Manual Hemato UNAM

FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM

MAN U AL DE P R ÁC TI CA S DE L L AB OR A TO RI O DE H EMA T OL OG IA

QFB EVA CALDERON GARCIDUEÑAS

QFB GUILLERMO GONZALEZ VARGAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIADIVISION DE BIOQUIMICA Y FARMACIAFACULTAD DE QUIMICAU N A M

I N D I C E Página

1. Valores de referencia de la biometría hemática.....................................................3

2. Anticoagulantes......................................................................................................5

3. Determinación de hemoglobina..............................................................................6

4. Cuenta de eritrocitos............................................................................................10

5. Hematocrito..........................................................................................................13

6. Velocidad de sedimentación.................................................................................16

7. Cuenta de reticulocitos.........................................................................................19

8. Cuenta de leucocitos............................................................................................22

9. Cuenta de plaquetas............................................................................................25

10.Frotis y tinciones...................................................................................................28

11.Morfología normal.................................................................................................33

12.Morfología anormal...............................................................................................36

13.Hierro....................................................................................................................37

14.Capacidad de fijación de hierro............................................................................44

15.Hemoglobina fetal.................................................................................................52

16.Fragilidad osmótica..............................................................................................55

17. Inducción de drepanocitos....................................................................................59

18.Hemoglobina libre en plasma...............................................................................61

19.Recomendaciones generales para realizar pruebas de coagulación...................64

20.Cascada de la coagulación...................................................................................65

21.Fragilidad capilar..................................................................................................66

22.Tiempo de sangrado.............................................................................................68

23.Retracción del coágulo.........................................................................................71

24.Tiempo de coagulación.........................................................................................73

25.Tiempo de protrombina.........................................................................................76

26.Tiempo de tromboplastina parcial.........................................................................80

27.Tiempo de trombina..............................................................................................83

28.Fibrinógeno...........................................................................................................86

29.Lisis de euglobulinas............................................................................................94

30.Sulfato de protamina............................................................................................97

31.Gel de etanol......................................................................................................100

2

32.Hemolisinas y aglutininas...................................................................................102

33.Anticuerpos irregulares.......................................................................................105

34.Reactivos............................................................................................................110

35.Cámara de Neubauer.........................................................................................115

36.Tabla de % de transmitancia y absorbancia.......................................................116

3

VALORES DE REFERENCIA – BIOMETRIA HEMATICA

PARAMETRO UNIDADESCONVENCIONALES

UNIDADESSI

Eritrocitos Mujeres4.3 – 5.0 X 106/mm3

4.3 – 5.0 X 1012/L

Hombres4.5-5.5 X 106/mm3

4.5 – 5.5 X 1012/L

Hemoglobina Mujeres14.6 1.9 g/dl 1.86 – 2.48 mmol/LHombres16.4 1.9 g/dl

2.09 – 2.79 mmol/L

Hematocrito Mujeres44 2.7 %Hombres 2.6 %

0.44 0.027%

0.51 0.026%

Volumencorpuscularmedio VCM

82 – 96 u3 82 – 96 fL

Hemoglobinacorpuscularmedia HCM

27 – 31 uug ó pg 0.45 – 0.49 fmol

Concentracióncorpuscularmedia de HbCMHC

Reticulocitos

32 – 36 %

0.5 – 1.5%25,000 – 75,000/mm3

0.32 – 0.36

25 – 75 x 109/L

4

Leucocitos 4.0 – 11 X 103/mm3 4.0 – 11.0 X 109/L

Neutrofilossegmentosbanda

EosinófilosBasófilosLinfocitosMonocitos

50 – 70% 1800-7000/mm3

1 – 3% 700/mm3

1 – 3% 450/mm3

0 – 1% 200/mm3

22 – 40% 1000-4800/mm3

3 – 8% 120 – 800/mm3

1.8 – 7.0 X 109/L0.0– 0.7 X 109/L0.0-0.45 X 109/L0.0– 0.20 X 109/L1.0 – 4.8 X 109/L0.1 – 0.8 X 109/L

Plaquetas 150,000 – 450,000/mm3 0.15-0.40 X 1012/L

VelocidaddeSedimentación

Mujeres10 – 15 mm/hHombres4 – 7 mm/h

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ANTICOAGULANTES EMPLEADOS EN EL LABORATORIODE HEMATOLOGIA

PRINCIPITANTES USO VENTAJAS DESVENTAJAS

Oxalatos de amonio y potasio (Mezcla de Paul Heller)

3 partes de amonio y 2 partes de potasio. De esta mezcla usar 2 mg/ml de sangre

Barato, fácil de preparar No afecta el VGM

Degeneración de los granulocitos. Utilidad limitada a los primeros minutos en extensiones.

IONIZANTES

EDTA al 10% Sal disódica más soluble

1 – 2 mg/ml de sangre No altera la morfología, aún después de 3 h. Evita aglutinación de plaquetas

Citrato de sodio 3.8% (coagulación)

9 partes de sangre por 1 parte de anticoagulante. 0.5 ml de citrato 4.5 ml de sangre

Evita aglutinación de plaquetas, preserva más tiempo la sangre

ANTITROMBINICOS

HeparinaCarbohidrato ácido

0.1 – 0.2 mg/ml de sangre

Seco evita más la hemólisis.Útil en estudios de anemias hemolíticas

Claro. Frotis teñidos con Wright toman coloración azul difusa

MECANICO

Desfibrinización Con perlas de vidrio y agitación mecánica

Útil para células LE

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DETERMINACION DE HEMOGLOBINA

1. INTRODUCCION

La hemoglobina es una proteína conjugada la cual proporciona el color rojo de la sangre. Se encarga de llevar el oxígeno a los tejidos y participa en el transporte del CO2 para el equilibrio ácido-base. La porción porfirínica de la hemoglobina es una protoporfirina IX, la cual combinada con Fe (II) constituye el grupo hem; éste más la parte proteíca (globina) constituye la hemoglobina.

Existe una amplia variedad de técnicas para cuantificar a la hemoglobina, entre las que destacan: determinación de su contenido de Fe, espectrofotometría, refractometría, gasometría, etc.

El método de cianometahemoglobina es el método recomendado por el Comité Internacional para la Estándarización en Hematología y las ventajas que ofrece este método son:

– Existen soluciones estándar certificadas de cianometa hemoglobina (HbCN) con una estabilidad mayor a un año.

– El espectro de absorción de (HbCN) permite efectuar lecturas en la región del visible en cualquier tipo de fotómetro ya que presenta un máximo a 540 nm y las soluciones de (HbCN) siguen la ley de Beer a esta longitud de onda.

FUNDAMENTO

El Fe (II) es oxidado a Fe (III) por acción del ferricianuro y por lo tanto la hemoglobina se convierte en metahemoglobina, la cual se combina con cianuro para producir la cianometahemoglobina (CNHb) que es estable y se puede medir en la región de 530-550 nm. La hemoglobina, oxihemoglobina, metahemoglobina y carboxihemoglobina es decir todas las formas de hemoglobina presentes son transformadas en cianometahemoglobina excepto la sulfohemoglobina.

2.- OBJETIVOS

–Realizar una curva de calibración de cianometahemoglobina

–Valorar las concentraciones de hemoglobina en sangre total.

–Distinguir valores normales de los patológicos.

3- PROCEDIMIENTO

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3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13 X 100 mmPipetas de 1.0 mlPipetas de 5.0 mlPipetas de sahli (0.02 mlBoquillaGradillaCeldas de 1 cm de diámetro

3.2 MATERIAL BIOLOGICO

Sangre capilar o venosa con anticoagulante.

3.3 EQUIPO

Espectrofotómetro o fotómetro

3.4 REACTIVOS

Solución de EDTA al 10%Reactivo de DrabkinSolución estándar de cianometahemoglobina80 mg/dl. Facultad de Química, UNAMEtanol al 70%

3.5 TOXICIDAD DE SUSTANCIAS

El reactivo de Drabkin y la solución estándar de (HbCN) contienen derivados de cianuro los cuales son tóxicos; sin embargo las concentraciones de éstos están por debajo de la dosis letal referido a un litro de solución. Se recomienda utilizar perillas de seguridad para pipetear estas soluciones y no ingerir alimentos durante la práctica; al finalizar la determinación es necesario lavarse las manos.

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3.6 TECNICA

CURVA ESTANDAR

B 1 2 3 4 5Solución estándar de (HbCN) (ml) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0Reactivo de Drabkin (ml) 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0Concentración g/dlMmoles/L

Agitar cuidadosamente después de la adición de cada reactivo, dejar reposar 10 minutos, leer la absorbancia o el % de transmitancia contra el blanco de reactivos a 540 nm.

Trazar la gráfica en papel milimétrico o semilogarítmico según sea el caso; colocando en el eje de las abscisas la concentración en g/dl ó mmoles/L y en el eje de las ordenadas las lecturas de la absorbancia o % de transmitancia.

MUESTRA PROBLEMA

1.- Colocar en un tubo de 13 x 100 mm, 5 ml de reactivo de Drabkin.

2.- Homogenizar perfectamente la muestra.

3.- Empleando una boquilla, tomar con la pipeta de Sahli 0.02 ml de sangre, aforar cuidadosamente y limpiar la sangre adherida en el exterior de la pipeta.

4.- Transferir el volumen de muestra al tubo que contiene el reactivo de Drabkin y mezclar cuidadosamente. Enjuagar 3 veces la pipeta en la dilución.

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5.- Dejar reposar durante 10 minutos y leer contra un blanco de reactivos (reactivo de Drabkin). Interpolar las lecturas en la curva de calibración. La reacción es estable un mínimo de 2 horas.

4- CALCULOS

Es necesario aplicar la siguiente fórmula para calcular la concentración de cada uno de los tubos de la curva de calibración.

g/dl de ml del estándar x conc. del estándar (g/dl) x 251hemoglobina = ml totales

5- VALORES DE REFERENCIA

Hombres 15.4 – 17.6 g/dl 2.38 – 2.73 mmol/LMujeres 13.6 – 15.6 g/dl 2.10 – 2.42 mmol/L

6- BIBLIOGRAFIA

Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. FifthEdition. Churchill Livingstone, New York. 1975.

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CUENTA DE ERITROCITOS

1. INTRODUCCION

El resultado de la eritropoyesis es la producción de una célula eritrocito bien diferenciada y capaz de ejercer su función principal, que es la de transportar oxígeno y bióxido de carbono.

Su falta de núcleo le da la capacidad de llevar el oxígeno sin consumir prácticamente nada de él, su forma bicóncava es la que mejor se presta para afrontar la hemólisis; su membrana no admite la salida de la hemoglobina.

FUNDAMENTO

Se diluye una cantidad exacta de muestra con el líquido de Hayem, que es una solución isotónica y por lo tanto no altera la estructura de los eritrocitos; esta mezcla se coloca en la cámara de Neubauer y se cuenta el número de células localizadas en los cuadros indicados para elloc.

2.- OBJETIVOS

– Practicar el recuento de eritrocitos

– Reconocer a los eritrocitos

– Manejar adecuadamente la cámara de Neubauer

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13X100 mmpipetas de thoma para glóbulos rojoscámara de neubauerboquillasmicroscopiosgradillapapel higiénicopapel parafilm


Sangre capilar o venenosa con anticoagulante.

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3.3 EQUIPO

MicroscopioAgitador de pipetas

3.4 REACTIVOS

EDTA al 10%Líquido de Hayem

3.4 TECNICA

Obtener sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA al 10% (un mg de anticoagulante por cada ml de sangre)

a) Llenar con sangre bien mezclada, la pipeta de Thoma hasta la marca 0.5

b) Limpiar cuidadosamente la parte externa de la pipeta.

c) Completar con líquido de Hayem hasta la marca 101.

d) Sellar los extremos de la pipeta con papel parafilm.

e) Agitar durante 3 minutos, mezclar perfectamente.

f) Colocar el cubrehematímetro sobre la cámara.

g) Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y llenar la cámara por capilaridad por uno de los bordes del cubrehematímetro.

h) Se deja que el líquido penetre lentamente entre la cuadrícula y el cubrehematímetro, sin que se formen burbujas, ni huecos y sin sobrepasar los canales de la cámara.

i) Dejar reposar de 3-5 min.

j) Con objetivo de 40X se cuentan los eritrocitos contenidos en 80 cuadros pequeños (uno central y cuatro de los extremos del cuadro central de 1 mm2).

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4.- CALCULOS

Si consideramos que el cuadro central de 1 mm2 tiene 400 cuadros, se realiza el siguiente cálculo:

N X 200 X 10 X 400 = N x 10,00080

Donde:

N = Número de eritrocitos contados200 = Factor de dilución10= Corrección de l altura de la cámara80= Número total de cuadros contados400 = Número total de cuadros del cuadro central

5. VALORES DE REFERENCIA

Hombres.- 5.4 – 5.9 x 106 /mm3 5.4 - 5.9 x 1012/L

Mujeres.- 4.7 – 5.3 x 106/mm3 4.7 – 5.3 x 1012/L

6. BIBLIOGRAFIA

Cartwright, George E. El Laboratorio en el diagnóstico clínico.4ª. edición. Ed. Científico Médica. Barcelona, España 1973

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HEMATOCRITO

1.- INTRODUCCION

El hematocrito representa la proporción de glóbulos rojos en la sangre-circulante. Este valor depende del número de hematíes de sangre periférica, de la forma y tamaño de los mismos. Al igual que la hemoglobina y la cuenta de eritrocitos, el hematocrito es uno de los parámetros importantes para determinar los índices eritrocíticos (VGM, CMHG).

FUNDAMENTO

El hematocrito es el volumen de eritrocitos expresada como un porcentaje del volumen de sangre total existente en una muestra. Es determinado en sangre anticoagulada por medio de centrifugación y es expresado como el volumen de eritrocitos por unidad de volumen.

2.-OBJETIVOS

Explicar los fundamentos de las técnicas de hematocrito

Evaluar su importancia diagnóstico.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.tubos de wintrobe graduadopipetas Pasteur con bulbocapilaresplastilina


Sangre capilar o venenosa con anticoagulante

3.3 EQUIPO

centrífugadisco lector de hematocrito

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3.4 REACTIVOS

Anticoagulantes EDTA al 10% (Sal disódica).

3.4A TECNICA MACROHEMATOCRITO

a) Homogeneizar perfectamente la muestra de sangre.

b) Con una pipeta Pasteur llenar con sangre un tubo de Wintrobe hasta la marca superior 10, evitar la formación de espuma, no debe quedar ninguna burbuja de aire dentro de la columna o en el fondo.

c) Centrífugar a 3600 rpm durante 30 minutos.

d) La lectura se realiza en la línea de separación superior de la columna de glóbulos rojos, donde empieza la de glóbulos blancos, haciendo la referencia a la escala ascendente del lado derecho. Cada línea de la escala equivale a 1%.

3.4 TECNICA DE MICROHEMATOCRITO

a) Se llenan con sangre proveniente del tubo de la muestra, las 2/3 partes de dos tubos capilares. Puede hacerse también a partir del punto de punción con dos capilares heparinizados.

b) El extremo vacío se cierra a la flama o con plastilina efectuando un movimiento de rotación.

c) Colocarlos en los canales o surcos radiales de la centrífuga (cabezal ranurado con numeración para colocar los capilares) con el extremo cerrado dirigido hacia fuera, centrífugar a 12,000 rpm durante 5 minutos.

4. CALCULOS

Calcular el % del paquete eritrocitario midiendo la altura (M2) con relación al volumen total de la muestra (M1).

M1- 100%M2- x%

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5.- VALORES DE REFERENCIA

Varones 47% 2.5

Mujeres 42% 2.5

Niños 35% 5.0

Recién nacidos 56% 10.0

6.- BIBLIOGRAFIA

Gradwhol, R Clinical Laboratory Methods and Diagnosis. 7ªedición Vol. 3 de. Mosby Co. U.S.A. (1970)

Todd. Sanford- Davidsohn Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 16ª. Edición W.B. Saunders Co. (1979)

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VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR

1.- INTRODUCCION

En una muestra de sangre, el descenso de los glóbulos rojos causa desplazamiento hacia arriba del plasma, lo cual produce una corriente ascendente y una fuerza de retraso. En la sangre normal, las fuerzas descendente y ascendente son casi iguales y hay poca sedimentación

Cuando se aglomeran los eritrocitos, el aumento de peso de la masa tiene mayor efecto para aumentar la velocidad de sedimentación que el aumento de volumen para retrasarla. En consecuencia, cualquier estado que cause aglomeración de eritrocitos o formación de pilas de monedas aumentará la velocidad de sedimentación de los eritrocitos.

En estado normal los eritrocitos no se aglomeran, porque tienen carga negativa y se repelen mutuamente. Se considera que un aumento de determinadas proteínas del plasma puede disminuir la carga negativa del hematíe y originar su aglomeración. El aumento de fibrinógeno guarda estrecha relación con el aumento de la VSE, pero también puede guardar relación con ella los aumentos de globulinas y .

Las anemias, las infecciones bacterianas aumentan la VSE. A la inversa, la VSE suele ser muy lenta en pacientes policitémicos. La mayor parte de las virosis se acompañan de velocidad normal o con aumento mínimo. Las enfermedades de la colágena, las neoplasias y muchos trastornos gastrointestinales y renales se acompañan de aumento de la velocidad de sedimentación, que también se observa después de cirugía, quemaduras o traumatismos importantes.

FUNDAMENTO

Los eritrocitos sedimentan porque su densidad es mayor que la del plasma, por lo que la velocidad de sedimentación es la distancia (en mm) que descienden los eritrocitos por unidad de tiempo (generalmente una hora) desde la parte superior de una columna de sangre hasta la parte superior de la capa de hematíes.

2.- OBJETIVOS

– Efectuar la técnica de la velocidad de sedimentación de los eritrocitos.

– Analizar su importancia clínica.

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3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13X100 mmTubos de Wintrobe de 11.5 cm de largopor 3 mm de Pipetas Pasteur con bulboGradilla de sedimentación



3.3 EQUIPO

Centrífuga clínica

3.4 TECNICA

1.- Seguir todos los pasos de la técnica del macrohematocrito para llenar un tubo de Wintrobe.

2.- Después de que el tubo de Wintrobe esté lleno de sangre, colocarlo en posición vertical en una gradilla de sedimentación por un lapso de 60 minutos.

3.- Leer en la escala descendente de la izquierda el nivel en que se encuentra la zona de separación entre el plasma y los eritrocitos sedimentados.

4.- Informar el resultado en milímetros en una hora.

4.- CALCULOS

Corrección por hematocrito

La velocidad de sedimentación se corregirá cuando el valor de Ht de la muestra se encuentre por debajo de los valores de referencia. Utilizar la tabla de corrección.


Niños 0 – 20 mm/hMujeres 0 – 20 mm/hHombres 0 – 9 mm/h6.- BIBLIOGRAFIA

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Dacie J.V., Lewis, S.M. Practical Hematology. 5th ed. Ed. Churchill Livingstone. London (1975).

International Comittee for standardization in Hematology. Standard techniques for the measurements of red cells of Hamatology. 25:801 (1973).

Jones, R.F. 1961. Determination of packed cell volume by centrifugation. Journal of Clinical Pathology. 14, 198.

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CUENTA DE RETICULOCITOS

1.- INTRODUCCION

Durante el proceso de maduración eritroide se observa una serie de cambios bioquímicos y morfológicos orientados a la formación de un elemento maduro apto para realizar el transporte gaseoso (02, C02). El objetivo fundamental de dicha maduración es la síntesis de hemoglobina (Hb).

Una vez que el eritroblasto ha expulsado su núcleo, la célula conserva parte de su maquinaria biosintética constituida principalmente por mitocondrias y polirribosomas, los cuales una vez cumplido su cometido (la síntesis de Hb restante) son autodegradados con lo cual la célula pasa a estadio de hematíe maduro.

En tinciones policromatófilas el reticulocito presenta un volumen mayor que el eritrocito, así como basofília difusa, lo que indica su contenido variable de RNA ribosomal. La fase de maduración del reticulocito requiere de 2 a 4 días y se realiza en la microcirculación de la médula ósea.

FUNDAMENTO

Los organelos citoplasmáticos y el RNA residual de los reticulocitos son precipitados y teñidos con una tinción supravital, con el azul de cresil brillante o con nuevo azul de metileno. Se preparan frotis y se cuentan los elementos que tienen un precipitado reticular (reticulocitos) teñido. Las cifras obtenidas son reportadas en valores porcentuales y absolutos.

2.- OBJETIVOS

– Valorar de manera sencilla la producción eritrocitaria.

– Evaluar tempranamente en anemias carenciales la eficacia del tratamiento.

– Establecer el diagnóstico diferencial entre anemias hemolíticas y otro tipo de anemias.

3. PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 10x75 mmPipetas Pasteur con bulbo

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PortaobjetosCubreobjetosGradillaAplicadores


Sangre capilar o venosa con anticoagulantes (EDTA)

3.3 EQUIPO

MicroscopioContador de células

3.4 REACTIVOS

Solución de nuevo azul de metilenoSolución de azul de cresil brillanteBálsamo de CanadáAceite de inmersiónXilol

3.5 TECNICA

1.- Coloque en tubo de 10x75 mm un volumen de sangre del paciente.

2.- Agrega un volumen del colorante supravital recién filtrado

3.- Mezclar suavemente y dejar en reposo 15 min. A temperatura ambiente

4.- Tomar una gota de la mezcla y efectuar un extendido fino en el portaobjetos (o cubreobjetos), dejar secar el frotis al aire.

5.- Observar en el microscopio con objetivo de 100.

6.- Contar las células que tienen gránulos azules o reticulares en un total de 1000 hematíes los cuales no deben estar agrupados o apilados.

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4.- CALCULOS Y RESULTADOS

Calcular los valores porcentuales (% de reticulocitos)

Cálculo en valores absolutos (reticulocitos/mm3)

Reticulocitos/mm3 = %reticulocitos x eritrocitos / mm3

100

Cifra corregida de reticulocitos = % reticulocitos x hto pacientehto. Normal


% reticulocitos 0.5- 2-0%

Valores absolutos

Mujer 23,000 – 106,000/mm3

Hombre 27,000 – 118,000/mm3

6.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El Laboratorio en el Diagnóstico Hematológico. 4ª. Edición Científico-Médica (1973)

Rodríguez Moyado y Col. Procedimientos Básicos para la selección de Donadores de Sangre en la Cd. de México. Rev. Med. IMSS Vol. VII, 131 (1968)

Todd Sanford- Davisohn. Clinical Diagnosis and Manegement by Laboratory Methods. 16- Ed.W,B, Saunder Co. (1979)

William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983)

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CUENTA DE LEUCOCITOS

1.- INTRODUCCION

En la sangre normal pueden distinguirse los siguientes tipos de leucocitos:

Granulocitos.- neotrófilos, esinófilos, basófilos.

Agranulocitos.- linfocitos, monocitos.

La producción de linfocitos es en sitios diseminados (bazo, ganglios linfáticos y otros tejidos linfáticos organizados), pero la producción de neutrófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos está limitada a la médula ósea en el ser humano normal.

El examen de los leucocitos comprende dos fases técnicas. Una fase cuantitativa que determina el número de leucocitos, las cifras absolutas y relativas de las diversas formas de glóbulos blancos, y la segunda, que determina la morfología celular.

En ocasiones basta su examen para formular un diagnóstico específico, por ejemplo en las leucemias. Con más frecuencia puede ser de ayuda diagnóstica para establecer un pronóstico en relación al curso de la enfermedad.

FUNDAMENTO

La sangre es diluida con una solución hipotónica de ácido acético glacial más un colorante como medio de contraste (líquido de Turk), que lisa los glóbulos rojos maduros pero, los leucocitos permanecen intactos. Su núcleo se tiñe ligeramente. Los normoblastos no se destruyen, cuando se encuentran presentes; como es el caso de algunas situaciones patológicas, por lo que se deben tomar en cuenta para no incluirlos en el valor verdadero de glóbulos blancos.

2.- OBJETIVOS

– Manejar adecuadamente la cámara de Neubauer

– Distinguir y contar los glóbulos blancos presentes en muestras normales y patológicas.

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3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Pipetas de Thoma para glóbulos blancosTubos de ensaye de 13 x 100 mmCámara de NeubauerBoquillasGradillaPapel parafilmPapel higiénico

3.2.-MATERIAL BIOLOGICO

Sangre capilar o venosa con anticoagulante

3.3.- EQUIPO

MicroscopioAgitadores de pipetas

3.4.- REACTIVOS

Solución de EDTA al 10%Líquido de TurkEtanol al 70%

3.4 TECNICA

1.- Homogenizar perfectamente bien la sangre

2.- Con la pipeta de Thoma para glóbulos blancos, aspirar sangre hasta la marca de 0.5; secar cuidadosamente la parte exterior de la punta de la pipeta.

3.- Complementar con líquido de Turk hasta la marca de 11. (dilución 1:20).

4.- Agitar 2 minutos.

5.- Desechar las primeras 4 ó 5 gotas y se carga la cámara de Neubauer, procedimiento descrito en el recuento de eritrocitos.

6.- Dejar reposar la cámara con la muestra durante 3 minutos.

7.- Observar con el microscopio utilizando el objetivo de 10 X.

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8.- Se cuentan los leucocitos en cada uno de los cuatro cuadros de 1 mm 2 de las esquinas de la cuadrícula de la cámara de Neubauer.

4.- CALCULOS

Para obtener la cifra de leucocitos por milímetro cúbico se emplea la siguiente fórmula:

N x 20 x 10 = N x 50

= leucocitos/ mm3

= leucocitos/l

en dónde:N = número de leucocitos contados20 factor de dilucióncorrección por altura de la cámara4 número de cuadros de 1 mm2 en los que se efectuó el conteo de leucocitos.

El factor de 50 variará si cambia la dilución y/o el número de cuadros contados.


4,500 – 10,000/mm3 4.5 – 10 X 109/L

4.- BIBLIOGRAFIA

Dacie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hamatology. FifthEdition, Churchill Livingstone, New York. 1975.

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CUENTA DE PLAQUETAS

1.- INTRODUCCION

Las plaquetas se originan en la médula ósea a partir del megacariocito, son redondas u ovaladas y miden de 1 a 3 micras de diámetro. Tienen una vida media de 8 a 11 días, desempeñan una función crítica en la hemostasia que consiste en: 1) mantenimiento continúo de la integridad vascular; 2) paro inicial del sangrado por formación del tapón plaquetario; 3) estabilización del tapón hemostático por la contribución de factores plaquetarios en el proceso de formación de fibrina.

FUNDAMENTO

En una dilución con citrato de sodio adicionado de azul de cresil brillante, las plaquetas se observan al microscopio como células con un movimiento browniano. Las plaquetas se cuentan en una cámara de Neubauer utilizando también microscopía de contraste de fases después de que los eritrocitos han sedimentado en solución con oxalato de amonio al 1%

2.- OBJETIVOS

– Comparar las diferentes técnicas para la cuenta de plaquetas.

– Evaluar las ventajas y limitaciones de cada una de ellas.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13 X 100 mmPipeta de Thoma para glóbulos rojosCámara de Neubauer con cubrehematímetroCaja de PetriGradilla para tubosBoquillaPapel sanitario


Sangre capilar o venosa con anticoagulante (EDTA al 10%)

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3.3 EQUIPO

Microscopio de campo claroMicroscopio de contraste de fasesAgitador de pipetas de Thoma

3,4 REACTIVOS

Solución de EDTA al 10%Líquido diluyente de plaquetasSolución de oxalato de amonio al 1%

3.6 TECNICA

1.- Cargar con la muestra de sangre una pipeta de Thoma para glóbulos rojos hasta la marca 1.0

2.- Limpiar cuidadosamente la sangre adherida al exterior de la pipeta.

3.- Completar el volumen hasta la marca de 101 con el líquido diluyente de plaquetas o con oxalato de amonio al 1% (según el método a emplear) dilución 1:100.

4.- Mezclar el diluyente y la sangre por agitación durante 3 a 5 minutos.

5.- Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y cargar la cámara de Neubauer.

6.- Preparar una caja de Petri con papel filtro humedecido y sobre éste unos soportes de madera para dejar reposar la cámara durante 15 minutos.

7.- Al finalizar este período, realizar la cuenta de las plaquetas con el objetivo de 40 y el ocular de 10X. Debe trabajarse con buena iluminación en el microscopio para evitar confundir las plaquetas con levaduras, colorante precipitado o artefactos. En la cámara las plaquetas aparecen como cuerpos refráctiles ovales o elongados.

8.- Contar todos los cuadros del cuadro central (para glóbulos rojos) que tiene una superficie de 1 mm2.

Nota: Esta determinación debe hacerse rápidamente para evitar que las plaquetas se aglomeren.

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4.- CALCULOS

Número de plaquetas/mm3 = N x 10 x 100= N x 1000

N = número de plaquetas contadas10 = corrección por la altura de la cámara100 = Factor de dilución.


150,000 – 400,000 plaquetas/mm3 150 – 400 x 109/L

6.- BIBLIOGRAFIA

Dacie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975.

28

FROTIS Y TINCIONES

1.- INTRODUCCION

El examen cuidadoso del frotis sanguíneo proporciona más información que cualquier otro parámetro de laboratorio, sin embargo la interpretación solo se adquiere con la práctica y el estudio constante. Es importante resaltar el hecho de que la utilidad de esta prueba se ve correlacionada con una orientación clínica justificada por parte del médico.

Por medio del examen del frotis de sangre periférica teñido con colorantes policromatófilos, es posible detectar alteraciones morfológicas en los hematíes como: Anisocitosis, macrocitosis, microcitosis, anisocromia, policromatofilia, cuerpos de Howell Jolly, anillos de Cabot y otras variaciones en la forma, gracias a lo cual es posible establecer un diagnóstico presuntivo de algunos tipos de anemia.

Asimismo, se puede realizar la identificación de leucocitos en base a afinidades tintoriales o morfológicas y gracias a esto se pueden detectar trastornos cuantitativos, mieloproliferativos y en ocasiones alteraciones cualitativas de los leucocitos; la observación de las plaquetas proporciona un valor semicuantitativo de las mismas.

FUNDAMENTO

Los colorantes policromatófilos son mezclas de compuestos básicos como el azul de metileno y colorantes ácidos como la eosina; estas mezclas presentan afinidad por las estructuras celulares dependiendo de su carácter ácido o básico, así, los componentes ácidos se tiñen con el colorante básico (basófilos) y viceversa (eosinófilos); otras estructuras se tiñen con ambos colorantes (neutrófilos).

2.- OBJETIVOS

Identificar los diversos tipos celulares en el frotis de sangre periférica en base a sus características morfológicas y tintoriales.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

PortaobjetosCubreobjetosCámara de tinciónPisetaVaso precipitado de 250 ml

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Sangre capilar o venosa anticoagulante (EDTA)

3.3 EQUIPO

MicroscopioContador de células

3.4 REACTIVOS

MetanolColorante de WrightColorante de GiemsaColorante de May-GrunwaldSolución amortiguadora de fosfatos pH 7.2XilolBálsamo de CanadáMezcla alcohol-acetonaAceite de inmersión

3.5.- TOXICIDAD DE SUSTANCIAS

El metanol es un compuesto de notable interés toxicológico. En el organismo es transformado en formaldehído y este en ácido fórmico, por lo que su ingestión da lugar a un cuadro de acidosis con afectación selectiva a las células retinianas. Este reactivo debe ser pipeteado con perillas de seguridad.

3.6.- TECNICA

IA.- PREPARACION DEL FROTIS DE SANGRE PERIFERICA (METODO DEL PORTAOBJETOS)

Se coloca una hoja de sangre anticoagulada en uno de los extremos de un portaobjetos, se sujeta colocando los dedos pulgar e índice en extremos opuestos, con un segundo portaobjetos se toca la gota de sangre y por capilaridad difunde; en un ángulo de 30º se desliza rápida y firmemente en dirección opuesta.

IB.- PREPARACION DE FROTIS DE SANGRE PERIFERICA (METODO DEL CUBREOBJETOS)

Tomar un cubreobjetos por las esquinas adyacentes con los dedos pulgar e índice, colocar una gota de sangre anticoagulada en el centro del cubreobjetos, con la mano contraria tomar otro cubreobjetos de manera que

30

en conjunto formen un óctagono, con lo cual la sangre se extenderá rápida y uniformemente entre las dos superficies, los cubreobjetos se separan mediante un tirón lateral y horizontal.

IIA.- TINCION DE WRIGHT

En la charola de tinción que tiene varillas en forma paralela, se colocan los frotis en posición horizontal.

Se añade colorante de Wright sobre el frotis de manera que quede totalmente cubierta la superficie; se deja actuar el colorante 1 ó 2 minutos (el tiempo puede variar según la “madurez” del colorante).

Agregar con piseta solución amortiguadora, de manera que se forme una capa metálica, tener cuidado de no sobrepasar el efecto de tensión superficial; con una pipeta soplar suavemente para que la mezcla sea uniforme, se deja la mezcla de 3 a 6 minutos (depende del lote de cada colorante).

Se lava la tinción con agua corriente, debe evitarse la precipitación en la superficie del frotis, las extensiones se dejan secar al aire.

IIB.- TINCION DE GIEMSA

Colocar los frotis en la charola de tinción.

Fijar los frotis con metanol de 10 a 20 minutos.

Se cubre luego con una mezcla recién preparada de 1 ml de colorante y 10 ml de amortiguador de fosfatos, por 30 minutos.

Se lava la tinción con agua corriente, los frotis se dejan secar al aire.

IIC.- TINCION DE MAY-GRUNWALD

Se cubren los frotis con solución de May-Grunwald sin diluir, dejar actuar durante 3 a 5 minutos.

Se agrega la solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2, evitar sobrepasar el efecto de la tensión superficial, se deja la mezcla de 5 a 10 minutos.

Lavar con solución amortiguadora pH 7.2 hasta que el frotis adquiera una tonalidad rosa pálido.

31

IID.- TINCION PAPNOTICA DE PAPPENHEIM

El frotis se fija por 3 minutos con solución de May-Grunwald

Se agrega la solución amortiguadora de fosfatos pH 7.2, evitar sobrepasar el efecto de la tensión superficial, dejar por un minuto.

Se decanta (sin lavar) la solución colorante y se adiciona la solución de Giemsa diluida, dejar actuar durante 15 minutos.

Se lava con solución amortiguadora de fosfatos y secar al aire.

EXAMEN DEL FROTIS

El examen del frotis se efectua primero con el objetivo de (40X) con el fin de observar la distribución celular, así como las características de la tinción; se selecciona un área donde exista una monocapa de células (donde los eritrocitos apenas se tocan).

Empleando ahora el objetivo de inmersión (100X) se realiza el examen del frotis. La observación incluye eritrocitos, los cuales son examinados en cuanto a tamaño, forma, color e inclusiones eritrocitarias.

Las plaquetas se aprecian en cuanto a cantidad y morfología. Se observan los leucocitos, determinando si el número esta normal, aumentado o disminuido, posteriormente se efectúa la cuenta diferencial evitando contar dos veces la misma área; para ello se sigue una rutina en greca de izquierda a derecha, bajar el campo y si luego de derecha a izquierda, etc. se cuenta un mínimo de 100 leucocitos también deben ser reportadas.

4.- RESULTADOS

Informe de anormalidades cuantitativas y morfológicas en las tres estirpes celulares sanguíneas, así como la cuenta diferencial leucocitaria en valores porcentuales (relativos)

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Sin alteraciones en serie roja

Sin alteraciones en las plaquetas

Cuenta diferencial:

Valores relativos Valores absolutos

Linfocitos 22 – 40 % 1100 – 4000/mm3

Monocitos 2 – 8 100 – 800Eosinófilos 1 – 3 50 – 300Basófilos 0 – 1 0 – 100N. segmentados 50 – 70 2500 – 7000N. banda 1 – 2 50 – 200

6.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El laboratorio en el DiagnósticoHematológico. 4ª. Edición Científico-Médica (1973) España.

Lynch-Raphael-Mellor. Métodos de laboratorio. 2ª. Edición.Interamericana. (1972). México

Todd Sanford – Davisohn. Clinical Diagnosis and Manegament by Laboratory Methods. 16- Ed.W.B. Saunder Co. (1979)

William J. William Hematology 3- Ed. McGraw-Hill Book Co.(1983). USA.

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MORFOLOGIA NORMAL

La información que se obtiene al examinar una extensión de sangre adquiere gran importancia ya que mediante la morfología del eritrocito se puede valorar:

a) La estimulación de eritropoyetinab) Hallazgos de anomalías de maduración nuclear y citoplásmica.c) Detección de trastornos en la médula ósea.d) Transtornos hemolíticos,

ERITROCITOS

El eritrocito presenta una forma bicóncava con un área central pálida y mide aproximadamente 7 en promedio. En cada laminilla pueden investigarse las características generales de tamaño, forma y color de los eritrocitos, así como de los leucocitos. Las alteraciones en la maduración nuclear se caracterizan por un aumento en el tamaño del eritrocito sin un cambio de la concentración de hemoglobina

A continuación se definen las alteraciones más comunes que es posible observar en un frotis de sangre periférica teñido por las técnicas habituales.

a) Eliptocitos (ovalocitos).- Son fácilmente identificados por deformación de las células en forma elíptica. Se presenta en pacientes con ovalocitosis hereditaria.

b) Esferocitosis.- Se reconocen como células microcíticas, “hipercromicas”, resultan de la pérdida de la membrana del eritrocito y de electrolitos intracelulares.

c) Acantocitos.- Cuando se encuentra dañada la membrana del eritrocito se encuentran presentes; aparecen en enfermedad hepática, trastornos lipídicos o enfermedad renal.

d) Células en Diana.- Son el resultado de un aumento en la membrana del eritrocito, ésto ocurre en muchas hemoglobinopatías, talasemias y enfermedades hepáticas.

e) Eritrocitos fragmentados (esquizocitos).- Pueden deberse a traumatismos intravasculares o daño de los eritrocitos recientemente formados al entrar en circulación.

f) Cuerpos de Howell-Jolly.- Algunas veces se ven en pacientes con funcionamiento deficiente del bazo o en ausencia de éste.

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g) Punteado basófilo.- Un punteado denso se observa con anomalías del estroma de la médula ósea y con estimulación aumentada de eritropoyetina. Un punteado muy denso se debe considerar un envenenamiento con plomo.

h) Parásitos palúdicos intracelulares.- Se observa Plasmodium vivax en el interior del eritrocito. Se presentan cuadros de fiebre y anemia hemolítica.

i) Eritrocitos nucleados.- Pueden ser normoblastos tardíos, pero formas más tempranas de eritrocitos, indican desorganización de liberación del eritrocito o ausencia de función esplénica.

j) Anillos de Cabot.- Son restos de membrana nuclear, proteínas o lipoproteínas desnaturalizadas.

LEUCOCITOS

En la sangre humana pueden distinguirse los siguientes tipos de leucocitos:

Metamielocitos.- Estas células se encuentran rara vez en sangre periférica. El núcleo es ovalado o de forma de “frijol” pero sin segmentación inicial, la cromatina está aglutinada en forma diferente al neutrofilo polimorfonuclear, el citoplasma tiene un color más azulado, debido al mayor contenido de RNA. Se observa síntesis de granulaciones definitivas.

Neutrófilos en banda.- Son una forma inmadura en comparación de los polimorfonucleares.

Neutrófilos maduros (Polimorfonucleares).- Tienen un núcleo segmentado con los lóbulos separados por un filamento. En las tinciones con Wrihgt el núcleo es color azul oscuro y la cromatina esta densamente aglutinada. El citoplasma abundante tiene color ligeramente rosa y oscuro, hay presentes gránulos transparentes, así como de color rosa. Pueden encontrarse de tres a cinco segmentos en el núcleo.

Eosinófilos y Basófilos.- Tienen las mismas características generales de forma y secuencia de desarrollo de los neutrófilos. Sus gránulos característicos de rojo brillante (eosinófilos) y azul intenso (basófilo) aparecen en la etapa de mielocito. Los gránulos de este último están a menudo sobre el núcleo y lo obscurecen.

Linfocitos.- Varían de tamaño desde ligeramente mayores que un eritrocito hasta tan grandes o mayores que los monocitos. Generalmente son redondos, con núcleos esféricos, pero tanto la forma de la célula completa como la del núcleo puede ser ovalada o ligeramente dentada.

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El citoplasma tiene color azul claro, en algunas ocasiones puede observarse de color azul oscuro; éste puede ser escaso siendo difícil distinguirlo en los linfocitos pequeños y abundante en los linfocitos grandes. Ocasionalmente pueden observarse gránulos rojo vino (azurófilos).

Monocitos.- La característica más importante es su cromatina, la cual esta aglutinada, siendo ésta de diámetro más pequeño y más alargada que en los linfocitos y neutrófilos. La célula puede ser redonda y en algunas, el límite citoplásmico es ondulado o tiene seudópodos manifiestos. El monocito típico tiene citoplasma de color gris azulado y un núcleo en forma de riñón pudiendo ser también redondo u ovalado sin dentación y en ocasiones puede ser segmentado.

PLAQUETAS

Son los elementos formes más pequeños, cuyo diámetro oscila entre 2-4 se caracterizan por presentar una zona granular que se tiñe de manera semejante a la de los núcleos de los leucocitos, rodeada por una zona hialina que le confiere un aspecto difuso.

36

MORFOLOGIA ANORMAL

En esta práctica se presentará al alumno una serie de transparencias de las anormalidades más frecuentes que es posible observar en el laboratorio de Hematología.

A Continuación se presenta la lista de las transparencias que integran el programa.

MORFOLOGIA NORMAL Y ANORMAL

SERIE ROJA NORMAL

1.- Pronormoblasto2.- Normoblasto basófilo3.- Normoblasto basófilo4.- Normoblasto policromatófilo5.- Normoblasto policromatófilo6.- Normoblasto ortocromático7.- Retìculocito8.- Eritrocito normal

SERIE ROJA ANORMAL

9. Poiquilcitosis10. Hipocromía11. Hipocromía12. Macrocitosis13. Codocitos14. Esferocitos15. Ovalocitos16. Drepanocitos17. Esquizocitos18. Esquizocitos19. Acantocito20. Punteado Basófilo21. Cuerpo de Howell-Jolly22. Anillos de Cabot23. Anillos de Cabot24. Cuerpos de Heinz25. Alfa talasemia26. Beta talasemia27. Beta talasemia28. Eritroblastosis fetal29. Eritroleucemia30. Sideroblastos en anillo

SERIE BLANCA NORMAL

31.- Mieloblasto32.- Mieloblasto y promielocito33.- Mielocito34.- Metamielocito35.- Banda36.- Neutrofilo bilobulado37.- Neutrólo multilobulado38.- Eosinófilo39.- Basófilo

SERIE BLANCA NORMAL

40.- Anomalía de Pelger41.- Netrófilo multilobulado42.- Célula LE43.- Leucemia mieloblástica44.- Tinción de Sudán negro45.- Tinción de PAS46.- Linfocito47.- Linfocito48.- Célula plasmática49.- Linfocito plasmocitoide50.- Linfocito atípico51.- Linfocito atípico52.- Tinción de PAS53.- Tinción de PAS54.- Monocito55.- Monocito vacuolado

SERIE MEGACARIOCITICA

56.- Promegacariocito57.- Megacariocito58.- Megacariocito anormal

VARIOS59 y 60.- Paludismo

37

HIERRO SERICO

1. INTRODUCCION

El hierro es un elemento que se combina con protoporfirina para formar el grupo hem y con diversas proteínas para originar enzimas importantes como catalasa, citocromo y peroxidasa. La absorción del hierro es máxima en el duodeno y disminuye progresivamente en las partes distales del intestino; debido a que la capacidad del cuerpo para excretar hierro es muy limitada, su absorción en el intestino debe ser controlada para que no se acumule en los tejidos y no alcance niveles tóxicos.

La determinación de hierro sérico junto con la capacidad total de combinación y saturación de la transferrina permiten evaluar los niveles de este elemento en el organismo.

FUNDAMENTO

El Fe3x unido a la transferrina es separado de ella por la adición de una solución amortiguadora (Ph 1.9) y reducido simultáneamente al estado ferroso por la presencia del ácido ascórbico en la misma solución amortiguadora. El Fe2+ liberado reacciona con la batofenantrolina sulfonatada (4:7-difenil-1:10-fenantrolina sulfonatada), obteniéndose la formación de un complejo colorido cuya intensidad de color es proporcional a la concentración de Fe.

2. OBJETIVOS

Determinar la concentración de Fe en suero aplicando el método de Beale et al modificado por Loria, A.

3. PROCEDIMIENTO (A)

3.1- MATERIAL

Tubos de ensayo de 13x100 mmPipetas serológicas de 0.1 mlPipetas serológicas de 1.0 mlPipetas serológicas de 5.0 mlGradilla para tubosPisetaCeldasPropipeta

38

El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocar toda la noche en ácido nítrico o clorhídrico diluido con un volumen igual de agua; al día siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.


Suero o plasma libre de hemólisis

3.3 EQUIPO

EspectrofotómetroAgitador de tubos

3.4 REACTIVOS

Solución de batofenantrolina al 0.64%Solución amortiguadora de glicina-HCl pH 1.9Solución de ácido ascórbico al 0.5%Solución de trabajo: ácido ascórbico al 0.5%En amortiguador de glicina-HCl pH 1.9Solución de cloruro de sodio al 0.85%Solución estándar de hierro 150 ug/dlAgua desionizada

3.5 MANEJO DE SUSTANCIAS

Para pipetear el material biológico y los reactivos de esta técnica es necesario emplear propipeta.

39

3.6 TECNICA

Preparar 3 tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla (es recomendable realizar el problema y el estándar por duplicado).

BLANCO ESTANDAR PROBLEMAml

Amortiguador

Suero o plasma

Solución salina

Solución estándar 150 ug/dl

2.0

---

0.5

---

2.0

---

---

0.5

2.0

0.5

---

---

Mezclar vigorosamente y dejar en reposo mínimo de 20 minutos. Leer la absorbancia A1 contra el blanco a una longitud de onda de 530 nm.

Solución de batofenan-trolina sulfonatada 0.05 0.05 0.05

Mezclar inmediatamente, dejar reposar de 30 a 90 minutos. Leer la absorbancia A2 contra el blanco a una longitud de onda de 530 nm.

4.- CALCULOS

Calcular la concentración de hierro presente en el suero del paciente empleando la siguiente fórmula;

Fe (g)/dl) = A2 – A1 del problemaA2 – A1 del problema

x concentración del estándar en g/dl


65 – 175 g/dl

40

3.- PROCEDIMIENTO (B)

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13x100 mmPipetas serológicas de 1.0 yh 5 mlGradilla para tubosPisetaCeldaspropipeta

El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda la noche en ácido nítrico o clorhídrico diluido con un volumen igual de agua; al día siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.



3.3 EQUIPO

EspectrofotómetroAgitador de tubosBaño de incubación

3.4 REACTIVOS

Buffer de fosfato de sodio 0.4 M pH 5.5Reactivo de coloración.- AcidoBatofenantrolindisulfónico, sal disófica 0.68 mM, fosfato de sodio 0.4 M pH 5.5Ascorbato de sodioSolución estándar de hierro 1 ug/ml = 17.91 mmol/LAgua desionizadaHCl 1 NAcido tricloroácetico 20%Acetato de sodio al 30%



41

3.6 TECNICA

SIN DESPROTEINIZAR

BLANCOReactivos

ESTANDAR BLANCOProblema

PROBLEMA

Ascorbato de sodio 5 mg 5 mg 5 mg 5 mgml

Buffer

Reactivo de color

---

1.0

---

1.0

1.0

---

---

1.0Disolver el ascorbato agitando lentamente.

Solución estándar --- 1.0 --- ---

Agua destilada 1.0 --- --- ----

Suero --- --- 1.0 1.0

Mezclar, tapar los tubos y dejarlos a 37 ºC durante 10 minutos.Enfriar a temperatura ambiente, medir las extinciones del problema y del estándar contra el blanco de reactivos y la extinción del blanco del problema contra agua destilada a 535 nm.

Nota: Si la extinción del blanco suero medida frente a agua excede 0.3, debe realizarse la determinación con suero desproteinizado.

42

CON DESPROTEINIZACION PREVIA

PROBLEMA ESTANDAR BLANCOml

Suero 2.0 --- ---

Estándar --- 2.0 ---

Agua destilada --- --- 2.0

HCl 1 N 1.0 1.0 1.0

Mezclar, dejar reposar durante 45 minutos a temperatura ambiente.

TCA al 20% 1.0 1.0 1.0

Mezclar, y centrifugar luego el problema. Pipetear de las soluciones claras en tubos limpios y secos.

Sobrenadante exento de proteínas o mezcla patrón o mezcla blanco

2.0 2.0 2.0

Acetato de sodio 1.0 1.0 1.0

Ascorbato de sodio 5 mg 5 mg 5 mg

Reactivo de color 1.0 1.0 1.0

4.- CALCULOS

SIN DESPROTEINIZACION

CONCENTRACION DE HIERRO = (EPROBLEMA – EBLANCO) x F g/dl

F= 100EESTANDAR

CON DESPROTEINIZACION PREVIA

CONCENTRACION DE HIERRO = EPROBLEMA x 100 ug/dlEESTANDAR

43


Hombres 59 – 158 g/dl

Mujeres 37 – 145 g/dl

6.- BIBLIOGRAFIA

Beale, R.N., Bostrom, J.O. Improved rapid methods for the determiantion of iron content and binding capacity of serum.Jclin. Pathol

Loria, A., Monge, B. Técnicas de dosificaciones séricas de hierro y capacidad de fijación de hierro. Rev. Inv. Clin. 20:429 (1969).

44

CAPACIDAD LIBRE DE FIJACION DE HIERRO

1.- INTRODUCCION

En el plasma, el hierro se encuentra unido a la trasnferrina (b-globulina) y la capacidad total de fijación de hierro (C.T.F.H.) depende de la concentración de esta globulina. La transferrina que no se encuentra unida a hierro se conoce como la capacidad libre de fijación de hierro. La concentración de hierro en el suero más la capacidad libre de fijación de hierro es igual a la capacidad total de fijación de hierro.

CAPACIDAD TOTAL DE FIJACION DE HIERRO HIERRO EN EL

= SUEROCAPACIDAD LIBRE DE+ FIJACION DE HIERRO

La capacidad libre es determinada al adicionar un exceso de hierro al suero y midiendo el hierro retenido después de la adición de carbonato de magnesio (o bien una resina de intercambio iónico) a la muestra..

FUNDAMENTO

Un exceso de hierro es añadido a la muestra para saturar totalmente a la transferrina y el hierro libre se precipita por la adición de carbonato de magnesio. Se centrifuga y en el sobrenadante se determina el hierro unido a la transferrina después de la saturación.

2.- OBJETIVOS

– Determinar la capacidad libre de fijación de hierro.

– Calcular la capacidad total y el % de saturación de la transferrina.

3.- OBJETIVOS (B)

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13x100 mmPipetas serológicas de 0.1 mlPipetas serológicas de 1.0 mlPipetas serológicas de 5.0 mlGradilla para tubosPiseta

45

CeldasPropipetaEspátulaPapel sanitario


1. MATERIAL BIOLOGICO


2. EQUIPO

EspectrofotómetroAgitador de tubosCentrífuga

3. REACTIVOS

Solución de batofenantrolina al 0.64%Solución amortiguadora de glicina-HCl pH 1.9Solución de ácido ascórbico al 0.5%Solución de trabajo: ácido ascórbico al 0.5%En amortiguador de glicina-HCl pH 1.9Solución de cloruro de sodio al 0.85%Solución estándar de hierro 150 ug/dlSolución de hierro de 600 ug/dlCarbonato de magnesioAgua desionizada

4. MANEJO DE SUSTANCIAS


46

5. TECNICA

Preparar tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla (es recomendable realizar el problema por duplicado).

PROBLEMA

TUBO 1 TUBO 2

ml

Suero o plasma

Solución hierro de600 ug/dl

1.0

1.0

1.0

1.0Dejar en reposo 20 minutos

Carbonato de magnesio 200.0 mg 200.0 mg

Mezclar vigorosamente durante 2 minutos, centrifugar a 3000 rpm durante 30 minutos. Tomar del sobrenadante 0.5 ml de cada uno de los tubos y procesarlos de la misma forma que para hierro sérico.

47

BLANCO ESTANDAR PROBLEMAml

Amortiguador 2.0 2.0 2.0

Suero o plasma --- --- 0.5

Solución salina 0.5 --- ---

Solución estándar 150ug/dl--- 0.5 ---


Solución de batofenantro-lina sulfonatada 0.05 0.05 0.05


4.- CALCULOS

Capacidad libre A2 - A1 del problemaX conc. Del x 2 estándar

de combinación = A2 - A2 del estándar

% de saturación = Conc. De Fe en suro X 100Capacidad libre

Capacidad total de fijación de hierro

= hierro en el suero + capacidad libre de fijación de hierro


Capacidad libre de combinación

Hombres 200 - 300 g/dlMujeres 150 - 250 g/dl

Capacidad total de combinación

48

Hombres 300 - 400 ug/dlMujeres 250 - 350 ug/dl

% de saturación

20 - 50

3.- PROCEDIMIENTO (B)

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13x100 mmPipetas serológicas de 0.1 y 0.2 mlPipetas serológicas de 1.0 mlGradilla para tubosPisetaCeldasPropipeta



suero o plasma libre de hemólisis

3.3 EQUIPO

EspectrofotómetroAgitador de tubosBaño de incubación

3.4 REACTIVOS

Buffer Tris (hidroximetil) aminometano 1.0 M pH 8.3Solución reductora.- Sulfato de metilaminofenol 30MM, hidrogenosulfito de sodio 162 mM.Reactivo de coloración.- AcidoBatofenantrolindisulfónico, sal disódica 1.7 Solución estándar de hierro 2.5 mg/dlAgua desionizada


49


BLANCOReactivos

ESTANDAR BLANCOProblema

PROBLEMA

ml

Suero

Buffer

Solución estándar

---

0.5

---

---

0.5

0.2

1.0

0.5

0.2

1.0

0.5

0.2Mezclar, tapar los tubos y dejar en baño de agua durante 10 minutos a 450 ºC

Solución reductora 0.2 0.2 0.2 0.2

Agua destilada 1.2 1.0 0.2 ----

Reactivo de color 0.2 0.2 --- 0.2

Mezclar, tapar los tubos y dejarlos a 45 ºC durante 90 minutos. Enfriar a temperatura ambiente, medir las extinciones del problema y del estándar contra el blanco de reactivos y la extinción del blanco del problema contra agua destilada a 535 nm.

4.- CALCULOS

CAPACIDAD LIBRE DEFIJACION DE HIERRO = (EESTANDAR – EPROBLEMA + EBLANCO) X f

F= 500 EESTANDAR

50


Capacidad libre de fijación de hierro


Capacidad total de fijación de hierro


6.- BIBLIOGRAFIA

Beale, R.N., Bostrom, J.O. Improved rapid methods for the determination of iron content and binding capacity of serum.Jclin. Pathol. 15:156 (1962)

Loria, A., Monge, B. Técnicas de dosificaciones séricas de hierro y capacidad de fijación de hierro. Rev. Inv. Clin. 20:429 (1969).

51

HEMOGLOBINA FETAL(DESNATURALIZACION ALCALINA)

1.- INTRODUCCION

La hemoglobina normal en el adulto (Hb A) consta de dos moléculas proteícas, cada una de las cuales contiene dos cadenas polipeptídicas, llamadas a y b.

La hemoglobina fetal (Hb F) es similar a la Hb A, posee dos cadenas a pero difiere en la presencia de dos cadenas y en lugar de las cadenas b. Al nacer, la Hb F constituye el 80% de la Hb total, sin embargo, esta desciende a menos del 2-38 a los seis meses de edad y persiste hasta la vida adulta.

La información para producir Hb F esta latente pero se manifiesta en niveles importantes en ciertas patologías como son: trastornos talasémicos, algunas hemoglobinopatías, anemia aplasica y metástasis medular.

FUNDAMENTO

La Hb F a diferencia de las demás hemoglobinas presentes en la sangre, resiste condiciones de hidrólisis alcalina y ácida.

2.- OBJETIVOS

– Cuantificar la Hb F en una muestra de sangre.

– Demostrar que la Hb F es más resistente que las demás hemoglobinas, frente a la desnaturalización con hidróxido de sodio.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13 X 100 mmTubos de ensayo de 13 x 150 mmPipetas de 0.2, 5.0 y 10 mlPipetas de sahli (0.02 ml)BoquillaGradillaCeldas de 1 cm de diámetro


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3.3 EQUIPO

CentrífugaEspectrofotómetro o fotómetroAgitador de tubos (Vortex)

3.4 REACTIVOS

Citrato de sodio al 3.8%Hidróxido de sodio 0.083 NSolución salina al 0.9%Cloroformo R.A.EDTA al 0.3%Sulfato de amonio al 50%

3.5 TECNICA

SEPARACION DEL HEMOLIZADO

La muestra de sangre es colectada añadiendo 1 mg de EDTA por cada ml de sangre (EDTA al 10%), centrifugar y separar el plasma. Los eritrocitos son lavados dos veces con solución salina al 0.9%, a un volumen de células lavadas se les añade un volumen de agua y un volumen de cloroformo. Mezclar en Vortex de 5 a 7 minutos, dejar 12 h a 4ºC; centrifugar a alta velocidad durante 30 minutos. La capa superior acuosa, la cual contiene la Hb se transfiere a un recipiente limpio para la determinación de Hb fetal.

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA FETAL

a.- Medir 3.2 ml de NaOH 0.0083 N en un tubo.

b.- Añadir 0.2 ml de solución de Hb (hemolizado), lavar la pipeta varias veces con la misma solución. En el momento de la adición poner en marcha el cronómetro.

c.- Al minuto exanto, añadir 6.6 ml de sulfato de amonio al 50%, tapar e invertir el tubo inmediatamente seis veces.

d.- Filtrar a través de papel filtro.

e.- Hacer un control por dilución del hemolizado con EDTA al 0.3% en una relación de 1:251.

f.- Leer las absorbancias del control y del filtrado contra agua a 540 nm.

53

4.- CALCULOS

% de Hb fetal =

=

Absorbancia del problemaAbsorbancia del control X 5Absorbancia del problemaAbsorbancia del control

X 100

X 20


En sangre normal es menor de un 2% después de los 2 años de edad.

6.- BIBLIOGRAFIA

Williams, W.J. Hematología. Ed. Salvat. 2ª. Edición. 1983.

54

FRAGILIDAD OSMOTICA

1.- INTRODUCCION

La prueba de fragilidad osmótica es un método simple para valorar la relación que existe entre el área/volumen del glóbulo rojo y detectar por lo tanto la presencia de algún defecto en la membrana del eritrocito. En algunas anemias hemolíticas se presentan alteraciones en la fragilidad de los glóbulos rojos como sería el caso de la esferocitosis hereditaria y las talasemias.

FUNDAMENTO

Los eritrocitos están rodeados por una membrana semipermeable al agua y a electrolitos. Si un eritrocito es colocado en una solución hipotónica, el equilibrio osmótico puede ser estabilizado por la acción del agua que penetra al glóbulo rojo y provoca que este se hinche hasta alcanzar una forma esférica. En este punto se produce un desplazamiento de los electrolitos u un cambio en la molécula de la hemoglobina; posteriormente la membrana del eritrocito se rompe liberando toda la hemoglobina contenida en él.

La cantidad de hemoglobina liberada es metida en diferentes concentraciones de NaC1 y comparada con la obtenida en una muestra totalmente hemolizada. Los eritrocitos presentan resistencia globular cuando están en contacto con soluciones hipotónicas de concentración decreciente de NaC1. El punto donde se inicia la hemólisis se le denomina resistencia mínima y cuando la hemólisis es completa se llama resistencia máxima.

2.- OBJETIVOS

– Evaluar la resistencia de la membrana de los eritrocitos a los cambios a que son sometidas in vitro.

– Determinar la resistencia mínima y máxima de una muestra.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13x100 mmPipetas serológicas de 0.1 mlPipetas serológicas de 1.0 mlPipetas serológicas de 5.0 mlGradilla para tubosPiseta

55

CeldasPropipeta


Sangre heparinizada o desfibrinada o bien sangre recientemente extraída en EDTA al 10% y lavada varias veces con solución salina isotónica.

3.- EQUIPO

EspectrofotómetroAgitador de tubosCentrifuga

3.4 REACTIVOS

HeparinaSolución de NaC1 al 10% en amortiguador de fosfatos de pH 7.4Solución de trabajo de NaC1 al 1% (diluir la solución anterior 1:10).

3.5 CONDICIONES DE LA MUESTRA

Es necesario utilizar muestra heparinizada o desfibrinada ya que si se emplea sangre oxalatada o citratada, u otros anticoagulantes variarán las condiciones de la determinación.

56

3.6 TECNICA

Preparar 13 tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla:

TUBO NaC1 1%Ml

Agua dest.Ml

Conc. DeNaC1 (X)

Absorbancia Hemolisis%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

4.50

4.25

3.75

3.25

3.00

2.75

2.50

2.25

2.00

1.75

1.50

1.00

0.50

0.50

0.75

1.25

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50

4.00

4.5

0.90

0.85

0.75

0.65

0.60

0.55

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

0.20

0.10

0 0

100

Homogenizar perfectamente la sangre y adicionar 0.05 ml a cada uno de los tubos mezclando por inversión varias veces.

Dejar reposar los tubos durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Resuspender y centrifugar todos los tubos a 1500 rpm durante 5 minutos.

Separar el sobrenadante de cada tubo y utilizando el del tubo #1 como blanco, leer la absorbancia de los demás a 540 nm.

57

4.- CALCULOS

Obtener el % de hemólisis de cada uno de los tubos, relacionando la absorbancia de cada tubo con la obtenida en el tubo # 13, ésta equivale al 100% de hemólisis.

Graficar % de hemólisis contra la concentración final de NaC1.

Obtener el valor de la concentración de NaC1 a la cual obtiene el 50% de hemólisis.


0.47 – 0.57% de NaC1 50% de hemólisis.

6.- BIBLIOGRAFIA

Decie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth edition. Churchill Livingstone, New York. 1975.

58

INDUCCION DE DREPANOCITOS

1.- INTRODUCCION

Existe una serie de alteraciones posibles en el proceso de síntesis de la molécula de hemoglobina, entre las más estudiadas de estas hemoglobinopatías, se encuentran la Hb S cuya presencia ocasiona la llamada drepanocitosis, la cual es una alteración en la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de las globinas (sustitución de ácido glutámico por valina), esto se traduce en una variación de las propiedades fisicoquímicas de la molécula, entre otras la baja solubilidad en condiciones de baja tensión de oxígeno, polimerizando la Hb y favoreciendo la forma característica de este tipo de anemia.

FUNDAMENTO

La presencia del metabisulfito de sodio en una muestra de anemia falciforme provoca disminución de la tensión de oxígeno y por lo tanto la deformación de los eritrocitos al polimerizarse las moléculas de hemoglobina S.

2.- OBJETIVO

Diagnosticar la presencia de anemia drepanocítica o sus variantes.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Portaobjetos y cubreobjetosTubos de 10x75 mmGradilla

3.2- MATERIAL BIOLOGICO

Sangre venenosa o capilar

59

3.3 EQUIPO

Microscopio

3.4 REACTIVOS

Metabisulfito de sodio al 2% en agua destilada (recién preparado)

3.5 TECNICA

En un portaobjetos colocar una gota del metabisulfito de sodio al 2% y una gota de sangre venosa o capilar, mezclar con un aplicador. En seguida colocar un cubreobjetos sobre la mezcla, paralelamente se monta un control, sustituyendo el agente reductor por solución salina fisiológica.

Se mantiene en cámara húmeda durante 15 a 30 minutos y se observa al microscopio con objetivo de 40X


La sola presencia de células falciformes (drepanocitos) se considera como prueba positiva, el control con solución salina resulta útil cuando existen alteraciones en la forma (poiquílocitosis) debidas a otras patologías.


Prueba negativa

6.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnóstico Hematológico. Ed. Científico-Médica 1973.

William J. William Hematology 3 Ed. Mc Graw-Hill Book Company 1983.

60

HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA

1.- INTRODUCCION

Entre las causas principales de anemia, se encuentran las hemolíticas, cuya naturaleza puede ser intracorpuscular (hereditarias) o extracorpuscular (adquiridas); en las primeras la destrucción se realiza en el vaso (extravascular) y en las segundas generalmente se hemolizan intravascularmente, en este último tipo de anemias los niveles de hemoglobina en plasma se incrementan notablemente, así que este parámetro es indicativo del tipo de hemólisis que sufre el paciente.

FUNDAMENTO

La hemoglobina es una proteína que actúa como pseudoperoxidasa, esta propiedad es aprovechada para ponerla de manifiesto al catalizar la oxidación de la bencidina por acción del agua oxigenada para producir un complejo de color azul.

2.- OBJETIVO

Determinar los niveles de hemoglobina libre en plasma de una muestra problema.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensaye de 13 X 100 mmTubos de ensaye de 16 X 150 mmPipetas serológicas de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0 mlPropipetaPisetaGradillaCeldas


Sangre venenosa o arterial

3.3 EQUIPO

61

CentrifugaEspectrofotómetro

3.4 REACTIVOS

EDTA al 10%HeparinaBencidina al 1%Agua oxigenada al 1%Estándar de hemoglobina 200 mg/L

3.5 TECNICA

Obtener la muestra de sangre de preferencia con heparina como anticoagulante (0.1 ml, 100 unidades) o en su defecto con EDTA al 10% mezclar y centrifugar, separar el plasma cuidadosamente y centrifugar nuevamente, transferir el plasma a otro tubo.

Marcar 3 tubos de 16 X 150 mm :

PROBLEMA ESTANDAR BLANCO

Bencidina 1% 1.00 ml 1.0 ml 2.0 ml

Plasma 0.02 ml --- ---

Estándar de Hb --- 0.02% ---

Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

H2O2 1.0 ml 1.0 ml 1.0 mlMANTENER LOS TUBOS A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 20 MINUTOS

Acido acético 10% 10.0 ml 10.0 ml 10.0 ml

Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer a 515 nm.

62


Absorbancia del problema X 200 mg/L = mg de Hb/LAbsorbancia del estándar


Menor a 30 mg/L

TOXICIDAD DE LAS SUSTANCIAS

La bencidina es un reactivo considerado como carcinógenico por lo que se deben extremar precauciones en su manejo.

6.- BIBLIOGRAFIA

Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. FifthEdition. Churchill Livingstone, New York. 1975

63

RECOMENDACIONES GENERALES PARA REALIZAR LAS PRUEBAS DE COAGULACION

2. Todo el material debe lavarse con agua bidestilada y sólo se empleará para pruebas de coagulación.

3. La mezcla de anticoagulante y sangre debe ser exacta. La solución de citrato de sodio al 3.8% se debe emplear en una proporción de una parte de anticoagulante para nueve partes de sangre. La mezcla debe realizarse por inversión suave del tubo y no por agitación.

4. No usar reactivos con fecha de caducidad vencida. Debe tenerse mucho cuidado de no contaminar con plasma o con reactivos los viales empleados para cada determinación.

5. Los reactivos empleados deben alcanzar la temperatura indicada evitándose al mismo tiempo un sobrecalentamiento (Tomar en cuenta que se trabaja con un sistema multienzimático). También debe tomarse el tiempo de incubación debidamente.

6. Usar siempre un control de plasma humano normal fresco o liofilizado para todas las determinaciones realizadas.

7. Utilizar tubos de vidrio recubiertos de silicón.

8. Efectuar todas las pruebas por duplicado.

9. No utilizar material de vidrio que este dañado o rayado.

10.La obtención del espécimen debe ser realizado bajo las mejores condiciones y evitando en todo momento cualquier fuente de variación (e.g. tiempo prolongado de la toma, personal inexperto, etc.)

11.La muestra deberá procesarse máximo después de dos horas de haberla tomado, en caso de no ser así deberá refrigerarse y trabajarla en el transcurso de la mañana.

12.No utilizar muestras hemolizadas.

64

FRAGILIDAD CAPILAR(PRUEBA DEL TORNIQUETE)

1.- INTRODUCCION

La hemostasis es el conjunto de fenómenos que tienden a controlar el sangrado cuando hay lesión en un vaso sanguíneo. Dentro de los mecanismos que participan en este proceso están: Los Vasculares y los Celulares, representados por el endotelio vascular y las plaquetas respectivamente.

Una de las pruebas que mide ambos mecanismos es la prueba del torniquete o fragilidad capilar, puesto que las plaquetas y el cemento intercelular de los vasos (vitamina C) son los factores de mayor importancia para conservar la integridad de los vasos.

FUNDAMENTO

Esta prueba permite someter a prueba la resistencia capilar mediante la aplicación de una presión debida al esfingomanómetro colocado alrededor del antebrazo. Esto provocará a aparición de unas cuantas petequias en la zona seleccionada de un paciente normal. Sin embargo, el número de éstas se incrementará en situaciones de trombocitopenia o en alteraciones vasculares. La prueba puede ser positiva aún en pacientes con tiempo de sangrado normal.

2.- OBJETIVO

Conocer y aplicar una prueba útil en la detección de trastornos vasculares y celulares de la coagulación.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

EsfingonanómetroEstetoscopio

65


Es una prueba in vivo

3.3 REACTIVOS

No requiere reactivos

3.3 TECNICA

1.- Obtener la presión arterial y calcular el promedio de las lecturas.

2.- En el brazo opuesto colocar el esfingomanómetro. Marcar una zona de 3 cm de diámetro en el antebrazo. Esta deberá estar libre de marcas o petequias.

3.- Aplicar la presión promedio obtenida durante 5 minutos.

4.- Retirar el esfingomanómetro y al cabo de 5 minutos observar la presencia de petequias en el antebrazo en el área seleccionada y a una distancia de 5 cm de la zona de aplicación.


El número de petequias comprendidas en el área mencionada no debe ser superior a 20. En casos normales las petequias aparecen con frecuencia justo debajo del borde inferior del esfingomanómetro, estas no se toman en cuenta.


0 a 20 petequias/3 cm. de diámetro

6.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El Laboratorio en el Diagnóstico Hematológico. Ed. Científico-Médica 1973

Lynch-Raphael. Métodos de Laboratorio en el Diagnóstico 2ª. Ed. Interamericana 1972.

Todd-Sanford. Diagnóstico Clínico por el Laboratorio 6ª. Ed. Salvat 1979.

66

William J. Williams Hematology 3ª. Ed. Mc. Graw-Hill Bool Company 1983.

67

TIEMPO DE SANGRADO

1.- INTRODUCCION

Un tiempo de sangrado normal indica una retracción normal de los capilares y la existencia de un número suficiente de plaquetas con actividad normal. Se alarga en la insuficiencia del factor VII, púrpura trombocitopénica, tromboastenia de Glanzmann, en la enfermedad de Von Willebrand, etc.

Esta prueba da información de la función hemostática global de las plaquetas in vivo, por la determinación del tiempo del sangrado de una incisión estándar en la piel mientras se mantiene aumentada la presión venosa, con ayuda de un esfingomanómetro.

Además de ser una prueba global de los mecanismos de coagulación, es importante en la evaluación de trombocitopenia debido a su capacidad para discriminar entre las plaquetas con función normal y las que tienen función disminuida o aumentada.

FUNDAMENTO

La determinación del tiempo de sangrado mide: la capacidad de los capilares para controlar el sangrado, cantidad y calidad de las plaquetas y la actividad de los factores en el control del sangrado.

2.- OBJETIVOS

Realizar dos determinaciones de tiempo de sangrado.

Evaluar la importancia de esta determinación, así como sus ventajas y limitaciones.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Lencetas estérilesTorundas de algodón con alcoholPapel filtro

3.2 EQUIPO

Esfingomanómetro

68

3.3 TECNICA

METODO DE DUKE

a) Dar masaje suave al lóbulo de la oreja y limpiarlo con una torunda de algódon impregnada con alcohol (también puede hacerse en el pulpejo del dedo anular).

b) Con una lanceta estéril hacer una punción de 2 x 4 mm de profundidad (con un movimiento rápido) en el borde inferior del lóbulo de la oreja o en el pulpejo del dedo. En el momento en que aparece la gota de sangre se marca el tiempo en el cronómetro.

c) Cada 15 segundos se aplica cuidadosamente sobre la gota de sangre el borde de un papel filtro, sin tocar la herida.

d) Para el cronómetro en el momento en que el papel filtro ya no se manche de sangre.

Nota: No abarcar venas visibles ni lesiones cutáneas. Hay que recordar que ciertos factores locales (presencia de hematomas) pueden variar el tiempo de sangrado.

NOTIFICACION DE MARX

Después del paso (b) del método anterior, se introduce el lóbulo de la oreja, en un vaso de precipitado de 50 ml con agua a 37 ºC; el cronómetro se pone en marcha cuando se observa la aparición de un hilo continuo de sangre. En el instante en que este se interrumpe se para el cronómetro.

METODO DE IVY

a) En el brazo del paciente se coloca el esfingomanómetro a una presión de 40 mm de Hg durante 2 a 4 minutos.

b) En el antebrazo del paciente se define un área y utilizando una lanceta estéril, se hacen 3 punciones de 2 x 4 mm de profundidad, (evitando las venas visibles o lesiones cutáneas). En el momento en que aparece la gota de sangre se marca el tiempo en el cronómetro.

c) Cada 30 segundos secar la gota con un papel filtro, procurando no tocar la piel, hasta que desaparezca la sangre.

d) Parar el cronómetro en el momento en que el papel filtro ya no se manche de sangre.

69


Método de Duke 1 – 3 minutosMétodo de Marx 3 – 5 minutosMétodo de Ivy 3 – 7 minutos

5.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El laboratorio en el DiagnósticoHematológico. 4ª. Edición Científico-Médica (1973) España.

William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983) USA.

70

RETRACCION DEL COAGULO

1.- INTRODUCCION

Cuando los mecanismos celulares de la coagulación se activan como ocurre en una lesión vascular, las plaquetas tienden a obturar el sitio lesionado formando así un trombo dentro del cual quedan atrapados además de plaquetas los otros elementos formes de la sangre. Las plaquetas entonces liberan una proteína fibrilar contractil, llamada trombostenina que es la causante de la retracción del coágulo. Existen trastornos plaquetarios sobre todo cualitativos donde esta función esta alterada.

FUNDAMENTO

Al tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y colocarla en un tubo, ocurre primero coagulación y posteriormente la retracción del coágulo; está en función de la cantidad y capacidad funcional de las plaquetas.

2.- OBJETIVO

Evaluar mediante esta prueba la cantidad y calidad de las plaquetas en una muestra problema.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de centrífuga graduadosTapón de hule con tirabuzón


Sangre sin anticoagulante

3.3 EQUIPO

Baño de incubación a 37 ºC

71

3.4 TECNICA

Se toma 5 ml de sangre por punción venosa y se colocan en el tubo de centrifuga graduado, se tapa con el tapón de hule con tirabuzón, se deja coagular y se mantiene a 37 ºC durante una hora.

Después de esta incubación se saca y se observa el coágulo (compacto o gelatinoso); el tubo con el suero y los glóbulos rojos restantes se centrifugan a 3000 rpm durante 5 minutos después de lo cual se lee el volumen total de suero que corresponde al suero expulsado del coágulo.

4.- RESULTADOS

El volumen total de sangre es el 100%

El volumen de suero representa el x %

A este resultado se le resta el valor del hematocrito y esto es el porcentaje de retracción.

5.-VALORES DE REFERENCIA

25% de retracción

6.- BIBLIOGRAFIA

William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983)- USA.

72

TIEMPO DE COAGULACION

1.- INTRODUCCION

El diagnóstico y estudio de un efecto de coagulación cualquiera, representa interacciones complejas entre sistemas enzimáticos y varias proteínas enzimáticas lábiles.

Se encuentran tiempos prolongados en la hemófilia clásica y en la deficiencia del factor IX, la prueba carece de valore para insuficiencias ligeras de distintos factores, porque basta una pequeña cantidad de trombina para producir un coágulo de fibrina.

Es menos útil para anomalías de las últimas etapas de la coagulación.

FUNDAMENTO

Nos da un índice de la eficacia global del sistema intrínseco, así como del sistema celular.

2.- OBJETIVO

Medir el tiempo de coagulación de la sangre in vitro

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 13x100 mmGradilla para tubosTubos capilaresLancetas estériles

3.2 MATERIAL

Baño de incubación a 37 ªCCronómetro


Sangre total sin anticoagulante.

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3.4 METODO

1) Método de Lee-White

a) Colocar sangre obtenida por punción venosa en dos tubos de ensayo (2 ml aproximadamente), poner en marcha el cronómetro.

b) Poner los tubos en baño de incubación a 37ªC.

c) Al cabo de 3 minutos se inclina un tubo cada 15 segundos con agitación suave y otro cada 30 segundos con el fin de determinar el tiempo de coagulación.

d) Se nota como tiempo de coagulación al intervalo de tiempo transcurrido desde que la sangre entra en contacto con el cristal hasta que al invertir completamente el segundo tubo la sangre ya no fluye. Sacando el promedio de los dos tubos se obtiene el tiempo de coagulación.

2) Método capilar

a) Aseptizar la yema del dedo y puncionar firmemente con una lanceta estéril.

b) Se desecha la primera gota y se llena un capilar, cuidando de que no queden burbujas de aire, poner el cronómetro en marcha.

c) A partir del tercer minuto se procede a romper pedazo a pedazo el capilar hasta observar la formación del hilo de fibrina, en el momento en que se presenta la coagulación; parar el cronómetro.

5 VALORES DE REFERENCIA

Método de lee-White 5 – 10 minutosMétodo capilar 3 – 5 minutos

Comentarios

1) El tiempo de coagulación es relativo. Sobre el tiempo normal de coagulación influyen: La temperatura, el tamaño y la superficie del tubo, el pH de sangre, frecuencia e inclinación y otros factores más.

2) La punción no debe ser traumática, no debe ejercerse presión sobre el área de punción.

74

3) Es importante encontrar la vena limpia y rápidamente obtener la sangre al primer intento, pues de otra manera se provocaría la entrada a la jeringa de sustancias tisulares y por lo tanto acortar el tiempo de coagulación.

4) De ser posible deben usarse tubos nuevos que no hayan tenido contacto con detergentes.

5) El diámetro interior del tubo de ser constante, la sangre coagula más rápidamente en tubos pequeños.

6) La temperatura influye, temperatura inferior a 37ºC retarda la coagulación.

7) El punto final es relativo, también, no indica que haya coagulación completa en toda la sangre; lo que sucede es que sea formado suficiente fibrina en la zona de contacto con el aire para sostener toda columna de sangre con el tubo completamente invertido.

6.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El laboratorio en el DiagnósticoHematológico. 4ª. Edición Científico-Médica (1973) España

William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983) USA.

75

TIEMPO DE PROTROMBINA

1.- INTRODUCCION

La protrombina tiene un peso molecular aproximado de 75,000. La protrombina es una a-1 globulina que se sintetiza en elhígado y requiere para su síntesis la vitamina k.

Esta prueba mide la actividad coagulante del sistema extrínseco incluyendo fibrinógeno, protrombina y factores V, VII y X. Además permite registrar los efectos de anticoagulantes y también se emplea en el diagnóstico de trastornos de la coagulación congénitos y adquiridos.

FUNDAMENTO

Cuando el calcio y un extracto de tejido de cerebro (Factor III, fosfolípidos y proteínas y que constituyen una tromboplastina completa) son añadidos al plasma, inmediatamente el factor VII reacciona con el factor V, calcio y los fosfolípidos presentes en extracto del tejido para dar origen a la protrombinasa extrínseca, la cual transforma a la protrombina en trombina; ésta convierte al fibrinógeno en fibrina.

La velocidad de formación de la fibrina depende de la concentración de los factores V, VII y X, protrombina, fibrinógeno por lo tanto la prueba valora la actividad de la totalidad de estos factores, es decir, los que participan en la vía intrínseca, excepto el factor XIII.

2.- OBJETIVOS

Realizar una curva de actividad de protrombina vs tiempo.

Evaluar el tiempo de protrombina en plasmas normales y patológicas.

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3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo por 13x100 mmTubos de ensayo de 10x75 mmPipetas serológicas de 0.1 mlPipetas serológicas de 1.0 mlPipetas serológicas de 5.0 mlPipetas Pasteur con bulbo Gradilla para tubos


Plasmas citratado pobre en plaquetas. (sangre venosa adicionada de citrato de sodio al 3.8% en una proporción de 9 partes de sangre y una de anticoagulante, la cual es centrifugada a 3000 rpm durante 10 minutos).

3.3 EQUIPO

CentrifugaBaño de incubación a 37ºCCronómetro

3.4 REACTIVOS

Citrato de sodio al 3.8 %Tromboplastina líquida activadaCloruro de calcio 0.02 M

3.5 CONDICIONES DE LA MUESTRA

Es necesario que la mezcla de anticoagulante y sangre se haga adecuadamente y en la proporción indicada; puesto que muestras donde se observa coágulos pequeños se deben descartar. El plasma deberá separarse inmediatamente del paquete de eritrocitos y colocado en hielo.

3.6 TECNICA

a) Mantener el plasma en baño de hielo hasta el momento de la determinación.

b) Homogenizar adecuadamente el reactivo de tromboplastina.

c) Transferir a un tubo de 10 x 75 mm la cantidad de CaCl2 suficiente para el número de pruebas a efectuar y mantenerlo a una temperatura de 37ºC en el baño de incubación.

77

d) Adicionar 0.1 ml de plasma a un tubo e incubar durante 2 minutos.

e) Posteriormente agregar 0.1 ml de tromboplastina activada (previamente incubada durante 10 minutos) y colocar la mezcla en el baño de incubación a 371C.

f) Agregar 0.1 ml de CaC1212 0.02 M a la mezcla de plasma y tromboplastina, y simultáneamente poner en marcha el cronómetro.

g) Agitar inmediatamente la mezcla y mantenerla en el baño de incubación a 37ºC. Es necesario revisar constantemente la apariencia de la mezcla y para ello se debe contar con buena iluminación para observar oportunamente la aparición de los primeros filamentos de fibrina; este es el momento final de la prueba y se detiene la marcha del cronómetro.

PLASMANORMAL

ml

SOLUCIONNaC1 0.85%

ml

ACTIVIDAD%

1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.1

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

100908070605040302010

Con cada una de las diluciones continuar a partir del punto 4 de la técnica. Graficar los valore obtenidos del tiempo en segundos contra actividad en %. Utilizar para ello papel milimétrico o semilogarítmico.

78

4.- RESULTADOS

Los resultados se expresan en tiempo en segundos o bien en % de actividad.

Un tiempo prolongado (% de actividad bajo, es decir menor al 60%) indicará la deficiencia de uno o más de los siguientes factores

Factor I (Fibrinógeno)Factor II (Protrombina)Factor V (Proacelerina, Factor lábil)Factor VII (proconvertina, factor estable)Factor X (Factor de Stuart-Prower)


Tiempo de protrombina 10 - 15 segundos

% de actividad mayor al 60&

6.- BIBLIOGRAFIA

Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. FifthEdition. Churchill Livingstone, New York. 1975

79

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL

1.- INTRODUCCION

Es un estudio sobre el efecto del factor antihemofílico en las pruebas de coagulación de una fase, Longdell, Wagner y Brinkhous (1953) demostración que había dos tipos de actividad troboplastínica y confirmaron la observación de Mills (1926) de que los preparados de cefalina cruda no coagulan el plasma hemofílico tan pronto como al plasma normal.

Cuando las tromboplastinas hísticas activas fueron diluidas o fraccionadas, tenían estos preparados una actividad semejante a la de la cefalina cruda. Basándose en estos hallazgos, los preparados de tromboplastina pueden describirse como completos o parciales. Las tromboplastinas completas son capaces de producir una coagulación tan rápida en el plasma hemofílico como en el normal, mientras que con la parcial el plasma hemofílico coagula menos rápidamente que el plasma normal.

FUNDAMENTO

El tiempo de tromboplastina parcial mide la actividad intrínseca de la coagulación del plasma. El tiempo requerido para que el plasma recalcificado coagule después de la incubación con fosfolípidos plaquetarios (cefalina) y un activador (caolín) del factor de contacto, es una medida de intensidad con la cual se forma la trombina a través de la vía intrínseca de la coagulación.

Esta prueba mide los factores VIII, IX, XII, II, V, X y la conversión de fibrinógeno a fibrina.

2.- OBJETIVOS

Analizar el mecanismo de acción de la tromboplastina parcial dentro del fenómeno de la coagulación.

Familiarizarse con las precauciones que requiere esta técnica y todas las de coagulación.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

tubos de ensayo de 13x100 mmtubos de ensayo de 10x75 mmpipetas serológicas de 0.1 ml

80

pipetas serológicas de 1.0 mlpipetas Pasteur con bulbo

gradilla para tubos


Plasma citratado pobre en plaquetas (sangre venosa adicionada de citrato de sodio al 3.8% en una proporción de 9 partes de sangre y una de anticoagulante, la cual es centrifugada a 3000 rpm durante 10 minutos).

3.3 EQUIPO

centrifugabaño de incubación a 37ºCcronómetro

3.4 REACTIVOS

Citrato de sodio al 3.8%Tromboplastina parcial líquida activadaCloruro de calcio 0.02 M

3.5 CONDICIONES DE MUESTRA

Es necesario que la mezcla de anticoagulante y sangre se haga adecuadamente y en la proporción indicada; puesto que muestras donde se observa coágulos pequeños se deben descartar. El plasma deberá separarse inmediatamente del paquete de eritrocitos y ser colocado en hielo.

3.6 TECNICA

1. Adicionar a un tubo de ensaye de 10 x 75 mm 0.1 ml de tromboplastina parcial líquida activada e incubarlo a 37ºC durante 2 minutos.

2. Transcurrido los dos minutos, agregar 0.1 ml de plasma, mezclar perfectamente e incubar a 37ºC por 2 minutos.

3. Agregar 0.1 ml de cloruro de calcio 0.02 M (que se encuentra también a la misma temperatura) y simultáneamente poner en funcionamiento el cronómetro. Incubar, a los 20 segundos observar cuidadosamente el tubo de la prueba, haciendo resbalar el contenido por la pared, hasta la aparición de los primeros hilos de fibrina. En este momento detener el funcionamiento del cronómetro. La observación debe hacerse con mucha rapidez metiendo y sacando el tubo del baño de agua.

81

4.- RESULTADOS

La prolongación anormal indica deficiencias intrínsecas de un factor o presencia de un inhibidor. Solo el factor VII no está incluido en el tiempo de tromboplastina parcial. Detecta deficiencias importantes de los factores VIII, IX, XI, XII o presencia de inhibidores (anticoagulantes circulantes) como la heparina, anticuerpos dirigidos contra el factor VIII o IX.


Tiempo de tromboplastina parcial 40 3 segundos.

6.- BIBLIOGRAFIA

Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975

82

TIEMPO DE TROMBINA

1.- INTRODUCCION

La trombina es la enzima activa que transforma el fibrinógeno en fibrina. El calcio acelera esta reacción, pero no es añadido a la prueba. La velocidad de coagulación con la trombina es una función de la concentración de fibrinógeno. La trombina es una globulina que tiene un PM de 37,700 daltons.

Consta de 2 cadenas de longitud desigual unidas por un puente disulfuro. La cadena A de la trombina contiene 49 residuos de aminoácidos y no contiene carbohidratos; la cadena B tiene 225 residuos y deriva de la terminal C de la protrombina y contiene el centro activo de la enzima (residuo de la serina).

FUNDAMENTO

Mide el tiempo de coagulación del plasma citratado en presencia de trombina, explora la última fase de la coagulación. Se encuentra alargado el tiempo de trombina cuando el fibrinógeno se encuentra disminuido, o bien, está presente la heparina o productos de degradación de fribrinógeno y fibrina en cantidades importantes.

2.- OBJETIVO

Emplear una prueba rápida para determinar la concentración de fibrinógeno.

Detectar la presencia de productos de la degradación del fibrinógeno o de la fibrina.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensayo de 10 x 75 mmPipetas de 1.0 ml graduadas 1/100CronómetroGradillaBaño de incubación a 37ºC

83


Plasma citratado pobre en plaquetas.

3.3 REACTIVOS

Citrato de sodio 3.8%Solución salina fisiológicaTrombina humana de 50 unidades NIH


La trombina humana es preparada a partir de mezclas de plasmas y aunque el reactivo tiene una reacción negativa para hepatitis, ésto no excluye el riesgo del contagio; por lo que es necesario manejar el reactivo de trombina y el material biológico con sumo cuidado.

3.5 TECNICA

1. Reconstituir la trombina humana de 50 unidades NIH con 1 ml de solución salina fisiológica, tomar 0.5 ml de ésta y llevarla a 10 ml con solución salina (Reactivo de trombina). Asegurarse que con un plasma normal el tiempo de trombina está entre 18-22 segundos.

2. Poner 0.2 ml del reactivo de trombina e incubarlo 2 minutos a 37ºC.

3. Agregar 0.2 ml de plasma citratado, poner el cronómetro en marcha y anotar el tiempo de coagulación.

4.- RESULTADOS

Anotar el tiempo de la formación del coágulo.


18 – 22 segundos

La prolongación del tiempo de trombina se presenta cuando hay una deficiencia de fibrinógeno o bien la presencia de un inhibidor de la reacción de trombina-fibrinógeno.

84

6.- BIBLIOGRAFIA


85

FIBRINOGENO

1.- INTRODUCCION

Los procedimientos para determinar fibrinógeno pueden ser: Cuantitativos (Colorimétricos y físicos) y semicuantitativos (observación del coágulo): Dentro de los más usados se cuentan los métodos nefelométricos, enzimáticos y gravimétricos.

FUNDAMENTO

(Método enzimático de Claus).- La trombina transforma al fibrinógeno soluble en un polímero insoluble (fibrina), la velocidad de la reacción esta determinada por la concentración del fibrinógeno. Este método mide el fibrinógeno funcional.

(Método de Ratnoff).- El fibrinógeno del plasma es transformado en fibrina utilizando tromboplastina y cloruro de calcio. La cuantificación de fibrinógeno se hace en base a su contenido de tirosina en la molécula utilizando el reactivo fenólico de Folin-Ciocalteau. Este método mide fibrinógeno total.

2.- OBJETIVO

Ejecutar e interpretar correctamente esta prueba.

3.- PROCEDIMIENTO METODO DE CLAUSS

3.1 MATERIAL

Tubos para pruebas de coagulación fibrotips y fibrocups (BBL)


Sangre anticoagulado con citrato de sodio al 3.8% en proporción anticoagulante-sangre 1:10

3.3 EQUIPO

FibrómetroCronómetroCentrífuga

86

3.4 REACTIVOS

Citrato de sodio 3.8&Trombina humana (aprox. 50 unidades NHI/mlFibrindexAmortiguador de veronal 2.84 x 102 M en cloruro de sodio 1.25 X 10 pH 7.35


La trombina humana es preparada a partir de mezclas de plasmas y aunque el reactivo tiene una reacción negativa para hepatitis, ésto no excluye la posibilidad; por lo que es necesario manejar el reactivo de trombina y el material biológico con sumo cuidado.

3.6 TECNICA

- PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACION

1. Con el amortiguador se efectúan una serie de diluciones de un estándar de fibrinógeno (1:5, 1:10, 1:40).

Efectuar en el fibrómetro determinación por duplicado a cada dilución.

a) Incubar 0.2 ml. de la dilución del fibrinógeno durante 2 minutos a 37 oC.

b) Adicionar 0.1 ml del reactivo de trombina (a temperatura ambiente) y accionar el cronómetro del fibrómetro, el cual se para automáticamente al formarse el coágulo.

c) Anotar el tiempo de coagulación para cada uno de los puntos y trazar una gráfica de concentración en mg/dl contra tiempo en segundos.

DETERMINACION DEL FIBRINOGENO PROBLEMA

a) Hacer una dilución de la muestra 1:10 en el amortiguador. Todas las determinaciones se hacen por duplicado, se procesan de igual manera que los puntos de la curva.

b) Anotar el tiempo de coagulación y obtener en la curva de calibración la concentración de fibrinógeno del problema.

c) El resultado se reporta en mg/dl.


87

Si el tiempo obtenido es muy corto (más de 800 mg/dl) se diluye el plasma 1:20 y el resultado obtenido se multiplica por 2.

Si el tiempo es muy prolongado (menos de 50 mg/dl) se efectúa una dilución 1:5 y el resultado se divide entre 2.

Si con una dilución 1:2 el plasma no coagula, la concentración de fibrinógeno es menor de 15 mg/dl.


200 – 400 mg/dl

3.- PROCEDIMIENTO METODO DE RATNOFF

3.1 MATERIAL

Tubos de centrífuga de 15 mlPipetas serológicas de 0.1, 0.2, 1.0, 5.0 y 10 mlPipetas PasteurTubos de cultivo de 13 x 100 mmTubos de cultivo de 16 x 150 mmGradillaMecheroTripieTela de alambreVaso de precipitados de 200 mlPisetaPropipetaVidrio molidoCeldas


Sangre anticoagulada con citrato de sodio al 3.8% en proporción anticoagulante-sangre 1:10.Centrífugar a 1500 rpm durante 5 minutos para separar el plasma.

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3.3 EQUIPO

EspectrofotómetroBaño de incubaciónCentrífuga

3.4 REACTIVOS

Citrato de sodio 3.8%Solución de cloruro de sodio 0.85%Hidróxido de sodio al 10%Carbonato de sodio al 20%Reactivo de Folin-CiocalteauTromboplastina líquida activadaCloruro de calcio 0.02 MSolución estándar de tirosina 20 mg/dl = 234 mg/dl de fibrinógeno

89

3.5 TECNICA

Colocar en un tubo de centrífuga de 15 ml:

ml

Vidrio molido

Cloruro de sodio 0.85%

Tromboplastina

Cloruro de calcio 0.02 M

1.5

10.0

0.2

1.5

Agitar suavemente por inversión

Incubar a 37ºC durante 10 minutos. Agitar suavemente por inversión.

Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm

Descartar el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur.

Repetir 2 veces el lavado de la fibrina.

Descartar el sobrenadante

En este punto es necesario incluir un blanco que se prepara colocando en un tubo de centrífuga de 15 ml, el mismo volumen de vidrio molido que el problema. (ver cuadro anexo).

90

Problema Blancoml

Hidróxido de sodio 10% 1.0 1.0

Colocar los tubos en baño de agua en ebullición durante 10 minutos. Enfriar en hielo.

Carbonato de sodio 20% 3.0 3.0

Agua destilada 7.0 7.0

Folin-Ciocalteau 1.0 1.0

Mezclar después de la adición de cada reactivo. Reposar a temperatura ambiente 10 minutos. Centrifugar 5 minutos a 2000 rpm. Transferir a tubos de 13 x 100 mm los siguientes volúmenes:

Sobrenadante de c/tubo 1.0 1.0

Agua destilada 2.0 2.0

Leer la absorbancia del problema contra el blanco a 650 nm e interpolar el valor en la curva de calibración

91

CURVA DE CALIBRACION

1 2 3 4 blanco

Concentraciónmg/dl 702 468 234 93.6 0

ml

Estándar de tirosina 1.5 1.0 0.5 0.2 --

Hidróxido de sodio 10% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Agua destilada 5.5 6.0 6.5 6.8 7.0

Mezclar después de la adición de cada reactivo. Hervir 10 minutos y enfriar.

Carbonato de sodio 20% 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Folin-Clocalteau 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Mezclar todos los tubos y reposar 10 minutosTomar de cada uno de los tubos 1.0 ml y mezclar con 2 ml de agua destilada (Excepto el blanco). Leer la absorbancia a 650 nm.


1 mg de tirosina = 11.7 mg de fibrinógeno


200 – 400 mg/dl

6.- BIBLIOGRAFIA

Cartwright, G.E. El laboratorio en el DiagnósticoHematológico. 4ª. Edición Científica-Médica (1973)

Teliz Sandoval E. Estudio comparativo de 5 métodos para determinar el fibrinógeno en plasma Tesis de Licenciatura UNAM, 1982.

William J. Williams, Hematology, 3ª. Ed. Mc. Graw-Hill Book Company 1983.

92

TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS

1. INTRODUCCION

En la fracción euglobulinica del plasma, se encuentra el fibrinógeno, el plasminógeno y las fibrinólisinas. Esta técnica suprime los inhibidores del plasminógeno. Las fibrinólisinas del glóbulo rojo destruidas aceleran la lisis, pero se encuentran en cantidades muy constantes, en cambio existe variación en la fibrinólisis plasmática.

Si el paciente cursa con un cuadro de fibrinólisis aumentada, las actividades presentes en dicha reacción transformarán al plasminógeno en plasmina y esta última actuará sobre la fibrina formada de manera acelerada.

FUNDAMENTO

La fracción euglobulinica del plasma preparada por dilución y acidificación, está relativamente libre del sistema enzimático fibrinólitico La desaparición del coágulo va a significar la lisis de euglobulinas, y por lo tanto es un indicio de la presencia de plasmina y/o de los activadores del plasminógeno.

2.- OBJETIVO

Valorar el componente fibrinolítico.

3- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de cultivo de 13 x 100 mmPipetas serológicas de 0.2, 1.0 y 5.0 mlAplicadores de maderaGradillaMatraz erlenmeyer de 50 mlPapel sanitarioPapel parafilm


Plasma citratado pobre en plaquetas

3.3 EQUIPO

93

CentrífugaBaño de incubación a 37 C

3.4 REACTIVOS

Acido clorhídrico 0.1 NAmortiguador de imidazol pH 7.3Trombina diluida (solución de trabajo 1:10)Acido acético 1%Cloruro de calcio 0.025 M

3.5 TECNICA A

a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm colocar:

4.2 ml de agua destilada0.15 ml de ácido clorhídrico 0.3 ml de plasma problema

b. Tapar el tubo con papel parfilm y agitarlo por inversión suavemente.

c. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos

d. Desechar el sobrenadante.

e. Agregar 0.3 ml de amortiguador de imidazol

f. El precipitado se resuspende con aplicador previamente mojado en amortiguador de imidazol.

g. Agregar 0.1 ml de trombina diluida

h. Agitar el tubo suavemente, taparlo con papel parafilm y colocarlo en baño de incubación a 37 oC

i. Observar la formación del coágulo cada 10 minutos.

94

TECNICA B

a. En un matraz erlenmeyer de 50 ml agregar 19 ml de agua destilada.

b. Adicionar 1.0 ml de plasma y 0.35 ml de ácido acético al 1% (gota a gota y agitando).

c. Reposar a 4 oC durante 10 minutos.

d. Agitar y repartir en 4 tubos volúmenes iguales.

e. Centrifugar a 3500 rpm durante 5 minutos.

f. Decantar el sobrenadante y secar la pared interna de los tubos con papel filtro.

g. Redisolver con 1 ml de amortiguador de imidazol.

h. Colocar en baño de incubación a 37 oC.

i. Coagular con 2 gotas de cloruro de calcio 0.025 M o 0.1 ml de trombina (debe coagular entre 1 minuto 45 segundos a 2 minutos).

j. Observar la lisis del coágulo en las 2 primeras horas.


El coágulo debe permanecer formado más de 90 minutos.

5.- BIBLIOGRAFIA

Astrup, T. The biological significance of fibrinolysis Lancet 11:565. 1956.


95

SULFATO DE PROTAMINA

1.- INTRODUCCION

El sulfato de protamina tiene la propiedad de inducir la polimerización no enzimática de complejos solubles de monómeros de fibrina, que se forman en el plasma cuando se encuentran trazas de trombina circulante. Tal fenómeno se denomina paracoagulación y consiste en la formación de filamentos de fibrina o de un verdadero coágulo después de añadir sulfato de protamina.

FUNDAMENTO

Los complejos solubles de monómeros de fibrina con fibrinógeno y productos de la degradación de fibrina y fibrinógeno o ambos, precipitan cuando se añade protamina al plasma.

2.- OBJETIVO

Detectar los monómeros solubles de fibrina y/o los productos de degradación de fibrinógeno y fibrina.

3- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de cultivo de 10 x 75 mmPipetas serológicas de 0.2, 1.0 y 5.0 mlTubos de centrífuga de 5 mlPapel sanitarioPapel parafilm



3.3 EQUIPO

CronómetroBaño de incubación a 37 oC

96

3.4 REACTIVOS

Solución de sulfato de protamina 1% en amortiguador TRIS pH 6.5 0.05 M.Amortiguador TRIS pH 6.5 0.05 M

3.5 TECNICAS

a) Efectuar una dilución 1:5 de la solución de sulfato de protamina con el amortiguador TRIS.

b) Colocar 0.2 ml de esta dilución en un tubo de 10 x 75 mm.

c) El plasma pobre en plaquetas (ppp) del problema se obtiene al centrifugar el plasma rico en plaquetas durante 10 minutos a 3500 rpm. El ppp se coloca en un tubo limpio y se incuba a 37 oC durante 5 minutos.

d) Adicionar 0.2 ml del ppp al tubo que contiene 0.2 ml del sulfato de protamina (dilución 1:5).

e) Tapar el tubo y colocarlo a 37 oC durante 30 minutos. Agitar suavemente y observar la apariencia de la mezcla de reacción. Reportar considerando los criterios indicados en la parte de resultados.

4.- RESULTADOS

g = gelaciónrf = red de fibrina = precipitado grueso = precipitado fino- = solución clara

Si el resultado es positivo es necesario realizar diluciones del sulfato de protamina con el amortiguador TRIS en las siguientes proporciones: 1:10; 1:20 y 1:40. Para cada una de estas diluciones continuar con la técnica desde el inciso (b).

97


Negativo = solución clara

La presencia de un precipitado granular fino significa la existencia de bajos niveles de monómeros de fibrina o productos de degradación de fibrinógeno y de fibrina.

Se considera positiva si los tubos presentan coágulos de fibrina o precipitado fina.

3- BIBLIOGRAFIA

Seaman, A.J. The plasma protamine paracoagulation test.1985. Arch Intern Medical.

Barrantes, A. Hemostasia y trombosis. 1980. Laboratorio de investigación clínica.

98

GELACION DE ETANOL

1.- INTRODUCCION

En algunas patologías de los sistemas de la coagulación como en Coagulación Intravascular Diseminada (CID) o en procesos fibrinolíticos, se producen productos de degradación de la fibrina o del fibrinógeno, así como monómeros de fibrina; los cuales son capaces de paracoagular en presencia de etanol.

FUNDAMENTO

En esta prueba se aprovecha la propiedad de provocar la paracoagulación que tiene el etanol sobre los complejos solubles: monómeros de fibrina o fragmentos Xo ligados a productos de degradación del fibrinógeno o de la fibrina.

2.- OBJETIVO

Observar las reacciones de paracoagulación en una muestra problema.

3- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de cultivo de 10 x 75 mmPipetas serológicas de 1.0 mlGradillaPapel sanitarioPapel parafilm



3.3 EQUIPO

Baño de incubación a 22 C

3.4 REACTIVOS

Citrato de sodio al 3.8%Etanol al 50% en agua destilada

99

3.5 TECNICA

En un tubo de 10 x 75 mm colocar 0.5 ml de plasma pobre en plaquetas. Colocarlo en el baño de incubación durante 3 minutos; adicionar 0.15 ml de etanol al 50%, agitar suavemente el tubo y mantener en reposo durante 10 minutos a 2 oC (TA), después de este tiempo observar con inclinación cuidadosa del tubo, la gelificación de la muestra.

4.- RESULTADOS

Gelación = positivaNo gelación = negativo

Interpretación.- Dado que esta prueba es positiva para monómeros de fibrina como para productos de degradación del fibrinógeno, es necesario que el resultado se analice en forma integral con el resto de las pruebas de laboratorio.


No se observa gelación

6.- BIBLIOGRAFIA

Martínez C. Adela, et al. Técnicas de Hemostasia y trombosis Grupo CLATES. Buenos Aires, Argentina. 1975.

100

HEMOLISINAS Y AGLUTININAS

1.- INTRODUCCION

Los anticuerpos completos son capaces de producir aglutinación o hemólisis en presencia de solución salina. Las hemolisinas son anticuerpos que producen la hemolisis de los hematíes en presencia de completo.

Las aglutininas son anticuerpos que producen aglutinación de los hematíes. El antígeno del hematíe se denomina aglutinógeno para que tenga lugar la aglutinación, no es necesario que haya complemento.

En el campo de la Inmunohematología se ha comprobado que existen distintos tipos de anticuerpos en base a su tamaño, peso molecular, temperatura óptima de reacción medio de reacción, etc. en cuanto a estas propiedades han sido clasificados en dos grupos: anticuerpos fríos y anticuerpos calientes.

Los anticuerpos fríos reaccionan mejor en rango de temperatura de 20 a 30 oC. Puede interferir en la clasificación sanguínea del individuo y en las pruebas de compatibilidad realizadas a temperatura ambiente. Estos anticuerpos se denominan IgM con un peso molecular de 900,000 y reacciona en medio salino.

FUNDAMENTO

Las hemolisinas al estar en presencia del antígeno que estimuló su formación y del complemento, desencadenan una reacción que causa la lisis de los eritrocitos. Este fenómeno es el resultado de la acción enzimática del complemento, el cual es activado por la unión del antígeno y del anticuerpo específico; el complemento activado va a producir cambios en la permeabilidad de la membrana del eritrocito y al cambiar las propiedades osmóticas de ésta, penetran los líquidos y se produce el estallamiento de los eritrocitos (hemólisis).

2.- OBJETIVO

– Realizar la técnica de titulación de hemolisinas y aglutininas en un suero problema.

– Interpretar los resultados obtenidos y establecer su utilidad.

101

3- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de cultivo de 13 x 100 mmTubos de cultivo de 10 x 75 mmPipetas Pasteur con bulboGradillaPapel sanitarioPapel parafilm


Suero problema (A, B ú O)Suspensión de glóbulos rojos (A, B ó AB) al 4% en solución salina

3.3 EQUIPO

Centrífuga

3.4 REACTIVOS

Solución de cloruro de sodio al 0.9%

102

3.5 TECNICA

Preparar una serie de tubos con las siguientes diluciones del suero problema empleado solución salina para ello:

1:1, 1:2, 1:4, ..........., 1:1024

4 gotas del suero problema 4 gotas de sol. Salina

4 gotas de sol. salina

4 gotas del suero problema sin diluir

4 gotas dedil. 1:2

....... Dil.1:1024

1:1 1:2 1:4

Agregar a todos los tubos 2 gotas de la suspensión de glóbulos rojos al 4%.

Centrifugar todos los tubos y centrifugar a 3000 rpm durante 30 segundos. Observar la aglutinación y reportar el título.

Incubar una hora a temperatura ambiente todos los tubos y centrifugar 3 minutos a 3000 rpm.

Observar hemólisis y reportar el título. En ambos casos se reporta el título de la dilución en la cual todavía se presenta hemólisis o aglutinación.

4.- RESULTADOS

Dilución : HemolisinasDilución : Aglutininas


No debe presentarse hemólisis en diluciones mayores a 1:64

6.- BIBLIOGRAFIA


103

ANTICUERPOS IRREGULARES

1.- INTRODUCCION

Dentro de los sistemas antígeno-anticuerpo a nivel eritrocitario se presentan anticuerpos, tanto regulares como irregulares; dentro de éstos se encuentran generalmente inmunoglobulinas anti A y anti B, a los que se les ha denominado hemolisinas, aglutininas, anticuerpos fríos, anticuerpos completos, anticuerpos salinos o anticuerpos regulares; generalmente de naturaleza IgM.

También es posible detectar anticuerpos de otros sistemas diferentes al ABO y a éstos se les denomina anticuerpos calientes, anticuerpos albumina o anticuerpos irregulares, de naturaleza IgG.

La reacción antígeno-anticuerpo es específica; tenemos que poner en contacto el anticuerpo con el antígeno específico, para lo cual necesitamos como reactivo a eritrocitos con sus antígenos identificados plenamente. Estos eritrocitos pueden conseguirse comercialmente, pero también son preparados por el Banco Central de Sangre del IMSS. Se les conoce Panel de células de fenotipo conocido.

FUNDAMENTO

El rastreo de anticuerpos irregulares antieritrocitos, está indicado en pacientes politransfundidos, mujeres multíparas con antecedentes de productos con enfermedad hemolítica del recién nacido, las mujeres embarazadas con Rh negativo y en la selección de donadores de sangre.

Su determinación será útil tanto en diagnóstico como en la eliminación de donadores peligrosos.

2.- OBJETIVO

Determinar la presencia de anticuerpos irregulares y si éstos están presentes identificar su especificidad.

3- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL

Tubos de ensaye de 13 X 100 mmTubos de hemólisis 10 X 75 mmPipetas Pasteur con bulboGradillaPiseta

104

Papel sanitarioPapel parafilm


Suero problemaEritrocitos problema al 2-3% en solución salinaPanel de células de fenotipo conocido, lavadas y suspendidas al 2-3% en solución salina.

3.3 EQUIPO

CentrífugaReloj de intervalosBaño de incubación a 37 C

3.4 REACTIVOS

Solución salina al 0.9%Albumina bovina al 22% o 30%Suero antiglobulina humana (suero de Coombs)

3.5 TECNICA

a. Rotular 10 tubos de 10 X 75 mm del a al 10 y otro más como autotestigo.

b. Poner en cada tubo 2 gotas del suero del paciente.

c. Poner una gota de los eritrocitos del panel en su tubo correspondiente.

d. Colocar una gota de los eritrocitos del paciente (2%) al tubo marcado como autotestigo.

e. Mezclar y centrifugar a 3400 rpm por 30 segundos.

f. Leer aglutinación tubo por tubo. Reportar el resultado.

Aglutación = anticuerpos irregulares de naturaleza IgM. No aglutinación = continuar la técnica

g. Adicionar a todos los tubos tres gotas de albumina bovina al 30%.

h. Agitador y centrifugar a 3400 rpm 45 segundos.

i. Resuspender con suavidad el botón de eritrocitos y anotar resultados.

Aglutinación = anticuerpos irregulares de naturaleza IgG (alb-salina). No aglutinación = continuar la técnica.

105

j. Incubar los tubos a 37 oC durante 1 hora, después de lo cual centrifugar a 3400 rpm durante 45 segundos.

k. Suspender con suavidad el botón de eritrocitos y anotar resultados.

Aglutinación =anticuerpos irregulares de naturaleza IgG (alb.-salina 37 oC.No aglutinación =continuar la técnica.

l. Lavar el botón de glóbulos rojos 3 veces con solución salina después del último lavado eliminar el sobrenadante y resuspender el botón.

m. Adicionar una gota de suero de Coombs, agitar con suavidad, centrifugar a 3400 rpm durante 15 segundos.

n. Resuspender y anotar los resultados.

Aglutinación = anticuerpos irregulares de naturaleza IgG (alb-Coombs). No aglutinación = Ausencia de anticuerpos irregulares.

Nota: Cuando se observa hemólisis y aglutinación o únicamente aglutinación el resultado es positivo.

La aglutinación se califica desde poca aglutinación = graniento hasta aglutinación total = 4.

4.- RESULTADOS

Si no hubo hemólisis ni aglutinación en ninguno de los tubos el resultado es negativo, es decir no hay anticuerpos irregulares fuera del sistema ABO.

Si hubo resultados positivos, éstos se comparan con la carta que acompaña a las células del panel que se llama carta del panel para identificar la especificidad y se reporta así:

Anticuerpos irregulares antieritrocito fuera del sistema ABO positivos de probable especificidad ___________________ (la encontrada por ejemplo Anti S, anti P).

106

Hay que recordar que las 10 células del panel es un muestreo de los fenotipos de la población. Están seleccionados los antígenos contra los cuales se producen anticuerpos más frecuentemente. La importancia de elegir el panel elaborado por el Banco Central de Sangre, es que está elaborado, tomando en cuenta la estructura antígenica de nuestra población mexicana.

Una vez establecida la especificidad, efectuar titulación de anticuerpos irregulares mediante la prueba de alb-Coombs para ellos se efectúan diluciones al doble del suero en solución salina y se adicionan los eritrocitos correspondientes, se procesa igual que en la técnica anterior, el último tubo donde se observa aglutinación es el título de anticuerpos irregulares.


Negativo

6.- BIBLIOGRAFIA

Quintanar, E. Manual de técnicas y procedimientos del Banco Central de Sangre. Instituto Mexicano del Seguro Social.

107

REACTIVOS

1. SOLUCION DE EDTA AL 10%

EDTA sal disódicaAgua destilada c.b.p.

10.0 g100.0 ml

2. SOLUCION DE DRABKIN

Bicarbonato de sodioFerricianuro de potasioCianuro de potasioSaponinaAgua destilada c.b.p.

1.0 g0.20 g0.05 g0.10 g

1000.00 ml

Solución diáfana de color amarillo pálido, estable en frasco ámbar a temperatura ambiente durante 6 meses

3. SOLUCION DE HAYEM

Cloruro de mercurioCloruro de sodioSulfato de sodio anhidroAgua destilada c.b.p.

0.50 g1.00 g5.00 g

200.00 g

Disolver en el orden indicado. Estable por 2-3 semanas.

4. SOLUCION DE NUEVO AZUL DE METILENO

Nuevo azul de metilenoOxalato de potasioCloruro de sodioSaponinaAgua destilada c.b.p.

0.50 g1.40 g0.80 g

100.00 ml

Filtrar antes de usar.

5. SOLUCION DE AZUL DE CRISAL BRILLANTE AL 1%

Azul de cresil brillanteSolución salina al 0.85% c.b.p.

1.00 g100.00 ml

6. SOLUCION DE TURK

Acido acético glacialVioleta de gensiana al 1%Agua destilada c.b.p.

3.00 ml1.00 ml

100.00 ml

108

Filtrar la solución antes de usarla.

7. SOLUCION DE ALCOHOL ETILICO AL 70%

Alcohol etílico absolutoAgua destilada c.b.p.

70.00 ml100.00 mL

8. SOLUCION DILUYENTE DE PLAQUETAS

Citrato de sodioFormaldehído al 40%Azul de cresil brillanteAgua destilada c.b.p.

3.80 g0.20 ml0.10 g

100.00 ml

Guardar la solución en refrigeración. Filtrar antes de usarla.

9. SOLUCION DE OXALATO DE AMONIO AL 1%

Oxalato de amonioAgua destilada c.b.p.

1.00 g100.00 ml

Guardar la solución en refrigeración. Filtrar antes de usarla.

10.METABISULFITO DE SODIO AL 2%

Metabisulfito de sodioAgua destilada c.b.p.

2.00 g100.00 ml

Debe prepararse diariamente.

11.CLORURO DE SODIO AL 0.85%

Cloruro de sodioAgua destilada c.b.p.

0.85 g100.00 ml

12.SOLUCION DE CLORURO DE SODIO AL 1% AMORTIGUADA CON FOSFATOS A pH 7.4

Cloruro de sodioFosfato disódicoFosfato monosódicoAgua destilada c.b.p.

180.00 g27.31 g

4.86 g2000.00 ml

Solución de trabajo al 1%: diluir la solución 1:10 con solución salina isotónica.

109

13.SOLUCION DE CITRATO DE SODIO AL 3.8%

Citrato de sodioAgua destilada c.b.p.

3.80 g100.00 ml

14.SOLUCION DE CLORURO DE SODIO AL 0.9%

Cloruro de sodioAgua destilada c.b.p.

0.90 g100.00 ml

15.SOLUCION DE HIDROXIDO DE SODIO 0.083 N

Hidróxido de sodioAgua destilada c.b.p.

3.32 g1000.00 ml

16.SOLUCION DE SULFATO DE AMONIO SATURADA. REACTIVO PRECIPITANTE

Sulfato de amonioAgua destilada

350.00 g500.00 ml

Filtrar y diluir 400 ml del filtrado con 400 ml de agua destilada.Adicionar:

Acido clorhídrico 10 N (ajustar el pH a 7.0)Este reactivo es estable indefinidamente en frasco de polietileno a temperatura ambiente.

17.SOLUCION DE EDTA AL 0.3%

EDTA sal disódicaAgua destilada c.b.p.

0.30 g100.00 ml

18.REACTIVO DE BENDICINA

BendicinaAcido acético glacialAgua destilada c.b.p.

1.00 g90.00 ml

100.00 ml

19.SOLUCION DE PEROXIDO DE HIDROGENO AL 1%

Peróxido de hidrógeno al 30%Agua destilada c.b.p.

3.30 g100.00 ml

20.SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10%

Acido acético glacialAgua destilada c.b.p.

10.00 g100.00 ml

110

21.SOLUCION DE BATOFENENTROLINA SULFONATADA AL 0.64%

Batofenantrolina sulfonatadaAgua destilada c.b.p.

0.64 g100.00 ml

22.SOLUCION DE ACIDO ASCORBICO AL 0.5%

Acido ascórbicoAgua destilada (libre de Fe)

50.00 g10.00 ml

23.SOLUCION AMORTIGUADORA DE GLICINA-HCl pH 1.9

GlicinaAgua destilada c.b.p. (libre de Fe)Ajustar el pH a 1.9 0.02 con HC1 1N Agua destilada c.b.p.

0.75 g30.00 ml

50.00 ml

24.SOLUCION DE TRABAJO: ACIDO ASCORBICO AL 0.5%-AMORTIGUADOR DE GLICINA-HC1

1 volumen de amortiguador de glicina – HC12 volúmenes de solución de ácido ascórbico al 0.5%

25.SOLUCION DE HIERRO 150 g/dl

Hierro G.R.Disolver en H2S04 INAgua destilada c.b.p.

150.00 mg

100.00 ml

26.SOLUCION DE HIERRO DE 300 g/dl

Igual que la anterior, pero usando 300 mg de hierro.

27.SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO 0.0125 M

Cloruro de calcioAgua destilada c.b.p.

1.38 g1000.00 ml

28.SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO 0.02 M

Cloruro de calcioAgua destilada c.b.p.

2.22 g1000.00 ml

111

29.SOLUCION AMORTIGUADORA DE VERONAL DE OWREN pH 7.35

Dietil barbiturato de sodioCloruro de sodioAgua destiladaAcido Clorhídrico 0.1 NAjustar el pH a 7.35Agua destilada c.b.p.

11.75 g14.67 g

500.00 mlml

2000.00 ml

30.SOLUCION AMORTIGUADORA DE VERONAL (OWREN-KOLLER) pH 7.4

Igual que la solución anterior, pero ajustar el pH a 7.4

31.SOLUCION DE ALCOHOL ETILICO AL 50%

Etanol absolutoAgua destilada c.b.p.

50.00 ml100.00 ml

32.AMORTIGUADOR DE FOSFATOS pH 7.2

Fosfato dibásico de sodioFosfato monobásico de potasioAgua destiladaAjustar el pH a 7.2Agua destilada c.b.p.

1.14 g0.49 g

900.00 ml

1000.00 ml

112

TABLA DE % DE TRANSMITANCIA – ABSORBANCIA

%T A %T A %T A %T A

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5

10.010.511.011.512.012.513.013.514.014.515.015.516.016.517.017.518.018.519.019.520.020.521.021.522.022.523.023.524.024.525.025.5

2.0001.8241.6991.6021.5231.4561.3981.3471.3011.2601.2221.1871.1551.1261.0971.0711.0461.0221.000.979.959.939.921.903.886.870.854.838.824.810.796.782.770.757.745.733.721.710.699.688.678.668.658.648.638.629.620.611.602.594

26.026.527.027.528.028.529.029.530.030.531.031.532.032.533.033.534.034.535.035.536.036.537.037.538.038.539.039.540.040.541.041.542.042.543.043.544.044.545.045.546.046.547.047.548.048.549.049.550.050.5

.585

.577

.569

.561

.553

.545

.538

.530

.523

.516

.509

.502

.495

.488

.482

.475

.469

.462

.456

.450

.444

.438

.432

.426

.420

.414

.409

.403

.398

.392

.387

.382

.377

.372

.367

.362

.357

.352

.347

.342

.337

.332

.328

.323

.319

.314

.310

.305

.301

.297

51.051.552.052.553.053.554.054.555.055.556.056.557.057.558.058.559.059.560.060.561.061.562.062.563.063.564.064.565.065.566.066.567.067.568.068.569.069.570.070.571.071.572.072.573.073.574.074.575.075.5

.292

.288

.284

.280

.276

.272

.268

.264

.260

.256

.252

.248

.244

.240

.237

.233

.229

.226

.222

.218

.215

.211

.208

.204

.201

.197

.194

.191

.187

.184

.181

.177

.174

.171

.168

.164

.161

.158

.155

.152

.149

.146

.143

.140

.139

.134

.131

.128

.125

.122

76.076.577.077.578.078.579.079.580.080.581.081.582.082.583.083.584.084.585.085.586.086.587.087.588.088.589.089.590.090.591.091.592.092.593.093.594.094.595.095.596.096.597.097.598.098.599.099.5

100.0

.119

.116

.114

.111

.108

.105

.102

.100

.097

.094

.092

.089

.086

.084

.081

.078

.076

.073

.071

.068

.066

.063

.061

.058

.056

.053

.051

.048

.046

.043

.041

.039

.036

.034

.032

.029

.027

.025

.022

.020

.018

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Documents

Manual Hemato UNAM