M.C. Productos Naturales y Alimentos

Métodos Instrumentales Modernos

Espectrometría de Masa

Analizadores

Dr. Raúl Salas Coronado

1

Analizadores en

espectrometría de masa

2

Tipos de analizadores usados en

espectrometría de masa

3

Las cinco principales características para medir

el desempeño de un analizador de masa

1. Límite del intervalo de masa

2. Velocidad del análisis

3. Transmisión

4. Exactitud de la masa

5. Resolución

4

Resolución

5

El término resolución se usa frecuentemente en MS. En general, los

espectrómetros de alta resolución son aquellos que pueden separar y detectar

iones que tienen valores muy similares.

m/z < 500, esto significa difieren por menos de 0.001 unidades.

Un espectrómetro de baja resolución solamente puede distinguir unidades

enteras de m/z.

El término M/M se define como la resolución del instrumento y el inverso de

este valor se define como el poder de resolución (M/M)

Diagrama mostrando los conceptos de

resolución de picos y valle

6

Trazo de la izquierda: Definición de m a una altura dada del pico. Trazo de la

derecha: Relación entre las dos definiciones de resolución, relación de amplitud total a

x% de la altura del pico o resolución a y% del valle. El fondo del valle es la suma de las

intensidades en la intersección, y = 2x.

7

Comparación de analizadores de masa

8

Analizador Electrostático

(de sector eléctrico)

Un analizador electrostático es un dispositivo

focalizador de energía. La energía ganada por

los iones acelerados desde la fuente de iones es

zV (=1/2*mv2). En el sector eléctrico la fuerza

centrífuga que actúa sobre los iones es:

zV = ½*mv2

Ahora si:

E = Potencial eléctrico (voltaje) entre las placas

interna y externa.

R = Radio de curvatura de la trayectoria del

ion.

zE = mv2/R

m/z = v2/R*E

9

Analizador de sector magnético

10

En un campo magnético, un ion con masa m, experimentará una fuerza

centrípeta (un “empuje” hacia el centro del círculo) igual a Bzv, donde B =

fuerza del campo magnético, z = carga del ion, v = velocidad del ion. Al mismo

tiempo cualquier partícula que se mueve en un círculo con radio r se mueve

alejándose del centro del círculo, igual a mv2/r. El grado de desviación de la

trayectoria del ion

zV = Energía potencial

Espectrómetro de masa de alta resolución

11

El analizador electrostático focaliza la energía cinética del haz de iones conforme salen del

analizador de sector magnético. Esto permite la separación de valores de m/z que difieren

por menos de 0.001. La capacidad de separación del instrumento es determinado por el

tamaño de la abertura de la ranura.

Analizadores cuadrupolares de transmisión

El analizador cuadrupolar es un dispositivo que usa la estabilidad de las trayectorias en un

campo eléctrico oscilante para separar iones de acuerdo a su relación m/z.

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Analizador cuadrupolar de transmisión

El generador de RF produce una onda sinusoidal que

tiene una amplitud variable U y una frecuencia w

que se conserva constante. El generador dc produce

un voltaje V que alterna en signo.

Las ecuaciones para los cuadrupolos son complejas.

La obtención de éstas involucra la derivación

completa de las ecuaciones que describen los

movimientos de los iones en campos eléctricos y

magnéticos combinados.

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U = voltaje del campo de RF aplicado

V = voltaje de dc aplicado

r = radio del círculo formado por la superficie interna del cuadrupolo

w = radiofrecuencia aplicada

Diagrama de estabilidad para

espectrometría de masa cuadrupolar

14 a y q no tienen un significado físico

Movimiento y, z inestable

Intervalo de valores

de a estables

Intervalo de valores

de q estables

Movimiento x, z

inestable

V = 0-200 V

U = 0-1200 V

Para m/z = 0-800

El límite superior de m/z

está determinado por por la

onda de RF.

Tryectorias estables e inestables de iones en

un cuadrupolo

15

Carácterísiticas principales de multipolos

diferentes

16

Diagrama de un instrumento de triple

cuadrupolo

17

El primero y último cuadrupolo (Q1 y Q3) son analizadores. El cuadrupolo del

centro, q2, es una celda de colisión fabricada de un cuadrupolo usando solo

radiofrecuencia.

Otra vista del triple cuadrupolo

18

Diferentes modos de barrido para un

espectrómetro de masa en cascada (tandem)

19

Analizador de trampa de iones

20

En las trampas de iones, los iones son

atrapados en un pozo de potencial. El

espectro de masa se adquiere por la

expulsión de iones desde el pozo de

potencial en orden ascendente de m/z.

• Voltaje de radiofrecuencia

• Gas amortiguador

• Presión de 1 mtorr de helio

• La eficiencia del atrapamiento se

incrementa al configurase para que

coincidan la amplitud del voltaje de

radiofrecuencia con la energía de los

iones

Vista esquemática de una trampa de iones

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Las ecuaciones son similares al analizador

cuadrupolar de transmisión, excepto que

están relacionadas al movimiento que es

perpendicular a las superficies de las tapas

de los extremos (definida como la

dirección z).

Trampa de iones con un voltaje de radiofrecuencia

aplicado al electrodo anular

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Espectrometría de masa en cascada en trampas

de iones

Hay varias maneras de realizar espectrometría de masas en cascada en una

trampa de iones.

1. Seleccionar iones de una relación m/z determinada, expulsando el resto

desde la trampa de iones.

2. Conservar esos iones fragmento. La energía es proporcionada por colisiones

con el helio, el cual está siempre presente. Esta fragmentación puede

mejorarse por excitación de los iones seleccionados por irradiación a su

frecuencia.

3. Analizar los iones por uno de los métodos de scanning (barrido): Límite de

estabilidad o expulsión resonante.

4. Alternativamente, seleccionar un fragmento en la trampa, y dejar este

fragmento un tiempo adicional. Esta etapa puede repetirse para

proporcionar espectros MSn.

23

Expulsión resonante de un ion de 100 Th

24

Los iones de una m/z dada tienen una frecuencia

de oscilación característica a lo largo tanto de r

como de z. Superponiendo sobre el potencial RF

fundamental un potencial de AC, con una

frecuencia igual a la de la oscilación característica

de un ion, la energía se transfiere al ion a través de

resonancia.

En este ejemplo, se eligió una frecuencia de 160

kHz. La trayectoria del ion a lo largo de z se

desestabiliza.

Este modo resonante permite la expulsión de los

iones de masa alta.

Secuencia de operaciones controlada por computadora

para llevar a cabo un experimento MS/MS/MS en una

trampa de iones.

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A. Ionización electrónica del gas ionizante.

B. Sintonización correcta de los voltajes de DC

y RF.

C. Protonación del analito por 200 ms.

D. Selección del ion precursor.

E. El voltaje se incrementa para seleccionar un

intervalo de masa y observar los fragmentos.

F. Excitación resonante para fragmentar los

iones precursores seleccionados.

G. Uno de los fragmentos se selecciona.

H. Excitación resonante para fragmentar este

fragmento.

I. Barrido de masa para observar la segunda

generación de fragmentos.

Analizadores de Tiempo de Vuelo

El concepto de los analizadores de tiempo de vuelo fue descrito por Stephens en 1946.

Wiley y McLAren en 1955 publicaron el diseño de un TOF lineal el cual llegó a ser el primer

instrumento comercial. El interés en este instrumento se renovó en los años 1980’s.

Primero, debido a los progresos en dispositivos electrónicos simplificados para el manejo de

flujo de datos alto. Segundo, los analizadores TOF son bastante adecuados para la naturaleza

pulsada de la ionización por desorción con láser (LDI) y MALDI.

26

Fuente de

iones Tubo de deriva

0.5-2.0 m

D

Detector

Separación de iones en un TOF

La separación de iones en un TOF está basada en el principio que los iones que tienen una

energía inicial igual tendrán velocidades que son proporcionales a sus valores m/z. En la

fuente de iones de un TOF, los iones de todos los valores de m/z se forman casí

simultáneamente usando un breve ráfaga de energía desde el filamento. Este método de

ionización es llamada ionización de pulso. Esos iones se aceleran posteriormente usando un

potencial eléctrico positivo V. Los iones adquieren una energía expresada como zV. En el

tubo de vuelo del espectrómetro, toda esa energía se convierte en movimiento, energía

cinética. El ion más masivo es el más lento.

La velocidad del ion durante su viaje a través del tubo de vuelo es simplemente la longitud

del tubo de vuelo D dividido por el tiempo.

27

m/z = 2V(t/D)2

Funcionamiento de un TOF

(a) Un pulso de iones se forma y es

acelerado hacia el exterior de la

fuente.

(b) Los iones inician su entrada a la

región de deriva.

(c) Después de un tiempo corto.

(d) Los iones se separan de acuerdo a

sus valores de m/z.

(e) Los iones con valores más pequeños

se mueven más rápido arribando

primero al detector.

28

Resolución de un TOF

Generalmente, el poder de resolución de un TOF está limitado, particularmente a masas altas: una inherente a la técnica y la otra a un problema práctico. Primero, el tiempo de vuelo es proporcional a la raíz cuadrada de m/z. La diferencia en los tiempos de vuelo (tm y tm+1) para dos iones separados por unidad de masa está dado por:

29

Efecto de la masa sobre la dispersión para iones

individuales con valores promedio m/z

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(a) Cada conjunto de iones a un valor de m/z tendrá

una dispersión en términos de velocidad debido a

que no todos se forman exactamente en el mismo

lugar en la fuente de iones.

(b) Dos conjuntos iones separados por una unidad de

masa (m, m+1) traslapados debido a que los iones

más lentos de masa más pequeña se traslapan con

los iones más rápidos de masa más grande.

(c) Para valores más grandes de m/z, este efecto

conduce a la desaparición casi total de la

resolución.

(d) A valores más grandes de m/z, con diferencias de

200 o más, los iones se separan.

31

Dispositivos focalizadores de tiempo

La resolución de los analizadores TOF está limitada por la dispersión en la

velocidad inicial. Sin embargo, un dispositivo poderoso que puede compensar

esta distribución de velocidad, y que es la técnica más ampliamente utilizada

hoy en día, se trata del reflector de iones electrostático (espejo electrostático) y

focalizador de tiempo-latente (extracción retardada). El reflector fue introducido

por Mamryn et al. (1973).

Espectrómetro de masa de tiempo de vuelo

(TOF) con reflectrón

32

El reflectrón consiste de una serie de electrodos

anulares, en cada uno de los cuales se coloca un

potencial eléctrico. El primer anillo tiene el más bajo

pencial y el último el más alto para producir un

campo electrostático.

Este campo está al final del camino de vuelo de los

iones y tiene la misma polaridad que la de los iones.

En el reflectrón los iones llegan a detenerse y

después se aceleran en dirección opuesta.

Los iones más rápidos pasan más tiempo en el

reflectrón que los iones más lentos.

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En un orbitrap, los iones son inyectados tangencialmente en un campo eléctrico entre dos

electrodos y quedan atrapados porque su atracción electrostática hacia el electrodo interior

es contrarrestada por la fuerza centrífuga. Así los iones dan vueltas alrededor del electrodo

central. Adicionalmente los iones también se mueven delante y detrás a través del eje del

electrodo central. Así, los iones con una relación masa-carga específica se mueven en anillos

que oscilan alrededor del huso central, la frecuencia de estas oscilaciones armónicas es

independiente de la velocidad del ion y es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la

relación masa-carga (m/z).

Analizadores orbitrap

Detectores

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Colectores de (a) punto de iones y de

(b) matriz de iones

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(a) Colector de punto de iones. El haz de iones se focaliza a un punto, y los iones de

diferente valor m/z al colector secuencialmente en el dominio del tiempo.

(b) Colector de matriz de iones. El haz de iones se dispersa, y todos los valores de m/z

se registran simultáneamente en un dominio de espacio.

Usos de los colectores de iones

Analizadores cuadrupolares de transmisión usan colectores de punto de iones.

Analizadores magnéticos, de trampa de iones y de TOF pueden utilizar colectores de punto y

de matriz de iones.

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(a) Iones de diferentes valores de m/z

atraviesan un cuadrupolo uno después

de otro.

(b) El haz de iones se dispersa en el

espacio, cada valor de m/z se enfoca a

un punto que está en un plano focal.

Se puede utilizar una placa fotográfica

o un detector de matriz que está a lo

largo de un plano focal.

(c) El mismo haz de iones dispersado

como en (b) se focaliza en un punto

cambiando la fuerza del campo

magnético, por lo que únicamente se

requiere un colector de punto de

iones.

Copa de Faraday

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Los iones de carga eléctrica positiva o negativa, arriban a una placa metálica con toma

de tierra, y son neutralizados ya sea aceptando o donando electrones. El flujo resultante

de electrones constituye un pequeño flujo de electrones que se puede amplificar y

usarse para registrarse en un dispositivo. En lugar de usar una placa se puede utilizar

una copa colectora (Faraday) que necesita un electrón para neutralizar un ión pero

ocasiona que varios electrones sean emitidos; esto proporciona una amplificación. El

detector de copa de Faraday es simple y robusto, y se usa cuando no se requiere una

sensibilidad alta.

Multiplicador de electrones

Cuando un ión viaja a velocidad alta y golpea una superficie metálica ocasiona que un

número de electrones sean expulsados. Este principio se utiliza en el multiplicador de

electrones.

Los iones se dirigen hacia una primera placa (dínodo) de un multiplicador. Los electrones

expulsados se aceleran en un potencial eléctrico y golpean un segundo dínodo. Suponga que

la colisión de cada ión ocasiona que diez electrones sean expulsados, y que cada uno de esos

electrones en un segundo dínodo ocasione que diez electrones sean expulsados a un tercer

dínodo. Los multiplicadores de electrones comerciales tienen 10, 11 ó 12 dínodos por lo que

amplificaciones de 106 son fácilmente disponibles.

38

Detector multiplicador de electrones de dínodo continuo

39

El número total de electrones expulsados depende de la ganancia del multiplicador, la cual

está en función de la diferencia de potencial entre la entrada y salida de la superficie del

multiplicador.

Centellador

Un centellador, algunas veces conocido como detector de Daly, es un colector de iones que

es especialmente útil para estudios de iones metaestables.

El principio de operación, consiste en poner en contacto el haz de iones con un primer

dínodo que ocasiona la emisión de electrones que son acelerados y dirigidos a un segundo

dínodo. Este díno consiste de una sustancia (un centellador) que emite fotones (luz). La luz

emitida es detectada por un fotomultiplicador.

40

Elección del espectrómetro de masa

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