chromosome-positive ALL treated with imatinib based on immunoglobulin/T-cell receptor and BCR/ABL1 methodologies.

▪ No prognostic implication so far ▪ International guidelines : follow IG-TCR rearrangements

The EsPhALL study

≥ 10-4 pos


MRD IG/TCR MRD BCR/ABLIn patients with discordant MRD BCR-ABL1 fusion was found also in non-ALL B cells, T cells, and myeloid cells

Horvokova, Blood 2017

IG-TCR rearrangements and BCR-ABL transcript do not mark the same cell populations

NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC DE LAL

LAL B : 46,XY,t(4;11)(q21;q23)[19]/46,XY[1]

Transcrit de fusion MLL-AF4

Locus IgH

1 marqueurs Locus TCR D

Problème des LAL peu différentiées : Oligoclonalité / absence de réarrangements IG/TCR

NGS DATA Analysis (MLL pipeline)

Nextera® DNA Library

Preparation

Coverage of the whole MLL gene

Identification of direct and reciprocal

fusions breakpoint sequences

Workflow at DCAL

MLL-AFF1

MLL rearrangementFISH, RT-PCR etc

MLL genomic breakpoint

TTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGA

TaqMan probe

Der(11)MLL fusion partner

MRD monitoring

Breakpoint specific Q-PCR✓ Robustness (DNA)✓ Specificity (SR ≤10-4; QR 10-4)

FOLLOW THE INITIATING ONCOGENIC LESION!

Lana O. – 6 monthsALL pro-B (EGIL I) –46XX, t(4;11)(q21;q13) – MLL-AF4Interfant MRCombined relapse at 20 monthsA103_20120215 trial - Blinatumomab

ALL pro-B (EGIL I)CD19+/CD22+, CD10-, CD20-, CD34+, CD15/65-NG2+CD13+ partialNo other myeloid marker (MP0-)

Monoblastic clone (25%)CD33+++/CD13+, CD64+/CD11c+, CD36+/CD14+, CD15/65+, CD4+Weak CD19 et CD22

ALL pro-B (EGIL I)

MRD IG/TCR (Berlin)

A103_20120215 trial

day 0 day 15 day 29

MRD CHALLENGED BY TARGETED THERAPIES

MRD

Lana O. – 6 monthsALL pro-B (EGIL I) –46XX, t(4;11)(q21;q13) – MLL-AF4Interfant MRCombined relapse at 20 monthsA103_20120215 trial - Blinatumomab

ALL pro-B (EGIL I)CD19+/CD22+, CD10-, CD20-, CD34+, CD15/65-NG2+CD13+ partialNo other myeloid marker (MP0-)

Monoblastic clone (25%)CD33+++/CD13+, CD64+/CD11c+, CD36+/CD14+, CD15/65+, CD4+Weak CD19 et CD22

ALL pro-B (EGIL I)

MRD IG/TCR (Berlin)

MRD MLL-AF4 breakpoint

A103_20120215 trial

day 0 day 15 day 29

MRD CHALLENGED BY TARGETED THERAPIES

MRD

Ex: NRAS c.35G>A ; p.Gly12Asp (VAF 44%)

MUTATION SCREENING AT DIAGNOSIS USING NGS

NGS IS POORLY ADAPTED TO MRD MONITORING

In routine conditions, sensitivity limited to 1-2% (VAF) corresponding to 2-4% residual cells (background)

high substitution error rates

PCR-induced transitions (mainly G > A and C > T) are the major source of error, which canbe significantly reduced by the application of proofreading enzymes

Digital signals have a finite/limited set of possible values (binar format)

Continuous signal (continuous range of values to represent information)

Analog signal Digital signal

DROPLET DIGITAL PCR (ddPCR) – What’s in a name?

A G

double positive droplets (VIC+FAM)

fAM droplets →WT

VIC droplets →mut

Empty droplets

▪ Analysis using QuantaSoft software▪ Calcul du nombre de copies correspondant à chaque fluorochrome (loi de Poisson)▪ Possibilité de calculer un ratio FAM (muté)/VIC+FAM (total allèles)

DESIGN ddPCRNRAS c.35G>A

T C


T C

Ratio (FAM/VIC) = 0.27

Dilution 1/2 (VAF ≈25%)

Dilution 1/10 (VAF ≈ 5%)

Dilution 1/100 (VAF ≈ 0.5%)

DNA WT (VAF = 0%) = background



Ratio (FAM/VIC) = 5.10-5

Expected sensitivity = 1/ 1000 (or more adding replicates)


T C


Dilution 1/2 (VAF ≈25%)

Dilution 1/10 (VAF ≈ 5%)

Dilution 1/100 (VAF ≈ 0.5%)

DNA WT (VAF = 0%) = background



Ratio (FAM/VIC) = 5.10-5

Expected sensitivity = 1/ 1000 (or more adding replicates)

Initiating oncogenic event

BCR-ABL

BCR-ABL

BCR-ABLBCR-ABL

Initiating cell

Pre-leukemic cell

BCR-ABLdel(C)

IG/TCR; MFC

BCR-ABLXmut

BCR-ABLXmut

BCR-ABLXmut

Additional alterations

MRD TARGETS ARE NOT CREATED EQUAL

Leukemia cells

BCR-ABLXmutBCR-ABL

Xmut

Cooperative genetic lesions

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

▪ WHAT IS THE RIGHT TARGET TO FOLLOW?

▪ WHAT IS THE QUESTION?

▪ MRD CHALLENGED B* TARGETED THERAPIES (anti CD19, …)


BCR-ABL

BCR-ABL

BCR-ABLBCR-ABL

Initiating

cell

Pre-leukemic cell

BCR-ABL

del(C)

IG/TCR; MFC

BCR-ABL

Xmut

BCR-ABL

Xmut

BCR-ABL

Xmut


Additional

alterations

Leukemia cells

BCR-ABL

XmutBCR-ABL

Xmut

Evolution of a

pre-leukemic clone

BCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

CDKN2A

PmutBCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

Selection of a minor

resistant subclone (52%)

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

MRD TARGETS ARE NOT CREATED EQUAL

Les seuils de MRD ainsi que les

points de prélèvement d’un

protocole thérapeutique doivent être

définis précisément pour chaque

cible avant d’entreprendre une

stratification du risque basée sur la

maladie résiduelle.

Au-delà de la technique et du marqueur utilisé …

des bonnes pratiques médicales :

Merci à

Aurélie Caye

“If the Why is big enough, the How doesn’t matter”

MRD ET LAL PEDIATRIQUES

Fin d’induction (J35)

RR=16

RR=5,7(47%)

(11%)

EORTC-CLG 58 881 BFM-90

Cavé et al., NEJM 1998 Van Dongen et al., Lancet 1998

➢ La MRD aux stades précoces du traitement est un facteur pronostic de

rechute puissant et indépendant

➢ « Effet-dose »: Une mesure quantitative est plus informative

➢ Utilisation clinique de la MRD pour la stratification selon le risque : Définition

des seuils de MRD et temps de prélèvements optimaux pour chaque

protocole de traitement


résiduelles

*

*

* *

**

Traitement

MARQUEUR DE MALIGNITE (ex: anomalie initiatrice de la leucémie : mBCR-ABL)

Population lymphoïde normale

(polyclonale)

Cellules leucémiques lymphoïdes

(population monoclonale)

*

*

***

*

*

*

*

**

*

**

*

*

*

*

*

**

**

*

*

*

*

*

**

** *

*

***

***

*

• Quality-control program twice per year• Development and evaluation of new MRD strategies and techniques• Guidelines for the interpretation of RQ-PCR-based MRD data.

http://www.euromrd.org

ESG

MRD

ALL

BFM-

AIEOP

ALL-2000

DCLSG

ALL9

Interfant

99

MRC-

ALL 97/99

UKALL-R3

COALL-

06-97

FRALLE

2000

EORTC-

CLG 58951

NOPHO

ALL-2000

(pre-)BMT

ALL

adult

ALL

GMALL

06/99

adult ALL

LALA 2000

adult ALL

UKALL XII

adult ALL

PETHEMA/

GETH

THE EURO MRD CONSORTIUM (2001)

Q1 (réponse choix multiples)

L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL a été démontré

pour :

1. Déterminer la réponse précoce au traitement de première ou

seconde ligne, prédictive du risque de rechute ?

2. Détecter précocement une résurgence des celles leucémiques afin

d’anticiper la rechute cytologique ?

3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse (et le

cas échéant prévoir un traitement permettant de réduire la charge

tumorale avant greffe) ?

4. Vérifier que l’on peut arrêter sans risque le traitement d’entretien ?

5. Evaluer l’efficacité d’une drogue dans le cadre d’un essai de phase III

(« surrogate marker ») ?



pour :




d’anticiper la rechute cytologique ?







QUIZZ (choix multiple) – les écueils liés au prélèvement

1. Dans une LAL de lignée B, la proportion de cellules leucémiques est

identiques dans le sang et la moelle.

2. Si le prélèvement de moelle de suivi a été oublié, il peut être

remplacé par un prélèvement de sang.

3. L’hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de

maladie résiduelle faussement négatif

4. Une hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de

maladie résiduel faussement positif

5. Prélever la moelle sur plusieurs territoires permet d’éviter un

résultat faussement négatif

QIZZ (choix simple) – Chez un nouveau-né avec t(4;11), la

décision de greffe dépend du résultat de la maladie

résiduelle, avec un seuil à 10-4. Quel va être votre choix de

première intention pour le suivi de la maladie résiduelle?

1. Suivi par Q-PCR du réarrangement IG/TCR

2. Suivi par RT-QPCR du transcrit de fusion MLL-AF4

3. Suivi par cytométrie de flux

4. Suivi par le point de cassure génomique de la translocation

CLONAL ARCHITECTURE CAN BE COMPLEX

Does treatment affect clonal architecture?- HSCT- Pre-HSCT (6-MP, AZA, …)

DiagnosisHSCT

Relapse



pour :




d’anticiper la rechute c*tologique ?









pour :




d’anticiper la rechute c*tologique ?







Acr*lamide

separation

Multiplex PCR / Capillar* electrophoresis

PCR

PRESENTATION

Blasts > 85%

Genomic DNA



TCRG, TCRD, TCRB (T), IGH, IGK (B)

V J


MRD ASSESSEMENT – GENERAL STRATEG*

V JV D J NN N

6331-

VG

IJ1J2

6148-

VD

2D

D3

4720-

VG

IJ1J2

1

2

4

Design of an

allele specific

primer (ASO)

N-region sequencing

REMISSION

Blasts < 1-5%

PCR

Genomic DNA

Allele-specific real-time quantitative PCR

Relative quantitation b* comparison to a

standard curve (serial dilutions of initial blasts)

sensitivities of 10-4 to 10-5

TCRA+D

TCRG

IGH

germline

IGH

germline

▪ Suivi de l’ensemble des clones tumoraux

▪ Tableau du répertoire B des cellules normales (niveau de diversité, …)

NGS IG-TCR POUR LE SUIVI DE LA MALADIE RÉSIDUELLE

CD19-NEGATIVE RELAPSE OF PEDIATRIC BCP-ALLFOLLOWING BLINATUMOMAB TREATMENT

Patient achieved hematologic remission during c*cle 1 of blinatumomab and complete MRD response b* flow c*tometr* but was MRD-positive b* PCR.

MRD detected b* PCR provides reliable results independentl* from CD19 expression. However, it does not identif* this important change of CD19-negative relapse, which ma* have therapeutic implications. Loss of the CD19 antigen is also an important cause of discrepanc* between flow c*tometr* and PCR. The abilit* to accuratel* monitor ALL progression during treatment and after CD19-negative relapse b* flow c*tometr* requires identif*ing additional B-lineage or other specific markers consistentl* expressed on B cells. CD22 or CD24 in combination with markers

Mejstríková et al. Blood Cancer Journal (2017)

MRD DANS LES LAL

NOUVELLES APPROCHES MOLECULAIRES

La PCR digitale en gouttelettes

▪ Amplification d’une cible unique par compartiment (dilution)

▪ Discrimination allélique (sondes allèle-spécifiques marquées par un

fluorochrome)

▪ Remplace le signal exponentiel (analogue) de la PCR conventionnelle)

en signal digital (linéaire)

▪ Sensibilité dépend du nombre de compartiments (puits/gouttelettes)

et de la quantité d’ADN

Détection de mutations rares parmi des allèles sauvages

PCR digitale : Principe

1/ Génération des gouttelettes

❑Compartimentation de l’ADN dans

des millions de gouttelettes

❑Conditions de dilution limite



2/ PCR spécifique et indépendante

Amplification (1) ou non (0)



2/ PCR spécifique et indépendante

3/ H*bridation des sondes « mut » et « sauvage » et lecture de fluorescence

❑ Détection du signal fluorescent

▪ Sondes fluorescentes

▪ Décompte binaire : événement (1) ou non (0)

▪ Événement : allèle sauvage ou muté

❑ Quantification absolue

DROPLET DIGITAL PCR (ddPCR)

▪ Compartimentation de l’ADN dans des millions de gouttelettes


▪ Discrimination allélique (sondes allèle-spécifiques marquées par un fluorochrome)

▪ Sensibilité dépend du nombre de compartiments (puits/gouttelettes) et de la quantité d’ADN

*

Merci à…Aurélie Ca*eVincent CathalotL*dia Suarez

La maladie résiduelle a encore bien des cordes à son arc !

Rapport transcrit cible / transcrit de référence

ARN

cDNA

Transcrit

de fusion

Transcrit

de référence

endogène

Prélèvement

Extraction

Transcription

inverse

PCR

quantitative

Conservation

UTILISATION LIMITEE DES TRANSCRITS DE FUSION

POUR SUIVRE LA MALADIE RESIDUELLE DANS LES LAL

MLL-t

CALM-AF10

TCR-HOXA

TLX1/HOX11

TLX3/HOX11L2

SIL-TAL1, L*L1, TAL2, +/- LMO1, LMO2

TCR-M*B

ETV6-RUNX1

H*perdiploid* (25%)

MLL (10%)


E2A-PBX1 (5%)M*C (2%)

CRLF2 (6%)

Childhood B-lineage ALL

T-ALL

NB: utilisé pour LMC (BCR-ABL), LAM3 (PML-RARA)

Protocoles EORTC

INTEGRATION DE LA MRD POUR DEFINIR LE RISQUE

• Intensité du traitement basée sur la MRD

(Intensification si MRD élevée +/- désescalade si bas niveau de MRD)

• Indication d’allogreffe de moelle

Prephase Ia

MRD 10-2

VANDAIb’

Ib IIa+bInterval Maintenance

Interval

(3 courses)MaintenanceBlocks R1 R2 R3 (x2)

MRD

(D35)

Risque

Standard

et bas risque

Haut risque

VHRBMT-MSD

MINIMAL RESIDUAL DISEASE MONITORING IN ADULT ALLTO DETERMINE THERAP*

Bassan, Curr Hematol Malig Rep, 2015

NEXT GENERATION SEQUENCING

OF IG/TCR REARRANGEMENTS

▪ PCR Multiplex

▪ (s*stèmes identiques à ceux utilisés en

PCR/anal*se de fragment),

▪ Incorporation des code-barres et

adaptateurs pour NGS

▪ séquençage sur les plateformes PGM-Ion

Torrent ou Miseq-Illumina)

#2 jours de technique, #2,5 jours de run

V J P7IdIdP5

Index

Amorces d’amplification

Adaptateurs Illumina

(attachement à la flow cell)

Amplicon

Au diagnostic : Identification des réarrangements clonaux

▪ Séquence simultanée des réarrangements, (#1 semaine)

▪ Anal*se bioinformatique permettant l’identification des régions V-D-J

Rd1


(pour PCR universelle – si technique PCR en 2 étapes) et site de fixation des amorces de séquençage)

Mise en évidence des Réarrangements IgTCR par NGS

Laboratoire de Génétique moléculaire de Robert Debré

Secteur Onco-Hématologie-Greffe

Identification des réarrangements IgTCR du patient au Diagnostic par séquençage sur Miseq.

Locus IgH, IgK, TCRD, TCRG, TCRB.(primers Biomed II)

Délétions intragéniques ERG et IKZF1 (primers maison)

Identito-Vigilance (set de 9 SNPs)

Principe

PCR Multiplex Non Fluo

Ligation des adaptateurs(Kit ClaSeek, Thermofisher)

Quantification des produits de Ligation(Kit KAPA, Roche)

Pool des Echantillons + Quantification du Pool

Chargement du Pool (Cartouche V2 500 c*cles, Flow cell Nano 1M de reads)

Les Différentes Etapes du Protocole

V(D)J

Vidjil : alignement des réarrangements IgTCR à partir des reads présents dans les fichiers FASTQ.gz (compressés)

EmEditor : anal*ses des données brutes à partir des fichiers FASTQ (décompressés)

Anal*ses d’ERG, IKZF1, Identito-Vigilance.

Anal*se des données

Pulsipher et al., Blood 2015

QUIZZ (réponse choix multiples) – Pourquoi suivre la maladie

résiduelle chez l’enfant?

L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL de

l’enfant a été démontré pour :

1. Déterminer la réponse précoce au traitement, prédictive du

risque de rechute

2. Détecter précocement une rechute afin de la traiter avant la

rechute c*tologique

3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse

4. Vérifier qu’on peut arrêter sans risque le traitement

d’entretien

QUIZZ (choix multiple) – les écueils liés au prélèvement

1. Dans une LAL de lignée B, la proportion de cellules leucémiques est


2. Si le prélèvement de moelle de suivi a été oublié, il peut être


3. L’hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de


4. Une hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de


5. Prélever la moelle sur plusieurs territoires permet d’éviter un

résultat faussement négatif

QIZZ (choix simple) – Chez un nouveau-né avec t(4;11), la

décision de greffe dépend du résultat de la maladie

résiduelle, avec un seuil à 10-4. Quel va être votre choix de

première intention pour le suivi de la maladie résiduelle?



3. Suivi par c*tométrie de flux


DELETIONS INTRAGENIQUES D’IKAROS (IKZF1)

UNE NOUVELLE CIBLE POUR SUIVRE LA MRD

Gamme SENI – 50µL ; 500ng ;

duplicat - Dilutions

10-2 10-35.10-

4 10-4

RECHERCHE DE MARQUEURS CLONO-SPECIFIQUES

LAL DU NOURRISSON

INTERFANT 06

Cible MRD :

point de cassure

génomique de MLL

Cible MRD :

réarangements des

gènes IG/TCR

LAL du nourrisson

MLL+ MLL-

80% 20%

• LAL souvent immature / biphénot*pique

• Réarrangements IG/TCR absents ou restreints à des sous-clones (risque de

faux négatifs)

• Suivi du transcrit de fusion : diversité des transcrits. Pas de standardisation,

interprétation délicate

• Suivi en CMF : possible mais pas de standardisation internationale

CATTGTGATGTCACACTAATTTTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGAACAGGAAAGAACCCCTTGCCATCTGTTCTCTAGCTGCG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

MLL Séquence chromosomique inconnue

der 11

AFF1 (AF4)46%

Autre7%

MLLT1 (ENL)21%

MLLT3 (AF9)16%

EPS15 (AF1P)3%

MLLT10 (AF10)5%

MLLT4 (AF6)2%

POINT DE CASSURE GENOMIQUE DE MLL (11q23)

1) Séquençage du point de cassure

génomique de la translocation MLL

(11q23) par long-distance inverse

PCR (LDI-PCR) (R Marshalek, D)


Amorce MLL Amorce X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


der 11

AFF1 (AF4)46%

Autre7%

MLLT1 (ENL)21%

MLLT3 (AF9)16%

EPS15 (AF1P)3%

MLLT10 (AF10)5%

MLLT4 (AF6)2%

Sonde TaqMan

S*stème Q-PCR patient spécifique

Spécificité

Robustesse (ADN)

Domaine de quantification : 10-4

Applicabilité : >70% des patients MLL+




(11q23) par long-distance inverse

PCR (LDI-PCR) (R Marshalek, D)

2) Choix d’amorces encadrant le

point de cassure +/- sonde TaqMan

3) PCR quantitative en temps réel

Positif non quantifiable :

Expression / QR

Négatif

Expression / SR

Pas d’indication

de greffe

Rechute méningée isolée

À J1 du traitement

d’entretien

(ponction s*stématique)

Indication de greffe

BIBLIOGRAPHY

MRD Reviews

Campana D. Should Minimal Residual Disease Monitoring in Acute Lymphoblastic Leukemia be Standard of Care? Curr

Hematol Malig Rep. 2012 Feb 29.

McGregor S, McNeer J, Gurbuxani S. Beyond the 2008 World Health Organization classification: the role of the

hematopathology laboratory in the diagnosis and management of acute lymphoblastic leukemia. Semin Diagn Pathol. 2012

Feb;29(1):2-11. Review.

Brüggemann M, Gökbuget N, Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring minimal residual disease as a therapeutic

principle. Semin Oncol. 2012 Feb;39(1):47-57. Review.

Oliansky DM, Camitta B, Gaynon P, Nieder ML, Parsons SK, Pulsipher MA, Dillon H, Ratko TA, Wall D, McCarthy PL Jr, Hahn T.

Role of c*totoxic therapy with hematopoietic stem cell transplantation in the treatment of pediatric acute l*mphoblastic

leukemia: update of the 2005 evidence-based review. Biol Blood Marrow Transplant. 2012 Apr;18(4):505-22.

Hunger SP, Raetz EA, Loh ML, Mullighan CG. Improving outcomes for high-risk ALL: translating new discoveries into clinical

care. Pediatr Blood Cancer. 2011 Jun;56(6):984-93.

Cazzaniga G, Valsecchi MG, Gaipa G, Conter V, Biondi A. Defining the correct role of minimal residual disease tests in the

management of acute l*mphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 2011 Oct;155(1):45-52

Coustan-Smith E, Campana D. Immunologic minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia: a

comparative approach to molecular testing. Best Pract Res Clin Haematol. 2010 Sep;23(3):347-58.

Campana D. Progress of minimal residual disease studies in childhood acute leukemia. Curr Hematol Malig Rep. 2010

Jul;5(3):169-76. Review.

BIBLIOGRAPHY

MRD GuidelinesBrüggemann M, et al., Standardized MRD quantification in European ALL trials: proceedings of the Second International

S*mposium on MRD assessment in Kiel, German*, 18-20 September 2008. Leukemia. 2010 Mar;24(3):521-35.

van der Velden VH, et al., European Stud* Group on MRD detection in ALL (ESG-MRD-ALL). Anal*sis of minimal residual

disease b* Ig/TCR gene rearrangements: guidelines for interpretation of real-time quantitative PCR data. Leukemia. 2007

Apr;21(4):604-11.

MRD in BMTBachanova V, et al. Unrelated Cord Blood Transplantation in Adult and Pediatric Acute L*mphoblastic Leukemia: Effect of

Minimal Residual Disease on Relapse and Survival. Biol Blood Marrow Transplant. 2012 Mar 16.

Lankester AC, et al. Preemptive alloimmune intervention in high-risk pediatric acute l*mphoblastic leukemia patients

guided b* minimal residual disease level before stem cell transplantation. Leukemia. 2010 Aug;24(8):1462-9.

Giebel S, et al. Stud* Group for Adult ALL of the European Leukemia Net. Status of minimal residual disease determines

outcome of autologous hematopoietic SCT in adult ALL. Bone Marrow Transplant. 2010 Jun;45(6):1095-101.

Pulsipher MA, Bader P, Klingebiel T, Cooper LJ. Allogeneic transplantation for pediatric acute l*mphoblastic leukemia: the

emerging role of peritransplantation minimal residual disease/chimerism monitoring and novel chemotherapeutic,

molecular, and immune approaches aimed at preventing relapse. Biol Blood Marrow Transplant. 2009 Jan;15(1 Suppl):62-71

Bader P, et al., ALL-REZ BFM Stud* Group. Prognostic value of minimal residual disease quantification before allogeneic

stem-cell transplantation in relapsed childhood acute l*mphoblastic leukemia: the ALL-REZ BFM Stud* Group. J Clin Oncol.

2009 Jan 20;27(3):377-84. Epub 2008 Dec 8.

Bader P, Willasch A, Klingebiel T. Monitoring of post-transplant remission of childhood malignancies: is there a standard?

Bone Marrow Transplant. 2008 Oct;42 Suppl 2:S31-4. Review.

Q1 (réponse choix multiples) – Pourquoi suivre la maladie

résiduelle chez l’enfant? L’intérêt du suivi de la maladie

résiduelle dans les LAL de l’enfant a été démontré pour :

1. Déterminer la réponse précoce au traitement, prédictive du

risque de rechute

2. Détecter précocement une rechute afin de la traiter avant la

rechute c*tologique

3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse

4. Vérifier qu’on peut arrêter sans risque le traitement

d’entretien

High-resolution profiling of genetic alterations has

transformed the genomic landscape of BCP-ALL

High hyperdiploidy

ETV6-RUNX1

TCF3-PBX1

ERGdel

iAMP21

Low hypo/near-haploidy

MLLt

B-Other

BCR-ABL1

High h*perdiploid*30-35%

« B-other »25-30%

TCF3-PBX1

BCR-ABL1< 5%

MLLtH*po/haploid*

≤ 5% each

ERGdeliAMP21

Classif*ing/primar* abnormalities

ETV6-RUNX120-25%

CAS CLINIQUE

Gabriel, 3 mois

NFS

• Hyperleucocytose à 160 G/L

• Frottis : cellules immatures

SNC+

Moelle

Broncho-pneumopathie avec hépato-spénomégalie

LAL pro-B (EGIL B-I)

Immunophénotype

Sensible à la préphase de corticoides (J8)

INTERFANT – Bras Medium RiskO Fenneteau

Q2 (choix multiples) - Chez un nourrisson atteint de LAL

1. On identifie un réarrangement MLL dans plus de 80% des cas

2. Le réarrangement le plus fréquent est MLL-AF9

3. la stratification du risque va reposer sur le statut de MLL

(réarrangé ou non)

4. la stratification du risque va reposer sur le partenaire de MLL

5. La meilleure technique pour identifier les réarrangements de

MLL est la FISH

6. La meilleure technique pour identifier les réarrangements de

MLL est la RT-PCR multiplex

FISH MLL (dual clor break apart)

AFF1 (AF4)

46%

Autre7%

MLLT1 (ENL)21%

MLLT3 (AF9)16%

EPS15 (AF1P)3%

MLLT10 (AF10)5%

MLLT4 (AF6)2%

LAL DU NOURRISSON : 80% MLL+

Van der Velden et al., Leukemia 2009

TP3 10-4

INTERFANT 99MLL-AF4

LAL DU NOURRISSON : 80% MLL+

LAL DU NOURRISSON : INTERFANT 06

Risque faible - MLL-

Haut Risque - MLL+

- âge <6 mois - GB >300 G/L ou mauvaise réponse aux corticoïdes

Risque intermédiaire : - autres MLL+

RECHERCHE DE MARQUEURS CLONO-SPECIFIQUES

Q3 (choix simple) - La décision de greffe dépend du résultat de

la maladie résiduelle, avec un seuil à 10-4. Quel va être

votre choix de première intention pour le suivi de la

maladie résiduelle?



3. Suivi par cytométrie de flux


LAL DU NOURRISSON

INTERFANT 06

Cible MRD :

point de cassure

génomique de MLL

Cible MRD :

réarangements des

gènes IG/TCR

LAL du nourrisson

MLL+ MLL-

80% 20%

• LAL souvent immature / biphénot*pique

• Réarrangements IG/TCR absents ou restreints à des sous-clones (risque de

faux négatifs)

• Suivi du transcrit de fusion : diversité des transcrits. Pas de standardisation,

interprétation délicate

• Suivi en CMF : possible mais pas de standardisation internationale


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


der 11

AFF1 (AF4)46%

Autre7%

MLLT1 (ENL)21%

MLLT3 (AF9)16%

EPS15 (AF1P)3%

MLLT10 (AF10)5%

MLLT4 (AF6)2%




(11q23) par long-distance inverse PCR

(LDI-PCR) (R Marshalek, D)


Amorce MLL Amorce X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


der 11

AFF1 (AF4)46%

Autre7%

MLLT1 (ENL)21%

MLLT3 (AF9)16%

EPS15 (AF1P)3%

MLLT10 (AF10)5%

MLLT4 (AF6)2%

Sonde TaqMan

S*stème Q-PCR patient spécifique

Spécificité

Robustesse (ADN)

Domaine de quantification : 10-4

Applicabilité : >70% des patients MLL+




(11q23) par long-distance inverse PCR

(LDI-PCR) (R Marshalek, D)

2) Choix d’amorces encadrant le point de

cassure +/- sonde TaqMan

3) PCR quantitative en temps réel

Positif non quantifiable :

Expression / QR

Négatif

Expression / SR

Pas d’indication

de greffe

Rechute méningée isolée

À J1 du traitement

d’entretien

(ponction s*stématique)

Indication de greffe

The target

Jak2

STAT5

STAT5

PP

P

1

22

33

1 Gab2

P

P STAT5

*1002

*694

TKI

Drug targeted pathwa*s

CD20, …

Phosphoproteins (phospho-FCM)

Oncogenic markers

Breakpoint specific Q-PCR

✓ Robustness (DNA)

✓ Specificit* (SR ≤10-4; QR 10-4)


(initiating lesion)


TaqMan probe

Der(11) MLL fusion partner

IKZF1 intragenic deletions

(drug-resistant cell subset)

1 2 3 4 5 6 7

1 2 7IKZF4-7

TaqMan® probe

Be*ond the technique used…

MRD DANS LES LAL


Nouvelles méthodes

• “PCR universelle”: Séquençage

haut débit des réarrangements

IG/TCR (NGS) (>1 million lectures

avec des amorces consensus)

Nouvelles cibles

• Marqueurs oncogéniques

identification et suivi de sous-

clones résistants au traitement


Autre

93%

IKZF1 (Δ4-7)

7%

3

Oncogenic markers






1 3 4 5 6 8

1 2 8IKZF4-7

TaqMan® probe

QUALIT* CONTROL WITHIN EURO-MRD

Positive

1.00E-05

1.00E-04

1.00E-03

1.00E-02

Mean

QR: 5x10-4

RQ-PCR anal*sis of a follow-up sample using provided primers/probe set

→ MRD level differs less than 2-fold between various laboratories

MRD-PCR laboratories

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

Results 7th ESG-MRD-ALL Qualit* Control Round; Spring 2005

ESGMRDALL

BFM-AIEOP

ALL-2000

DCLSGALL9

Interfant99

MRC-ALL 97/99UKALL-R3

COALL-06-97

FRALLE2000

EORTC-CLG 58951

NOPHOALL-2000

(pre-)BMTALL

adultALL

GMALL06/99

adult ALLLALA 2000

adult ALLUKALL XII

adult ALLPETHEMA/

GETH

RQ-PCR anal*sis of Ig/TCR

gene rearrangements

RQ-PCR anal*sis of fusion

gene transcripts

(BCR-ABL, etc…)

Flow c*tometr*

Applicabilit* Wide

B-lineage and T-ALL

(90-95%)

<30%

Depends on the marker

Wide

B-lineage and T-ALL

(80-95%)

Sensitivit* 10-4 to 10-5 10-3 to 10-5

Depends on RNA input

(qualit*/quantit*)

3- to 4-color: 10-3 to 10-4

6- to 9- color: 10-4 to 10-5

Depends on cell input

Quantitative

range

10-3 to 10-4 To be defined To be defined

Biological

material

DNA (stabilit* +++) possibilit* of centralised and

retrospective anal*ses

RNA (unstable) Fresh cells

1st step cannot be easil*

centralised or tested

retrospctivel*

Marker stabilit* Oligoclonalit*

Clonal evolution

+

Leukemia specific

Immunophenot*pic shifts

Standardization High level In process In process

Cost +++ + +++

METHODS FOR MRD QUANTITATION IN ALL

RQ-PCR anal*sis of Ig/TCR

gene rearrangemnts

RQ-PCR anal*sis of fusion

transcripts (BCR-ABL, etc…)

Flow c*tometr*

Pros • Most published data for

evidence based treatment

decisions

• Well established

stratification tool

• Universal markers

• Follow-up of a treatment

target (BCR-ABL, …)

• Quantitative

• Additional infos on

benign cells or malignant

cells

• Follow-up of a treatment

target (CD20, …)

Cons • Patient-specific markers:

• Time-consuming (cannot

be used for ver* earl* time-

points)

• Variations in expression

levels (relationship with cell

number)

• Risk of false positivit*

(contaminations)

• Changes in precursor B-

compartment during

regeneration

• Extensive expertise

necessar* for ≥6-color flow

c*tometers

Conclusion Remains the gold standard

for multicenter protocols

Challenged b* DNA oncogenic

markers (genomic

breakpoint, …)

Still in learning process

(room for improvement)

METHODS FOR MRD QUANTITATION IN ALL

MRD term Proposed definition Remarks

Remission assessement

Complete MRD response Minimal technical requirements

fulfilled and MRD negativit*

Treatment modifications depending on

these measurements are recommended to

be based on anal*sis of at least 2 samples

MRD persistence Minimal technical requirements

fulfilled and quantifiable MRD

positivit* for at least 2 time-points

Time-point should be specified in the

protocol. At least one relevant treatment

element should be administered in-

between

Post-remision monitoring

MRD reapparance Minimal technical requirements

fulfilled and conversion after MRD

negativit* to quantifiable positivit*

Treatment modifications depending on

these measurements are recommended to

be based on anal*sis of at least 2 samples

Relapse Usuall* c*tologicall* defined Can be equated with « MRD

reapparance » onl* in protocol that

evidenced invariable association between

both

DEFINITIONS OF MRD TERMS IN ALL

Workshop on MRD assessment in ALL – Kiel, German*

(Brüggerman et al., 2010)

Study group I-BFM-SG BFM-AUSTRIA NOPHO EORTC ST-JUDE

Treatment protocol ALL-BFM 90/ AEIOP ALL91/ DCLSG – ALL8

ALL-BFM 95 NOPHO ALL MRD 95 EORTC protocol 58881 Total Therapy Study XIIIAand XIIIB

Induction intensitybefore MRD sampling

Standard (PRED + Mtx i.th.+ VCR + DAUNO + L-ASP)

Standard (PRED + Mtx i.th.VCR + DAUNO + L-ASP)

Standard (PRED + Mtx i.th.VCR +DOXO + L-ASP)

Standard (PRED + Mtx i.th.VCR +DOXO + L-ASP)

Intensive (Mtx + PRED +VCR + Dauno + L-ASP +VP-16 + Ara-C + triple i.th.)

Number of patients 169 98 100 151 165

Relapse rate 27% at 5 years 12% at 3.5 years 15% at 4 years 21% at 3 years 16.3% 3.5% at 4 years

Technique Ig/TCR PCR Flow cytometry Ig/TCR PCR Ig/TCR PCR Flow cytometry

Standardization multi-center single-center single-center multi-center single-center

MRD time point at theend of inductiontreatment

5 weeks 5 weeks 4 weeks 5 weeks 6 weeks

MRD status at the endof induction treatment

Distribution% (No.)

Relapse rate% (No.)

Distribution% (No.)

Relapse rate% (No.)

Distribution% (No.)

Relapse rate% (No.)

Distribution% (No.)

Relapse rate% (No.)

Distribution% (No.)

Relapse rate% (No.)

MRD-negative 42% (71) 3% (2) 60% (59) 7% (4) 66% (88) 8% (7) 75% (123) 7% (9)

MRD 10-4 20% (33) 24% (8) 5% (5) 20% (1)

53%

(53) 2% (1)

12% (19)

MRD 10-3 22% (38) 39% (15) 32% (31) 16% (5) 32% (32) 28% (9)

23%

(30) 17% (5)

8% (14)

30%

MRD 10-2 16% (27) 74% (20) 3% (3) 100% (3) 15% (15) 33% (5) 11% (15) 73% (11) 5% (9) 72% 21%

Combined two time points Combined two time points Single time point Single time point Combined two time pointsRisk groupclassification

Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate

MRD-based LRG 43% (55) 2% (1) 40% (40) 0% 79% (123) 7% (9)

MRD-based IRG 43% (55) 24% (13)

90%

(94)

3%

(3) 89%

(118) 10% (12)

9% (14) 7% (1)

MRD-based HRG 15% (19) 84% (16) 10% (10) 100% (10)

60%

(60)

25%

(15)11% (15) 73% (11) 12% (18) 56% (10)

MRD : LARGE PROSPECTIVE STUDIES IN CHILDHOOD ALL

JJM Van Dongen., personal communication

Marqueurs de maladie résiduelle

• Nécessité d’homogénéiser la présentation des résultats

• Transcrits oncogéniques : pathologies différentes

• Nécessité de corrélations cliniques pour chaque marqueur

• Les données issues de l’étude des IGH/TCR ne peuvent pas être extrapolées!

• Protocoles nationaux ou internationaux : standardisation des techniques (accréditation)

MRD AFTER INDUCTION IS THE STRONGEST PREDICTOR OF PROGNOSIS

IN INTERMEDIATE RISK RELAPSED ALL – ALL-REZ BFM P95/96 TRIAL

Eckert, Eur J Cancer 2011

Bruggerman et al., 2012

MRD AS AN INDICATOR OF IMPENDING RELAPSE

➢ Should molecular relapse be regarded as an overt ALL relapse? (Initiate salvage

therap* prior to hematologic relapse with a lower tumour burden)

➢ If *es, at which level of MRD?

Whether treatment in molecular relapse is more effective

than in overt relapse is still to be proven.

GMALL trial: conversion to quantifiable MRD positivit* during earl* post-

consolidation is highl* predictive of subsequent relapse.

Q4 (choix multiple) – les écueils liés au prélèvement

• Dans une LAL de lignée B, la proportion de cellules leucémiques est


• Si le prélèvement de moelle de suivi a été oublié, il peut être


• L’hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de


• Une hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de


Gamme SENI – 50µL ; 500ng ;

duplicat - Dilutions

10-2 10-3

5.10-

410-4

Maladie résiduelle et Séquençage de Nouvelle Génération (NGS)

Maladie résiduelle et Séquençage de Nouvelle Génération (NGS)

Technique : PCR Multiplexe (s*stèmes identiques à ceux utilisés en PCR/anal*se de fragment), puis incorporation des barcodes et adaptateurs pour NGS (séquençage sur les plateformes PGM-Ion Torrent ou Miseq-Illumina)


Au diagnosticIdentification des réarrangements clonauxSéquence simultanée de ces mêmes réarrangements, obtenues donc en

#1 semaine (plus de séparation sur pol*acr*lamide, plus de séquence à lancer une à une)

Séquence de l’ensemble des réarrangementsAnal*se bioinformatique permettant l’identification des régions V-D-J

Application sur les prélèvements au suivi Sensibilité de 10 4 à 10 6 (fonction de la quantité initiale d’ADN)Quantification possible par rapport au diagnostic/contrôle interneAbsence de mise au point de s*stèmes patients spécifiqueSuivi de l’ensemble des marqueurs

avantage si oligoclonalitéavantage si évolution clonale

1) Identification et séquençage des

réarrangements Ig/TCR présents dans

les cellules leucémiques de chaque

patient

2) Design d’une ASO pour Q-PCR

3) Courbe de calibration (dilutions en

série des blastes du patient dans des

cellules mononucléées pol*clonales)

DV J


or

PCR ALLELE-SPECIFIQUE EN TEMPS REEL


V J


Protocoles EORTC

INTEGRATION DE LA MRD POUR DEFINIR LE RISQUE

• Intensité du traitement basée sur la MRD

(Intensification si MRD élevée +/- désescalade si bas niveau de MRD)

• Indication d’allogreffe de moelle

Prephase Ia

MRD 10-2

VANDAIb’

Ib IIa+bInterval Maintenance

Interval

(3 courses)MaintenanceBlocks R1 R2 R3 (x2)

MRD

(D35)

Risque

Standard

et bas risque

Haut risque

VHRBMT-MSD

*AN, 3 ans

NEXT GENERATION SEQUENCING

OF IG/TCR REARRANGEMENTS

▪ PCR Multiplex

▪ (s*stèmes identiques à ceux utilisés en

PCR/anal*se de fragment),

▪ Incorporation des code-barres et

adaptateurs pour NGS

▪ séquençage sur les plateformes PGM-Ion

Torrent ou Miseq-Illumina)


V J P7IdIdP5

Index

Amorces d’amplification


(attachement à la flow cell)

Amplicon

Au diagnostic : Identification des réarrangements clonaux

▪ Séquence simultanée des réarrangements, (#1 semaine)

▪ Anal*se bioinformatique permettant l’identification des régions V-D-J

ANALYSE BIOINFORMATIQUE

L*mphoTrack® Dx MiSeq Data Anal*sis (Kits IGH, TCRG) Invivoscribelogiciel d’anal*se spécifique, macro Excel, 1 échantillon par anal*se

visualisation graphique des réarrangements majoritaires

séquence des réarrangements majoritaires, avec anal*se des segments V et J

Logiciel Vidjil (développé à Lille, accès en ligne, tous réarrangements)

BMC Genomics, 15:409, doi:10.1186/1471-2164-15-409

interface web (compte utilisateur)

visualisation graphique des réarrangements majoritaires

accès à la séquence du réarrangement sélectionné

identification des régions V,D,J

liens pour anal*se de la séquence sur IMGT/V-QUEST, IgBlast, Blast

possibilité de lier plusieurs échantillons à un patient : cinétique

NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC DE LAL

18900, LAL pré pré B, h*perleucoc*taire, B-other45, XX, der(7) t(7;11) (q2?2;q1?3), der(9) t(9;11)(p13;p?11), -11, ?der(12)del12)(p13) [11]Bon répondeur à la préphase (J8)

Recherche de réarrangements Ig/TCR classique : 1 VH1-DH4-JH4 / 1 VH6-DH3-JH2

Visualisation L*mphoTrack VisualisationVidjil

16536, LAL pré B, absence de transcrits46,XX,del(9)(p10)[5]/46,XX[10]Seul le locus IGH présente des réarrangements, mais oligoclonalité marquée (VH3, VH4, VH6)4 des réarrangements ont une région DJ commune et sont suivis simultanément

Visualisation L*mphoTrack

SANGERRéarrangement VH3 : échec de séquence des allèles à 323, 324 pb (double séquence)Région DJ (DH3JH6) commune aux réarrangements VH4 et VH6

VisualisationVidjil

NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC

Echantillon pol*clonal

Visualisation L*mphoTrack VisualisationVidjil

NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC

▪ Suivi de l’ensemble des clones tumoraux

▪ Tableau du répertoire B des cellules normales (niveau de diversité, …)

NGS IG-TCR POUR LE SUIVI DE LA MALADIE RÉSIDUELLE

MRD DANS LES LAL


Nouvelles cibles





▪ Points de cassure génomiques

des translocations



Oncogenic markers





(initiating lesion)


TaqMan probe

Der(11) MLL fusion partner

80% des LAL du nourrisson

MRD DANS LES LAL


Nouvelles cibles





▪ Points de cassure génomiques

des translocations



Autre

93%

IKZF1 (Δ4-7)

7%

3

Oncogenic markers






1 3 4 5 6 8

1 2 8IKZF4-7

TaqMan® probe

MRD DANS LES LAL


La PCR digitale en gouttelettes


▪ Discrimination allélique (sondes allèle-spécifiques marquées par un

fluorochrome)

▪ Remplace le signal exponentiel (analogue) de la PCR conventionnelle)

en signal digital (linéaire)

▪ Sensibilité dépend du nombre de compartiments (puits/gouttelettes)

et de la quantité d’ADN

Détection de mutations rares parmi des allèles sauvages

10-2 10-3 5.10-4 10-4

PCR DIGITALE EN GOUTTELETTES

Raindrop® s*stem (Raindance technologies)

Exemple d’une mutation ponctuelle d’IKZF1

t(A;B)

t(A;B)

t(A;B)t(A;B) Mutation

sélection

Cellule

progénitrice

Cellule

pre-leucémique


t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmutt(A;B)

del(C)

Xmutt(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)t(A;B)

del(C)

t(A;B)

del(C)

t(A;B)

del(C)

t(A;B)

del(C)

Xmut

ou

Rechute

Chimioresistance +

MRD+

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmutt(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

MRD+TRAITEMENT

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

t(A;B)

del(C)

Xmut

MRD(-)

t(A;B)

del(C)

Xmut

MARQUEUR, MRD ET HISTOIRE NATURELLE DES RECHUTES


t(A;B)

t(A;B)

t(A;B)t(A;B)

Mutation

sélection

Cellule

progénitrice

Cellule

pre-leucémique


t(A;B)

del(C)t(A;B)

del(C)

t(A;B)

del(C)

t(A;B)

del(C)

t(A;B)

del(C)

Xmut

TRAITEMENT

MRD(-)

t(A;B)

Add(F)

Pmut

t(A;B)

Add(F)

Pmut

t(A;B)

Add(F)

Pmut

t(A;B)

Add(F)

Pmutt(A;B)

Add(F)

Pmut

Rechute

Chimiorésistance +/-

Dup(V)

Kmut

Dup(V)

Kmut

Dup(V)

KmutDup(V)

Kmut

2nde LAL

[0,5-1,5%]Protocoles

t*pe BFM


BCR-ABL

BCR-ABL

BCR-ABLBCR-ABL

Initiating

cell

Pre-leukemic cell

BCR-ABL

del(C)

IG/TCR; MFC

BCR-ABL

Xmut

BCR-ABL

Xmut

BCR-ABL

Xmut

Additional

alterations

Leukemia cells

BCR-ABL

XmutBCR-ABL

Xmut


BCR-ABL

Xmut

IKZF1


Toutes les cibles ne sont pas ph*sio-pathologiquement équivalentes


BCR-ABL

BCR-ABL

BCR-ABLBCR-ABL

Initiating

cell

Pre-leukemic cell

BCR-ABL

del(C)

IG/TCR; MFC

BCR-ABL

Xmut

BCR-ABL

Xmut

BCR-ABL

Xmut


Additional

alterations

Leukemia cells

BCR-ABL

XmutBCR-ABL

Xmut

Evolution of a

pre-leukemic clone

BCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

CDKN2A

PmutBCR-ABL

CDKN2A

Pmut

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

Selection of a minor

resistant subclone

(52%)

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1BCR-ABL

Xmut

IKZF1

BCR-ABL

Xmut

IKZF1


Thank you for your attention

UTILISATION LIMITEE DES TRANSCRITS DE FUSION

POUR SUIVRE LA MALADIE RESIDUELLE DANS LES LAL

MLL-t

CALM-AF10

TCR-HOXA

TLX1/HOX11

TLX3/HOX11L2

SIL-TAL1, L*L1, TAL2, +/- LMO1, LMO2

TCR-M*B

ETV6-RUNX1

Hyperdiploidy (25%)

MLL (10%)


E2A-PBX1 (5%)MYC (2%)

CRLF2 (6%)

Childhood B-lineage ALL

T-ALL

NB: utilisé pour LMC (BCR-ABL), LAM3 (PML-RARA)

Documents

Mesurer la maladie résiduelle dans les LALaihemato.cluster013.ovh.net/AIH/documents/Cours DES/DES 2019-04-12/H... · Journée nationale du DES d’Hématologie clinique Mesurer la