Masena Spektrometrija [Compatibility Mode]

8/13/2019 Masena Spektrometrija [Compatibility Mode]

1/15

Masena spektrometrija (Mass spectrometry - MS)je analitika metoda za razdvajanjeioniziranih molekula na osnovu razlike u omjeru mase i naboja (m/z).

Radijus putanje (r) nabijene estice koja se kree kroz magnetno polje ovisi o gustoi

magnetnog toka (B), naboju (z) i brzini estice (v) pri emu je centripetalna sila (Fc)koja djeluje na esticu uravnoteena silom magnetnog polja (Fm).

Fm = B z vr =

m v

B z

Fc = mv2

r

Radijusi putanja estica jednakog naboja koje se kreu jednakom brzinom kroz

magnetno polje konstantne jakosti su proporcionalni masi estica to omoguujeda se iz radijusa putanja estica odrede njihove relativne mase.

m1 : m2 : m3 : ..... = r1 : r2 : r3 : .....


2/15

Molekule uzorka se najprije ioniziraju, zatim u elektrinom polju ubrzavaju i uvode uodabirabrzine koji se sastoji od elektrinog polja i na njega okomito postavljenog

magnetnog polja. Kada su ova polja jednake jakosti kroz izlaz odabiraa brzine moguproi samo ioni odreene brzine (v).

Fe = E z

Fm = B z vv =

E

B

Fe .... sila elektrinog polja

Fm .... sila magnetnog polja

E .... jakost elektrinog polja

Ioni iste brzine nadalje kroz magnetno polje putuju zakrivljenim putanjama iji se radijusiodnose kao njihove mase i konano detektiraju na kolektoru koji se pomie cijelomirinom polja.

U drugoj izvedbi MS mijenja se jakost napona (i/ili magnetnog polja) tako da ioni razliitihmasa imaju jednaku putanju (fiksni poloaj detektora) pa se iz odnosa veliina naponapri kojima dolaze do detektora izrauna odnos njihovih masa.


3/15

MS se sastoji od 3 osnovna dijela:

1. ionizator

2. analizator masa

3. detektor

Electrospray Ionization (ESI)

Fast Atom Bombardment (FAB)

Matrtix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Quadrupol (Q)

Time of Flight (TOF)

Tandem SM (QQQ; MS/Q ; Q/TOF itd.)

Elektronsko pojaalo

Scintilacijski broja


4/15

Uzorci se u ionizator mogu unositi direktno ili se prije razdvojiti na komponente nekomkromatografskom metodom (HPLC, GC, CE).

Metode ionizacije se razlikuju ovisno o sastavu uzorka i njegovom afinitetu za primanjeodnosno otputanje protona. Tako se proton akceptori (npr. proteini, peptidi i sl.) prevode

u kationski, a proton donori (npr. eeri, oligonukleotidi i sl.) u anionski oblik.

Tijekom ionizacije se mogu dobiti jednostruko ili viestruko nabijene molekule ovisno o

broju grupa koje mogu ionizirati.

Koliine i koncentracije uzorka potrebne za analizu se razlikuju ovisno o metodi koja sekoristi (1 10 l otopine; koncentracije 1 fmol 10 pmol).

1. Ionizatori


5/15

Fast Atom Bombardment (FAB)je najstarija blaga ionizacijska metoda koja se koristi

za velike bioloke molekule koje teko prelaze u plinovito stanje.Uzorak se otopi u nehlapivom matriksu i nanese na metalnu ploicu u ionizatoru tebombardira fokusiranom zrakom atoma (Xe, Cs+, glicerol-NH4

+). Udar zrake dovodi dorasprivanja molekula uzorka i matriksa u plinovitu fazu priemu se glavnina energije

potroi na molekulama matriksa pa ne dolazi do znaajnijeg frakcioniranja molekula

uzorka. Istodobno dolazi do ionizacije molekula uzorka.zraka iona / atoma

+

+

+

+ +

+

analizator


6/15

Electrospray Ionization (ESI) se koristi za velike bioloke molekule koje teko prelazeu plinovito stanje i ioniziraju.

Uzorak se otopi u polarnom hlapivom otapalu i pod visokim tlakom, brzinom 120 l/min,tjera kroz kapilaru na iji je vrh prikljueno jako elektrino polje (3-4 kV). Na izlazu izkapilare se uzorak raspruje u aerosol jako nabijenih kapi koje se zatim provode krozstruju vrueg plina pri emu otapalo isparava pa se kapi raspruju u jo sitnije kapljicesve dok se ne dobiju pojedinane ionizirane molekule.

plin

uzorak

vrui plin

elektroda

atmosferski tlak

analizator


7/15

Matrtix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) koristi se za termolabilne,nehlapive molekule velike molekulske mase.

Uzorak se pomjea sa matriksom ( u omjeru 1:1000), nanese na ploicu u analizatoru ina njega usmjeri laserska zraka (duikov, UV ili IR laser) pri emu glavninu energijeapsorbira matriks koji se zbog toga brzo zagrijava. Uzorak pri tome isparava i ionizira se.

+

+

+

+ +

+

laserska zraka

analizator


8/15

FAB ESI MALDI

Opseg masa (Da) 7 000 25 000 70 000 200 000 300 000

Osjetljivost niska visoka visoka

Potrebna

koliina analita

nmol pmol

fmol

pmol

fmol

Fragmentacija slaba nema slaba ili nema

Pozadinskisignal

visok (matriks) nizak visok (matriks)

Nije prikladna za molekule koje tekoioniziraju

smjese (trebavisoka istoa

uzorka)

fotosenzitivnemolekule

Provoenje arno kontinuirano arno

Provoenjeionizacije

kontinuirano kontinuirano kratki impulsi

Matriks nehlapivo otapalo vodena otopina vrstamikrokristalinina

struktura


9/15

2. Analizatori

Razliiti tipovi analizatora se razlikuju prema principu rada, opsegu razdvajanja m/z,preciznosti i rezoluciji.

Rezolucija (R)je sposobnost analizatora da razdvoji ione bliskih m/z omjera.

R =M

mm .... razlika masa izmeu dva simetrina,

blizu postavljena pika

M .... eksperimentalno odreena masa (Da)


10/15

Quadrupol (Q) analizator se sastoji od 4 metalna tapia rasporeena u dva okomitopoloena para. Jedan par tapia je spojen na odreeni konstantni napon i promjenjivu

radiofrekvenciju, a drugi ima napon i radiofrekvenciju suprotne polarnosti. Ioni prolazekroz sredite kvadrupola i pri datim uvjetima napona i frekvencije samo ioni odreenogomjera m/z imaju stabilnu putanju i prolaze do detektora. Frekvencija se varira kako bise ioni razliitih m/z doveli u fokus detektora. Opseg m/z koji se mogu analizirati naovaj nain ovisi o duljini i promjeru tapia.

+ +

-

-


11/15

Time of Flight (TOF) analizator se moe koristiti za gotovo neogranien rasponmolekulskih masa, vrlo je brz i ima ekstremno visoku osjetljivost. Ioni se u analizatorunose direktno iz ESI ili MALDI ukljuivanjem jakog elektrinog akceleracijskog poljakoje daje kinetiku energiju ionima. Ioni putuju kroz vakuumsku cijev do detektora, priemu su ioni sa manjim m/z bri pa dolazi do razdvajanja prema molekulskoj masi.


12/15

U svrhu poboljanja rezolucije i preciznosti mjerenja moe se pri kraju cijevi ugraditi serijaelektrikih polja (tzv. ionsko ogledalo ili reflekton) koja odbijaju ione nazad u cijev pod

odreenim kutom te se ioni konano fokusiraju na reflektronskom detektoru.

reflektron

reflektonski detektor

linearni detektor


13/15

Tandem MS (MS/MS ; QQQ; MS/Q ; Q/TOF itd.)je spoj dvaju ili vie analizatora useriju pri emu se mogu koristiti istovrsni ili kombinacije razliitih tipova analizatora.

Najee se koriste dva analizatora izmeu kojih se nalazi komora za fragmentaciju ukojoj se ioni uzorka bombardiraju molekulama inertnog plina pri emu dolazi dofragmentacije iona uzorka (Collision Induced Dissociation CID).Na ovaj nain mogu se dobiti informacije o strukturi molekula i detektirati odreenispojevi u sloenim smjesama na osnovu njihovog specifinog uzorka fragmentiranja.

Upotreba MS u analitici proteina: - identifikacija proteina- odreivanje istoe uzorka

- detekcija supstitucija aminokiselina- praenje postsintetskih modifikacija- odreivanje broja disulfidnih veza

- praenje enzimskih reakcija- praenje razgradnje i kemijskih modifikacija proteina

- potvrivanje sekvence (karakterizacija peptida)- praenje smatanja proteina- detekcija ligand-protein interakcija- odreivanje makromolekulske strukure proteina


14/15

Postupak identifikacije proteina:1. odreivanje mase cijele molekule (ESI TOF)

2. proteoliza proteina na peptide veliine do 2500 Da3. oitavanje mase peptida (ESI-TOF) u smjesi (mapa petida ili MS fingerprint)4. ponovno proputanje peptida u tandem MS/MS modu (ESI Q-TOF) ukljuujuifragmentaciju peptida (CID) to omoguuje odreivanje sekvence peptida

5. pretraivanje baza podataka posebnim algoritmima


15/15

Sekvenciranje peptida (Protein Ladder Sequencing ) veliine do 30 aminokiselinskihostataka moe se provesti kombinacijom Edmanove odgradnje i analize smjese peptidapomou MALDI -TOF MS.

Documents

Masena Spektrometrija [Compatibility Mode]