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Master Sciences

Mention « Microbiologie-Biologie Végétale et

Biotechnologies »

Année 2010/2011

Unité d’enseignement

« Initiation à la recherche en Microbiologie »

 

Fascicule de principes techniques

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Avant-propos

A titre d’exemples, certains protocoles sont explicités dans ce fascicule. Ceux-ci peuvent présenter de nombreuses variantes.

METHODES D'OBSERVATION DES MICROORGANISMES

Bactériologie

Il est possible d'observer les microorganismes- soit lorsqu'ils sont regroupés en colonies sur boîte visible à l’œil, il s'agit alors d'uneobservation macroscopique

- soit à l'état de cellule, il s'agit alors d'une observation microscopique.

1 - Observation macroscopique des colonies

C'est l'étude de l'aspect des colonies.Une colonie est l'amas, visible à l’œil nu, constitué par des milliards de descendants

d'une seule cellule bactérienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sontcaractéristiques de chaque espèce.

L'étude de l'aspect des colonies nécessite l'observation à l’œil nu, en lumière naturelle etartificielle, par éclairage direct et par transparence des colonies.

Conditions d'examen L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de l'isolement aprèsincubation . L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé, de la durée et de la température del'incubation . Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : lescolonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées.

Les colonies sont observées par transparence, réflexion ou transillumination oblique.

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 AspectLa description des colonies doit mentionner

1 : La taille ou le diamètre de la colonieElle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies.

2 : La forme- allure des contours  

lisses, dentelés, déchiquetésréguliers, irréguliers

- relief  surface bombée, demi-bombée, platecentre parfois surélevé, parfois ombiliqué (en creux)

3 : L'aspect de la surfaceIl peut être lisse ou rugueux,

4 : L'opacitéLes colonies sont décrites comme- opaques (ne laissent pas passer la lumière)- translucides (laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, comme leverre dépoli)- transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers, comme le verre)

5 : La consistanceAu moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses (onobtient facilement des suspensions homogènes), sèches ou encore muqueuses (on obtientdifficilement des suspensions homogènes).

6 : La couleur (pigmentation)Les colonies habituelles sont crème. Une couleur différente est due à des pigments : jaune, rouge,orange, violette ...

 Principaux types

En rassemblant les critères précédemment décrits, trois sortes de colonies peuvent êtredistinguées

- colonies S (de l'anglais Smooth - Lisse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées,de consistance crémeuse et donnant des suspensions homogènes

- colonies R (de l'anglais Rough - Rugueux) : colonies à surface rugueuse et bords dentelés, plates, de consistance sèche et donnant des suspensions hétérogènes

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 - colonies M (= Muqueuse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées, filantes sousl'anse, et donnant des suspensions hétérogènes.

7 : Odeur- une odeur caractéristique peut être présente

2 - Observation microscopique

L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellulesd'une espèce microbienne.Elle comprend

l'examen à l'état frais (examen entre lame et lamelle des bactéries vivantes)l'examen après coloration (le plus souvent sur frottis séchés et fixés).

2.1 - Examen à l'état frais

Il permet d'observer sur les cellules vivantes:- la forme des cellules- leur mode de groupement- leur mobilité- la quantité approximative des bactéries par champ microscopique

* Forme des cellules

Ce caractère est très important en bactériologie, il peut à lui seul conduire à ladétermination de genre mais on doit l'utiliser avec une extrême prudence. C'est ainsi qu'ondifférencie des germes ayant :

- une forme sphérique : les cocci (ordres de Micrococcales)- une forme allongée en bâtonnet : les bacilles (ordre des Bacteriales)- une forme intermédiaire : les cocobacilles- une forme incurvée en virgule (vibrio) ou en ondulation (ordre des Spirillales)- une forme spiralée (ordre des Spirochaetales)- une forme ramifiée (ordre des Actinobactériales).

Attention l'examen est effectué à travers une certaine épaisseur de liquide, des bactéries

identiques pourront apparaître sous des angles divers et sembler différentes.

A côté de la forme elle-même des bactéries, l'étude des groupements  retrouvés dans lescultures et qui sont liés au mode de division des germes vient compléter les donnéesmorphologiques et fournir de précieuses informations pour l'identification . Ainsi dans l'ordre desMicrococcales, les différents groupements observés sont caractéristiques d'un genre donné:

- groupement par deux en diplocoques:

genre Pneumococcus  pour les cocci Gram +

genre Neisseria  pour les cocci Gram -

- groupement en chainettes:

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  genres Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus  - groupement en tétrades : genre Gaffkya - groupement en amas plans (grappe de raisin): genre Staphylococcus  

- groupement en amas non plans:amas cubiques: genre Sarcina amas irréguliers : genre Micrococcus

- groupements en palissades ou en lettres (XVL): genres Corynebacterium etCellulomonas. 

* Mobilité

La mobilité est le caractère le plus important mis en évidence à l'état frais. On doitobserver :

- la présence ou l'absence de mobilité

- les caractères de cette mobilité : frétillement des bactéries à ciliature polaire outournoiement des bactéries péritriches.

Remarque: Une bactérie mobile doit se déplacer dans le champ microscopique avec unmouvement qui lui est propre, les autres bactéries restant immobiles ou se déplaçant dansd'autres directions. Attention cette mobilité ne doit pas être confondue avec les mouvements browniens qui sont des mouvements désordonnés de particules (sans déplacement véritable)dus à l'agitation thermique des molécules de liquide ni avec les mouvements transmis par lescourants (toutes les bactéries sont entrainées dans la même sens).

* Eléments particuliers de la bactérie

La capsuleLa présence d'une capsule est révélée à l'état frais de la souche cultivée sur milieu

enrichi, par la coloration négative à l'encre de Chine. Sa mise en évidence est un indiceimportant .

Ex : des diplocoques Gram+  entourés d'une capsule importante évoquent Streptococcus  pneumoniae.

Les sporesLeur présence permet à elle seule de ranger les bactéries aérobies dans la famille des

Bacillaceae. De plus la spore et sa position permettent la classification des bactéries en groupesà l'intérieur d'une famille.

2.2 - Examen après coloration

Si la plupart des bactéries et des microbes peuvent être observés en suspension aqueuse,cette observation est grandement facilitée par l'application de colorants.

Les colorations, réalisées sur des frottis séchés et fixés, sont classées en

coloration simple (1 seul colorant)

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 coloration différentielle type Gram

L’action de plusieurs colorants permet des effets de contraste: un premier colorant

(cristal violet), un mordant qui complexe le colorant (lugol, acide phénique, acide chromique,chaleur), un différenciateur qui est une substance décolorante (alcool à 90°, mélangealcool/acétone, acides forts) et enfin un deuxième colorant .

colorations spécialesdes structures bactériennes (cils ou pili, capsules, spores ...)

La coloration de Gram

C'est la coloration différentielle systématiquement réalisée lors d'un examenmicroscopique de bactéries.

Elle permet non seulement d'observer la forme des cellules mais aussi de diviser les bactéries en deux grands groupes taxonomiquement différents:

- bactéries Gram-positives : Gram +

- bactéries Gram-négatives : Gram -

Les bactéries qui retiennent le colorant basique utilisé (cristal-violet) après lavage àl'alcool sont dites Gram-positives, celles qui ne le retiennent pas sont dites Gram-négatives.

Les bactéries Gram-négatives peuvent prendre la couleur d'un second colorant. Leur paroi ne présente pas de barrière de perméabilité à l'élution du complexe colorant-mordant parl'alcool.

La paroi des bactéries Gram + est imperméable au complexe colorant-mordant, elles nesont pas décolorées.

Procédure :

- Préparer la lame et l'échantillon à examiner comme pour un état frais.- Etaler la suspension bactérienne en un film mince et régulier sur la lame avec une ansede platine par un mouvement régulier et circulaire (étalement de 2 à 3 cm de diamètre).- Laisser évaporer à sec soit à l'air libre, soit en tenant la lame bien au dessus de laflamme, le frottis doit devenir terne mais ne doit ni brunir, ni brûler.- L'étape de fixation qui suit consiste à tuer les bactéries, à rendre les membranes plus

 perméables, à fixer les structures sans les altérer et à faire adhérer le frottis à la lame.En tenant la lame avec une pince écraser trois fois la flamme avec la lame, le frottis est prêt à subir une coloration. (Il existe une technique plus délicate qui consiste à verserquelques gouttes d'alcool à 90°C sur la lame, laisser quelques secondes, égoutter etenflammer).

Coloration de Gram :

- recouvrir le frottis fixé de cristal-violet, laisser agir une minute- laver l'excès de cristal violet avec quelques gouttes de Lugol; attendre 1mn- laver à l'eau et égoutter sur un mouchoir en papier.

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- traiter la préparation avec de l'alcool à 95° (ou avec un mélange alcool/acétone) goutte àgoutte jusqu'à ce que l'alcool ajouté n'entraîne plus de cristal-violet- recolorer avec la safranine pendant une minute (si le décolorant utilisé est un mélange

alcool/acétone, ne colorer que 20 secondes avec la safranine)- laver, égoutter, sécher doucement la lame entre deux feuilles de papier Joseph.- Observer à l'immersion avec l'objectif ayant le plus fort grossissement sans contraste de phase (0 ou HF). Pour cela, déposer une goutte de liquide à immersion sur la lame,directement au contact du frottis. Ne pas utiliser de lamelle.

Champignons filamenteux

Les champignons constituent un groupe d’organisme d'une extrême variété, des espècesmicroscopiques aux organismes de plusieurs kilos. Ils ont colonisé tous les milieux, terrestres ouaquatiques, et jouent un rôle primordial dans l'écologie de la planète en recyclant la matièreorganique morte.

Les champignons présentaient déjà de grandes diversités à l'ère carbonifère. Ils sont parmiles plus anciennes formes « végétales » différenciées apparues sur le globe terrestre. Classés,initialement, parmi les végétaux à cause de la structure de leurs cellules, ils ne réalisent pourtant pas de photosynthèse.Ce groupe, dont les quelque 100 000 espèces se sont adaptées à des modes de vie très variés, estmaintenant considéré comme un règne à part entière. Certains s'associent par symbiose à desalgues pour survivre dans des conditions climatiques extrêmes, d'autres parasitent la peau del'homme, quant aux saprophytes, ils provoquent la pourriture du bois.

Ce sont des Eucaryotes.Ils sont hétérotrophes : ils ne peuvent pas, comme les plantes vertes, synthétiser la

matière organique à partir du gaz carbonique atmosphérique et doivent donc puiser dans le milieuambiant l'eau, les substances nutritives et les éléments minéraux nécessaires à la synthèse de leur propre matière. Ils les absorbent à travers la paroi de leur appareil végétatif.Sans véritables tissus, à l'inverse des plantes supérieures ou des animaux, leur appareil végétatif :le thalle   ne comporte ni racine, ni tige, ni feuille. Le thalle peut être constitué d'une celluleunique, comme dans le cas de la levure de bière, ou plus souvent, d'une structure filamenteuse,ou mycélium. Le mycélium est non cloisonné chez les champignons inférieurs, et les filamentsmycéliens, ou  hyphes, peuvent être comparés à des cellules géantes. Chez les champignonssupérieurs le mycélium est cloisonné, en effet les hyphes sont divisées en plusieurs segmentscontenant chacun un ou plusieurs noyaux.

D’un point de vue structural les hyphes sont des sortes de tuyaux contenant le cytoplasme,les noyaux et autres organites cellulaires. Elles sont chez les champignons supérieurs cloisonnées.Dans les parties jeunes du mycélium les cloisons sont percées de pores qui permettent le passagedu contenu cellulaire d'un compartiment à l'autre. Dans les parties les plus âgées, les cloisons sontfermées, isolant les parties en voie de dégénérescence des parties actives. Des septums assurent lecloisonnement des différents compartiment cellulaire (Fig1, Fig 2 et Fig3).

La colonisation du susbstrat est réalisée par extension et ramification des hyphes.L'accroissement de celles-ci s'effectue par le sommet, ou apex, où s'effectue l'essentiel desréactions de synthèse et dégradation du métabolisme dit "primaire", indispensable à laconstruction de la cellule du champignon. Les régions apicales des hyphes sont caractérisées par

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la présence de nombreuses vésicules cytoplasmiques contenant les enzymes et les précurseurs desynthèses de nouveaux polymères. Les produits du métabolisme "secondaire" non indispensableau fonctionnement de la cellule, sont plutôt stockés en région subapicale. Les métabolites

secondaires les plus connus sont les pigments, les antibiotiques, les mycotoxines...Le mycélium croît et s'étend pour former un réseau à trois dimensions capable de s'organiser enstructures complexes, tels que les chapeaux des champignons supérieurs. Le chapeau et le pied, partie visible du champignon, ne constituent que sa fructification (organe a reproducteur quicontient les spores produites au cours de la reproduction sexuée).

Fig2  : Région apicale d’une hyphe Fig 4  : Une colonie :

Fig 3  : architecture d’une cellule fongique (ascomycètes, deutéromycètes)

Le développement de l’hyphe se fait à partir d’une spore (sexuée ou asexuée) parémission d’un ou plusieurs tubes germinatifs et par croissance de la seule cellule terminale. Laformation d’une colonie se fait de façon radiale à partir du point d'inoculation.

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La complexité des cycles de reproduction sexuée ou asexuée est l'un des éléments qui ontentraîné la création d'un règne à part pour les champignons. La classification des espèces estd'ailleurs fondée sur ces particularités.

La  reproduction asexuée   se réalise différemment selon l'espèce: par bourgeonnementchez la levure, par individualisation d'un des segments d'une hyphe ou par formation de sporesasexuées.

Fig 5  : Sporulation asexuée :  A. niger   et  A. fumigatus

La  reproduction sexuée nécessite la fusion de deux cellules spécialisées, ou gamètes.

Les levures

Les levures sont des champignons microscopiques unicellulaires (ou très faiblement pluricellulaires) qui se multiplient par bourgeonnement ou sporulation. Elles ont la capacité defermenter des matières organiques, minérales ou végétales pour produire des substances variées.Les levures sont constituées par les espèces du genre Saccharomyces, agents de la fermentationalcoolique de la bière, du vin, du cidre, et des éléments actifs du levain de boulanger. C'estl'activité chimique des levures qui provoque le dégagement de bulles de gaz carbonique et faitlever la pâte à pain. Ces levures sont des cellules rondes ou ovales, qui, placées dans un milieusucré ou glucidique, avec ou sans oxygène, se multiplient activement.Ces micro-organismes ont un diamètre compris entre 6 à 8 10 -6 m .

Saccharomyces pompe  : ce groupe se caractérise par son mode de division végétatif qui esttransversal alors que les autres levures bourgeonnent. Elle a une forme rectangulaire.

Saccharomyces cerevisiae. Au microscope, elle apparaît de formes arrondies ou ovoïdes.Bourgeon en formation

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CROISSANCES BACTERIENNES

RAPPELS SUR L'ENERGETIQUE DE LA CROISSANCE 

La croissance peut être définie comme un accroissement ordonné de tous les composants

d'un organisme. Chez les organismes unicellulaires, elle aboutit à une augmentation du nombre

d'individus. Cette augmentation du nombre de cellules se traduit par une augmentation de la

turbidité du milieu de culture. On peut admettre que lorsque la densité optique du milieu ne

dépasse pas la valeur 0,6 (avec les spectros de TP) il y a proportionnalité entre le nombre

d'individus présents dans la culture et la densité optique.

Le développement d'une culture sera donc facilement représenté en traçant le graphique

des densités optiques en fonction du temps : D.O. = f (t)En réalité, pour des raisons de précision, on tracera plutôt le graphique du log de la D.O.

en fonction du temps sur papier semi-logarithmique.Au temps to  on a xo  bactéries dans le milieu (inoculum)

au temps t on a x  bactéries dans le milieu

Pendant l'intervalle de temps dt, l'accroissement du nombre de cellules de la culture sera

 proportionnel à x 

Donc :dx/dt = µ.x (1) où: dx/x = µ.dt

d'où : Ln x = µ . t + constante (2) Ln = log népérien

Au temps t = o, on a xo bactéries, donc : Ln x o = constante (3)

De (2) et (3), on tire: Ln x = µ . t + Ln xoLn x-Lxo  = µ . t

Ln x/xo =  µ . t

On passe en exponentielle : x/xo = eµt

soit : x = xo . eµt

  (4)

Si l'on considère que la masse unitaire des bactéries présentes dans la culture est

constante, la relation (4) peut s'écrire :

m = mo . eµt  (5) m o = masse de l'inoculum

Soit t le temps nécessaire à un doublement de la population (temps de génération). C'estle temps pour lequel on a : m = 2.mo 

Si l'on reporte cela dans (5), on a : 2 mo = mo eµt 2 = e µt 

Donc : Ln 2 = µt . Ln e ( or Ln e = 1 )

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soit :0,69 = µt d'où l'on tire: µ = 0,69/t; µ = taux népérien de croissance

Pour une culture en phase exponentielle de croissance, le logarithme du nombre

d'organismes s'accroît linéairement en fonction du temps.

En conséquence, on peut admettre que le log de la masse bactérienne et donc le log de laDO600 nm s'accroissent eux aussi linéairement en fonction du temps.

La croissance d'une culture est affectée par des facteurs tels que :

- l'état physiologique des cellules utilisées pour inoculer le milieu,

- la composition du milieu

- les conditions d'incubation.Ces différentes influences se répercutant sur la forme de la courbe de croissance, il sera

assez facile de mettre leurs effets en évidence par comparaison des courbes établies dans diverses

conditions de culture.

Ces différents facteurs vont aussi se répercuter sur une grandeur très importante : le

rendement de la croissance K :

K = masse de bactéries produites (en g poids sec) quantité d'aliment consommé (en g) 

Par la suite, on appellera rendement moléculaire de croissance : La valeur de Y s'exprimera donc

en grammes. mole -1.Y = masse de bactéries produite ( en grammes P.S)

quantité d'aliment consommé (en moles) Remarques : en milieu non renouvelé, Y est constant tout au long de la croissance si celle ci est

 bien limitée par la source d'énergie.

- Y ne peut être déterminé qu'en milieu minimum, c'est-à-dire ne contenant qu'un seul

substrat énergétique. Donc la masse de bactéries synthétisée en fin de croissance dépend de la

quantité initiale de substrat limitant. 

De manière pratique

Pour établir une courbe de croissance, il convient d’ensemencer un milieu de culture

avec un inoculum provenant d’une préculture réalisée dans les mêmes conditions que celles

établies pour l’étude (atmosphère, nature du milieu, riche ou minimum, température, agitation,

facteur limitant la croissance). La cinétique de croissance est suivie par lecture de l’absorbance de

fractions aliquotes prélevées par exemple toutes les 20 minutes.

La valeur lue est rapportée directement sur une feuille de papier à échelle semi-

logarithmique (DO échelle log en ordonné ; temps, échelle millimétrée en abscisse). La phase

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TRANSFORMATION DE MICROORGANISMES

Définition : Modification héréditaire des propriétés d'une bactérie par un ADN extérieur. Ce phénomène existe naturellement chez certaines bactéries comme Acinetobact er.La transformation "naturelle" ou physiologique est le premier modèle connu de transfert dematériel génétique (ADN), qui est fixé et absorbé par des bactéries réceptrices, dites en état decompétence. Ce modèle a permis en 1944 de démontrer que l'ADN était le support chimique del'hérédité.

Principe :

D'une part, il doit y avoir de l'ADN libéré d'une bactérie (exogénote). D'autre part celui-ci doitêtre fixé sur une bactérie réceptrice en phase de compétence

Cette absorption d'ADN est suivie d'une recombinaison génétique avec acquisition de nouveauxcaractères génétiques stables, donc transmissibles à la descendance.

Ce transfert naturel d'ADN bactérien est limité à quelques espèces. Il est partiel : une partie del'exogénote (1-2% du génome) pénètre et se recombine (si homologie suffisante).

La transformation est une technique de base du génie génétique. Elle est utilisée quotidiennementdans les laboratoires lors de clonage.

Des cellules non transformables naturellement   comme  E. coli  mais rendues compétentes partraitement chimique (classiquement par des traitements au CaCl2) peuvent être transformées avecde l’ADN plasmidique.

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1- Cellules compétentes

Protocole de préparation de cellules compétentes :- pour 50 mL de culture1 - Ensemencer le milieu liquide Luria Broth (LB) au 1/100 avec culture de la nuit. Incuber   à37°C avec agitation.2 - Quand DO550 = 0,45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. Transférer dansdes récipients de centrifugation refroidis.3 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rotations par minute (rpm) à 4°C.4 - Jeter le surnageant en égouttant au maximum et reprendre le culot dans un petit volume deCaCl2 100mM glacé avec agitation douce. Compléter à 20 ml avec la même solution.5 - Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus).

6 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rpm à 4°C.7 - Jeter le surnageant  et reprendre le culot   dans un petit volume de CaCl 2  100mM -15%

glycérol glacé avec agitation douce. Compléter à 1,25 ml.8 - Laisser dans la glace 15 minutes au moins.9 - Aliquoter, refroidir dans l'azote liquide. Conserver à -70°C. 

2-Transformation bactérienne

Préparer des tubes de bactéries compétentes contenant 100µl d'une suspension de cellulesd' Escherichia coli. Ils doivent être maintenus dans de la glace.Les manipulations devront se faire stérilement près d'un bec Bunsen allumé.Protocole : 1 - t = 0. Ajouter l'ADN dans les tubes ; agiter le tube. Les bactéries restent dans la glace.

2 - t = 25 minutes. Agiter légèrement et transférer les tubes dans un bain-marie à 37°C pendant 3minutes.3 - t = 28 minutes. Agiter legèrement et laisser les tubes 10 minutes dans la glace.4 - t = 38 minutes. Ajouter stérilement 0,5 ml de milieu liquide Luria Broth (LB) préchauffé à37°C ; agiter légèrement. Transférer à 37°C durant 60 minutes.5 - t = 98 minutes. Agiter légèrement et étaler les bactéries (éventuellement après dilution selon le protocole qui aura été discuté). Sur chaque boîte, étaler 100µl de la suspension de bactéries.Remarque   : pendant les temps morts les boîtes des différents milieux seront marquées et lestubes de dilution préparés, selon le protocole que vous aurez entrepris.Commentaires : 1

ère étape : l'ADN en solution dans le tube va venir s'adsorber à la surface des bactéries. Il n'entre

 pas dans les bactéries car à 0°C les phospholipides sont figés (donc les menbranes sont figées).2ème  étape   : on passe de 0°C à 37°C. La fluidité membranaire se trouve alors presqueinstantanément restaurée. Ceci permet à l'ADN de franchir l’ enveloppe bactérienne.3

ème étape  : retour à température ambiante.

4ème  et 5ème  étapes   : le milieu liquide LB préchauffé à 37°C va restaurer le métabolisme et lacroissance des bactéries (1 à 2 cycles de division). Durant 60 minutes le plasmide va pouvoir serépliquer ; les gènes vont s’exprimer, notamment le gène codant pour l’enzyme conférant aux bactéries transformées la résistance a un antibiotique. Puis on triera les bactéries sensibles et les bactéries resistantes en les plaçant sur un milieu renfermant un antibiotique (principe de sélection positive par expression directe). On récupérera ainsi les bactéries transformées.

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3- L’electrotransformation

L'électrotransformation a pour but la perméabilisation de la membrane cytoplasmique sousl'influence d'un champ électrique. Les fonctions précises qui induisent cette perméabilisation sontencore mal connues, mais il semble que la membrane soit destabilisée localement ettransitoirement, laissant apparaître des structures transitoires de perméation (STP) qui autorisentl'entrée ou la sortie de molécules. Dans le cas d'une transformation, le but recherché est l'entréede matériel plasmidique dans les cellules avec bien sûr, la notion de rendement maximum. Oncherche à obtenir le maximum de transformants par g d'ADN. Pour ce faire, 3 paramètresdoivent être contrôlés:

- le champ électrique appliqué, dont la tension et la durée doivent être suffisament élevées pour induire l'apparition de STP, sans tuer les cellules (pour E. coli, 5 à 6 kV/cm, 4 ms).

- la résistance du milieu, qui doit être très grande de façon que l'énergie du choc électrique

ne soit pas dissipée en chaleur.- la concentration de cellules, qui doit être suffisante pour que le courant passe par contactentre les cellules (habituellement de l'ordre de 1011 cellules/ml).

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Minipréparation de plasmides et analyse de restriction

Les plasmides :

Les plasmides sont des éléments génétiques que l'on trouve dans une grande variété de bactéries. Ce sont des molécules d'ADN bicaténaire et circulaire dont la taille varie, selon lestypes, de 2000 à 200 000 paires de bases. Ils contiennent souvent des gènes dont les produitssont utiles à la bactérie (par exemple un gène conférant la résistance à un antibiotique).

L'utilisation des plasmides a permis la construction d'outils appelés vecteurs , qui sont desADN plasmidiques (ou phagiques) modifiés et qui ont permis le développement des techniquesde biologie moléculaire. Dans ces vecteurs on peut insérer dans des endroits précis un fragmentd'ADN étranger (clonage). Cette construction (plasmide recombinant) est ensuite introduite dansdes bactéries (transformation) où elle pourra être produite en un grand nombre de copies.

Des méthodes rapides ont été mises au point permettant d'isoler l'ADN plasmidique enquantité et en qualité suffisantes pour effectuer un certain nombre d'analyses. Bien que cesméthodes puissent différer sur certains points, les étapes principales restent les mêmes :

- croissance des bactéries contenant le plasmide à extraire- récupération des cellules bactériennes par centrifugation- lyse des cellules avec un tampon approprié (il s’agit souvent d’un mélange de SDS et de NaOH : on parle alors de lyse alcaline)- précipitation de l’ADN plasmidique en présence d’éthanol ou d’isopropanol (il peutaussi s’agir d’une fixation spécifique de l’ADN sur une résine)- resuspension de l’ADN dans de l’eau ou dans du tampon

Une fois purifiés, ces ADN plasmidiques peuvent être analysés par électrophorèse sur geld'agarose. On peut ainsi contrôler la qualité d'une préparation de plasmides.

Les enzymes de restriction :

Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire desenzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’unacide nucléique. Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la moléculed’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).

Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître spécifiquement une courteséquence, de 4 à 10 pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils permettent de fragmenter l'ADN en

segments de taille réduite. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deuxfragments dont les extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupuredissymétrique : on parle dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaînequi dépasse l'autre de quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont été caractérisés :ils reconnaissent une grande variété de sites de coupure.

Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sonthabituellement des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont desséquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’ vers 3’ (gauche-droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens5’ vers 3’). Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases.

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Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4). La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en majuscule,elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde lettre et la

troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme estextraite. On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à la souche bactérienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de cesenzymes.Exemples: EcoRI, extraite de Escherichia coli  RYB, site reconnu: G / AATTCSmaI, extraite de Serratia marcescens, site reconnu: CCC / GGGPst I, extraite de Providencia stuartii, site reconnu: CTGCA / G

Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie moléculaire.Elles peuvent être utilisées pour établir une carte de restriction de toute molécule d'ADN que l'on

souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction le long de cettemolécule, qui vont produire, après "digestion enzymatique" de cette molécule, des fragments detailles différentes dont la taille pourra être définie par électrophorèse. Les enzymes de restriction peuvent également être utilisées pour préparer un fragment d’ADN d’un gène donné (insert) àêtre inséré dans un vecteur comme un plasmide.

Un grand nombre d’enzymes sont commercialisées. Une unité d’activité enzymatique estdéfinie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour couper 1 µg d’ADN en 1 heure dans letampon et à la température appropriés pour l’enzyme utilisée.

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PCR = Polymerase Chain Reaction

( réaction de polymérisation en chaîne ) 

1) Introduction

La PCR est une méthode permettant la multiplication d’une courte séquence d’ADN (jusqu’à 2ou 3 Kb en routine et parfois plus) appelée séquence cible, à partir d’une infime quantité d’ADNgénomique ou plasmidique. Elle est même possible à partir de l’ADN génomique issu d’unecellule unique voire a patir de cellules lysées. Elle est réalisée dans un tube à essai (Tubeeppendorf) en quelques heures. Publiée en 1985 par R. Saiki, elle a révolutionné le diagnosticmoléculaire des maladies génétiques comme bien d’autres domaines. 

Le taux de multiplication (ou taux d’amplification) est tel que la réaction revient à rendrenégligeable le reste du génome qui n’a pas été amplifié car le produit de PCR contient presqueexclusivement des millions d’exemplaires de la séquence cible. Il est donc facilement analysable par exemple sur un gel d’électrophorèse en fluorescence UV sans avoir à rechercherspécifiquement la séquence cible par hybridation moléculaire comme c’était le cas auparavant(technique de Southern-blot). La PCR est utilisée dans la très vaste majorité des diagnosticsmoléculaires.

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2) Principe

La séquence cible est multipliée par synthèses successives à l’aide :

- des amorces (Primers), fragments courts d’ADN, spécifiques (ou non) de la séquence àamplifier, il s’agit généralement d’oligonucléotides de 18 à 25 bases, dont les séquences nedoivent pas être complémentaires et qui ne doivent pas former de structures secondaires.- d’un enzyme particulière, une ADN polymérase active à haute température, température àlaquelle l’ADN est dénaturé, comme par exemple la Taq polymérase

Chaque synthèse ou cycle de PCR est constituée de 3 étapes constituées de trois plateaux detempérature différents : dénaturation (autour de 95°C), hybridation des amorces (entre 50 et60°C) et polymérisation ou élongation (autour de 72°C). On considère souvent un tempsd’élongation de 1 minute par Kb à amplifier. Chaque cycle dure quelques minutes. La séquencecible étant doublée à chaque cycle, le taux d’amplification (théorique) est de 2(exposant)n, si bien

qu’après une trentaine de cycles de PCR, le nombre de copies de la séquence cible est plusieursdizaines de millions de fois supérieur à n’importe qu’elle autre séquence du génome. Cette sur-représentation la rend facilement analysable et manipulable.

3) La réaction 

Le milieu réactionnel doit contenir :

l’ADN contenant la séquence à amplifier ; il peut s’agir de l’ADN génomique ou d’ADN plasmidique contenant une séquence d’intérêt

les deux amorces olignonucléotidiques monobrins complémentaires chacune d’une desextrêmités du fragment à amplifier.

des désoxynucléotides libres dATP, dCTP, dGTP, dTTP qui sont incorporables pourformer le brin d’ADN néosynthétisé.

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du MgCl2 et une solution donnant au milieu réactionnel un pH et une concentration salineoptimale pour le fonctionnement de l’enzyme

l’enzyme permettant la synthèse d’un néobrin à partir des amorces ; il s’agit d’une ADN

 polymérase thermostable, par exemple la Taq DNA polymérase issue du micro-organismethermophile : Thermus aquaticus.

Le tube contenant le milieu réactionnel est placé dans un appareil appelé « thermocycleur », sortede plaque chauffante programmable en temps et en température et disposant de délais de montéeet de descente en température extrêmement courts. Il délivre à chaque instant au milieuréactionnel une température donnée permettant la réalisation de l’une des trois étapes du cycle dePCR : dénaturation, hybridation ou synthèse.

Simulation d’une réaction PCR :

 Nombre de brin d’ADN : 1 Nombre de cycles : 25 Nombre de copies : 33 554 432 Nombre de copies cibles : 33 554 382

Copies cibles = 99.99985% Nombre de copies

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4) Les limites de la technique

a) La PCR suppose la synthèse chimique de deux oligonucléotides utilisés pour l’amorçage

de la réaction. Il faut donc que la séquence nucléotidique du fragment à analyser soit connue auniveau de ces régions d’amorçage. Il est néanmoins possible de contourner le problème enclonant le fragment dont la séquence est totalement inconnue dans un vecteur (plasmide, bactériophage ...) afin d’utiliser la séquence (connue) du vecteur pour amorcer la réaction dePCR..

 b) La taille du fragment à amplifier ne peut pas dépasser quelques kilobases. Au-delà, il se produit des phénomènes qui empêchent la réaction de se faire normalement : interruptions prématurées dues à la formation de structures secondaires, réappariement des fragmentsnéosynthétisés entre eux etc………

c) Le taux d’amplification est théoriquement de 2(exposant)n mais en pratique le rendement de laréaction n’est jamais de 100%.

d) Au-delà d'un certain nombre de cycles, le taux d'amplification baisse progressivement pourtendre vers 1 (Voir ci après). Ceci est dû à une diminution de la concentration desdésoxynucléotides et des oligonucléotides et à l'augmentation de la concentration du produit dePCR.

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5) Design des amorces

Les amorces doivent être spécifiques, stables et compatibles

Les amorces ont en général une longueur de 21 nt (ou 21 mers) et sont toujours écrites du5’ vers le 3’.

Généralement les nucléotides G et C plus stables, sont privilégiés à l’extrémité 5’ alorsque les nucléotides T et A moins stables sont privilégiés à l’extrémité 3’.

Extrémité 3’ stable Extrémité 5’ stable

En effet le sens de la polymérisation étant 5’ 3’, l’initiation de la polymérisation parla Taq sera rendue plus efficace par la facilité d’accession à cette extrémité moins rigide del’amorce hybridée sur la cible.

Ex : Choi x d’ amorces obt enues avec l e pr ogr amme en l i gneht t p: / / f r odo. wi . mi t . edu/ pr i mer 3/

GTCATGGTGATGTGGTTTGTTTGCTGCTCAGCCATGCGGAAAACGGCCTCCAATGTGCTG>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

AATACGTCATGCGCATCCCCGTCAAGCTCGCTCGCGTAATGGACACCCTGTACGAAAGTG

CCTTGGGCTTTTGCAATGTCGACAGCCTCCATAATCAATCCCATATAATCCGGCTCATTC

ATTGGATAAAGGGCAAATTGGCACGGCG

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Purification d'une protéine

Pour étudier la structure et les fonctions biologiques d'une protéine in vitro, plusieurs étapesessentielles doivent être mises en œuvre afin d'obtenir une protéine suffisamment pure etconcentrée pour être utilisée dans différents tests enzymatiques ou chimiques. Les principalesétapes sont schématisées ci-dessous :

2 . Préparation d'unextrait protéique

1 . Surproduction

3 . Purification

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- Surproduction : Le gène d'intérêt est cloné dans un vecteur d'expression, qui porte également un

gène de résistance à un antibiotique (par exemple, le gène bla   dont l'expression entraîne unerésistance à l'ampicilline). Après des bactéries par le plasmide recombinant, ces dernières sontcultivées en présence de l'antibiotique ad hoc  afin de sélectionner uniquement les bactéries portant le vecteur. Arrivées en phase exponentielle (DO600 comprise entre 0,4 et 0,7), il est alors possible d'ajouter un inducteur dans le milieu de culture (arabinose pour pBAD, ou IPTG pour le promoteur  Lac   par exemple) qui est ensuite importé dans le cytoplasme bactérien. En se fixantsur le promoteur localisé en amont du gène cloné, l'inducteur augmente le niveau de transcriptiondu gène, ce qui a pour effet direct de surproduire la protéine d'intérêt.

Préparation d'un extrait protéique : Cette étape va consister à préparer un extrait "brut" à partir dela culture cellulaire précédente. Pour cela, il va falloir rompre les cellules soit par choc

mécanique (presse de French, ultrasons), soit par traitement enzymatique (lysozyme). Aprèscentrifugation, on retrouve toutes les molécules solubles dans le surnageant, alors que les débriscellulaires, les membranes biologiques et les molécules insolubles sont concentrés dans le culot.

Purification : A ce stade, le but est de séparer la protéine d'intérêt de toutes les autres protéines présentes dans l'extrait. Plusieurs critères permettent la séparation des protéines : leur taille (gelfiltration), leur charge (chromatographie échangeuse d'ions), leur affinité (chromatographied'affinité, immuno-adspoption). Généralement, plusieurs étapes faisant intervenir différentscritères de séparation sont nécessaires pour permettre une purification efficace.Depuis une dizaine d'années, les techniques de biologie moléculaire ont permis la construction de protéines recombinantes possédant une étiquette (ou tag) greffée sur leur extrémité N- ou C-

terminale. La plus répandue est l'étiquette histidine, qui est constituée d'un hexapeptide de 6histidines qui ont la propriété de se fixer sur le nickel. On peut également citer le "flag peptide",qui est un octapeptide reconnu spécifiquement par un anticorps. Le principal intérêt de cetteapproche est d'obtenir un protocole de purification en une étape, l'inconvénient étant que la protéine purifiée porte un peptide additionnel sur l'une des deux extrémités.

Evaluation de la pureté de la protéine : Une fois la protéine purifiée, il est possible d'évaluer sondegré de pureté en la faisant migrer sur SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamideGel Electrophoresis). Si la purification est correcte, on ne doit obtenir qu'une seule bande migrantà la taille de la protéine si elle est monomérique, ou à la taille de sa sous-unité si elle estoligomérique. Cette étude peut être complétée par la technique de western-blot, qui permet deconfirmer les résultats obtenus par SDS-PAGE en faisant agir un anticorps reconnaissantspécifiquement la protéine purifiée. Cette expérience permet également de visualiser les produitsde dégradation éventuels de la protéine d'intérêt, et d'expliquer ainsi la présence potentielle de bandes de plus faible poids moléculaire que la protéine.

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Les gels de polyacrylamide résultent de la polymérisation d’un monomère, l’acrylamide, en présence un agent bifonctionnel (NN’méthylène bis acrylamide) réticulant les chaînes entre elles.

La polymérisation du gel est initiée par l’ajout d’APS (persulfate d’ammonium) et est catalysée par l’ajout de TEMED (NNN’N’-tétraméthyl-éthylène diamine). La polymérisation se traduit parla formation d’un réseau de mailles, dont la taille varie en fonction de la concentration enacrylamide. La migration des protéines sera plus ou moins retardée en fonction de leur taille et decelle des mailles (9% séparation de grosses protéines, 15% de petites protéines). Il existe unerelation linéaire entre la distance de migration électrophorétique et le log de la masse moléculairedes protéines dénaturées par le SDS.

La séparation des protéines s’effectue dans un système discontinu constitué de deux parties. Ungel de concentration (stacking-gel) qui contient des puits dans lesquels sont chargés leséchantillons. Ce gel est coulé au-dessus d’un gel de séparation (running-gel) où les protéinesseront séparées en fonction de la taille.L’acrylamide est neurotoxique. Manipuler avec des gants tant qu’il n’est pas polymérisé.

Principe:  séparation de protéines en fonction de leurs masses moléculairesQuand elles sont dénaturées par la chaleur (à 95°C) en présence d’un excès deSDS et d’un agent réducteur (-mercaptoéthanol DTT -dithiothreitol-), la plupart des protéines fixent de la même façon le SDS (détergent anionique)qui les transforment en polyanions et leur confèrent donc une charge nettenégative. Les protéines ayant la même densité de charge se déplaceront à lamême vitesse dans un champ électrique. Dans le système SDS-PAGE, laséparation des protéines s’effectue donc uniquement selon un critère de taille. 

puits

stacking-gel

running-gel

SDS-PAGE

(sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis) 

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Des conditions natives de PAGE peuvent être réalisées pour conserver la structure des protéines,leur activité enzymatique ou l’interaction avec une autre protéine partenaire. Dans ce cas, il nefaut pas utiliser de SDS (dans aucun des tampons), d’agents réducteurs, ni bouillir les

échantillons. Il s’agit alors d’une séparation selon la taille et la charge globale des protéines.

Les protéines peuvent être colorées au bleu de Coomassie ou à l’argent (très sensible).

Système SDS-PAGE

(Miniprotean III, BioRad)

PhastSystem (Pharmacia)

Extrêmement rapide

Gels pré-coulés

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Western-blot (Immuno-blot)

Principe: Sous l’effet d’un courant électrique, les protéines contenues dans le gel d’acrylamidevont être transférées ("blottées") sur une membrane (nitrocellulose, PVDF). Les protéines sontliées irréversiblement à celles-ci et peuvent donc être visualisées par réaction anticorps-antigèneaprès traitement de la membrane par un anticorps spécifique de la protéine étudiée.

Deux méthodes de détection sont couramment utilisées :

- réaction chromogénique qui produit un précipité sur la membrane au niveau de la protéine cible- chémiluminescence : émission de lumière au niveau de la protéine cible, détectée aprèsexposition sur film photographique (très sensible)ex  péroxydase /H 2O2   O 2

- (superoxyde)  oxydation du luminol  lumière

La détection s’effectue le plus souvent de manière indirecte grâce àun anticorps secondaire (anti IgG) dirigé contre le premier anticorps et couplé à- un radioisotope (auto-radiogramme)- fluorophore

- une enzyme (phosphatase alcaline ou peroxydase)- à la streptavidine (révélation par la biotine)

Ac Iaire 

Ac IIaire 

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Electrophorèse ADN

Principe:  séparation des acides nucléiques (AN) en fonction de leurs masses moléculaires

Des gels d'agarose de % différents (0,3 à 2%) sont utilisés pour séparer des fragments d'ADN de0,2 à 20kb, ou de polyacrylamide pour des fragments de taille inférieure à 1kb (5 à 20%). Cesmolécules chargées négativement migrent vers l'anode à une vitesse inversement proportionnelleà leur masse moléculaire. L'ADN est visualisé grâce au Bet (Bromure d’éthydium) qui s'intercaleentre les bases des acides nucléiques et qui émet une fluorescence orange (à 590nm) aprèsexcitation aux UV (à 300nm). La taille et la quantité des fragments sont estimées parcomparaison avec le marqueur de taille (seuil de détection dizaines de ng).Le Bet est potentiellement cancérigène : manipuler avec des gants, et utiliser les poubellesadéquates.

L'observation du gel sous UV réclame une protection des yeux.

Mupid system

Marqueur de taille

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DOSAGE de PROTEINES

PRINCIPE et GENERALITES

Plusieurs méthodes de dosage des protéines utilisent des propriétés des acides aminés,composant les protéines. Ce sont généralement des méthodes spectrophotométriques basées surcertaines caractéristiques spectrales ou réactionnelles des acides aminés. Le choix d’une méthodedépend des besoins et des caractéristiques recherchés: fiabilité, sensibilité, rapidité, possibilité derécupérer l'échantillon après dosage, présence de substances interférentes dans l'échantillon, etc..

MÉTHODOLOGIES

1/ Absorption à 280 nm

Le tryptophane absorbe fortement à 280 nm de même que, dans une moindre mesure, latyrosine. La phénylalanine et la cystine ont également de faibles absorptions dans cette région del'U.V. rapproché. Il est donc possible de doser les protéines en mesurant l'A280. Évidemmentl'absorption à cette longueur d'onde dépend principalement du nombre de tryptophanes dans lemélange protéique. Une solution contenant 1 mg de protéines/mL présente une A 280 de l'ordre de0.5 à 2.0.

Pour une protéine pure, il est possible de calculer le coefficient d’extinction molaire. Ils'agit de calculer l'A280 due à chacun des quatre acides aminés mentionnés précédemment et d'enfaire le total. Il suffit alors de mesurer l’A280  d’une solution protéique pure, dans un tamponcontenant un agent chaotropique (chlorure de Guanidium qui permet de dénaturer complètementla protéine), pour déterminer sa concentration.

On s'est aperçu qu'il y a très peu de masquage de l'A280.  On peut donc appliquer en première approximation le coefficient d’extinction molaire calculé pour une protéine nondénaturée. Pour un mélange de protéines, la mesure de A280  donne une approximation assezfiable, surtout pour comparer des mélanges de composition semblable.

Les avantages de cette méthode sont sa relativement bonne sensibilité (50-100 g), sasimplicité et sa rapidité d'exécution. Elle permet en outre de récupérer la solution protéique si besoin est, car elle ne nécessite pas que les protéines de la solution soient détruites par uneréaction quelconque. Elle est particulièrement utile pour suivre le contenu en protéine del'effluent d'une chromatographie.

Elle a cependant un désavantage majeur, la présence de contaminants ayant uneabsorption à 280 nm. Parmi ces contaminants potentiels, on trouve les acides nucléiques. Ilsabsorbent fortement dans l'U.V., avec un maximum autour de 254 nm, et contaminent souvent les préparations de protéines. Une méthode permet de déterminer la concentration protéique d'unmélange contenant une proportion donnée d'acides nucléiques. Cette méthode requiert la mesure

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de l'absorption à deux longueurs d'onde: à 280 nm, pour les protéines, et à 260 nm, pour lesacides nucléiques. Ces valeurs peuvent alors s'intégrer dans l'équation:

[protéines] (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A 260 

Parmi les autres contaminants potentiels, les produits tampons et les détergents peuventsouvent être problématiques. Une façon simple d'éliminer ce facteur est d'inclure ces produitsdans le blanc, lorsque c’est possible.

2/Méthode du biuret

La réaction du biuret a permis de mettre au point une méthode quantitative de dosage des protéines. Cette réaction du biuret est la formation d'un complexe pourpre entre le biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) et deux liens peptidiques consécutifs en présence de cuivre en milieu alcalin.Le complexe de coordination résultant absorbe fortement dans le bleu.

Cette méthode est peu sensible (1-20 mg), mais elle est relativement rapide. Sa principalequalité est d'avoir une absorption égale pour toutes les protéines. Certains composés interfèrentavec ce dosage, comme les peptides, le saccharose, le tampon Tris, le glycérol, etc...

3/Méthode de Lowry

Cette méthode combine une réaction au biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de phosphotungstate, réagit avec lestyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue qui s'ajoute à celle du biuret.Cette méthode a été tellement utilisée que l'article original de Lowry est un des articlesscientifiques les plus cités au monde! Encore aujourd'hui on publie de nouvelles variantes decette méthode.

La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa principale qualité. Elle peut atteindre5-10 µg. La zone de linéarité de la réaction est cependant étroite et il faut utiliser la portionlinéaire de la courbe qui correspond à l'absorption de l'inconnu.

Le protocole en est le suivant :

A 1 ml d'échantillon à doser, convenablement dilué dans l'eau distillée, on ajoute 5 ml deréactif C. Après dix minutes, on ajoute rapidement 0,5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu, dilué demoitié dans l'eau (ajouter le réactif au centre du tube, ne pas le faire couler sur les parois). Ceréactif est préparé pendant les 10 minutes d'attente, et en quantité juste suffisante pour le dosageen cours (exemple: un témoin + 5 dosages, soit 6 tubes). Il vous faudra donc 3 ml de réactif diluéde moitié, c.a.d. 1,5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu. Pour tenir compte d'un éventuel volumemort de la pipette, diluez 2 ml de réactif pur ---> 4 ml final). Mélanger. Après trente minutes àl'obscurité, l'absorption à 750 nm est lue et la concentration en protéines estimée par rapport àune courbe étalon établie avec l'albumine de sérum de boeuf (entre 0 et 0,1 g/l).

 N.B.: Réactif C = 50 parties de réactif A pour 1 partie de réactif B

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  Réactif A = Na 2CO3  20 g/l dans NaOH 0,1N

Réactif B = CuSO4  5 g/l; tartrate de sodium et de potassium 10 g/l.

La courbe d'étalonnage sera réalisée à partir d'une solution mère à 100 mg/l

Cette méthode est très sensible à de très nombreuses substances interférentes: certains peptides et acides aminés. le saccharose, le tampon Tris, le glycérol, les dérivés mercaptan,l'EDTA, de nombreux détergents, etc... De nombreuses variantes ont été développées pourcontrer ces défauts. Entre autres, citons une méthode permettant d'éliminer les substancesinterférentes par microprécipitation des protéines à l'acide trichloroacétique après complexationavec du desoxycholate.

4/Méthode du bleu de Coomassie

Cette méthode est basée sur l'adsorption du colorant bleu de Coomassie G250. En milieuacide, ce colorant s'adsorbe sur les protéines et cette complexation provoque un transfert de son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu.

C'est une méthode très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide. Elle est aussi assezrésistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres méthodes. Seuls lesdétergents, comme le Triton et le dodécylsulfate de Na (SDS), et des bases fortes interfèrent aveccette méthode.

Son principal défaut est sa réactivité très différente face à diverses protéines. Il faut parexemple noter que la protéine souvent utilisée pour la confection de courbes d'étalonnage,

l'albumine sérique bovine (ou BSA), réagit beaucoup plus fortement que la moyenne et n'est donc pas appropriée. Un autre inconvénient de la méthode est la tendance du réactif à s'adsorber sur leverre des cuvettes de spectrophotomètre et qu'il faut donc les nettoyer consciencieusement aprèsusage.

5/Acide bicinchonique

L'acide bicinchonique (BCA) réagit avec les complexes de Cu2+ et de protéines de façontrès similaire à la réaction du biuret. En formant de tels complexes, il prend une couleur pourpretypique. C'est une méthode sensible et rapide qui résiste aux détergents comme le Triton ou leSDS.

6/Méthode de Kejdahl

Cette méthode consiste à mesurer la quantité d'azote organique d'un échantillon. Il fautévidemment savoir, pour l'échantillon analysé, quelle est la relation entre la quantité d'azote etcelle de protéines. Elle requiert un équipement coûteux et complexe. On ne l'applique qu'à deséchantillons difficiles à homogénéiser comme du matériel végétal.

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LE DOSAGE ENZYMATIQUE

Le substrat de l’enzyme doit être fourni en concentration saturante (supérieure à 10 fois leKm). L’activité enzymatique est évaluée au cours du temps soit en évaluant la consommation

de substrat, soit en évaluant l’apparition d’un produit de la réaction. Cette évolution de la composition du mélange réactionnel peut être évaluée :

soit directement en mesurant l’absorbance de l’élément suivi en utilisant soncoefficient d’extinction molaire.

Soit en évaluant la concentration de cet élément dans le mélange par un dosagespécifique. Il est alors nécessaire de réaliser une gamme d’étalonnage.

L’activité enzymatique peut être exprimée par ml de solution enzymatiqueo ou rapportée à la quantité de protéine enzymatique et on parle d’activité spécifique

Quelques exemples concrets :

1/ Evaluation de l’apparition d’un produit de réaction et utilisation du coefficientd’extinction molaire : exemple du dosage de la phosphatase alcaline dans un extraitcellulaire

Principe : La mesure de l'activité de la phosphatase alcaline exploite la réaction suivante :

 NO2 - - O - PO3H2 + H2O -----> NO2 - - OH + H3PO4

 paranitophénylphosphate paranitrophénolou pNPP

La phosphatase alcaline hydrolyse le paranitrophénylphosphate en acide phosphorique et paranitrophénol qui absorbe à 410 nm.

Mode opératoireMettre dans un tube à essai :- 2 ml d’extrait cellulaire

- 1 ml de solution de pNPP à 2,5 10-3 M

Incuber 1 heure à 37°C.Arrêter la réaction en ajoutant 0,6 ml de tampon PO4Na 1 M pH 8,5.Lire la D.O à 410 nm en utilisant comme témoin le contenu d'un tube dans lequel le

 pNPP a été remplacé par 1 ml d'eau distillée.

Calcul

Connaissant le coefficient d'absorption moléculaire du p-nitrophénol (soit  = 1,75 X 10 3

UDO.M-1), déterminer la quantité de produit libéré à l’aide de la relation suivante DO/tx1,8/1 = lC (l, la longueur du trajet optique est généralement de 1 cm ; 1,8/1 permet de tenircompte du facteur de dilution de l’extrait dans le mélange enzymatique ; t est exprimé en

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minutes, C est l’activité enzymatique exprimée en nombre de moles de pNP libéré par litre et parminute)

1 unité phosphatase est la quantité d'enzyme qui libére 1 µmole de paranitrophénol parminute à 37°C. Pour avoir l’activité enzymatique exprimée en unités phosphatase, il fautmultiplier C par 106  (pour passer des moles en moles) et le diviser par 1000 (pour passer des len ml)

2 /Evaluation de l’apparition d’un produit de réaction :

a/ Exemple du dosage de la -galactosidase avec établissement d’une courbed’étalonnage pour l’évaluation de l’ONP produit.

On peut utilisé l'ortho-nitrophényl -D-galactopyrannoside ou ONPG qui est hydrolysé par la -galactosidase suivant la réaction:

-galactosidaseONPG + H2O ----------> galactose + ONP

L'ortho-nitrophényl (ONP) libéré présente en milieu alcalin une forte coloration jaune,dont l'intensité est proportionnelle à sa concentration, ce qui permet de le doser à 405 nm.

Le protocole expérimental du dosage dans un extrait cellulaire peut suivre les étapessuivantes :

- Au temps 0, mettre dans un tube 1 ml de la solution d'ONPG dans du tampon phosphate pH7 et 2 ml d’extrait dilué dans du tampon phosphate pH7.

- Incuber à 28°C pendant 15 mn exactement, dans un bain-marie (ou noter exactement letemps). On peut également préparer un volume réactionnel plus important au départ et faire des prélèvements de 3 ml à différents temps.

- Ajouter 2 ml de Na2CO3 1 M pour arrêter la réaction et permettre le développement de

la coloration jaune (en milieu alcalin) aux 3 ml de mélange réactionnel.- Bien agiter.- Mesurer la densité optique à 405 nm en utilisant comme témoin un mélange de 2 ml

d’extrait dilué + 1 ml d'eau distillée + 2 ml de Na2CO3.- En se reportant à la courbe étalon (U DO= f( nmole ONP/ml d’extrait dilué)) on pourra

déterminer le nombre d'unités -galactosidase de l’extrait cellulaire en tenant compte de sadilution successive dans la prise d’essai de 2 ml.

Etablissement de la courbe étalonPour établir la courbe représentant les variations de la densité optique à 405 nm en

fonction de la concentration en ONP, préparer une série de dilutions de 1/10ème en 1/10ème ,

dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7, à partir d’une solution mère d'ONP 2.10-3 M.Réaliser une courbe étalon : DO (4O5nm) / nmole d’ONP /ml d’extrait dilué* Une unité -galactosidase est souvent définie comme étant la quantité d'enzyme

libérant 1.10-9 mole (1 nmole) d'ONP par minute à 28°C.

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  L’unité officielle d’activité enzymatique est le katal. Le katal  ( kat) est la quantitéd'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Le katal n'est jamaisutilisé, car beaucoup trop grand. On utilise plutôt le µkat (10 -6 katal), nkat (10 -9 katal) ou le pkat

(10-12 katal).

La plupart des biochimistes préfèrent l' "unité internationale" (IU, International Unit),qui est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute.60 IU valent donc1 µkat.

b/ Le dosage de l’activité -galactosidase exprimée en Unités Miller

Principe :Le substrat utilisé est également l’ONPG (ortho-nitrophényl -galactopyranoside) qui est

hydrolysé en milieu aqueux en galactose et ONP (ortho-nitophénol). Le dosage est réalisé sur 0,1

ml d'échantillon de culture selon le protocole mis au point par Miller en 1972. Les unités Millerobtenues sont des unités arbitraires proportionnelles à une augmentation de la quantité d'ONP parminute et par cellule. Elles présentent l'avantage d'être de l'ordre de plusieurs centaines lorsque laß-galactosidase est présente dans la cellule et d'au maximum 10 lorsque l'enzyme est absente.

Mode opératoire- Dans un tube contenant 0,9 ml de tampon Z (tampon Z (Na2HPO4,7H2O: 0,06M;

 NaH2PO4,H20: 0,04M; KCl: 0,01M; MgSO4,7H2O: 0,001M; ß-mercaptoéthanol: 0,05M; pH

7). Ce tampon "phosphate" permet le maintien de l'état réduit des groupements SH des protéines indispensable à l'activité de la ß-galactosidase grâce au ß-mercaptoéthanol) est

ajouté 0,1 ml de culture préalablement refroidie. Faire un ou deux tubes témoins avec 0,9 mlde tampon Z et 0,1 ml de milieu de culture stérile.- Mélanger- Ajouter 1 goutte de toluène (à la pipette Pasteur, sous la hotte). Celui-ci permet l'interruption partielle de la membrane cytoplasmique et permet ainsi aux petites molécules comme l'ONPGde diffuser dans le cytoplasme qui contient la ß-galactosidase.- Mélanger au vortex pendant 10 secondes- Ouvrir les tubes et les mettre dans une étuve à 37°C pendant environ 40 minutes. Cette étape permet l'évaporation du toluène.- Ajouter 0,2 ml de solution d'ONPG (à 4 mg/ml dans du tampon phosphate) et déclencher unchronomètre, puis placer immédiatement les tubes dans un bain marie à 28°C.

- Surveiller la coloration jaune dans les tubes. Dès qu'elle apparaît, il faut sortir le tube du bainmarie, arrêter la réaction avec 0,5 ml de Na2CO3 1M, et noter le temps de réaction. Après 2

heures de réaction, arrêter les réactions dans tous les tubes qui n'ont pas "jauni"- Centrifuger les tubes pendant 5 minutes- Transférer 1 ml de surnageant dans une microcuve.- Lire les DO à 550nm et à 420nm pour chaque échantillon en faisant le zéro d'absorbance surle tube témoin.

Calcul des unités MillerL'activité ß-galactosidase mesurée selon Miller est proportionnelle à l'absorbance à 420nm

résultant de l'absorbance de l'ONP et est inversement proportionnelle au temps de réaction, au

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volume d'échantillon utilisé pour faire la réaction et à la concentration cellulaire de l'échantillon(donnée par l'absorbance des cellules à 600nm).

L'absorbance mesurée à 420nm est en fait la somme de l'absorbance de l'ONP et de

l'absorbance des débris cellulaires qu'il peut subsister dans les cuves. Pour éliminer cette dernièreabsorbance il convient de retrancher à la mesure lue à 420nm la mesure de l'absorbance à 550nm(due aux débris cellulaires seuls) multipliée par le facteur 1,75 quand il s'agit de cultures d'  E.coli.

L'activité en unités Miller est donc donnée par la formule

103 x (DO 420 - (1,75 x DO 550)) / t x V x DO600avec t : temps de réaction en mn

v : volume de culture utilisé pour faire la réaction en ml

Calcul des activités spécifiquesIl est possible de convertir les unités Miller ainsi obtenues en activité spécifique de la ß-galactosidase exprimée en unité ß-galactosidase par mg de protéine.

L'unité ß-galactosidase est souvent définie comme la quantité d'enzyme qui produit unenmole d'ONP par minute à 28°C et à pH 7.

Dans les conditions utilisées ci-dessus, une nmole d'ONP/ml a une absorbance à 420nmde 0,0045. De plus, bien que les dosages de protéines dans les extraits cellulaires soient précis etrelativement rapides, il est possible d'estimer la quantité de protéines à partir de la DO à 600nm

en supposant que 109  cellules contiennent 150µg de protéines et que 2 unités DO 600 

correspondent à 109 cellules par ml.  

Conseils pour l’établissement d’une COURBE ETALON

I) Dilutions- Pour l'établissement des courbes étalon, une solution-mère (SM) dont la concentrationcorrespond au maximum de la courbe étalon est utilisée. A partir de cette SM, il faut

confectionner des dilutions de 1/10e en 1/10 e de façon à obtenir 10 points expérimentaux (1/10 e,

2/10e,...., 8/10e, 9/10e, SM) régulièrement espacés sur votre courbe. Attention, il ne s’agit pas dedilutions en cascade.- Préparez des volumes suffisants des dilutions pour éviter les erreurs dues au pipetage de faibles

volumes. Par exemple, pour une dilution 8/10e:8 ml de SM + 2 ml d'eau distillée, ou4 ml de SM + 1 ml d'ED.

II) Pipetage- Il est préférable d'utiliser des pipettes de précision (volumes repérés par un code de couleur).- Toujours pipeter un volume entre deux graduations de la pipette, et non entre une graduation etl'extrémité de celle-ci (pipette à écoulement total). Vous gagnerez ainsi en précision.- Pour le maximum de précision, utiliser une pipette dont le volume maximum est le plus proche possible de votre volume à pipeter.

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III) Echantillon- Toujours bien agiter vos dilutions  (au vortex de préférence) avant de prélever le volumed'échantillon  (1 ml en général) nécessaire au dosage. Ne confondez pas dilution et échantillon.

Le volume de la dilution importe peu (exemple: 10 ml ou 5 ml pour les deux dilutions au 8/10 e décrites précédemment). Le volume de l'échantillon est défini par les conditions expérimentalesdu dosage. Appliquer sur les différents échantillons ainsi confectionnés les différentes étapes dudosage.

IV) Témoin- Il est absolument obligatoire de faire un témoin  pour chaque série de mesure. Ce témoincontiendra tous les réactifs (seul l'échantillon sera remplacé par un volume égal d'eau distillée), etsera incubé de la même façon que les autres tubes: temps de réaction, température, lumière ouobscurité. A ce propos il est primordial de respecter scrupuleusement les conditions de réaction si

vous voulez obtenir des résultats précis et reproductibles.V) Mesures-Vérifier que les parois des cuves de mesure ne soient pas recouvertes de buée - Faire toutes vos mesures avec la même cuve (neuve). Commencer par régler le zéro duspectrophotomètre sur le témoin, puis vider la cuve, l'égoutter sur un kleenex et la remplir avec la

 plus grande dilution (1/10e), faire la mesure puis vider la cuve et passer à la dilution suivante;ainsi de suite jusqu'à la solution mère. Vous vous affranchirez ainsi des petites erreurs de mesuredues aux imperfections des cuves de plastique.- Enfin, avant de faire vos mesures, vérifiez toujours que le spectrophotomètre que vous allezutiliser est réglé sur la bonne longueur d'onde.