Niš, 2015.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jelena S. Conić

Uticaj vodenog ekstrakta Hypericum rumeliacum Boiss. na ćelije kostne srži i

eritrocite pacova Wistar u in vitro uslovima

Master rad

Niš, Septembar, 2015

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj vodenog ekstrakta Hypericum rumeliacum

Boiss. na ćelije kostne srži i eritrocite pacova Wistar u

in vitro uslovima

Master rad

Kandidat Mentor

Jelena Conić 142 Dr Perica Vasiljević

Niš, Septembar, 2015

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The effect of Hypericum rumeliacum Boiss. water extract on

bone marrow cells and periferal blood erythrocytes of

Wistar rat in in vitro conditions

Master thesis

Candidate Mentor

Jelena Conić 142 Dr Perica Vasiljević

Niš, Septembar, 2015

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Jelena Conić je rođena 26. 07. 1991. godine. Osnovnu školu "Radoje

Domanović" u Nišu završila je 2006. godine. Gimnaziju "Bora Stanković",

prirodno-matematički smer, završila je 2010., takođe u Nišu.

Iste godine upisala je osnovne-akademske studije Prirodno-matematičkog

fakulteta u Nišu, na departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne studije završila

je 2013. godine i upisala master studije na istom fakultetu, smer biologija. Zvanje

"master biolog" dobija 2015. godine.

ZAHVALNICA

Veliku zahvalnost dugujem svom mentoru, prof. dr Perici Vasiljević, zbog velike pomoći i

strpljenja.

Takođe, izrazila bih zahvalnost i asistentu Mileni Aleksić, kao i stručnom-saradniku

Andrei Žabar, na ukazanoj pomoći u toku izvođenja eksperimentalnog dela rada.

Na kraju, najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici koja mi je pre svega omogućila

školovanje i motivisala me u toku istog.

Hvala…

SAŽETAK

Vrste roda Hypericum su veoma značajne u tradicionalnoj medicini. Rod Hypericum

karakteriše značajno prisustvo sekundarnih metabolita, od kojih su najzastupljeniji

naftodiantroni, derivati floroglucinola i flavonoidi. Cilj ovog rada je ispitivanje uticaja vodenog

ekstrakta vrste Hypericum rumeliacum Boiss. na vijabilnost ćelija kostne srži, kao i njegova

protektivna uloga na membrane eritrocita periferne krvi pacova soja Wistar. Dobijeni rezultati

pokazuju da ispitivane koncentracije (1, 2, 3, 4 i 5 mg/ml) ne poseduju značajniji citotoksični

potencijal ali poseduju antihemolitički potencijal.

Ključne reči: Hypericum rumeliacum, citotoksična aktivnost, ćelije kostne srži, eritrociti,

antihemoliza.

ABSTRACT

Species of Hypericum genus are very important in traditional medicine. Genus

Hypericum is characteristic by its secondary metabolites that include naphtodiantrones,

phloroglucinol derivatives and flavonoids, as the most important. The aim of this study was to

examine the influence of water extract of Hypericum rumeliacum Boiss. species on bone marrow

cells viability, as well as its protective role on erythrocyte membranes of Wistar rat periferal

blood. Obtained results show that examinated concetrations (1, 2, 3, 4, 5mg/ml) do not express

significant cytotoxic activity, but features antihemolitic potencial.

Keywords: Hypericum rumeliacum, cytotoxic activity, bone marrow cells, erythrocytes,

antihemolitic activity.

Sadržaj

1. UVOD..................................................................................................................................................... 1

1.1. Rod Hypericum .................................................................................................................................. 1

1.1.1. Biološke karakteristike .................................................................................................................... 2

1.1.2. Rasprostranjenje .............................................................................................................................. 2

1.1.3. Hemijski sastav ............................................................................................................................... 2

Hipericin ............................................................................................................................................... 3

Flavonoidi ............................................................................................................................................. 5

Hiperforin .............................................................................................................................................. 9

2. CILJ RADA ................................................................................................................................................ 11

3. MATERIJALI I METODE ............................................................................................................................ 12

3. 1. MATERIJAL ...................................................................................................................................... 12

3.2. METODE ........................................................................................................................................... 12

4. REZULTATI I DISKUSIJA ........................................................................................................................... 18

4.1. Ispitivanje potencijalne antihemolitičke uloge vodenog ekstrakta H. rumeliacum.......................... 18

4.1.1. I eksperiment ............................................................................................................................. 18

4.2. Ispitivanje uticaja vodenog ekstrakta H. rumeliacum na vijabilnost ćelija kostne srži u in vitro

uslovima .................................................................................................................................................. 20

4.2.1. I eksperiment ............................................................................................................................. 20

5. ZAKLJUČAK ............................................................................................................................................. 23

6. LITERATURA............................................................................................................................................ 24

1

1. UVOD

1.1. Rod Hypericum

Rod Hypericum sadrži preko 450 vrsta koje su široko rasprostranjene na svim

kontinentima. Javljaju se kao zeljaste biljke, žbunovi i drveće, i prilagodjavaju se različitim

klimama, izbegavajući ekstremno sušna staništa sa visokim temperaturama, kao i staništa

visokog saliniteta (Crockket i Robson, 2011). U Srbiji se nalazi 18 zabeleženih vrsta (Nikolić,

2014).

Naziv roda potiče od grčke reči hyper –nad i eikon – pustara i označava biljku koja raste

na pustari, dok je u našem narodu poznatiji pod imenom kantarion ili bogorodičina trava

(Blattner i Borsch, 2011).

Vrste roda Hypericum odavno su poznate i korišćene u narodnoj medicini zbog svojih

antiinflamatornih, antibakterijskih i antiviralnih dejstava, kao i za lečenje opekotina i želudačnih

problema. Hypericum perforatum L. je najpoznatiji predstavnik ovog roda i koristi se za lečenje

blažih oblika depresije. Takođe, dosta pažnje se posvećuje i ostalim vrstama i istražuje se njihov

fitohemijski sastav, kao i biološka aktivnost (Marelli i sar., 2015).

Slika 1. Hypericum rumeliacum Boiss. (www.bgflora.net)

http://www.bgflora.net/families/hypericaceae/hypericum/hypericum_rumeliacum/hypericum_rumeliacum_2_en.htmlhttp://www.google.rs/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCNW4jZbjjcgCFcndLAodq1ECxQ&url=http://www.bgflora.net/families/hypericaceae/hypericum/hypericum_rumeliacum/hypericum_rumeliacum_2_en.html&psig=AFQjCNH1ZMYzMrSTFTyvVn_JlNxUeDEABQ&ust=1443118935217225

2

1.1.1. Biološke karakteristike

Pripadnici roda Hypericum su višegodišnje, ređe

jednogodišnje biljke (Nikolić, 2014). Karakterišu se naspramnim

listovima kojima nedostaju lisni zalisci, žutim cvetovima na vrhu

izdanaka, velikim brojem prašnika i prisustvom bledih ili tamnih

tačaka koje predstavljaju žlezde. Plod je uglavnom čaura koja sadrži

mala cilindrična svetlo braon ili crna semena (Blattner i Borsch,

2011).

Hypericum rumeliacum Boiss. je višegodišnja vrsta sa

rasprostranjenjem u jugoistočnoj Evropi, uglavnom na Balkanu

(Srbija, Makedonija, Grčka, Albanija) (Nikolić, 2014). Dostiže

visinu od 10 do 40cm. Na naličju lancetastih listova, kao i po obodu čašičnih i površini kruničnih

listića mogu se naći tamne tačke. Žuti cvetovi na vrhu stabljike formiraju štitolike cvasti. Čaura

sadrži bradavičaste uljane rezervoare, ali može biti i glatka (Stjepanović-Veselčić, 1972).

1.1.2. Rasprostranjenje

Hypericum je rasprostranjen na čitavoj severnoj hemisferi, delovima južne Amerike i

južne Afrike, i u jugoistočnoj Aziji, a nekoliko vrsta se može naći čak i u Okeaniji. Glavni centar

rasprostranjenja je u Palearktičkoj zoni gde se nalazi preko 45% vrsta. Drugi centar

rasprostranjenja je Neotropski sa 30% vrsta (Blattner i Borsch, 2011).

1.1.3. Hemijski sastav

Sekundarni metaboliti vrsta roda Hypericum se mogu podeliti u čak 10 klasa od kojih su

najzastupljeniji naftodiantroni (hipericin i pseudohipericin), floroglucinoli (hiperforin),

flavonoidi (rutin, hiperozid, izokvercitrin, kvercitrin, kvercetin, amentoflavon) i fenilpropanoidi

(hlorogena kiselina) (Marrelli i sar., 2015). Iako su istraživanja o sadržaju sekundarnih

metabolita rađena uglavnom na vrsti H. perforatum, smatra se da su ove hemijske supstance

karakteristične za ceo rod (Crockket i Robson, 2011).

Slika 2. List kantariona

(https://hr.wikipedia.org/wiki/Kantarion)

https://hr.wikipedia.org/wiki/Kantarion

3

Hipericin je prirodni pigment roda Hypericum i pripada klasi naftodiantronskih

glikozida. Molekulska masa mu iznosi 504,45 Da. Prirodni je fotosenzibilizator i vekovima je

korišćen za lečenje mentalnih poremećaja, a postoje zapisi i da se nekada koristio za lečenje

malarije, različitih povreda, opekotina i ujeda insekata. Danas je poznato njegovo antidepresivno

dejstvo i koristi se za lečenje anksioznosti i nesanice. Njegova najznačajnija primena u modernoj

medicini je u dijagnozi i lečenju kancera (Saw i Heng, 2011).

Slika 3. Hemijska struktura hipericina (http://www.google.com/patents/EP0432496B1?cl=en)

Hipericin fluorescira crvenom bojom kada je pobuđen specifičnom laserskom svetlošću.

Dva glavna maksimuma absorpcije i fotoaktivacionih vrhova se javljaju negde oko 550 i 600 nm.

Hipericin je slabo rastvorljiv u vodi. Generiše visoke količine singleta kiseonika i superoksida.

Smatra se da su hemijske grupe koje dovode do fotodinamičkih aktivnosti hipericina

semikvinoni, singleti kiseonika i superoksidni anjoni (Saw i Heng, 2011).

Fototoksičnost hipericina je do sada dosta proučena. On utiče na ćelijsku vijabilnost

preko različitih mehanizama, delujući na ključne proteine, vitalne enzime, membrane organela i

promene u ćelijskoj homeostazi. U zavisnosti od količine, kao i svetlosnih uslova, dovodi do

ćelijske smrti putem apoptoze i/ili nekroze (Theodossiou i sar., 2009).

Za hipericin i pseudohipericin je od skora poznato da poseduju antiretroviralnu aktivnost,

potencijalno i anti-HIV dejstvo. Hipericin i pseudohipericin su pokazali inhibitorni uticaj na

protein kinazu C iz mozga pacova, pri čemu hipericin ima manju IC50 vrednost od

pseudohipericina. Upravo ova inhibicija protein kinaze C omogućava njihovu anti-HIV

aktivnost, s obzirom na to da je ovaj enzim medijator u HIV-indukovanoj fosforilaciji CD4+

ćelija. Na isti način hipericin i pseudohipericin mogu delovati i na ostale retroviralne infekcije.

Antiretroviralno dejstvo hipericina jače je od istog dejstva pseudohipericina (Takahashi i sar.,

1989). Takođe, postoji mogućnost za njegovu upotrebu u lečenju drugih autoimunih bolesti koje

su posledica abnormalne citotoksične aktivnosti T limfocita, kao što je psorijaza (Lavie i sar.,

2000).

http://www.google.com/patents/EP0432496B1?cl=en

4

S obzirom na to da se inhibitorni uticaj hipericina na protein kinazu C dovodi u vezu i sa

sprečavanjem rasta ćelija glioma in vitro, sintetički hipericin je testiran na pacijentima koji imaju

neki progresivni oblik glioma i primili su terapiju zračenjem. Korišćen je rastvor hipericina koji

se primenjivao oralno svakog jutra tri meseca. Rezultati su pokazali da je došlo do određenog

smanjenja volumena tumora kod dva pacijenta, što je obećavajuće (Saw i Heng, 2011).

Hipericin se kao fotoaktivni pigment koristi u fotodinamičnoj dijagnostici (Saw i Heng,

2011), kao i fotodinamičnim terapijama kancera (Dougherty i sar., 1998).

Fotodinamična dijagnostika omogućava razlikovanje normalnih i tumorskih ćelija

zahvaljujući razlikama u njihovoj fluorescenciji. Npr. ćelije bešike mogu fluorescirati upotrebom

delta-aminolevulinske kiseline ili njenih derivata. Delta-aminolevulinska kiselina sama po sebi

ne fluorescira, ali inicira seriju biohemijskih reakcija koje dovode do akumulacije protoporfirina

i fotoaktivisanog porfirina. Razlika između tumorskih i normalnih ćelija je u tome što kancerske

ćelije akumuliraju znatno veće količine ova dva jedinjenja pa se pod mikroskopom vide u drugoj

boji. Pobuđivanjem, benigne ćelije emituju plavo-zelenu svetlost, dok se maligne vide crveno

(Jichlinski i Jacqmin, 2008). Upotreba hipericina u fotodinamičnoj dijagnostici pokazala je da

ovaj molekul ima veći senzibilitet (82%) od obične bele svetlosne citoskopije (62%). Takođe,

ustanovljene su i mnoge njegove prednosti u detekciji raka bešike u odnosu na prethodno

korišćenu delta-aminolevulinsku kiselinu (Saw i Heng, 2011).

Fotodinamične terapije podrazumevaju upotrebu neke fotosenzitivne supstance koja se

aktivira zračenjem i na taj način produkuje reaktivne kiseonične vrste koje na kraju dovode do

ćelijske smrti (Dougherty i sar., 1998). Dosadašnja istraživanja pokazala su da se hipericin može

uspešno koristiti za lečenje nekih oblika tumora (Vandenbogaerde i sar., 1998).

Fotoaktivisani hipericin dovodi do apoptoze ili nekroze HeLa ćelija in vitro. U jednom

eksperimentu pokazano je da indukcija apoptoze ili nekroze zavisi od koncentracije

fotoaktivisanog hipericina. Kod koncentracije od 125nM, doći će do oslabađanja citohroma c

koji aktivira niz molekula i dovodi do apoptoze ćelije. Pri koncentraciji od 1µM doći će do

nekroze. Međutim, s obzirom na pojačano oslobađanje citohroma c i u slučaju nekroze, daljom

analizom zaključeno je da niže koncentracije fotoaktivisanog hipericina, aktiviraju prokaspazu 3,

koja u stvari predstavlja ključni medijator u hipericin-indukovanoj apoptozi (Vantieghem i sar.,

1998).

Veliki potencijal hipericina u fotodinamičnim terapijama dokazan je i u eksperimentu u

kome je upoređivana njegova antitumorska aktivnost sa aktivnošću drugih, dobro poznatih

fotosenzibilizatora. Grupe miševa sa Ehrlich ascites tumorom su tretirane različitim

fotosenzibilizatorima 3 sata. Najpre je analizirana citotksičnost bez upotrebe svetlosti gde su

rezultati pokazali da nije došlo ni do kakvih promena u grupama kod kojih su korišćeni 5-

aminolevulinska kiselina, mezo-tetra-porfin i fotofrin II. Jedino je kod grupa tretiranih

hipericinom i hematoporfirin-dimetil-etrom pokazana citotksičnost, što se u slučaju hipericina

5

može pripisati njegovim inhibitornim uticajem na protein kinazu C kao i aktivaciji citohroma c.

Fotoaktivacijom ovih supstanci, hipericin se izdvojio kao najefikasniji u sprečavanju rasta

tumora. Zaključeno je, takođe, da efikasnost fotosenzibilizatora u inhibiciji rasta tumorskih ćelija

zavisi od njegove sposobnosti da se akumulira u njima. Hipericin ima sposobnost snažnog

vezivanja za albumin i lipoproteine plazma membrane, što mu omogućava bolju akumulaciju u

tumorskim ćelijama (Lukšienė i de Witte, 2003).

Nema sumnje da hipericin ima veliki potencijal za lečenje Ehrlich ascites tumora u

odnosu na dosadašnje korišćene supstance. Daljim istraživanjima mogu se pronaći različiti tipovi

ćelija u kojima se ovaj molekul uspešno akumulira i tako sprečava rast tumora (Lukšienė i de

Witte, 2003).

Uticaj fotosenzibilisanog hipericina, posmatran je i na molekulu hemoglobina.

Iradijacijom hemoglobina, zajedno sa hipericinom, dolazi do promene mikrookoline hem

molekula, pri čemu se povećava katalitička aktivnost hemoglobina prema redukciji vodonik

peroksida. Pretpostavlja se da reaktivni kiseonični oblici, dobijeni aktivisanjem hipericina,

reaguju sa hem molekulom i menjaju njegovu mikrookolinu. Veće koncentracije hipericina ili

duže vreme iridijacije dovode do oštećenja samog molekula hemoglobina (Zhao i sar., 2008).

Hipericin je dobro poznat i kao antidepresiv (Linde i sar., 2005; Clement i sar., 2006).

Klasični lekovi protiv depresije mogu imati različite nuspojave, ali i biti neefikasni kod ljudi koji

su na njih imuni (Berton i Nestler, 2006). U isto vreme, efikasnost hipericina u lečenju depresije

se može porediti sa efikasnošću mnogih današnjih lekova, ali sa blažim nuspojavama (Linde i

sar., 2005; Clement i sar., 2006). Pored hipericina, supstanca karakteristična za rod Hypericum,

koja takođe pokazuje antidepresivno dejstvo je hiperforin. Analiza ove aktivnosti oba molekula

na pacovima dala je pozitivne rezultate u više eksperimenata (Butterweck i sar., 1997; 1998;

2003; Zanoli i sar., 2002). Međutim, o mehanizmu dejstva vrlo malo se zna. Pretpostavlja se da

hipericin produžava membranski akcioni potencijal nervnih i somatskih ćelija i tako poboljšava

efikasnost sinaptičkih veza (Wang i sar, 2010).

Flavonoidi su hidroksilovani fenoli i predstavljaju sekundarne metabolite biljaka koji im

služe u odbrani od mikrobijalnih infekcija (Dixon i sar., 1983). Nekada su se zvali i vitaminom

P. Flavonoidi se najviše koncentrišu u fotosintetičkim delovima biljaka i imaju glavnu ulogu u

bojenju cvetova. U osnovi se sastoje od ugljenikovog skeleta koji sadrži dva benzenova prstena

vezanih preko pirana (Middleton, 1998).

6

Slika 4. Osnovna struktura flavonoida (http://www.kgmu.kcn.ru/sites/default/files/u69/images/17.pdf)

Na osnovu nivoa oksidacije i obrasca supsitucije C prstena mogu se podeliti u različite

klase (flavoni, flavoloni, flavononi itd.) (Middleton, 1998). U poslednje vreme porasla je

zainteresovanost za ova jedinjenja zbog njihove antioksidantne aktivnosti.

Slika 5. Hemijska struktura različitih klasa flavonoida (http://supplementscience.org/antioxidants.html)

Antioksidantna aktivnost omogućena je zahvaljujući funkcionalnoj hidroksilnoj grupi

flavonoida koja sakuplja slobodne radikale i/ili vrši helaciju metalnih jona (Kumar i sar., 2013).

Pokazana je i njihova antibakterijska (Cuschnie i Lamb, 2005), antiviralna aktivnost, kao i

protektivna uloga protiv kardiovaskularnih bolesti (Hertog i sar., 1993; Tzeng i sar., 1991),

kancera (Hertog i sar., 1994) i drugih bolesti koje se javljaju u starijem dobu ljudi. Nedostatak

ovih jedinjenja je njihova slaba rastvorljivost u vodi, što dovodi do problema u terapeutskoj

primeni. Takođe, kratko se zadržavaju u intestinumu i slabo absorbuju pa je mala verovatnoća

predoziranja (Kumar i Pandey, 2013).

http://www.kgmu.kcn.ru/sites/default/files/u69/images/17.pdfhttp://supplementscience.org/antioxidants.html

7

Absorbcija flavonoida generalno zavisi od njihove strukture. Ukoliko su u pitanju

aglikoni, lako će se absorbovati u malom intestinumu. Medjutim, većina biljaka sadrži glikozidni

oblik koji se mora prvo pretvoriti u aglikon (Hollman i sar., 1999). Hidrofilni flavonoidi, vezani

za šećer, transportuju se u malom intestinumu uz pomoć Na+-zavisnih glukoznih kotransportera.

Alternativni put je hidroliza β-glukozidazom, pri čemu se dobija aglikon koji se lako može

absorbovati (Day i sar., 2000). Ostatak glikozida, koji ne predstavljaju supstrat za ovaj enzim,

transportuju se u debelo crevo gde podležu mikrobijalnoj razgradnji. Zbog manjeg kapaciteta

absorbcije, flavonoidi koji dođu u kolon, u manjoj količini dospevaju u organizam (Scheline,

1973). Nakon prolaska kroz intestinum, flavonoidi podležu procesima konjugacije sa sulfatima,

ugljenim hidratima, metilaciji, kao i metabolizmu u jetri pri čemu se dobijaju fenolna jedinjenja.

(Bravo, 1998). Iz tog razloga, flavonoidi se ne mogu naći u slobodnom obliku u krvi i urinu

(osim katehina) (Hollman i Katan, 1997).

Od nekoliko značajnih bioloških aktivnosti flavonoida, antioksidativna je najbolje

proučena. Efikasnost u obavljanju ove funkcije zavisi najviše od strukture i broja glikozida

vezanih za flavonoid. Aglikoni su generalno jači antioksidanti (Ratty i Das, 1988).

Prisustvo kateholne grupe na B prstenu je neophodno za efikasnu antioksidativnu

aktivnost, pa flavonoidi kojima ova grupa nedostaje, kao što je kempferol, znatno zaostaju u

sakupljanju oksidanata. Takođe, prisustvo 3-hidroksilne grupe na C prstenu znatno uvećava

stepen oksidacije kvercetina i kempferola, dok kod flavonoida kojima ova grupa fali, kao što su

luteolin i rutin, teže dolazi do oksidacije u prisustvu Cu2+ jona. Sposobnost helacije Cu2+ jona

ima ulogu u inhibiciji lipidne peroksidacije (van Ackeri sar., 1996).

Slika 6.Hemijska struktura kvercetina, rutina i kempferola

(http://www.jcimjournal.com/en/FullText2.aspx?articleID=jcim20110914)

Hidroksilne grupe na B prstenu imaju ulogu u doniranju vodonikovih atoma reaktivnim

kiseoničnim vrstama, pa ih na taj način stabilizuju. Zbog toga je kvercetin, sa dve hidroksilne

grupe, bolji antioksidant u odnosu na kempferol, koji ima samo jednu hidroksilnu grupu u orto

položaju. Takođe, prisustvo hidroksilne grupe, kao i 2,3-dvostruke veze na C prstenu,

omogućavaju delokalizaciju elektrona i samim tim stabilnost radikala (Branković, 2015).

Helacija metalnih jona, podrazumeva njihovo vezivanje za flavonoide i formiranje helata.

Na taj način se sprečava uključivanje metalnih jona u procese formiranja reaktivnih kiseoničnih

vrsta (Branković, 2015).

http://www.jcimjournal.com/en/FullText2.aspx?articleID=jcim20110914

8

Rezistentnost bakterija na antibiotike je postao važan globalni problem. S obzirom na to

da je antimikrobna aktivnost flavonoida odavno poznata, svako detaljnije istraživanje je od

velikog značaja.

Eksperimentom u in vitro uslovima, ustanovljeno je da kvercetin vrši potpunu inhibiciju

rasta vrste Staphiloccocus aureus (Havsteen, 1983), verovatno inhibicijom enzima DNK giraza

(Cushnie i Lamb, 2005). I za ovu aktivnost je bitno prisustvo šećerne grupe kod flavonoida, pri

čemu samo aglikani inhibiraju rast mikroorganizama. Osim toga, mehanizmi delovanja različitih

flavonoida nisu isti (Havsteen, 1983).

Dejstvo na viruse takođe se razlikuje između različitih grupa flavonoida. Istraživanjem na

Herpes simplex virusu, pronađeno je da među analiziranim flavonoidima iz pet grupa (flavoni,

flavanoli, flavonoli, isoflavoni i flavanoni), najveću antiviralnu aktivnost pokazuju flavonoidi

bez vezane šećerne grupe za sebe, i sa hidroksilacijom na trećoj poziciji, odnosno flavanoli i

flavonoli (Lyu i sar., 2005).

Nekoliko skorašnjih istraživanja postoji i o anti-HIV dejstvu. Generalno, pokazano je da

su flavani najefikasniji selektivni inhibitori HIV-1 i HIV-2 ili sličnih imunodeficitnih virusnih

infekcija u odnosu na ostale flavonoide (Ng i sar., 1997).

Postoje brojni podaci o tome da flavonoidi imaju inhibitorni uticaj na metabolizam

arahidonske kiseline, što se dovodi u vezu sa antiinflamatornim i antialergijskim dejstvom ove

grupe molekula (Ferrándiz i Alcaraz, 1991). Mehanizam dejstva odvija se preko inhibicije

enzima fosfolipaze A2, čija je funkcija oslobađanje arahidonske kiseline iz fosfolipida. Na taj

način, sprečava se dobijanje prostaglandina, jednih od glavnih regulatora upalnih procesa. Osim

fosfolipaze A2, ustanovljeno je inhibitorno dejstvo flavonoida i na mnoge druge enzime koji

učestvuju u procesima inflamacije. Takođe, flavonoidi mogu i direktno blokirati sintezu enzima,

utičući na njegove transkripcione faktore. Ostali mehanizmi antiinflamatornog dejstva uključuju

sprečavanje oslobađanja histamina (Rathee i sar., 2009), supresiju fosfodiesteraze (Saponara i

Bosisio, 1998), TNF-α (Manthey i sar., 1999) i protein kinaze C (Gamet-Payrastre i sar., 1999).

Slika 7. Hemijska struktura kvercetina (primer molekula sa važnim karakteristikama koje mu omogućavaju efikasnu

antiinflamatornu aktivnost) (http://www.mdpi.com/1420-3049/19/3/3570/htm)

http://www.mdpi.com/1420-3049/19/3/3570/htm

9

Pojedini flavonoidi izdvajaju se i svojom hepatoprotektivnom (Kim i sar., 2011) i

regenerišućom mogućnošću u eksperimentalnim bolestima ciroze kao i akutim, potencijalno

letalnim povredama jetre (Wu i sar., 2006).

Hiperforin, derivat floroglucinola, smatra se najodgovornijim za antidepresivno dejstvo

kantariona (Nakamura i sar., 2013). Pominje se još 1943. godine od strane Osborna u radovima

koji su obuhvatali istraživanje antibakterijskog dejstva vrsta roda Hypericum na Staphylococcus

aureus (Brondz i sar., 1982). U biljkama je skoncentrisan u tučku i plodovima, i verovatno ima

protektivnu ulogu (Beerhouse, 2006).

Struktura hiperforina do sada je dosta istraživana i predložen je njen moguć model.

Međutim, pokušaji sinteze ovog molekula do sada su bili neuspešni. Čist hiperforin je podložan

oksidaciji i nestabilan je na višim temperaturama. Eksperimentom je pokazano da ne postoje

naročite razlike između molekula hiperforina koji je stajao 8 meseci na temperaturi od -20oC u

azotu, onog koji je stajao na -30oC u normalnoj atmosferi i molekula koji je stajao u tečnom

azotu (-196oC), ali se zbog njegove osetljivosti preporučuje čuvanje u tečnom azotu (Orth i sar.,

1999).

Slika 8. Hemijska struktura hiperforina (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hyperforin.png)

Mehanizam delovanja hiperforina još uvek nije dobro poznat ali izgleda da je povezan sa

Na+-kanalima, preko kojih povećava intracelularnu koncentraciju Na+ jona (Zanoli, 2004). Kao

posledica uticaja na njih, dolazi do inhibicije preuzimanja nekih hormona od strane neurona, kao

što su serotonin, dopamin, noradrenalin, GABA i L-glutamat. Analizom dve različite vrste

Hypericum-a, zaključeno je da jačina antidepresivnog dejstva zavisi od koncentracije hiperforina

u njima (Chatterjee i sar., 1998). Postoje predpostavke i o uticaju hiperforina na druge jonske

kanale (Zanoli, 2004).

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hyperforin.png

10

S obzirom na nestabilnost čistog hiperforina, u eksperimentima in vivo se koriste različiti

rastvori ovog molekula. Sintetisan hiperforin acetat pokazao je dobre rezultate u testu forsiranog

plivanja rađenom na pacovima, pri čemu male koncentracije znatno smanjuju vreme njihove

imobilnosti. Detaljnije istraživanje moglo bi doprineti razvoju rastvora koji bi se koristio u

farmaceutske svrhe (Zanoli i sar., 2002). Osim hiperforin acetata, analizirani su i efekti čistog

ekstrakta H. perforatum, kao i dicikloheksilamonium-a (stabilna so hiperforina). I ovde su

rezultati bili slični prethodnim. Međutim, detekcija hiperforina u mozgu pacova nije bila

moguća, pa se pretpostavlja da je za to odgovorna krvno-moždana barijera koja propušta samo

male količine ovog molekula (Cervo i sar., 2002).

Suprotno, veće količine hiperforina (≥10mg/kg), pokazale su efekat smanjene lokomocije

kod pacova. U ovom slučaju, hiperforin inhibira preuzimanje holina od strane nervne ćelije, pa

se smanjuje sinteza, a samim tim i oslobađanje acetil-holina na krajevima neurona, pri čemu

dolazi i do smanjenja mobilnosti pacova. U dozama 1-10 mg/kg, hiperforin ima stimulativno

dejstvo na oslobađanje acetil-holina. Mehanizam terapeutskog delovanja još uvek nije objašnjen

(Buchholzer i sar., 2002).

Postoje podaci i o poboljšanju memorije kao rezultat delovanja hiperforina. U

eksperimentu sa pacovima, ovaj molekul doveo je do boljih kognitivnih sposobnosti grupi koja je

oralno primala male doze natrijumove soli hiperforina. Testom uslovnog izbegavanja, pokazano

je da hiperforin ima snažno dejstvo na memoriju, kako tokom primanja terapije, tako i određen

period nakon prestanka sa njom. Takođe, hiperforin je potpuno eliminisao sve simptome

amnezije indukovane skopolaminom. Čist hiperforin je pokazao jaču antidementnu aktivnost od

svoje antidepresivne aktivnosti u istim koncentracijama (Klusa i sar., 2001).

Ni jedan antidepresiv nema toliko široko dejstvo na veći broj različitih neurotransmitera

kao hiperforin. Pretpostavlja se da je to posledica njegovog dejstva na jonske Na+-kanale, koji su

zaslužni za transport monoamina u nervnu ćeliju putem kotransporta (Singer i sar., 1999).

Pokazano je da hiperforin može indukovati i apoptozu sisarskih ćelija aktivacijom

kaspaza, pa se uključuje u istraživanja kao potencijalni antikancerogeni agent (Schempp i sar.,

2002; Hostanska i sar., 2003). U eksperimentu sa embrionalnim ćelijama miša i fibroblastima,

visoka koncentracija hiperforina je inhibirala rast embrionalnih ćelija i izazvala apoptozu kod

ćelija fibroblasta. Takođe, zavisno od koncentracije, hiperforin je uticao na samu diferencijaciju

embrionalnih stem ćelija u pravcu kardiomiocita. U kulturi su se diferencirali i drugi tipovi ćelija

ali u znatno manjoj meri. Primećeno je i da je inhibiran rast ćelija mezodermalne i endodermalne

linije.

Hiperforin je bezbedan antidepresiv ukoliko se koristi u optimalnim količinama, ali

unošenje većih koncentracija u toku trudnoće može imati teratogeni i embriotoksični efekat

(Nakamura i sar., 2013).

11

2. CILJ RADA

Cilj ovog rada bio je:

1. Ispitivanje procenta hemolize eritrocita periferne krvi pacova Wistar pod uticajem različitih

koncentracija vodenog ekstrakta vrste H. rumeliacum.

2. Ispitivanje uticaja različitih koncentracija vodenog ekstrakta vrste H. rumeliacum na

vijabilnost ćelija kostne srži pacova Wistar.

12

3. MATERIJALI I METODE

3. 1. MATERIJAL

U eksperimentu korišćen je sledeći materijal:

- Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine oko 300g

- Periferna krv pacova Wistar

- Kostna srž femura i tibije pacova Wistar

- Vodeni ekstrakt H. rumeliacum

3.2. METODE

- Priprema štok i radnih rastvora

- Uzimanje krvi iz srca pacova

- Postupak za dobijanje eritrocita

- Inkubacija eritrocita sa različitim koncentracijama vodenog ekstrakta H. rumeliacum

- Merenje procenta hemolize spektrofotometrom

- Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova

- Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži

- Određivanje broja ćelija kostne srži u komori

- Tripan plavo metoda

- Obrada rezultata

Priprema štok i radnih rastvora

Štok rastvor je koncentrovan rastvor koji se koristi u laboratoriji u različitim

razblaženjima. Razblaženja štok rastvora su radni rastvori. Štok rastvor napravljen je

usitnjavanjem 40g nadzemnog dela biljke H .rumeliacum i kuvanjem u 400ml destilovane vode.

Na taj način dobijen je štok koncentracije 100mg/ml sirovog ekstrakta biljke H. rumeliacum.

Rastvor je uvijen u aluminijumsku foliju, da ne bi došao u kontakt sa svetlošću, i ostavljen u

frižider na čuvanje. Pre izvođenja eksperimenta napravljeni su radni rastvori koncentracija

0,1mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml i 10mg/ml. Radni rastvori dobijeni su

razblaživanjem štoka u puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS), tako da su se konačne

koncentracije radnog rastvora kantariona nalazile u 0,9% PBS-u.

13

Uzimanje krvi iz srca pacova

Pacov je anesteziran intravenozno Ketamidor-om, dozom od 0,3ml (0,1ml na 100gr

težine). Nakon delovanja opšteg anestetika, pacov je dezinfikovan 70% alkoholom i okrenut na

leđa. Pincetom i makazama otvorena mu je trbušna duplja uzdužno i probijena dijafragma da bi

se došlo do srca. Ubodom igle u vrh srca izvađeno je 8ml krvi u sterilni špric, u koji je prethodno

uvučeno malo heparina.

Postupak za dobijanje eritrocita

Krv izvađena iz srca, prebačena je iz šprica u epruvetu za centrifugiranje. Krv je

centrifugirana 10min. na 2000 obrtaja/min, pri temperaturi od 4oC. Nakon centrifugiranja

izvađen je supernatant i dodata ista količina fiziološkog rastvora. Rastvor je resuspendovan i

vraćen na ponovno centrifugiranje pod istim uslovima. Po završetku drugog centrifugiranja

ponovljen je postupak vađenja supernatanta i dodavanja fiziološkog rastvora i epruveta je

vraćena na treće centrifugiranje kako bi bili sigurni da su eritrociti lepo oprani. Na kraju trećeg

centrifugiranja, supernatant je izvađen i izračunat je hematrokit. Na osnovu izračunatog

hematokrita, napravljen je 4% rastvor eritrocita.

Inkubacija eritrocita sa različitim koncentracijama sirovog vodenog ekstrakta

H. rumeliacum

Izvedena su dva eksperimenta. U prvom eksperimentu, koji je predstavljao pilot

eksperiment, 4% rastvor eritrocita inkubiran je sa koncentracijama od 0,1mg/ml, 1mg/ml i

10mg/ml radnog rastvora. Obeležene su 6 epruvete u kojima su dodati sledeći rastvori:

1. epruveta - 4% rastvor eritrocita (3ml) + 3% H2O2 (3ml) + radni rastvor H. rumeliacum

koncentracije 10mg/ml (1,5ml)

2. epruveta - 4% rastvor eritrocita (3ml) + 3% H2O2 (3ml) + radni rastvor H. rumeliacum

konc. 1mg/ml (1,5 ml)

3. epruveta - 4% rastvor eritrocita (3ml) + 3% H2O2 (3ml) + radni rastvor H. rumeliacum

konc. 0,1mg/ml (1,5ml)

4. epruveta (+K) - 4% rastvor eritrocita (3ml) + 3% H2O2 (4,5ml)

5. epruveta (+K) - 4% rastvor eritrocita (3ml) + dH2O (4,5ml)

6. epruveta (-K) - 4% rastvor eritrocita (3ml) + PBS (4,5ml)

*Prvo se doda radni rastvor H. rumeliacum i 4% rastvor eritrocira, inkubira 5 min u vodenom

kupatilu, a zatim se dodaju ostali rastvori.

Epruvete su inkubirane 3h u vodenom kupatilu.

14

U drugom eksperimentu analizirane su koncentracije 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml i

5mg/ml. Ostatak procedure isti je kao u pilot eksperimentu.

Merenje procenta hemolize spektrofotometrom

Nakon inkubacije, iz svake epruvete uzeto je 250µl rastvora i prebačeno u novu, čistu

epruvetu. Svakoj je zatim dodato još 8ml PBS-a. Epruvete su centrifugirane 10min., na 2000

obrtaja/min pri temperaturi od 4oC. Po završetku centrifugiranja, merena je absorbanca za svaku

epruvetu i na osnovu nje određen je procenat hemolize.

Merenje absorbance vrši se spektrofotometrom. Spektrofotometar je uređaj za merenje

intenziteta svetlosti preko intenziteta boje ili talasne dužine svetlosti. U njegovoj unutrašnjosti

nalaze se 2 ležišta za kivete. U jedno ležište stavlja se kiveta koja predstavlja standard, i u nju se

najčešće dodaje dH2O. U ovom eksperimentu, kao standard korišćen je 0,9% PBS, jer je on

korišćen kao rastvarač. Drugo ležište predviđeno je za kivetu u koju se stavlja uzorak. Pre

početka merenja vrši se kalibracija, odn. u obe kivete stavlja se standard da bi se vrednost

absorbance podesila na 0. Kiveta za uzorak se zatim isprazni i u nju se dodaje rastvor čija se

absorbanca meri. Vrednost absorbance čita se na monitoru, u programu, preko kog je kompjuter

povezan sa spektrofotometrom.

Sam uređaj sastoji se od izvora svetlosti, monohromatora i detektora. Izvor svetlosti šalje

svetlosni snop kroz monohromator, koji menja njegovu talasnu dužinu. Snop zatim prolazi kroz

uzorak i dolazi do detektora na kome se određuje intenzitet absorbovanog, propuštenog i

reflektovanog zračenja. Detektor zatim pretvara optički signal u električni i prikazuje ga na

monitoru.

Slika 9. Šematski prikaz komponenti spektrofotometra

(http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Experimental_Determination_of_Kinetc

s/Spectrophotometry)

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Experimental_Determination_of_Kinetcs/Spectrophotometryhttp://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Experimental_Determination_of_Kinetcs/Spectrophotometry

15

Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova

Pacovu, kome je izvađena krv iz srca, izolovani su femuri i tibije obe noge. Kosti su

očišćene od ostatka tkiva i odsečene su im epifize. U sterilni špric je uvučeno oko 2ml

fiziološkog rastvora. Jedan kraj kratke, gumene cevčice navučen je na vrh šprica, a drugi na kost.

Istiskivanjem fiziološkog rastvora iz šprica u epruvetu, izduvana je kostna srž svake kosti, pri

čemu je cevčica pridržavana da ne bi spala zbog pritiska. Ćelije kostne srži su resuspendovane

Pasterovom pipetom da bi se razbili ćelijski agregati.

Slika 10. Šematski prikaz izolacije kostne srži iz femura pacova

(http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4111/kju.2008.49.5.432&vmode=PUBREADER)

Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži

Ćelijska suspenzija centrifugirana je 10min., na 1100 obrtaja/min pri temperaturi od 4oC.

Nakon centrifugiranja, izvučen je supernatant i dodato je 5ml PBS-a. Ćelije su resuspendovane u

PBS-u i izvučeno je 50µl ćelijske suspenzije koja je prebačena u novu, čistu ependorficu. Zatim

je dodato 50µl Tripan plavo boje.

http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4111/kju.2008.49.5.432&vmode=PUBREADER

16

Određivanje broja ćelija kostne srži u komori

Brojanje ćelija vrši se u hemocitometarskim komoricama. Neubauerova

hemocitometarska komora je najčešće korišćena i predstavlja debelu predmetnu pločicu u koju

su urezana 4 uzdužna žljeba. Između 2 unutrašnja žljeba, nalazi se poprečni žljeb koji deli

srednje polje na 2 jednaka dela. U oba dela srednjeg polja urezana je mrežica za brojanje ćelija.

Mrežica površine 9 mm2, podeljena je na 9 kvadrata površine 1mm2. Svaki od ovih kvadrata

dalje je podeljen na 16 manjih, jednakih kvadrata (površina 1/16 mm2). Centralni kvadrat

podeljen je na 25 manjih kvadrata, pri čemu je svaki od njih podeljen na još 16 kvadratića

površine 0,0025mm2.

Iz ependorfice, pipetmanom je uzorkovano 20µl obojene ćelijske suspenzije i prenešeno

u Neubauer-ovu hemocitometarsku komoricu. Ćelije su brojane u 4 periferna kvadrata površine

1mm2.

Slika 11. Prikaz mrežice Neubauerove hemocitometarske komorice (ćelije su brojane u obeleženim

kvadratima) (http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/63510.aspx)

Izbrojane ćelije su preračunate na 1ml preko formule:

𝐵𝑟𝑜𝑗ć𝑒𝑙𝑖𝑗𝑎 𝑢 1𝑚𝑙 =𝑋

4∗ 2 ∗ 4 ∗ 103

X – Br. ćelija izbrojenih u sva 4 periferna kvadrata

Nakon brojanja, obeležene su nove, čiste ependorfice u kojima je prebačeno po 500µl

ćelijske suspenzije i 500µl radnog rastvora H. rumeliacum, triplet od svake koncentracije. U

kontroli je, umesto radnog rastvora, dodata ista količina PBS-a. Epruvete su inkubirane 3h u

vodenom kupatilu na temperaturi od 37oC. Po završetku inkubacije, izvučeno je 900µl suspenzije

http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/63510.aspx

17

i dodata ista količina tripsina koji služi za odvajanje

ćelija od zidova ependorfice. Rastvor je stajao 10min. u

frižideru. Zatim je po 50µl suspenzije iz svake

ependorfice prebačeno u novu, gde je dodato 50µl boje

Tripan plavo.

Iz svake ependorfice, po 20µl obojene ćelijske

suspenzije prebačeno je u Neubauer-ovu komoricu gde

su se odvojeno brojale mrtve i žive ćelije. Na osnovu

odnosa živih i mrtvih ćelija izračunat je procenat

vijabilnosti ćelija za svaku koncentraciju. Određena je

srednja vrednost svakog tripleta i dobijena standardna

greška.

Tripan plavo metoda

Tripan plavo metoda bojenja određuje vijabilnost ćelija. Mehanizam delovanja boje

Tripan plavo zasniva se na njenom negativnom naelektrisanju, pa je ćelije, kojima je membrana

intaktna, ne propuštaju i pod mikroskopom su žućkasto-bele. Mrtvim ćelijama, membrana je

oštećena, samim tim propuštaju boju, i pod mikroskopom se vide kao plave. Iako se boja Tripan

plavo označava kao vitalna, odnosno razlikuje žive ćelije sa celom i oštećenom membranom,

obojene ćelije se ipak računaju kao mrtve (Tran et al, 2011).

Obrada rezultata

Za statističku obradu dobijenih podataka korišćen je program Microsoft Office Excel.

Slika 12. Obojene, plave ćelije su

nevijabilne, dok su žućkasto-bele vijabilne

18

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Ispitivanje potencijalne antihemolitičke uloge vodenog

ekstrakta H. rumeliacum

Radi utvrđivanja potencijalne antihemolitičke aktivnosti ekstrakta H. rumeliacum

urađena su dva eksperimenta. Prvi eksperiment je predstavljao pilot eksperiment koji je

sproveden da bi se utvrdilo da li ekstrakti poseduju neku antihemolitičku aktivnost i koja je doza

ta koja sprečava više od 50% hemolize. Drugi eksperiment je imao za cilj da preciznije odredimo

koncentraciju vodenog ekstrakta koja će sprečiti više od 50 % hemolize.

4.1.1. I eksperiment

Izolovani eritrociti, inkubirani su u vodenim rastvorima H. rumeliacum koncentracija

0,1mg/ml, 1mg/ml i 10mg/ml, 3h na temperaturi od 37oC. Pozitivna kontrola inkubirana je u

0,9% rastvorom PBS-a, a kao negativna kontrola korišćena je dH2O. Izazivač hemolize bio je 3%

H2O2. Sa grafika 1. može se primetiti da se sa povećanjem koncentracije ekstrakta, smanjuje

procenat hemolize eritrocita, sa vrednostima od 69,18% pri koncentraciji od 0,1mg/ml, 26,95%

pri koncentraciji od 1mg/ml, dok je kod najveće koncentracije (10mg/ml) procenat hemolize

najmanji i iznosi 14,41%. Ovi rezultati pokazali su da H. rumeliacum ima potencijalnu

antioksidantnu ulogu sa IC50 vrednošću od 0,32mg/ml, pa postoji potreba za detaljnijim

istraživanjem.

Grafik 1. Prikaz procenta hemolize eritrocita u zavisnosti od koncentracije vodenog ekstrakta H. rumeliacum

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0.1 1 10

Pro

cen

at h

emo

lize

Koncentracija (mg/ml)

19

4.1.2. II eksperiment

U II eksperimentu, za inkubaciju izolovanih eritrocita, korišćene su koncentracije

1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml i 5mg/ml. Pozitivna i negativna kontrola iste su kao u I

eksperimentu. Grafik 2. pokazuje smanjenje procenta hemolize sa povećanjem koncentracije

vodenog ekstrakta H. rumeliacum. Procenat hemolize se kreće od 23, 66% pri koncentraciji od

1mg/ml do 20,26 % pri koncentraciji od 5 mg/ml.

Grafik 2. Prikaz procenta hemolize eritrocita u zavisnosti od koncentracije vodenog ekstrakta H. rumeliacum

Ovakav rezultat može se objasniti kao posledica antioksidantne uloge flavonoida, koji su

karakteristični za rod Hypericum, kao što su rutin, hiperozid, izokvercitrin, kvercitrin, kvercetin,

amentoflavoni itd. (Crockett i Robson, 2011). Mehanizam antioksidativnog dejstva još uvek je

nedovoljno istražen. Efikasnost antioksidativne aktivnosti flavonoida zavisi primarno od broja

OH supstitucija na B prstenu, koji su donori elektrona hidroksil, peroksil i peroksinitrit

radikalima, i na taj način formiraju relativno stabilne radikale flavonoida (Cao i sar., 1996).

Pretpostaljeni mehanizam antioksidantne aktivnosti uključuje, kako sakupljanje slobodnih

radikala, tako i inhibitorno dejstvo na enzime koji učestuju u generisanju reaktivnih kiseoničnih

vrsta (ROS) (Brown i sar., 1998). Istraživanje rađeno na ćelijskoj kulturi retinalnih pigmentnih

epitelnih ćelja pokazalo je da flavonoidi štite ove ćelije od oksidativnog stresa sa efikasnošću

između 80% i 100% u µ i n molarnim koncentracijama. U zavisnosti od grupe flavonoida,

protektivno dejstvo ispoljava se preko različitih mehanizama. Npr. upotrebom kvercetina i

fisetina primećeno je povećanje nivoa glavnog intracelularnog antioksidativnog agenta (Mari i

sar., 2009), glutationa, pri čemu su i ova dva flavonoida preuzela istu ulogu (Hanneken i sar.,

2006). Mehanizam delovanja flavonola se odigrava preko blokade influksa Ca2+ jona u nervne

ćelije (Hanneken i sar., 2006), što predstavlja poslednji korak u procesu apoptoze (Lipton, 2005).

Slični rezultati dobijeni su i u eksperimetima sa srčanim ćelijama (Akhlaghi i Bandy, 2012),

fibroblastima (Filipe i sar., 2005) i keratinocitima (Verschooten i sar., 2010). Upoređivanjem

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5

Pro

cen

at h

emo

lize

Koncentracije (mg/ml)

20

efikasnosti kvercetina sa već dobro poznatim antioksidantima, vitaminom C i vitaminom E,

najveću efikasnost pokazao je upravo kvercetin, iako je njegova absorpcija znatno manja od

absorpcije vitamina (Hanneken i sar., 2006). Na kraju, možemo predpostaviti da sekudarni

metaboliti prisutni u vodenom ekstraktu H. rumeliacum deluju kao stabilizatori membrane

eritrocita.

4.2. Ispitivanje uticaja vodenog ekstrakta H. rumeliacum na

vijabilnost ćelija kostne srži u in vitro uslovima

Radi utvrđivanja potencijalne citotoksične aktivnosti ekstrakta H. rumeliacum urađena su

dva eksperimenta. Prvi eksperiment je predstavljao pilot eksperiment koji je sproveden da bi se

utvrdilo da li ekstrakti poseduju neku citotoksičnu aktivnost. Drugi eksperiment je imao za cilj

preciznije određivanje koncentracije vodenog ekstrakta koja izaziva više od 50% umiranja ćelija.

4.2.1. I eksperiment

Ćelije kostne srži inkubirane su vodenim ekstraktom H. rumeliacum, koncentracija

0,1mg/ml, 1mg/ml i 10mg/ml, 3h na temperaturi od 37oC. Kontrola je inkubirana u PBS-u.

Rezultati na grafiku 3. pokazuju da je najveća vijabilnost ćelija u kontroli, a sa povećanjem

koncentracije vodenog ekstrakta H. rumeliacum dolazi do smanjenja ćelijske vijabilnosti. Pri

koncentraciji od 0,1mg/ml procenat vijabilnih ćelija je 77,8%, koncentracija od 1mg/ml ima

nešto manju vijabilnost ćelija čija je vrednost 63,46%, dok je kod koncentracije od 10mg/ml

došlo do primetnog smanjenja procenta vijabilnosti ćelija koji iznosi 6,7% (Grafik 3.). Vrsta

pokazuje citotksičnost na ćelije kostne srži sa IC50 vrednošću od 2,318mg/ml.

Grafik 3. Prikaz zavisnosti procenta vijabilnosti ćelija kostne srži od koncentracije vodenog ekstrakta H.

rumeliacum

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

k 0.1 1 10

Vija

biln

ost

ćel

ija (

%)

Koncentracija (mg/ml)

21

4.2.2. II eksperiment

Nakon izolovanja, ćelije kostne srži inkubirane su u vodenom ekstraktu H. rumeliacum,

koncentracija 1mg/ml, 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml i 5mg/ml. Na grafiku 4. može se videti da

dolazi do smanjenja ćelijske vijabilnosti ćelija kostne srži sa povećanjem koncentracije vodenog

ekstrakta H. rumeliacum. U kontroli, procenat vijabilnih ćelija iznosi 90,43%. Koncentracija od

1mg/ml ima približnu vrednost procenta vijabilnosti ćelija kao kontrola (89,39%), a idući ka

većim koncentracijama, vijabilnost ćelija polako opada sa vrednostima od 85,5% za

koncentraciju od 2mg/ml, 79,47% za koncentraciju od 3mg/ml, dok koncentracije od 4 i 5mg/ml

imaju slične vrednosti, odn. 69,4% i 67,58%.

Grafik 4. Prikaz zavisnosti procenta vijabilnosti ćelija kostne srži od koncentracije vodenog ekstrakta H.

rumeliacum

Dobijeni rezultati pokazuju da koncentracije od 1-3mg/ml ne utiču nešto značajnije na

smanjenje vijabilnosti ćelija kostne srži u odnosu na kontrolu. Za razliku od njih, povećanje

koncentracija preko 3,5mg/ml dovodi do naglog smanjenja vijabilnosti, ali se ona održava

relativno visoko od nekih 67% do 69%. Ovi rezultati su u korelaciji sa slučajem iz 2005. godine,

u kome je 22-godišnjem pacijentu, nakon korišćenja kantariona (Hypericum perforatum) protiv

depresije, dijagnostifikovana nekroza kostne srži. Terapija Hypericum-om podrazumevala je

korišćenje 1000mg dnevno biljke, 3 nedelje. Nakon hospitallizacije, 3. dana primećeno je znatno

smanjenje hemoglobina u krvi (sa 10g/dl na 6g/dl), a uočeno je i prisustvo šistocita koji se

javljaju u hemolitičkim anemijama. Na osnovu ovih nalaza, urađena je biopsija kostne srži iz

ilijačne kosti, pri čemu je uočen smanjen broj hematopoeznih ćelija koje uključuju sve tri

ćelijske linije. Nekroza je obuhvatala prisustvo nekrotičnih ćelija, kao i povećanje zapremine

žute kostne srži. Dijagnostifikovana je hipocelularna kostna srž sa fokalnom nekrozom. S

obzirom na to da serološki nalazi nisu pokazivali nikakvu virusnu infekciju, objašnjenje nekroze

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

K 1 2 3 4 5

Vija

biln

ost

ćelij

a (%

)

Koncentracije (mg/ml)

22

kostne srži i povećanje nivoa enzima jetre pripisano je još neobjašnjenom toksičnom efektu

biljke H. perforatum (Demiroglu i sar., 2005).

Dobijeni rezultati mogu se uporediti i sa eksperimentom u kome je pokazano da H.

perforatum inhibitorno utiče na razgradnju triptofana, a stimulativno na smanjenje količine

neopterina u organizmu. Oba puta sinteze zavise od produkcije IFγ od strane imunih ćelija, pa je

zaključeno da H. perforatum vrši supresiju aktiviranih imunokompetentnih ćelija (Winkler i sar.,

2004).

Poznato je i da hiperforin izaziva apoptozu fibroblasta (Nakamura i sar., 2013), kao i

tumorskih ćelija putem aktivacije kaspaza. U eksperimentu, Hostanska i sar., 2003, pokazali su

da hipericin i hiperforin deluju sinergistički u inhibiciji rasta leukemičnih ćelija i normalnih

astrocita čoveka.

Inhibicija angiogeneze od strane hiperforina, još jedan je od negativnih dejstava ovog

molekula i obuhvata blokadu nekoliko koraka samog procesa. Jedan od njih je inhibicija rasta

endotelnih ćelija sa IC50 vrednošću od 7±3 µM, gde se zbog sličnosti IC50 vrednosti sa drugim

tipovima tumorskih ćelija (Doná i sar., 2004; Schempp i sar., 2002) može zaključiti da hiperforin

nije specifičan inhibitor samo za ovu ćelijsku liniju. Prema Lorusso i sar., 2009, hiperforin utiče

na NF-kappaB transkripcioni faktor, koji ima ulogu u regulaciji gena uključenih u ćelijski rast,

angiogenezu i invaziju, pa na taj način blokira ćelijski ciklus. Veće koncentracije hiperforina

izazivaju apoptozu endotelnih ćelija na isti način kao kod tumorskih (Rothley i sar., 2009).

Iako je hipericin poznat po svom citotoksičnom dejstvu nakon fotoaktivacije, bez

prisustva svetlosti, njegova citotoksičnost ili izostaje (Vandenbogaerde i sar., 1998) ili nema

neku značajniju vrednost (Lukšienė i de Witte, 2003).

23

5. ZAKLJUČAK

Sve ispitivane koncentracije vodenog ekstrakta Hypericum rumeliacum pokazuju anti

hemolitički efekat, pri čemu najveći efekat pokazuje najveća koncentracija od 5 mg/ml.

Ispitivane koncentacije vodenog ekstrakta H. rumeliacum ne pokazuju značajniji

citoksični potencijal na ćelije kostne srži u in vitro uslovima.

Dobijeni rezultati predstavljaju dobru osnovu za temeljnije proučavanje biološke

aktivnosti sekundarnih metabolita vrste H. rumeliacum.

24

6. LITERATURA

Akhlaghi, M., Bandy, B., 2012: Preconditioning and Acute Effects of Flavonoids in Protecting

Cardiomyocytes from Oxidative Cell Death. - Oxidative Medicine and Cellular

Longevity: ID 782321.

Alecu, M., Ursaciuc, C., Halalau, F., Coman, G., Merlevede, W., Waelkens, E., de Witte, P.,

1998: Photodynamic treatment of basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma with

hypericin. - Anticancer Research 18(6B): 4651-4654.

Beerhouse, L., 2006: Hyperforin. – Phytochemistry 67(20): 2201-2207.

Berton, O., Nestler, E. J., 2006: New approaches to antidepressant drug discovery: beyond

monoamines. - National Reviews. Neuroscience 7(2): 137–151.

Blattner, F. R., Borsch, T., 2011: Phylogenetic analyses in St. John’s wort (Hypericum), doctoral

thesis, - Departman za biologiju, hemiju i farmaciju, Univerzitet u Berlinu.

Branković, M., 2015: Uticaj temperature čuvanja na sadržaj ukupnih flavonoida i monomernih

antocijana u soku i sirupu od aronije, master teza, Prirodno-matematički fakultet,

Univerzitet u Nišu.

Bravo, L., 1998: Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional

significance. – Nutrition Reviews 56(11): 317-333.

Brondz, I., Greibrokk, T., Groth, P. A., Assen, A. J., 1982: The relative stereochemistry of

hyperforine – an antibiotic from Hypericum perforatum L. – Tetrahedron Letters 23(12):

1299-1300.

Brown, J. E., Khodr, H., Hider, R. C., Rice-Evans, C. A., 1998: Structural dependence of

flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties. –

Biochemical Journal 330: 1173–1178.

Buchholzer, M. L., Dvorak, C., Chatterjee, S. S., Klein, J., 2002: Dual Modulation of Striatal

Acetylcholine Release by Hyperforin, a Constituent of St. John's Wort. – The Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics 301(2): 714-719.

Butterweck, V., Christoffel, V., Nahrstedt, A., Petereit, F., Spengler, B., Winterhoff, H., 2003:

Step by step removal of hyperforin and hypericin: activity profile of different Hypericum

preparations in behavioral models. - Life Sciences 73(5): 627–639.

25

Butterweck, V., Petereit, F., Winterhoff, H., Nahrstedt, A., 1998: Solubilized hypericin and

pseudohypericin from Hypericum perforatum exert antidepressant activity in the forced

swimming test. – Planta Medica 64(4): 291–294.

Butterweck, V., Wall, A., Lieflander-Wulf, U., Winterhoff, H., Nahrstedt, A., 1997: Effects of

the total extract and fractions of Hypericum perforatum in animal assays for

antidepressant activity. – Pharmacopsychiatry 30(2): 117–124.

Cao, G., Sofic, E., Prior, R. L., 1997: Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids:

Structure-activity relationships. - Free Radical Biology & Medicine 22(5): 749–760.

Cervo, L., Rozio, M., Ekalle-Soppo, C. B., Guiso, G., Morazzoni, P., Caccia, S., 2002: Role of

hyperforin in the antidepressant-like activity of Hypericum perforatum extracts. –

Psychopharmacology 164(4): 423-428.

Chatterjee, S. S., Bhattacharya, S. K., Wonnemann, M., Singer, A., Müller, W. E., 1998:

Hyperforin as a possible antidepressant component of hypericum extracts. – Life Sciences

63(6): 499-510.

Clement, K., Covertson, C. R., Johnson, M. J., Dearing, K., 2006: St. John’s wort and the

treatment of mild to moderate depression: a systematic review. - Holistic Nursing

Practice 20(4): 197–203.

Crockett, S. L., Robson, N. K. B., 2011: Taxonomy and Chemotaxonomy of the Genus

Hypericum. – Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology 5(1): 1-13.

Cushnie, T. P. T., Lamb, A. J., 2005: Antimicrobial activity of flavonoids. – International

Journal of Antimicrobial Agents 26: 343-356.

Day, A. J., Cañada, F. J., Diaz, J. C., Kroon, P. A., Mclauchlan, R., Faulds, C. B., Plumb, G. W.,

Morgan, M. R. A., Williamson, G., 2000: Dietary flavonoid and isoflavone glycosides are

hydrolysed by the lactase site of lactase phlorizin hydrolase. – FEBS Letters 468(2-3):

166-170.

Dixon, R. A., Dey, P. M., Lamb, C. J., 1983: Phytoalexins: enzymology and molecular biology.

– Advances in enzymology and related areas of molecular biology 55: 1-136.

Dona, M., Dell’Aica, I.,Pezzato, E., Sartor, L., Calabrese, F., Barbera, M. D., Donella-Deana, A.,

Appendino, G., Borsarini, A., Caniato, R., Garbisa, S., 2004: Hyperforin Inhibits Cancer

Invasion and Metastasis. – Cancer Research 64: 6225-6232.

Dougherty, T.J., Gomer, C.J., Henderson, B.W., Jori, G., Kessel, D., Korbelik, M., Moan, J.,

Peng, Q., 1998: Photodynamic therapy. – Journal of National Cancer Institute 90(12):

889-905.

26

Ferrándiz, M. L., Alcaraz, M. J., 1991: Anti-inflammatory activity and inhibition of arachidonic

acid metabolism by flavonoids. – Agents and Actions 32(3-4): 283-288.

Filipe, P., Silva, J. N., Haigle, J.,Freitas, J. P., Fernandes, A., Santus, R., Morlière, P., 2005:

Contrasting action of flavonoids on phototoxic effects induced in human skin fibroblasts

by UVA alone or UVA plus cyamemazine, a phototoxic neuroleptic. – Photochemical

&Photobiological sciences 4(5): 420-428.

Hanneken, A., Lin, F., Johnson, J., Maher, P., 2006: Flavonoids Protect Human Retinal Pigment

Epithelial Cells from Oxidative-Stress–Induced Death. – Retinal Cell Biology 47(7):

3164-3177.

Havsteen, B., 1983: Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency. –

Biochemical Pharmacology 32(7): 1141-1148.

Hertog, M. G., Feskens, E. J., Hollman, P. C., Katan, M. B., Kromhout, D., 1993: Dietary

antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen Elderly Study. –

The Lancet 342(8878): 1007-1011.

Hertog, M. G., Feskens, E. J., Hollman, P. C., Katan, M. B., Kromhout, D., 1994: Dietary

flavonoids and cancer risk in the Zutphen elderly study. – Nutrition and Cancer 22(2):

175-184.

Hollman, P. C., Bijsman, M. N., van Gameren, Y., Cnossen, E. P., de Vries, J. H., Katan, M. B.,

1999: The sugar moiety is a major determinant of the absorption of dietary flavonoid

glycosides in man. – Free Radical Research 31(6): 569-573.

Hollman, P. C., Katan, M. B., 1997: Absorption, metabolism and health effects of dietary

flavonoids in man. – Biomedicine & Pharmacotherapy 51(8): 305-310.

Hostanska, K., Reichling, J., Bommer, S., Weber, M., Saller, R., 2002: Hyperforin a constituent

of St John's wort (Hypericum perforatum L.) extract induces apoptosis by triggering

activation of caspases and with hypericin synergistically exerts cytotoxicity towards

human malignant cell lines. – European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics

56(1): 121-132.

Hostanska, K., Reichling, J., Bommer, S., Weber, M., Saller, R., 2003: Hyperforin a constituent

of St John's wort (Hypericum perforatum L.) extract induces apoptosis by triggering

activation of caspases and with hypericin synergistically exerts cytotoxicity towards

human malignant cell lines. – European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics

56(1): 121-132.

Jichlinski, P., Jacqmin, D., 2008: Photodynamic Diagnosis in Non-Muscle-Invasive Bladder

Cancer. - European urology supplements 7: 529–535.

27

Kim, S. M., Kang, K., Jho, E. H., Jung, Y. J., Nho, C. W., Um, B. H., Pan, C. H., 2011:

Hepatoprotective effect of flavonoid glycosides from Lespedeza cuneata against

oxidative stress induced by tert-butyl hyperoxide. – Phytotherapy Research 25(7): 1011-

1017.

Klusa, V., Germane, S., Nöldner, M., Chatterjee, S. S., 2001: Hypericum extract and hyperforin:

memory-enhancing properties in rodents. – Pharmacopsychiatry 34(1): 61-69.

Kumar, S., Mishra, A., Pandey, A. K., 2013: Antioxidant mediated protective effect of

Parthenium hysterophorus against oxidative damage using in vitro models. - BMC

Complementary and Alternative Medicine 13: 120.

Lavie, G., Meruelo, D., Aroyo, K., Mandel, M., 2000: Inhibition of the CD8+ T cell-mediated

cytotoxicity reaction by hypericin: potential for treatment of T cell-mediated diseases. –

International Imunology 12(4): 479-486.

Linde, K., Mulrow, C. D., Berner, M., Egger, M., 2005: St John’s wort for depression. - The

Cochrane Database of Systematic Reviews 18(2): CD000448.

Lipton, S. A., 2005: Molecular Mechanism of Memantine in Treatment od Alzheimer’s Disease

and Other Neurologic Insults. In Misu, Y., Goshima, Y. (ed.): Neurobiology of DOPA as

a Neurotransmitter. – Taylor & Francis Group, Boca Raton. 352-371.

Lorusso, G., Vannini, N., Sogno, I., Generoso, L., Garbisa, S., Noonan, D. M., Albini, A., 2009:

Mechanisms of Hyperforin as an anti-angiogenic angioprevention agent. – European

Journal of Cancer 45(8): 1474-1484.

Lukšienė, Ž., de Witte, P. A. M., 2003: Hypericin as novel and promising photodynamic therapy

tool: studies on intracellular accumulation capacity and growth inhibition efficiency. –

Medicina 39(7): 677-682.

Lyu, S. Y., Rhim, J. Y., Park, W. B., 2005: Antiherpetic activities of flavonoids against herpes

simplex virus type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2) in vitro. – Archives of Pharmacal

Research 28(11): 1293-1301.

Marí, M., Morales, A.,Colell, A.,García-Ruiz, C.,Fernández-Checa, J. C., 2009: Mitochondrial

Glutathione, a Key Survival Antioxidant. – Antioxidants & Redox Signaling11(11):

2685–2700.

Marrelli, M., Statti, G., Conforti, F., Menichini, F., 2015: New Potential Pharmaceutical

Applications of Hypericum Species. – Mini Reviews in Medicinal Chemistry 15:

10.2174/1389557515666150709105844.

28

Manthey, J. A., Grohmann, K., Montanari, A., Ash, K., Manthey, C. L., 1999: Polymethoxylated

flavones derived from citrus suppress tumor necrosis factor-alpha expression by human

monocytes. – Journal of natural products 62(3): 441-444.

Middleton, E. J., 1998: Effect of plant flavonoids on immune and inflammatory cell function. –

Advances in Experimental Medicine and Biology 439: 175-182.

Nakamura, K., Aizawa, K., Yamauchi, J., Tanoue, A., 2013: Hyperforin inhibits cell

proliferation and differentiation in mouse embryonic stem cells. – Cell Proliferation

46(5): 529-537.

Ng, T. B., Huang, B., Fong, W. P., Yeung, F. W., 1997: Anti-human immunodeficiency virus

(anti-HIV) natural products with special emphasis on HIV reverse transcriptase

inhibitors. – Life Sciences 61(10): 933-949.

Nikolić, M. Lj., 2014: Rod Hypericum L. u Srbiji: distribucija i raznovrsnost, master teza, -

Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Nišu.

Orth, H. C., Rentel, C., Schmidt, P. C., 1999: Isolation, purity analysis and stability of hyperforin

as a standard material from Hypericum perforatum L. – Journal of Pharmacy and

Pharmacology 51(2): 193-200.

Ratty, A. K., Das, N. P., 1988: Effects of flavonoids on nonenzymatic lipid peroxidation:

structure-activity relationship. – Biochemical Medicine and Metabolic Biology 39(1): 69-

79.

Rothley, M., Schmid, A., Thiele, W., Schacht, V., Plaumann, D., Gartner, M., Yektaoglu, A.,

Bruyère, F., Noël, A., Giannis, A., Sleeman, J. P., 2009: Hyperforin and aristoforin

inhibit lymphatic endothelial cell proliferation in vitro and suppress tumor-induced

lymphangiogenesis in vivo. – International Journal of Cancer 125(1):34-42.

Saponara, R., Bosisio, E., 1998: Inhibition of cAMP-phosphodiesterase by biflavones of Ginkgo

biloba in rat adipose tissue. – Journal of natural products 61(11): 1386-1387.

Saw, C. L. L., Heng, P. W. S., 2011: Hypericin. In Schwab, M. (ed.): Encyclopedia of Cancer I.

(3rd Edition). – Springer, Heidelberg. 1781-1785.

Scheline, R. R., 1973: Metabolism of foreign compounds by gastrointestinal microorganisms. –

Pharmacological Reviews 25(4): 451-523.

Schempp, C. M., Kirkin, V., Simon-Haarhaus, B., Kersten, A., Kiss, J., Termeer, C. C., Gilb, B.,

Kaufmann, T., Borner, C., Sleeman, J. P., Simon, J. C., 2002: Inhibition of tumour cell

growth by hyperforin, a novel anticancer drug from St. John's wort that acts by induction

of apoptosis. – Oncogene 21(8): 1242-1250.

29

Schempp, C. M., Kirkin, V., Simon-Haarhaus, B., Kersten, A., Kiss, J., Termeer, C. C., Gilb, B.,

Kaufmann, T., Borner, C., Sleeman, J. P., Simon, J. C., 2002: Inhibition of tumour cell

growth by hyperforin, a novel anticancer drug from St. John's wort that acts by induction

of apoptosis. – Oncogene 21(8): 1242-1250.

Singer, A., Wonnemann, M., Müller, W. E., 1999: Hyperforin, a major antidepressant constituent

of St. John's Wort, inhibits serotonin uptake by elevating free intracellular Na+1. – The

Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 290(3): 1363-1368.

Stjepanović-Veselčić, L., 1972: Rod Hypericum. - In Josifović, M. (ed.): Flora SR Srbije 3. -

SANU, Beograd: 104-125.

Takahashi, I., Nakanishi, S., Kobayashi, E., Nakano, H., Suzuki, K., Tamaoki, T., 1989:

Hypericin and pseudohypericin specifically inhibit protein kinase C: possible relation to

their antiretroviral activity. – Biochemical and Biophysical Research Communication

165(3): 1207-1212.

Theodossiou, T. A., Hothersall, J. S., De Witte, P. A., Pantos, A., Agostinis, P., 2009: The

multifaceted photocytotoxic profile of hypericin. – Molecular Pharmaceutics 6(6): 1775-

1789.

Tran, S. L., Puhar, A., Ngo-Camus, M., Ramarao, N., 2011: Trypan Blue Dye Enters Viable

Cells Incubated with the Pore-Forming Toxin HlyII of Bacillus cereus. – Public Library

Of Science 6(9): e22876.

Tzeng, S., Ko, W., Ko, F., Teng, C., 1991: Inhibition of platelet aggregation by some flavonoids.

- Thrombosis Research 64(1): 91-100.

van Acker, S. A., van den Berg, D. J., Tromp, M. N., Griffioen, D. H., van Bennekom, W. P.,

van der Vijgh, W. J., Bast, A., 1996: Structural aspects of antioxidant activity of

flavonoids. – Free Radical Biology & Medicine 20(3): 331-342.

Vandenbogaerde, A. L., Delaey, E. M., Vantieghem, A. M., Himpens, B. E., Merlevede, W. J.,

de Witte,P. A., 1998: Cytotoxicity and antiproliferative effect of hypericin and

derivatives after photosensitization. – Phytoshemistry and Phytobiology 67(1):119-125.

Vandenbogaerde, A.L., Geboes, K.R., Cuveele, J.F., Agostinis, P.M., Merlevede, W.M., de

Witte, P.A., 1998: Hypericin-induced photosensitization of HeLa cells leads to apoptosis

or necrosis: Involvement of cytochrome c and procaspase-3 activation in the mechanism

of apoptosis. – FEBS Letters 440(1-2): 19-24.

Vantieghem, A., Assefa, Z., Vandenabeele, P., Declercq W., Courtois, S., Vandenheede, J. R.,

Merlevede, W., de Witte, P., Agostinis, P., 1998: Hypericin-induced photosensitization of

HeLa cells leads to apoptosis or necrosis. – FEBS Letters 440: 19-24.

30

Verschooten, L.,Smaers, K., Van Kelst, S., Proby, C., Maes, D., Declercq, L.,Agostinis,

P.,Garmyn, M., 2010: The Flavonoid Luteolin Increases the Resistance of Normal, but

Not Malignant Keratinocytes, Against UVB-Induced Apoptosis. - Journal of

Investigative Dermatology 130: 2277–2285.

Wang, Y., Shi, X., Qi, Z., 2010: Hypericin prolongs action potential duration in hippocampal

neurons by acting on K+ channels. - British Journal of Pharmacology 159: 1402–1407.

Wu, Y., Wang, F., Zheng, Q., Lu, L., Yao, H., Zhou, C., Wu, X., Zhao, Y., 2006:

Hepatoprotective effect of total flavonoids from Laggera alata against carbon

tetrachloride-induced injury in primary cultured neonatal rat hepatocytes and in rats with

hepatic damage. – Journal of Biomedical Science 13(4): 569-578.

Zanoli, P., 2004: Role of hyperforin in the pharmacological activities of St. John's Wort. – CNS

Drug Reviews 10(3): 203-218.

Zanoli, P., Rivasi, M., Baraldi, C., Baraldi, M., 2002: Pharmacological activity of hyperforin

acetate in rats. - Behavioral Pharmacology 13(8): 645–651.

Zhao, J., Meng, W., Miao, P., Yu, Z., Li, G., 2008: Photodynamic Effect of Hypericin on the

Conformation and Catalytic Activity of Hemoglobin. - International Journal of

Molecular Sciences 9: 149-153.

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: дипломски рад / мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Цонић

Ментор, МН: Перица Васиљевић

Наслов рада, НР: Утицај воденог екстракта Hypericum rumeliacum Boiss. на ћелије костне сржи и еритроците пацова Wistar у in vitro условима.

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2015.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

6 poglavlja/30 str./75 citata/12 slika/4 grafika

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: Биологија ћелије, ћелијска физиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Hypericum rumeliacum, цитотоксична активност, ћелије костне сржи, еритроцити, антихемолиза.

УДК 577.1:616.71 599.323.45

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Врсте рода Hypericum су веома значајне у традиционалној медицини. Род Hypericum карактерише значајно присуство секундарних метаболита, од којих су најзаступљенији нафтодиантрони, деривати флороглуцинола и флавоноиди. Циљ овог рада је испитивање утицаја воденог екстракта врсте Hypericum rumeliacum Boiss. на вијабилност ћелија костне сржи, као и његова протективна улога на мембране еритроцита периферне крви пацова соја Wistar. Добијени резултати показују да испитиване концентрације (1, 2, 3, 4 и 5 mg/ml) не поседују значајнији цитотоксични потенцијал али поседују антихемолитички потенцијал.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: проф. др Љубиша Ђорђевић

Члан: проф. др Марина Јушковић

Члан, ментор: проф. др Перица Васиљевић

Образац Q4.09.13 - Издање 1