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MANUAL DE MARCADORES MOLECULARES (RAPD, ISOENZIMAS Y PROTEÍNAS)

PARA EL ESTUDIO DE PROSOPIS Y ESPECIES FORESTALES AFINES

JUANA JUÁREZ MUÑOZ

CENTRO DE INVESTIGACIONES FORESTALES-ICAP

GUILLERMO CARRILLO CASTAÑEDA

COLEGIO DE POSTGRADUADOS

Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo

Pachuca, Hidalgo, 2005

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© 2005, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Abasolo 600, Centro, Pachuca, Hidalgo, México, CP 42000 Correo electrónico: editorial@uaeh.reduaeh.mx Prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el consentimiento escrito de la UAEH ISBN : 970-769-032-1

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE HIDALGO

Juan Manuel Camacho Bertrán Rector

Enrique Gerardo Macedo Ortiz

Secretario General

Carlos César Maycotte Morales

Director del Instituto de Ciencias Agropecuarias

Consejo Editorial

Evaristo Luvián Torres Víctor Manuel Ballesteros García

Rafael Cravioto Muñoz Guadalupe Durán Osorio

Consejeros

Enrique Rivas Paniagua

Producción Editorial

iv

AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Programa de Mejoramiento al Profesorado (Proyecto 103.5/03/1130) por el apoyo económico brindado para esta publicació n.

v

PRESENTACIÓN

La biología molecular es una de las pocas ciencias que, en los últimos años, se ha distinguido por

su acelerado desenvolvimiento y ha sido la base para el desarrollo de una importante serie de

métodos experimentales, con los cuales se facilitan las tareas para entender fenómenos

importantes en niveles moleculares hasta poblacionales. Desde el punto de vista aplicado, estos

estudios facilitan la tarea del análisis de plantas y animales útiles al hombre, de las que, mediante

su manipulación, se obtienen las razas de animales y los cultivos que son fuente de alimentos y

muchos productos requeridos para el bienestar de la humanidad.

Las técnicas que en su conjunto tratan acerca del cultivo de tejidos animale s y vegetales,

del ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante, así como de la formación de hibridomas,

todas en su sentido amplio, son conocidas en forma colectiva como biotecnología.

Los marcadores moleculares son características distintivas que manifiestan los

organismos, los cuales pueden ser utilizados para la discriminación de fenotipos y son de peculiar

importancia en el campo de la taxonomía. Ha sido desarrollada una diversidad de técnicas

basadas en el análisis de los polimorfismos de las proteínas, isoenzimas y el ADN, y en ello se

apoyan estas identificaciones.

Si bien hemos tomado como material de estudio al mezquite (Prosopis sp) por ser una

especie potencialmente importante en las regiones semiáridas de México, las técnicas descritas en

el presente manual tienen uso muy amplio en el reino vegetal.

Esta obra ha sido diseñada para apoyar la materia de Genética Forestal de la licenciatura

de Ingeniería Forestal de la UAEH, y para las personas interesadas en el conocimiento de estas

técnicas. Por tal razón, se presentan de la forma más clara posible con la intención de que puedan

llevarlas a cabo en el laboratorio y a su vez para que puedan hacer el análisis de los resultados.

En resumen, el lector podrá aplicarlas de manera práctica, y se recomienda que como parte

complementaria se consulte la información teórica de los respectivos temas de biología

molecular.

Juana Juárez Muñoz Guillermo Carrillo Castañeda

vi

CONTENIDO

Pag. 1. INTRODUCCIÓN 1 2 . GENERALIDADES 2 2.1. Determinación de la variabilidad genética 2 2.2. Metodologías basadas en el polimorfismo del ADN 3 2.3. Técnicas basadas en hibridación 3 2.4. Técnicas basadas en la reacción de polimerización en cadena 5 2.5. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPDs) 7 2.6. Microsatélites 8 2.7. Amplificación de longitudes de fragmentos de restricción polimórficos (AFLPs) 9 2.8. Construcción de dendrogramas a partir de datos moleculares aplicando la taxonomía numérica 9 3. METODOLOGÍAS DE AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN 15 3.1. Introducción 15 3.2. Objetivos 15 3.3. Material biológico 15 3.4. Aislamiento de ADN 15 3.5. Determinación de la pureza y concentración del ADN 16 3.6. Evaluación del grado de integridad del ADN 18 4. AMPLIFICACIÓN DEL DNA 19 5. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS 19 6. ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO Y GENÉTICO 21 6.1. Procesamiento de los datos y uso del programa NTSYS 21 7. METODOLOGÍAS BASADAS EN EL POLIMORFISMO DE PROTEÍNAS E ISOENZÍMAS 28 7.1. Introducción 28 7.2. Separación de proteínas e isoenzimas en geles de poliagrilamida 30 7.2.1. Objetivos 30 7.2.2. Material biológico 30 7.2.3. Preparación de extractos 30 7.2.4. Determinación de proteínas 32 7.2.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS 32 7.2.6. Identificación de peroxidasas por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS. 35 7.2.7. Identificación de la fosfatasa ácida por electroforesis en geles de poliacrilamida –SDS 35 7.2.8. Determinación de la actividad de fosfatasa ácida pH 5.8 35 8. LITERATURA CITADA 37 Apéndice 41

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LISTA DE FIGURAS

Pag. Figura 1. Secuencia del proceso de detección de los RFLPs. PstI = endonucleasa de restricción derivada de Pseudomonas 4 Figura 2. Secuencia de pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa 6 Figura 3. Estrategia general de la técnica de AFLP. Secuencias adaptadoras 10 Figura 4. Esquema que muestra los pasos para el aislamiento de ADN 17 Figura 5. Preparación de la mezcla de reacción para PCR, separación electroforética de los fragmentos amplificados y visualización de éstos en el gel

20

Figura 6. Carátula de presentación del programa NTSYS-pc 21 Figura 7. Menú principal del paquete NTSYS-pc en donde se muestran los programas que pueden ser utilizado en un análisis numérico 22 Figura 8. Pantalla en la que se introduce la información del archivo de la matriz básica de datos 22 Figura 9. Ejemplo integrado de la introducción de los datos para crear el archivo de la matriz básica de datos 23 Figura 10. Menú para ejecutar el programa Output 24 Figura 11. Matriz básica de datos verificada 24 Figura 12. Menú para ejecutar el programa “Qualitative” 25 Figura 13. Menú para ejecutar el programa SAHN Clustering 26 Figura 14. Menú para ejecutar el programa Tree 27 Figura 15. Procedimiento para la obtención de un sobrenadante para la separación electroforética de proteínas 31 Figura 16. Procedimiento sugerido para la separación electroforética de proteínas y visualización de estas en el gel 34

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LISTA DE ABREVIATURAS

AFLP Polimerización en longitud de los fragmentos amplificados AP-PCR Iniciador arbitrario de la reacción en cadena de la polimerasa DAF Amplificación de huellas genómicas del ADN RAPD Amplificación aleatoria del ADN polimórfico PCR Reacción en cadena de la polimerasa SSR Simples secuencias repetidas OTU Unidades taxonómicas operativas mg Miligramo µg Microgramo M Concentración molar mM Milimolar µM Micromolar pmol Picomol µL Microlitro % Porcentaje ng Nanogramo g Gramo L Litro mL Mililitro h Hora min Minuto s Segundo pb Pares de bases nm Nanómetro rpm Revoluciones por minuto °C Grados centígrados cm Centímetro mm Milímetro DO Densidad óptica UV Radiación ultravioleta pH Concentración – log H+ dNTP Desoxirribonucleótido trifosfato ADN Ácido desoxirribonucleico TAE Tris, ácido acético, EDTA UPCMA Método de ligamiento promedio (Unweighted pair-group method

with arithmetic averages)

1

1. INTRODUCCIÓN

El género Prosopis de la subfamilia Mimosoidae es uno de los más primitivos de la familia

Leguminosoidae; se piensa que se originó en África a finales del Mesozoico e inicios del periodo

Terciario. Actualmente se encuentra distribuido con amplitud en las zonas áridas y semiáridas de

América, norte de África y suroeste de Asia. El género incluye 44 especies, divididas en cinco

secciones y diez series. En América se ubican 40 de las especies conocidas, 31 se localizan en

Sudamérica, de las cuales 29 son nativas de Argentina, principal centro de diversificación del

Prosopis y nueve en Norteamérica (Burkart, 1976 a,b; Rzedowski, 1988). Las especies de este

género son capaces de desarrollarse en suelos pobres y degradados y, como todas las

leguminosas, contribuyen a mejorar la calidad de los suelos mediante la aportación de materia

orgánica y la incorporación de nitrógeno atmosférico al suelo.

Algunas especies de la sección Algarobia son simpátricas en diversas regiones del mundo,

lo cual da lugar a que se creen fenotipos nuevos por hibridación, que dificultan la clasificación

taxonómica. Por tal razón, en el caso de las especies argentinas se ha recurrido al uso de

marcadores moleculares (isoenzimas, RFLP, RAPD), para la identificación de ciertas especies y

para el establecimiento de sus relaciones filogenéticas (Saidman, 1986; Saidman y Vilardi, 1987;

Solbring y Bawa, 1975; Whitmore y Braag, 1979; Saidman et al., 1998b; Ramírez et al., 1999).

En el caso de las especies mexicanas es necesario caracterizarlas con estos criterios, ya que

nuestro país es considerado el segundo centro de diversificación del género y en algunas especies

existen problemas en su clasificación a nivel de serie.

En los últimos años se ha incrementado el interés por estudiar este género debido al

potencial multipropósito de algunas especies para la reforestación de regiones áridas y

semiáridas, así como para la producción de madera, carbón, forraje y alimentación para el

hombre. Sin embargo, para poner en práctica programas de reforestación, de mejoramiento o bien

para la explotación racional del género, se requiere conocer la constitución y variación genética

de las poblaciones naturales. Para conservar la variación genética en las áreas reforestadas,

también es necesario identificar las características morfológicas, fisiológicas y reproductivas que

favorecen la variación genética en las poblaciones naturales.

2

2. GENERALIDADES

2.1. Determinación de la variabilidad genética

La variabilidad genética y la caracterización de las especies se han estimado generalmente con

base en las características morfológicas. Durante los años recientes se ha incrementado el uso de

marcadores moleculares como una herramienta más en la caracterización de los individuos, ya

que en casos como el de la evolución convergente, donde la morfología coincide aun cuando las

diferencias genéticas sean muy grandes, es difícil definir a las especies únicamente en función de

los caracteres morfológicos. Los marcadores moleculares, considerados como un carácter

adicional en los estudios taxonómicos a diferencia de los caracteres morfológicos, no están

influidos por el ambiente y proporcionan un número ilimitado de caracteres moleculares que

pueden ser de gran valor en la diferenciación de especies y establecimiento de relaciones

filogenéticas. Un marcador molecular se define como la secuencia de ADN o de proteína que

puede ser fácilmente detectado y cuya herencia puede ser monitoreada. Este término hace

referencia al polimorfismo de bandas obtenido a través de las técnicas moleculares

isoenzimáticas o las basadas en el análisis del ADN.

La variación genética a nivel molecular puede ser detectada mediante el análisis directo del

ADN o mediante el de sus productos genéticos; es decir, analizando cambios en sus proteínas o

enzimas. La variabilidad genética con base en los productos del ADN se ha determinado

mediante análisis isoenzimáticos. Esta técnica involucra la separación electroforética de

isoenzimas en geles de almidón o poliacrilamida, seguida de la tinción del gel con un sustrato

específico para la detección de la enzima. Esta metodología es relativamente económica, permite

detectar varios loci en poco tiempo y detectar la herencia codominante. En organismos diploides,

ambos alelos son claramente identificados y los heterocigotos pueden ser claramente distinguidos

de los homocigotos, lo cual es un prerrequisito para la estimación de frecuencia de alelos en

estudios de genética de poblaciones (Weising et al., 1995). El análisis isoenzimático se ha

utilizado para estimar la variabilidad genética interespecífica e intraespecífica en estudios de

estructura de poblaciones, delimitación de especies y caracterización de modelos de introgresión

(Harrison, 1991). No obstante sus aplicaciones biológicas, el análisis isoenzimático se ve

limitado debido a que la expresión de las isoenzimas es influida por el medio ambiente, así

también porque su expresión puede ser temporal u órgano específica, ya que los genes que las

3

codifican sólo se expresan en estadios específicos del desarrollo y bajo determinadas condiciones

medioambientales, además de que el análisis isoenzimático sólo permite analizar una porción del

genoma. A diferencia de las isoenzimas, los marcadores moleculares basados en el ADN tienen la

ventaja de que sus polimorfismos son mucho más abundantes, ya que se encuentran distribuidos

por todo el genoma, tienen un mayor grado de reproducibilidad, no son afectados por condiciones

ambientales y su expresión no está limitada a ciertos tejidos.

2.2. Metodologías basadas en el polimorfismo del ADN

En los últimos años se ha desarrollado una gran variedad de técnicas para la detección de

polimorfismos del ADN, las cuales difieren en su principio y su potencialidad para detectar

niveles de variabilidad genética, así como en otros factores tales como reproducibilidad y costo.

Todo ello debe ser considerado para seleccionar la metodología que nos permita resolver de

manera satisfactoria el problema que se esté planteando.

Las técnicas utilizadas para la detección de polimorfismos se han dividido en los siguientes

dos grupos: 1. Técnicas basadas en hibridación; y 2. Las basadas en reacción de polimerización

en cadena (PCR).

2.3. Técnicas basadas en hibridación

Estas técnicas involucran el corte del ADN con enzimas de restricción, separación electroforética

de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño y la detección de patrones polimórficos por

hibridación, con una secuencia específica de ADN marcada con algún elemento radiactivo. En

este grupo se incluyen los RFLPs ( polimorfismo en longitud de fragmentos de restricción), los

cuales se generan por rearreglos en el genoma que originan alteraciones en los sitios de

reconocimiento para la endonucleasa que se utiliza en la digestión (Figura 1). Los RFLPs

expresan herencia codominante, permiten detectar alelos, son altamente reproducibles y detectan

polimorfismo intermedio. Este tipo de marcadores han sido utilizados para localizar genes

específicos, para discriminar individuos muy relacionados y para establecer mapas genómicos

(Demeke et al., 1997).

4

2.4. Técnicas basadas en la reacción de polimerización en cadena Figura 1. Secuencia del proceso de detección de los RFLPs. PstI = endonucleasa de restricción derivada de Pseudomonas. Tomado de Ramírez et al., 1991.

5

La técnica de reacción de polimerización en cadena (PCR) fue desarrollada por Mullis en 1985.

Esta técnica se aplicó exitosamente en el diagnóstico clínico de pacientes con anemia falciforme

y desde entonces se ha utilizado en diferentes áreas de la ciencia. La metodología de PCR es el

proceso bioquímico in vitro, mediante el cual las cadenas complementarias individuales del ADN

blanco son duplicadas por la enzima ADN polimerasa en cada uno de los ciclos (20 a 35) que

integran la reacción, y al final de cada uno las nuevas cadenas vuelven a ser duplicadas por la

misma enzima obteniéndose así la producción exponencial de millones de copias de los

segmentos de ADN específico sometidos al proceso (Figura 2). Para la reacción se requiere de

ADN blanco, iniciadores (oligonucleótidos) específicos, los cuatro desoxirribonucléotidos, la

enzima ADN polimerasa y el cloruro de magnesio. Cada uno de los ciclos de la reacción consta

de tres pasos (desnaturalización, alineamiento y extensión), determinados por temperaturas y

tiempos específicos. En el paso de desnaturalización, las cadenas complementarias del ADN

blanco se separan o se desnaturalizan, empleando rangos de temperaturas de 92 a 98° C y

tiempos de 30 a 90 seg. Sin embargo, generalmente se utiliza la temperatura de 94° C y tiempo de

30 seg., condiciones en que se ha demostrado se logra un balance adecuado que permite la

completa disociación del ADN genómico sin afectar la actividad de la ADN polimerasa, ya que a

temperaturas y tiempos mayores puede reducirse su actividad. En el paso de alineamiento se

realiza el apareamiento específico entre los iniciadores y las cadenas del ADN blanco

desnaturalizado. En este paso se pueden utilizar rangos de temperatura de 35 a 60° C y tiempos

de 30 a 60 seg. Esta fase es considerada la más crítica, ya que a temperaturas muy bajas de

alineamiento existe mayor probabilidad de que los iniciadores se apareen a regiones

noespecificas del ADN y puede originar inespecificidad en la amplificación. La temperatura de

alineamiento se determina con base en la longitud del iniciador, contenido relativo de G-C,

secuencia de los nucleótidos y estructura secundaria de los iniciadores. La temperatura óptima de

alineamiento es la temperatura media de fusión (Tm) de los oligonucleótidos o iniciadores, la

cual se calcula con la siguiente fórmula: Tm = [2(A + T) + (G + C)]. La duración de este paso

está en función de factores como la estructura secundaria y la concentración del iniciador. En el

paso de extensión, la ADN polimerasa extiende la longitud de los iniciadores apareados al ADN

blanco, al ir polimerizando los desoxinucleótidos libres, lo cual dará origen a la formación de las

nuevas cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas presentes al inicio de la reacción. En

6

+

5´

3´

3´ 5´

3 ́

3´

5´ 5´

5´

3´

3´ 5´

3 ́3´ 5´ 5´

5´

3´ 5´

3´ 5´ 5´

5´

3´ 5´

3´

5´ 5´

5´ 3´ 5´ 3´

5´ 3´ 5´ 3´

5´ 3´ 5´ 3´

5´ 3´ 5´ 3´

2° Ciclo

41 Copia

Polimerasa

Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

Iniciador

(92 – 98°C)

(35 – 60°C)

(70 – 74°C)

Iniciador

ADN de doble cadena

+

5´

3´

3´ 5´

3 ́3´ 5´ 5´

5´

3´ 5´

3´

5´ 5´

5´ 3´ 5´ 3´

5´ 3´ 5´ 3´

1er Ciclo

21 Copia

n Ciclos

n Copias

Desnaturalización

Alineamiento

Extensión

Figura 2. Secuencia de pasos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (modificado de Barnum, 1998).

7

este último paso se utilizan rangos de temperatura de 70 a 74° C y tiempos de 30 a 90 segundos

(Palumbi, 1996).

Con la sucesión de ciclos se logra una síntesis exponencial del segmento de ADN blanco,

cuyo tamaño se define desde los primeros ciclos de la reacción. La longitud del segmento

amplificado por la PCR es resultado de la suma de la longitud del iniciado más la longitud del

ADN blanco flanqueada por dos iniciadores.

Las metodologías basadas en PCR involucran la amplificación in vitro de una secuencia

particular de ADN con ayuda de un iniciador que puede ser aleatoria, semialeatoria o específica,

la separación de los fragmentos amplificados y la detección de patrones polimórficos por

métodos de tinción. En este grupo se incluyen las técnicas de RAPDs, AP-PCR, DAF,

microsatélites y AFLP, entre otras.

2.5. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPDs)

Esta metodología fue desarrollada simultáneamente por dos grupos de investigadores: 1.

Williams y colaboradores (1990), del grupo de DuPont Co. (Wilmington, USA), quienes la

denominaron random amplified polymorphic DNA (RAPDs, amplificación aleatoria del ADN

polimórfico); y 2. Welsh y McClelland (1990), del Instituto de Investigación de California, USA,

quienes la llamaron arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR, iniciador arbitrario

de la reacción de polimerización en cadena). Posteriormente Caetano-Anollés y colaboradores

(1991), al realizar estudios de las huellas genómicas de plantas, la nombraron DNA amplification

fingerprinting (DAF, amplificación de huellas genómicas del ADN).

En la metodología de RAPDs, a diferencia de la de PCR, no se requiere conocer la

secuencia del ADN blanco, y para la amplificación del ADN genómico sólo se utiliza un

iniciador con secuencia aleatorias de 10 nucleótidos. Los fragmentos se separan mediante

electroforesis en geles de agarosa y se tiñen con bromuro de etidio para evidenciarlos. El

polimorfismo obtenido de RAPDs resulta de cambios en las secuencias del sitio de unión del

ADN blanco con el iniciador originadas por mutaciones puntuales (inserciones y deleciones), las

cuales impiden o evitan la asociación estable con el iniciador, o producen cambios que alteran el

tamaño del fragmento amplificado, o pueden impedir la amplificación del ADN blanco. Con esta

metodología es posible detectar herencia dominante y un alto grado de polimorfismo. Sin

embargo, no es posible detectar alelos, y el grado de reproducibilidad entre laboratorios es

8

intermedio debido a que los patrones de RAPDs pueden cambiar al modificarse la concentración

de algunos componentes de la mezcla de reacción, tales como el ion Mg2+, ADN, iniciador y

ADN polimerasa, así como las condiciones de amplificación (desnaturalización, alineamiento y

extensión). Debido a este problema, al iniciar un estudio con una nueva especie o al cambiar de

laboratorio es necesario estandarizar las condiciones experimentales de la técnica.

Esta técnica se ha utilizado para estimar variabilidad genética interespecífica (Wilkie et al.,

1993; Nkongolo, 1999; Shen et al., 1998) o intraespecífica (Parant et al., 1998; Fuentes et al.,

1999), en estudios taxonómicos para delimitación de especies y para el establecimiento de las

relaciones filogenéticas (Demeke et al.,1997; Weising et al., 1995), estudios de hibridación e

introgrec ión (Crawford et al., 1993; Arnold et al., 1991), resistencia a enfermedades (Martin et

al., 1991).

AP-PCR (iniciador arbitrario de la reacción de polimerización en cadena). En esta

metodología se emplean iniciadores de 20 a 34 pb. Los fragmentos se separan en geles de

poliacrilamida y se visualizan por autoradiografía, y el grado de resolución es moderado.

DAF (amplificación de huellas genómicas del ADN). En esta metodología, a diferencia de

los RAPDs, se utilizan iniciadores aleatorios de 5 a 8 pb y se ap lica un ciclo corto de

alineamiento, dos temperaturas en el programa de amplificación en lugar de tres. Los fragmentos

son separados en geles de poliacrilamida y visualizados con una solución de plata. Esta técnica es

altamente reproducible y se ha utilizado para establecer mapas genéticos (Caetano-Anollés et al.,

1991).

2.6. Microsatélites

Microsatélites o SSR (simple sequence repeat) pueden constar de 2 a 6 nucleótidos, pero

generalmente tienen de 2 a 3 secuencias de nucleótidos (CAT) que se repiten muchas veces, las

cuales pueden variar en número y secuencia en los diferentes individuos. La principal ventaja que

los microsatélites ofrecen para el análisis del genoma es su abundancia y dispersión en el ADN.

Los microsatélites son marcas codominantes con un alto grado de polimorfismo y

reproducibilidad. Con esta técnica se ha logrado detectar la diversidad genética de líneas de trigo

muy relacionadas (Demeke et al., 1997).

9

2.7. Amplificación de longitudes de fragmentos de restricción polimórficos (AFLPs)

Los AFLPs (amplified fragment length polymorphisms) detectan polimorfismos del ADN, en los

cuales pequeños fragmentos de restricción son selectivamente amplificados. Esta metodología

involucra la digestión del ADN con dos endonucleasas (Eco R1 y Mse). Los fragmentos de

restricción son ligados en sus extremos por dos diferentes adaptadores de doble cadena de 25 a 30

pb. Posteriormente se lleva a cabo una amplificación pre-selectiva, utilizando para la reacción de

PCR iniciadores específicos con una base extra en el extremo 3′. Finalmente los fragmentos

amplificados son sujetos a una segunda selección más rigurosa, en donde se consideran

iniciadores con dos o tres bases extras (Figura 3). Los fragmentos amplificados son

complementarios al iniciador y a las extensiones consideradas, razón por la cual sólo una porción

del genoma fragmentado es amplificada en la reacción de AFLPs. En esta técnica, uno de los

iniciadores es marcado radioactivamente y los fragmentos pueden ser detectados después de su

separación en geles de poliacrilamida con autoradiografía. Esta técnica permite detectar herencia

dominante, un alto grado de polimorfismo y reproducibilidad. Los AFLPs se han utilizado en

estudios de diversidad genética, establecimiento de mapas genéticos e identificación de genes

específicos (Vos et al., 1995; Demeke et al., 1997), así como en estudios de variación genética y

estructura de poblaciones (Muller et al., 1999).

2.8. Construcción de dendrogramas a partir de datos moleculares, aplicando la taxonomía

numérica

Los datos moleculares generados de los patrones isoenzimaticos (RFLP, RAPD, AFLP, entre

otros) son utilizados para el análisis del genoma y para hacer inferencias taxonómicas y

filogenéticas. Los patrones de bandas observados después de la electroforesis son comparados

entre los diferentes taxa; en la mayoría de estos estudios la similitud en patrones de bandas

sugieren o indican un mismo genoma, mientras que patrones diferentes indican genomas

diferentes. Las bandas son tratadas como características individuales (variables) y se registran

como presentes (asignando valor de 1) o ausentes (asignando valor de 0) en los taxa analizados.

Los datos resultantes son analizados utilizando los métodos numéricos aplicados en la taxonomía

numérica.

La taxonomía numérica se define como el agrupamiento por métodos numéricos de

unidades taxonómicas con base en el conjunto de sus caracteres o como un sistema de

10

Iniciador + 1

Fragmento de restricción

Iniciador + 3

5’

Iniciador + 1

Amplificación preselectiva

Iniciador EcoRI + A y MseI + C

ADN Genómico

Restricción con MseI y EcoRI

Amplificación selectiva

Iniciador + 3

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Adaptador EcoRI Adaptador MseI

GAATTC CTTAAG

TTAA AATT

AATTC AATT T

G

5’- TA TTAA- 5’

AATTCN TTAAGN

5’

NTTA NAAT

5’

C 5’

GTTA

AAC

AAC

A

AATTCA TTAAGT

AATTCAAC TTAAGTTG

TTGTTA AACAAT

CAAT

Figura 3. Estrategia general de la técnica de AFLP (modificado Mueller y Wolfenbarger, 1999). Secuencias adaptadoras: Mse I EcoRI

11

clasificación basado en la similitud total de los organismos (Sneath y Sokal, 1973). La taxonomía

numérica tiene como objetivo colocar en grupos a los taxa (género, especie, etc.) o unidades

taxonómicas operativas (OTU, operation taxonomic unit ), con base en caracteres como tamaño,

color, forma, secuencia de nucleótidos y patrón de bandas generados por las diferentes técnicas

moleculares, usando métodos numéricos aplicados a los estados de los caracteres o matrices de

distancias entre ellos, para generar el árbol de relaciones de semejanzas o dendrograma.

La construcción de los dendrogramas puede realizarse a partir de caracteres cuantitativos

o cualitativos. Los patrones de bandas (tamaño de fragmento o posición en el gel) y los caracteres

morfológicos (como la forma de la hoja) son considerados caracteres cualitativos. Una vez

definidos los caracteres, se codifican en una matriz básica de datos (MBD) para estimar el grado

de similitud entre las OTU analizadas. Existen diferentes coeficientes para estimar el grado de

similitud; la selección de uno u otro tipo dependerá de los caracteres utilizados y de la manera en

que éstos se codifiquen. Entre los coeficientes más comúnmente utilizados se encuentran los siguientes:

1. Coeficientes de distancia. Miden la distancia entre las OTU en espacios definidos de

diferentes maneras. La medida más familiar de distancia es la euclidiana, la cual se basa en el

teorema de Pitágoras, por lo que la distancia entre las OTU i y la OTU j estará dada por la

siguiente ecuación:

donde dij representan la distancia entre las OTU’s i y j; xik, el estado del carácter k para el OTU i;

y xjk, el estado del carácter k para el OTUj. Este tipo de coeficiente se recomienda cuando los

caracteres son continuos o multiestado ordenados. Esta expresión considera que los caracteres no

se encuentran correlacionados, lo cual no ocurre en la práctica, por lo que el empleo de estas

distancias no se justifica ya que representaría una medida inadecuada de las OTUs. Este problema

puede resolverse realizando una trasformación a componentes principales.

2. Coeficientes de asociación. En general, estos coeficientes estiman coincidencia y

diferencias en los estados de caracteres entre dos OTUs. Requieren que los datos sean de tipo

binario, aunque algunos, como el SMC (simple matching coefficient), pueden utilizarse con datos

multiestado cualitativos. Existe un gran número de coeficientes de asociación; entre los más

utilizados está el mencionado anteriormente y el de Jaccard (Romesburg, 1984).

∑ ( xik- xjk )2 p

K=1

dij= 2

12

El SMC se calcula de la siguiente manera:

donde Cik indica el grado de similitud entre las OTU’s j y k; a es el número de caracteres en el

cual el mismo estado es compartido por ambas OTU (1, 1); b es el número de caracteres en los

cuales un estado es poseído por la primera OTU pero no por la segunda (1, 0); c es el número de

caracteres en los cuales un estado está ausente en la primera OTU pero no en la segunda (0, 1); y

d es el número de caracteres en los cuales el mismo estado está ausente en ambas OTU (0, 0).

Este coeficiente da el mismo peso al número de coincidencias a = (1, 1) y d = (0, 0). El máximo

valor de Cjk = 1.0 indica una similitud perfecta, la cual ocurre cuando b = c = 0.

El coeficiente de Jaccard excluye las coincidencias negativas y, al igual que el anterior,

varía en su magnitud de 0 a 1. Este coeficiente se define de la siguiente manera:

Representa la proporción del número de coincidencias negativas contra el total del número de

caracteres, menos el número de coincidencias negativas. En este coeficiente, d se omite del

cálculo por considerar ilógico que exista similitud entre las OTU por la ausencia de una

característica.

3. Coeficientes de correlación. Estos coeficientes cuantifican la similitud a partir de la

separación angular formada por dos líneas que parte del origen de las coordenadas y pasa por las

OTU i y j. El coeficiente de Pearson está en función de esos ángulos y representa la correlación

producto-momento. Está representado por la ecuación siguiente:

Cjk = a + d

a + b + c+ d

0.0 ≤ Cjk ≤ 1.0

0.0 ≤ Cjk ≤ 1.0 Cjk = a

a + b + c

n

i =1

r = 2

n =1 [ ∑ ( xij- xi)

2 ] - [ ∑ ( xik - xk)2 ] -

n

∑ ( xik - x) i =1

( xij - xk) n - -

13

donde xj es la media de todos los valores de los estados de las OTU j; y xk es la media de todos

los valores de lo s estados de la OTUk. Los valores de este coeficiente oscilan entre 1 y –1 para la

máxima y la mínima respectivamente (Kohlmann, 1994).

Una vez calculados los índices de similitud utilizando cualquiera de los coeficientes

expuestos anteriormente, se efectúan los análisis de agrupamiento, los cuales representan las

similitudes obtenidas de la matriz de unidades taxonómicas bajo un arreglo en forma de árbol

llamado dendrograma. Los métodos de agrupamiento sintetizan la información de la matriz de

similitud y arregla a las OTU de una manera jerárquica sin solapamientos por medio de

algoritmos SAHN (secuenciales, aglomerativos, jerárquicos, excluyentes). Existen varias técnicas

para formar los algoritmos; los métodos más comúnmente utilizados son las técnicas jerárquicas

aglomerativas. Estos métodos se basan en una serie de fusiones sucesivas en donde las OTU se

fusionan en grupos. Estas técnicas requieren para operar una matriz de proximidad inter-OTU, en

donde cada OTU se considera un agrupamiento de un único miembro. Se comienza por agrupar a

las dos OTU de máxima similitud (o distancia menor), posteriormente se calculan las

proximidades de cada OTU restante con este primer grupo de dos miembros de acuerdo con un

algoritmo específico. El proceso continúa hasta que todas las OTU llegan a formar un solo

agrupamiento. Entre los métodos más comúnmente utilizados se encuentran los siguientes:

1. Método de ligamiento promedio (UPGMA, unweighted pair-group method using

arithmetic averages). Define la proximidad entre dos agrupamientos como el promedio entre

todos los pares de las OTU que conforman uno de los agrupamientos (Kohlmann, 1994;

Romesburg, 1984).

2. Método de ligamiento de centroides (UPGMC, unweighted method using centoids).

Define la proximidad entre dos grupos como la distancia entre los centroides (medias aritméticas)

de los dos grupos; es decir, cada grupo es representado para efectos de agrupamiento por un

punto que es la media aritmética de los elementos de dicho grupo (Kohlmann, 1994; Romesburg,

1984).

3. Método de ligamiento simple o del vecino más cercano. En este caso, la distancia entre

dos grupos se calcula como el mínimo de las distancias entre todos los posibles pares de

elementos en ambos grupos ( Romesburg, 1984).

4. Método de ligamiento completo o del vecino más lejano. En este método, la distancia

entre dos grupos es definida como el máximo de las distancias entre todos los posibles pares de

14

entidades en los dos grupos ( Romesburg, 1984).

De estos métodos el más recomendado es el UPGMA, porque puede usarse con cualquier

coeficiente de similitud y juzga la similitud entre pares de grupos de manera menos extrema.

15

3. METODOLOGÍAS DE AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN

3.1. Introducción

El aislamiento de ácidos nucleicos de bacterias, plantas o animales es un requerimiento

fundamental en los procedimientos de caracterización del genoma y mapeo que involucran el uso

de marcadores genéticos, así como para la identificación y aislamiento de genes para ingeniería

genética. La factibilidad de estos estudios en algunos casos puede ser limitada por la calidad y

pureza de las muestras de ADN; por ejemplo: para análisis que involucran el uso de la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR), el ADN aislado no debe presentar degradación ni contener

contaminantes que interfieran con la reacción (Brown, 1992).

Entre las dificultades encontradas en el aislamiento de ADN se incluyen la degradación del

ADN por la presencia de ADNasas o metabolitos secundarios y el coaislamiento de polisacáridos

contaminantes que inhiben a las endonucleasas de restricción.

Se han desarrollado diferentes métodos para el aislamiento de ADN cromosómico y

plasmídico. En general, en cualquiera de los métodos, el primer paso para el aislamiento del

ADN involucra el rompimiento de las células (bacterias, vegetales o animales) mediante métodos

mecánicos o físicos, seguido de la solubilización de las membranas, para que el ADN sea

liberado en un amortiguador de extracción que incluye un detergente (SDS o CTAB) para este

fin, así como otros compuestos que lo protegen de la acción de endonucleasas. Algunos métodos

involucran un paso de desproteinización mediante fenol o una mezcla de fenol/cloroformo.

Finalmente, los ácidos nucleicos se precipitan con isopropanol o etanol (Towner, 1992; Wilkie,

1997).

3.2. Objetivos

Aislar el ADN de diferentes especies o individuos de una población de Prosopis.

3.3. Material biológico

Hojas de los diferentes individuos o especies son colectadas y conservadas en nitrógeno líquido

hasta el momento de procesarlas.

3.4. Aislamiento de ADN

El ADN genómico de las plantas es aislado a partir de 2g de tejido foliar, siguiendo el método de

16

Dellaporta (1983) modificado como se describe a continuación (Figura 4):

1. Adicionando nitrógeno liquido, 2g de tejido foliar fresco es macerado en un mortero

previamente congelado a -20º C.

2. La muestra pulverizada se trasfiere a un tubo Falcon de 50 mL de capacidad, se agregaron 20

mL de amortiguador de extracción (500 mM de NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA,

1.3 % de SDS, 0.2 % de β-Mercaptoetanol y 1% de polivinilpirolidona) y se incuba a 65º C

durante 15 min. Posteriormente se agregan 6.5 ml de la solución A (5 M de acetato de

potasio), mezclando suavemente y se incubó en hielo escarchado por 30 minutos.

3. Las muestras se centrifugarán a 10º C durante 30 min. a 4000 rpm.

4. El sobrenadante se trasfiere a otro tubo Falcon y se adicionaron 25 mL de isopropanol frío e

incuba a -20º C por 60 min.

5. Con un gancho de vidrio se trasfiere el ADN a un tubo eppendorf de 1.5 mL de capacidad.

Inmediatamente se agregarán 700 µL de solución B (50 mM de Tris-HCl pH8,10 mM de

EDTA) y 4 µL de una solución de RNasa (10 mg/mL), mezclando suavemente y se incuba a

37º C por 2 horas.

6. La reacción enzimática se detiene agregando 75 µL de acetato de sodio 3M y 500 µL de

isopropanol frío e incubando a -20º C durante 2 horas.

7. Con un gancho de vidrio, el ADN se colecta y trasfiere a otro tubo eppendorf de 1.5 mL de

capacidad, después se lava dos veces con etanol al 80%.

8. La muestra o muestras se mantienen durante 12 h en un desecador con vacío, posteriormente el

ADN se resuspende en 0. 5 mL de TE pH 8 (10 mM de Tris-HCl pH 8 y 1 mM de EDTA) y se

guarda a 4º C.

3.5. Determinación de la pureza y concentración del ADN

La pureza y concentración del ADN se determina por métodos espectrofotométricos. Para

determinar la pureza de las preparaciones se tomarán muestras alícuotas de 10 µL y se disolverán

en 1.5 mL de agua destilada estéril. Posteriormente se determinarán las lecturas a longitudes de

onda de 260 y 280 nm en un espectrofotómetro Spectronic 2000. Con el cociente obtenido entre

estas lecturas se estimará la pureza de los ácidos nucleicos en cada una de las muestras. Los

valores entre 1.8 y 2.0 de densidad óptica (DO) indican alto grado de pureza. Considerando que

la concentración de ADN de una solución puede ser determinada con los valores de absorbencia a

17

18

260 nm (A260) y que un valor de 1.0 A 260 = 50 µg/mL de ADN, la concentración de ADN en las

muestras se calculó utilizando la siguiente ecuación:

Concentración ADN (µg/mL) = 1500 µ

µL

x L

50µgmL

DO260

Donde:

x = volumen de ADN usado.

1500 µL = volumen de agua utilizado para disolver la muestra de ADN; el volumen puede variar

en función de la capacidad de las celdas utilizadas para medir la absorbencia.

50 µg/mL = concentración de ADN determinada para un valor de 1.0 A260.

DO260 = valor obtenido en las muestras a esta longitud de onda.

3.6. Evaluación del grado de integridad del ADN

El grado de degradación del ADN se estimará mediante la separación electroforética de las

muestras de ADN en geles de 0.8% de agarosa. La electroforesis se realizará a 40 voltios y 40

amperes, durante 4 h (tiempo en que el frente del gel recorrerá 6 cm), en amortiguador 1X TAE

(Apéndice ). Utilizando una fuente de poder y una cámara de electroforesis horizontal (Figura 5).

En los posos del gel se carga un volumen de 25 µL. Este volumen estará constituido por 5 µL de

la muestra de ADN, 5 µL de colorante de carga (50% de glicerol, 1% de azul de bromofenol y

1% de xilen cianol) (Apéndice ) y 15 µL de amortiguador TE, pH 8. Para evidenciar el ADN, se

coloca el gel en una charola de plástico (20 x 20 cm) y se sumerge en una solución de bromuro de

etidio (1µg/mL) durante 30 min., posteriormente se coloca sobre un transiluminador de luz

ultravioleta (UV). El ADN de alto peso molecular aparece como una banda compacta y el ADN

degradado presenta un barrido de bandas a lo largo del carril.

19

4. AMPLIFICACIÓN DEL ADN

Después de definir las concentraciones óptimas de la mezcla de reacción, se efectúa la

amplificación de las muestras que deseen analizarse. La mezcla de reacción por muestra

contendrá un volumen final de 25 µL: 10 mM de Tris HCl pH 8, 50 mM de KCl (amortiguador

10x de la taq polimerasa), 3mM de MgCl2 (Gibco), 200 µM de cada dNTP (Gibco), 20 pmol de

primer (Roth o Gibco), 1.5 unidades de Taq DNA polimerasa, 60 ng de ADN (para la preparación

de estas soluciones ver Apéndice ) y agua destilada estéril (Figura 5). La mezcla de reacción se

cubrirá con 20 µL de aceite mineral, para evitar la evaporación. La amplificación se efectuará en

un termociclador MJ Research modelo PTC 100, programado con un ciclo inicial de

desnaturalización de 1 min. a 94º C. Seguido de 38 ciclos cada uno con un paso de

desnaturalización a 94º C (por 30 seg. del ciclo 1 al 3, y de 15 seg. del ciclo 4 al 38),

alineamiento a 35º C por 30 seg. y extensión a 72º C por 1.30 minutos. (Figura 5).

5. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS

Los productos amplificados serán separados mediante electroforesis en geles de 1.5% de agarosa.

La electroforesis se realizará a 100 voltios durante 4 h (tiempo en que el frente del gel recorre 8

cm), utilizando una fuente de poder y una cámara de electroforesis horizontal (Figura 5). En los

posos del gel se depositarán las muestras que contendrán, en un volumen de 25 µL, 20 µL de la

muestra amplificada y 5 µL de colorante de carga. Para la electroforesis se utilizará el

amortiguador TAE 1X. Para evidenciar las bandas los geles se tiñen con una solución de bromuro

de etidio durante 30 min., posteriormente será fotografiado y capturado en computadora (Figura

5). Un marcador de 100 pb (Gibco) se utiliza como referencia de pesos moleculares.

20

21

6. ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO Y GENÉTICO

El tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos con los RAPDs se calcula a partir de una curva

estándar generada de los fragmentos de tamaño conocido del marcador de 100 pb (pares de

bases). Después de definir los pesos moleculares de los patrones de bandas generados con los

diferentes iniciadores, se construye una matriz en la que se codifica presencia (1) o ausencia (0)

de bandas de ADN. En esta matriz los fragmentos obtenidos con los diferentes iniciadores se

agruparán de mayor a menor número de pares de bases. Para el análisis de los fragmentos se

utilizarán los programas NTSYS-PC versión 1.8 (Rohlf, 1993), Biosys versión 1.7 (Swofford y

Selander, 1989) y RAPDFST (Black, 1995).

6.1 Procesamiento de los datos y uso del programa NTSYS

1. En la unidad donde este cargado el programa NTSYS, haga un doble clic en el icono de acceso

directo para abrir la carpeta del programa; a continuación, para abrir el programa haga un doble

clic en el archivo NTSYS.exe. En caso de no tener acceso directo haga clic en el botón inicio,

seleccione programas, luego seleccione explorador de Windows y abra la carpeta NTSYS; a

continuación, para abrir el programa seleccione con un doble clic el archivo NTSYS.exe. En

ambos casos se despliega la siguiente pantalla de presentación (Figura 6):

NTSYS-

Versión 1.8 S/N= 1630oo

Licensed to ISBN: 0-925031-22-4 Copyright (c) 1993 Applied bioestatics, Inc

Figura 6. Carátula de presentación del programa NTSYS-pc.

2. A continuacion, presione cualquir tecla. Inmediatamente después el programa abre la

siguiente patalla (Figura 7), en la cual aparesen los diferentes programas que constituyen el

paquete NTSYS-pc:

22

3. Del menú principal del paquete NTSYS-pc (Figura 7), seleccione el menú FILE. Al

entrar a éste se desplegará una pantalla de diálogo, de la cual deberá seleccionar la opción Edit.

Al entrar se desplegará un cuadro en el cual deberá dar nombre al archivo, el cual coresponderá al

de la matriz básica de datos. Por ejemplo a: proso.mbd.

Después de dar nombre al archivo, oprima la teclca F2. Inmediatamente después se

desplegará la siguiente pantalla (Figura 8):

NTEDITOR

F1= Help F2= New F4= Save F5= Zoo ESC=Quit

Figura 8. Pantalla en la que se introduce la información del archivo de la matriz básica de datos.

a) En esta pantalla deberá escribir, en la primera línea y entre comillas, un título de su archivo;

ejemplo: “Población 1 de Prosopis lavigata”.

General

Double center Fourier transformationes Outptu Standaritation Transformation Thin -plate spline. wts.

Cluster & graph methods

Consensus

Cophenetics values

Minimum Sparing Tree Neighbor-joining trees

SAHN clustering

(Dls) Similarity measures Genetics

Pool VCV matrices Interval Qualitative

Progra ms

FILES DOS EXEC HELP BATCH CONFIG

NTSYS-pc (c) 1993 Applied bioestatixties, Inc

Enter= select F1= help F3= Exit F10= menu More

Figura 7. Menú principal del paquete NTSYS -pc, donde se muestran los programas que pueden ser utilizados en un análisis numérico.

23

b) En el segundo renglón deberá escribir el número que identifica el tipo de matriz, el número de

líneas que constituyen la matriz seguido de la letra L, número de columnas que forman la

matriz seguido de la letra L y el número 0. Este último indica que no hay datos perdidos;

ejemplo: 1 12L 9L 0 (Figura 9 ).

c) En el tercer renglón se escriben suscesivamente los números de líneas que forman la matriz;

ejemplo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (Figura 9).

d) En el cuarto renglón se escriben suscesivamente los números de las columnas que forman la

matriz; ejemplo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (Figura 9).

e) En los siguientes renglones se introducen los datos de la matriz directamente, o se pegan si se

capturaron en un procesador de textos, el cual cuente con la opción de salvar en código

ASCII (Bloc de notas, Word Pard, Word).

Figura 9. Ejemplo integrado de la introducción de los datos para crear el archivo de la matriz básica de datos.

F1= Help F2= New F4= Save F5= Zoo ESC=Quit

NTEDITOR

101101001 010101101 101101100 111010101 101101001 010101101 101101100 111010101 101101001 010101101 101101100 111010101

“ Población 1 de Prosopis lavigata” 1 12L 9L 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9

f) Después de introducir todos los datos anteriores, oprima la tecla F4 para guardar el archivo,

poster iormente la tecla Enter, después cierre la ventana oprimiendo la tecla Esc.

4. Para continuar con el análisis es necesario verificar que esté bien la matriz básica de

datos, para lo cual, del programa general se selecciona el menú Output (Figura 7), el cual

despliega la siguiente pantalla (Figura 10):

24

En la opción “Name of matrix” se teclea la unidad en la cual se esté trabajando y el

nombre de archivo de la matriz básica de datos. Posteriormente se oprime la tecla F2 y se

despliega una ventana en la que aparece el nombre de la matriz, el tamaño (líneas x columnas),

las líneas y columnas numeradas (Figura 11). En caso de existir un error, al abrir la pantalla le

aparecerá un letrero que indica el tipo de error. En estos casos será necesario revisar el archivo

inicial de la matriz básica de datos. Para salir de esta ventana oprima la tecla Esc.

5. Después de verificar que esté bien la matriz básica de datos, se procede a obtener la

matriz de similitud. Del programa (Dis) Similarity measure se elige el menú Qualitative

(Figura 7), inmediatamente se desplegará la siguiente pantalla (Figura 12):

Input matrix: C:MBAC.MBD Comments: "Matriz Bacterias 9cepas" type=1, size=212 by 9, nc=none 1 2 3 4 5 6 ------------------------------------------------------- 1 | 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 2 | 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 3 | 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 4 | 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 5 | 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Figura 11. Matriz básica de datos verificada

Figura 10. Menú para ejecutar el programa Output.

OUTPUT

F1= Help F2= Run F4= Select F10= Exit ESC=Menu

Name of matrix

Field width

No. decimal places

Page width

:[9

:[ 3

:[80

:[

:[ Colum order matrix

Row order matrix

Listing file :[

]

]

]

]

]

]

]

:[

25

a) En la opción “input matrix” se escribe el nombre que se le asignó a la matriz básica de datos.

b) En la opción “Coefficient” se selecciona el coeficiente de similitud deseado [Jaccard (J),

Simple matching (SM) etc.]

c) En la opción “name for output matrix” se escribe el nombre que se le asignará a la matriz de

similitud; por lo general, al nombre de este archivo se le asigna como extensión la inicial

del coeficiente de similitud utilizado. Ejemplo: C:MBAC.J.

d) En la opción “By rows or cols” se selecciona con un clic Col.

e) En la opción “Show matrix” se selecciona con un clic Yes. Las otras opciones se mantienen

como aparecen en la pantalla.

f) Realizado todo lo anterior, se oprime la tecla F2; inmediatamente se desplegará una pantalla en

la que se muestra la matriz de similitud obtenida. Para cerrar esta pantalla se oprime la

tecla Esc. Al cerrarse ésta se despliega la pantalla del menú Qualitative (Figura 12), la

cual también debe cerrarse oprimiendo la tecla Esc.

6. Posteriormente se procede a obtener la matriz gráfica del fenograma o dendrograma.

Para esto, del programa “Cluster & graph methods” del menú principal (Figura 7) se selecciona

la opción SAHN Clustering ; inmediatamente se desplegará la siguiente pantalla (Figura 13):

Figura 12. Menú para ejecutar el programa “Qualitative”.

SIMQUAL

F1= Help F2= Run F4= Select F10= Exit ESC=Menu

Name of output matrix

Coefficient

Name for output matrix By rows o cols?

:[SM

:[ :[col

:[ 1

:[0 Negative code

Positive code

Sow matris? :[ yes

:[

Listing file

:[ CON

]

]

]

]

]

] ]

]

26

a) En la opción “input matrix” se escribe el nombre que se le asignó a la matriz de similitud.

b) En la opción “name for output matrix” se escribe el nombre que se le asignará a la matriz

gráfica; por lo general, al nombre de este archivo se le asigna como extensión la inicial

del método de agrupamiento utilizado. Ejemplo: C:MBAC.UPGMA.

c) En la opción “Method” se selecciona el método de agrupamiento deseado [UPG, UPGMA,

UPGMC, UPGMS, etc.] Las otras opciones se mantienen como aparecen en la pantalla

(Figura 13).

d) Realizado todo lo anterior, se oprime la tecla F2; inmediatamente se desplegará una pantalla en

la que se muestra la matriz gráfica. Para cerrar esta pantalla se oprime la tecla Esc. Al

cerrarse ésta se despliega la pantalla del menú SAHN clustering (Figura 8), la cual

también debe cerrarse oprimiendo la tecla Esc.

7. Obtención del fenograma o dendrogama. Para ver la forma final de éste se utiliza del

menú principal (Figura 7) el programa “Graphis” y se elige la opción “Tree Display”,

inmediatamente se desplegará la siguiente pantalla (Figura 14):

SAHN

F1= Help F2= Run F4= Select F10= menu ESC=Exit

Name of input matrix

Name for input matrix

Method

In case of ties

:[

:[

:[warn

:[ 25 :[ 0 Tie toleranse

Maximum n° tied trees

Show tree? :[ Yes

Listing file Beta :[ -0.25

:[ CON

Figura 13. Menú para ejecutar el programa SAHN Clustering.

:[

]

]

]

]

]

]

]

]

]

27

a) En la opción “Name of tree matrix” se escribe el nombre que se le asignó a la matriz gráfica.

Las otras opciones se mantienen como aparecen en la Figura 14. Realizado lo anterior, se

oprime la tecla F2 e inmediatamente se despliega una ventana en la que se muestra el

fenograma en su versión final.

b) Copie el fenograma oprimiendo simultáneamente la tecla Alt y la tecla ImpPnt.

Posteriormente abra el programa Paint, para copiar la imagen y modificarlo como guste.

c) Para salir del programa del NTSYS, cierre todas las ventanas oprimiendo la tecla Esc.

Estas técnicas y programas de análisis han sido utilizados por los autores en diferentes

estudios, y como ejemplo se incluyen en este trabajo el resumen de la siguiente publicación:

Para la detección de variación genética intra e interespecífica en cuatro poblaciones

silvestres de Prosopis, los autores del trabajo que se presenta a continuación, al utilizar los RAPD

como marcadores moleculares, encontraron que es mayor la variación genética entre las

poblaciones que dentro de ellas, así como estimar el flujo genético. También pudieron identificar

un total de 27 fenotipos o haplotipos y establecer las relaciones géticas entre tres especies de

Prosopis (Juárez-Muñoz, J.; G. Carrillo-Castañeda; A. Arreguín; y A. Rublúo. 2002. Inter- and

intra-genetic variation of four wild populations of Prosopis using rapd-pcr fingerprint. 11: 921-930).

Figura 14. Menú para ejecutar el programa Tree.

TREE

F1= Help F4= Select F10= menu ESC=Exit

Name of tree matrix

Title Tree style

Minimum for scale

:[ Tree G

:[ PHEN

:[ 0

:[ 0 :[ 0 Number class intervals

Maximum for scale

Graphics mode :[ Yes

Squeeze factor Line length (text mode) :[ 61

:[

:[ 1 Hardcopy device :[

LASER

]

]

]

]

]

]

] ] ]

]

28

7. METODOLOGÍAS BASADAS EN EL POLIMORFISMO DE PROTEÍNAS E

ISOENZIMAS

7.1. Introducción

Las proteínas son compuestos orgánicos formados por residuos de L- aminoácido. Cada tipo de

proteína tiene una secuencia de aminoácidos única que le confiere a la molécula propiedades

diferenciales. Las propiedades de estas moléculas se pueden entender examinando las

propiedades químicas de los aminoácidos que la constituyen, que por lo general son 20 tipos de

aminoácidos diferentes.

Por su tamaño, las proteínas son macromoléculas que realizan prácticamente todas las

actividades de la célula. Se estima que la célula típica de un mamífero puede tener unas 10 mil

diferentes proteínas con diversas funciones y estructuras. Como enzimas, las proteínas aceleran la

velocidad de las reacciones metabólicas; como fibras estructurales, las proteínas suministran

apoyo mecánico dentro de las células y en su perímetro exterior; como hormonas, factores de

crecimiento y activadores de genes, las proteínas ejecutan gran variedad de funciones

reguladoras; como receptoras y trasportadoras en la membrana, las proteínas determinan la

reacción celular y el tipo de sustancias que penetran o salen de la célula; como elementos

contráctiles, constituyen el mecanismo biológico del movimiento. Por otra parte, actúan como

anticuerpos, funcionan como toxinas, forman coágulos sanguíneos, absorben o refractan la luz y

trasportan sustancia de una parte del cuerpo a otra.

El término isoenzima fue acuñado por Market y Moller (1959), citado por Tanskley y Orton

(1983), para describir diferentes formas moleculares de enzimas con la misma función catalítica

incluyendo en el estado heterocigoto enzimas genéticamente diferentes.

La investigación moderna de isoenzimas está siendo conducida por muchos mejoradores,

genetistas, citogenetistas e investigadores genéticos. En los años cincuenta del siglo pasado, los

estudios realizados proporcionaron evidencia de que las enzimas en las plantas existían en

múltiples formas. La primera contribución mayor fue el desarrollo del gel de electroforesis de

almidón por Smiths (1955), citado por Tanskley y Orton (1983). Otra contribución fue la

demostración de que las enzimas podían ser visualizadas directamente en gel de almidón, cuando

29

se teñían con una sustancia específica. Hunter y Market (1957) plantearon que había especies con

varias formas específicas de enzimas.

Las isoenzimas son variantes de una misma enzima, que tienen todas función en un mismo

individuo y desarrollan actividad catalítica. Pueden desarrollar su función como polipéptidos

simples (monómeros) o como multímeros, cuyas subunidades pueden ser específicas para el

mismo o diferente gen (Fransworth, 1988). El uso de isoenzimas como marcadores genéticos

permite obtener una visión más precisa de la genética de las poblaciones, así como de los

procesos evolutivos y de las relaciones filogenéticas entre poblaciones. Se llama polimorfismo

genético a la coexistencia de dos o más alelos comunes y de varios fenotipos en una población,

(Mejía de León, 1992). Las isoenzimas también han sido usadas para la caracterización de

especies, variedades y líneas endogámicas y aneuploides, así como para la identificación de

híbridos interespecíficos por medio de polimorfismo de isoformas de varios tipos de enzimas.

Estos marcadores moleculares se asocian a caracteres fenotípicos y pueden medir el grado de

apomixia en diferentes genotipos.

Las enzimas que han sido corrientemente utilizadas son: esterasas, aspartato

aminotransferasas, amilasas, peroxidasas, fosfatasas, etc. Las isoenzimas también son

extremadamente variables en los tejidos de las plantas y los zimogramas deben ser interpretados

cuidadosamente (Kosuge et al., 1983). Su expresión puede ser inducida, órgano específica o

asociada a determinada etapa del desarrollo del individuo.

Peroxidasa. La inducción de esta defensa antioxidante supone una estrategia general

requerida para superar el incremento de estrés oxidativo debido al cambio drástico en las

condiciones ambientales. El estrés lleva a incrementar la oxidación que, a su vez, induce aumento

en la síntesis de compuestos antioxidantes no enzimáticos, como glutatión, ascorbato (vitamina

C) y tocoferol (vitamina E), así como también incrementa la síntesis de antioxidantes enzimáticos

como superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, ascorbato peroxidasa y

catalasas (Yang et al., 1993), citado por Smith (1996). La peroxidasa está implicada en la

regulación del crecimiento y desarrollo de las plantas. Su actividad está relacionada directamente

con el estrés oxidativo. Las peroxidasas son enzimas antioxidantes que incluyen la superoxido

dismutasa, ascorbato peroxidasa, entre otras. Las enzimas implicadas en la síntesis y regeneración

reducen a los antioxidantes (Fieldes y Gerhart, 1988).

30

Catalasas. Se encargan de controlar al peroxido de hidrógeno que se forma en los

peroxisomas de animales y los glioxisomas de plantas. En ciertas condiciones las plantas

producen radicales libres de oxígeno, los cuales son muy destructivos para la célula. Estos

radicales son catalizados por la peroxido dismutasa, la cual los trasforma en H2O2, y a su vez la

catalasa lo cataliza a H2O y O2 (Foyer et al., 1994; Chen et al., 1993).

Fosfatasas . Las fosfatasas son enzimas citoplasmáticas solubles de gran importancia en

los procesos fisiológicos y metabólicos de los organismos. Existen varios grupos de fosfatasas

entre las que destaca la fosfatasa ácida, perteneciente a un grupo de fosfohidrolasas

monoespecíficas, las cuales están involucradas en la hidrólisis de fosfomonoésteres; por ejemplo,

participan en la formación de sacarosa en el proceso de la fotosíntesis y también están

involucradas en el proceso de maduración y germinación de las semillas (Acquaah, 1992).

7.2. Separación de proteínas e isoenzimas en geles de poliacrilamida

7.2.1. Objetivos

a) Observar los patrones de proteínas y isoenzimas (peroxidasas y fosfatasas) de Prosopis.

b) Diferenciar mediante estos patrones entre las especies de Prosopis.

7.2.2. Material biológico

Cotiledones de 8 días de semillas de Prosopis, desarrollados en medio basal MS (Murashige y

Skoog, 1962), incubadas a 26 ±2º C y fotoperiodo de 16 horas, son utilizados para obtener los

extractos.

7.2.3. Preparación de extractos

Las proteínas son extraídas a partir del par de cotiledones de cada plántula. Para obtener el

extracto, 200 mg de tejido fresco son macerados en un mortero congelado colocado sobre hielo

con amortiguador de extracción (0.040 M Tris-HCl pH 8.0 y 0.015 M de 2-Mercaptoetanol) en

una relación 1:1 p/v. Las muestras se centrifugaron en tubos eppendorf a 4000 x g durante 10

min. para obtener el sobrenadante claro (Figura 15). Los extractos se conservan sobre hielo hasta

su uso.

31

32

7.2.4. Determinación de proteínas

El contenido de proteína de los extractos se determinará siguiendo el método de Lowry (1951).

La curva patrón se realizará usando albúmina de suero bovino, cristalizada en solución acuosa

(10 mg/50 ml), en el rango: 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mL de la solución de albúmina que

corresponda a: 0, 20, 40, 60, 80 y 100 µg/mL de albúmina. Posteriormente se agregará a cada

tubo 0.5 mL de NaOH 1N y 5 mL de la solución D (Na2 CO3. 10H2O [2%], CuSO4 [2%], Tartrato

de Na y K[1%]), después de 10 min. se agrega la solución E (reactivo de Folin diluido 1:1),

agitando vigorosamente las muestras. Posteriormente se conservan en oscuridad a 37° C durante

30 min. La absorbancia se determinó en un espectrofotómetro Bausch Lomb Spectronic a 580

nm.

7.2.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

Geles de poliacrilamida-SDS al 8% se separarán en un sistema de amortiguadores, de acuerdo

con Laemmli (1970). La concentración final de acrilamida para el gel separador será de 8% y 4%

para el gel concentrador.

a) Preparación de la solución de acrilamida-bisacrilamida. En un vaso de precipitado colocado

sobre hielo se agregaron 30 mL de agua desionizada fría, se pone en agitación constante y

se agrega lentamente 1g de bisacrilamida hasta que esté perfectamente disuelta.

Posteriormente se agregan gradualmente 29g de acrilamida, y finalmente se filtra y afora a

100 mL.

b) Procedimiento. Las dos piezas de vidrio, previamente lavadas con agua y jabón, se limpian

perfectamente con etanol al 50%, después con etanol al 96% y por último con xilol, a fin

de eliminar residuos de grasa. Posteriormente se arma el molde con el empaque.

c) Preparación de geles de acrilamida al 8.0%. Para preparar un gel al 8.0%, en un vaso de

precipitado de 100 mL, conservado en frío, se mezclaron: 6.39 mL de solución de

acrilamida-bisacrilamida (29-1%), 4.47 mL de amortiguador tris-HCl 2 M pH 8.8), 0.31

mL de solución de SDS al 10%, 0.41 mL de glicerol al 50%, y 11.77 mL de agua

deionizada estéril fría.

33

Gel sellador. De la solución de acrilamida-bisacrilamida preparada, se toma 1 mL y se le

agrega 25 µL de una solución concentrada de persulfato de amonio (15 mg /1 mL de agua

desionisada fría) y 4 µL de Temed; y con la ayuda de una pipeta pasteur se va agregando

lentamente, de manera que toda la parte interna del empaque sea cubierta; y se deja gelificar

durante 10 minutos.

Gel separador. 20 mL de la solución de acrilamida-bisacrilamida se desgasifican durante

15 min., para posteriormente agregarle 505 µL de la solución de persulfato de amonio y 27.58 µL

de Temed. Después de mezclar se vierte sobre el centro del molde con una pipeta pasteur y se

deja gelificar durante 45 minutos.

Gel concentrador. Los últimos 1.5 mL de la solución de acrilamida-bisacrilamida se

mezclan con 2 mL de amortiguador Tris-HCL 0.5 M pH 6.8, y después de desgasificar durante

15 min. se agregan 94.80 µL de la solución de persulfato de amonio y 5 µL de Temed. Después

de agitarla lentamente se procede a verter sobre el gel separador una vez colocado el peine. La

gelificación en este caso toma 30 minutos.

d) Separación electroforética y tinción del gel. En el gel se colocan, independientemente en cada

cubeta, las muestras que contienen:12 µL de extracto enzimático, 2 µL de colorante y 6 µL de

amortiguador de carga (Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8, glicerol, SDS 10% (p/v), 2-Mercaptoetanol). Un

marcador (SDS-PAGE 0303, Bio-Rad) se utiliza como referencia de pesos moleculares. Después

se llenan los tanques de la cámara de electroforesis con amortiguador de separación (Trisma base

1.5g, glicina 7.2, SDS 10% p/v), y para concentrar las muestras se aplica una corriente de 75

voltios y 40 mA durante 1 h (Figura 16). Para la separación de las muestras se utiliza una

corriente de 90 voltios y 50 mA por aproximadamente 5 horas.

Después de este periodo, para evidenciar las bandas, el gel se tiñe con una solución de

azul brillante de coomassie (0.1% p/v) durante 30 min, y posteriormente se destiñe con ácido

acético (10 % v/v) (Figura 16).

34

35

7.2.6. Identificación de peroxidasas por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

La actividad de peroxidasas se detecta empleando guiacol como sustrato, de acuerdo con el

método de Caruso et al. (1999). Después de la electroforesis, los geles se sumergen durante 10

min. en 40 mL de una solución estabilizadora de Tris-HCl 50 Mm, pH 7.4. A continuación se

incuba el gel en una solución nueva de Tris-HCl 50 Mm, pH 7.4, la cual contiene guiacol al

0.46% v/v y 13 mM de H2O2 (esta solución se prepara al instante de utilizarse). La reacción de

oxidación se deja proceder a 27º C hasta la aparición de bandas de color café.

7.2.7. Identificación de la fosfatasa ácida por electroforesis en geles de poliacrilamida–SDS

Para detectar la actividad de fosfatasa ácida (E. C. 3. 1. 3. 2) se emplea una reacción acoplada

Fields y Tyson (1983), usando el colorante Fast Garnet al 0.02% (Sigma), 0.06% Mg Cl2 y

0.007% de alpha naftil fosfato, en un amortiguador de acetato de potasio 0.25 M, pH 4.9. El gel

se deja en contacto con la solución reveladora durante 12 h en la oscuridad. Trascurrido este

tiempo, el gel se lava con agua destilada. La actividad de fosfatasa ácida se detecta por la

aparición de bandas de color amarillo.

7.2.8. Determinación de la actividad de fosfatasa ácida pH 5.8

Para la determinación de la actividad de la fosfatasa presente en los extractos, se utiliza el método

desarrollado por López y Carrillo (1996). En 1 mL de volumen final, la mezcla de reacción

contiene: 0.5 mL de solución amortiguadora (citrato de potasio 10-4 M, pH 5.8, 0.4 mL de agua

destilada y 0.1 mL de una solución de p-nitrofenil fosfato (10 µmoles/ mL). Inmediatamente

después de preparar la mezcla de reacción se precalienta durante 10 min. a 30º C, y después de

esto se adicionan 10 µL del extracto enzimático. La mezcla de reacción se incuba a 30º C durante

10 min. y la reacción se detiene con 3 mL de Na0H 0.1 N frío. La cantidad de p-nitrofenol

producido se determina a 400 nm.

Estas técnicas han sido utilizadas por los autores en diferentes estudios, y como ejemplo se

incluye en este trabajo un resumen de la siguiente serie de publicaciones:

1. Para la identificación de variedades de Solanum tuberosum, del Programa Mexicano de Papa,

los autores del trabajo que a continuación se presenta llevaron a cabo la separación electroforética

36

de proteínas hidrosolubles de tubérculos de siete variedades comercialmente importantes de papa.

Este método resultó ideal para la identificación de estas variedades, por lo que los autores lo

recomiendan para el análisis rutinario de proteínas e isoenzimas de papa. (López, D. H.; y G.

Carrillo-Castañeda. 1990. Identificación de variedades del Programa Mexicano de Papa por los

patrones electroforéticos de proteínas solubles. Revista Latinoamericana de la Papa (ALAP) 3 (1):

56-6).

2. Se analizaron los patrones electroforéticos de proteínas hidrosolubles, así como de tres

tipos de isoenzimas, para determinar su expresión en la interacción de la planta de Solanum

tuberosum y microorganismos causantes de enfermedades de este cultivo. Los autores

encontraron que los patrones de proteínas y de ciertas isoenzimas fueron modificados como

respuesta de la planta al ataque de los microorganismos. (Flores, L. R.; G. Carrillo-Castañeda; M.

A. Cadena; y L. Fucickovsy. 1992. Proteínas e izoenzimas de papa relacionadas con la interacción

Solanum tuberosum (Solanáceas) Pseudomonas solanacearum (Pseudomonadaceae). Agrociencia,

Serie Fitociencia 3 (1):79-90).

3. Los marcadores moleculares también dan información importante en fenómenos de

desarrollo de plantas. Los autores encontraron que cuando el Lycopersicon esculentum (jitomate)

se desarrolla expuesto a condiciones desfavorables como salinidad o a la presencia de drogas

como antibióticos, la planta responde mediante la inducción de nuevas proteínas que le permiten

adaptarse a las nuevas condiciones del ambiente. (Mejía, M. J. M.; y G. Carrillo-Castañeda. 1992.

Determinación del efecto estacional trascendente en el desarrollo in vitro de ápices del tallo de

Lycopersicon esculentum Mill. Agrociencia, Serie Fitociencia 3 (2):91-102).

4. En el caso de la regeneración de planta de Saccharum sp (caña de azúcar), propagada in

vitro, los autores demostraron que en el proceso de desdiferenciación celular y conservación de

los cultivos en estado indiferenciado, en un estudio que llevó nueve estadios de un mes cada uno,

los cultivos sufren una serie de adaptaciones que pueden ser descritas mediante el análisis de la

sucesión de isoenzimas asociadas a dicho proceso de desdiferenciación. Este estudio tiene

importancia dado que existen procedimientos para el establecimiento de los cultivos de caña a

nivel comercial, y en el método de micropropagación es importante para asegurar la mejor

indicción de brotes a partir de callos. (Carrillo -Castañeda, G.; y A. Mata. 2002. Succession of

esterase and peroxidase isozymes associated with the in vitro sugarcane tissue dedifferentiation

and shoot induction. Biotecnología aplicada 17: 226-230).

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41

APÉNDICE

Preparación de las soluciones utilizadas en la amplificación del ADN

• Iniciadores.

Los iniciadores leofilizados Gibco y Roth se disolvieron respectivamente en 500 y 1000 µL de

agua destilada o deionizada estéril, para obtener soluciones de entre 5 a 10 pmol/ µL. La cantidad

de pico moles obtenida depende del peso molecular del iniciador. Las casas comerciales que

distribuyen estos productos proporcio nan al adquirirlos una forma en la que especifican el peso

molecular del iniciador y otras características importantes.

• Mezcla de dNTPs.

En un tubo eppendorf se añadieron 5 µL de cada una de las soluciones concentradas de los cuatro

desoxirribonucleótidos (dNTPs) de la casa Gibco, los cuales están a la concentración de 100 mM.

Posteriormente se agregaron 980 µL de agua desionizada estéril, para obtener una solución 200

µM de dNTPs.

• Amortiguador TAE 10X

24.0 g de tris (hydroximetil aminometano)

5.71 mL de ácido acético glacial

10 mL de EDTA ( 0.5 M, pH 8.0)

Aforar a un volumen de 500 mL con agua desionizada.

• Amortiguador TAE 1X

Tomar 10 mL de TAE 10X y aforar a 100 mL con agua desionizada.

• Agarosa

En un matraz erlenmeyer de 500 mL de capacidad se agregan 1.2 g de agarosa tipo II (Sigma) y

100 mL de amortiguador TAE 1X. La agarosa se funde en un horno de microondas, durante 1.40

min. y se dejar enfriar hasta una temperatura aproximada de 30º C. Posteriormente se vierte en la

cámara de electroforesis, la cual previamente se prepara sellando los extremos y colocando el

peine, para formar el molde que constituirá el gel. Estas cantidades son las requeridas para formar

un gel de 15 x 15 cm de diámetro y 7 mm de espesor.

• Colorante de carga: cantidades para 10 mL.

42

Se colocan los tres componentes en un vaso de precipitados de 15 mL de capacidad, y para

disolver se colocan durante 15 min. en una parrilla eléctrica con agitación.

• Marcador 100 pb ADN (50 µg; 1µg/µL): cantidades para 100 µL.

En un tubo eppendorf de 1 mL de capacidad, se agregan 10µL del marcador y se diluyen en 90

µL de colorante de carga, para tener una solución de 0.1 µg/µL.

• Bromuro de etidio

5mg/ml

La preparación de esta solució n debe hacerse con guantes y en un recipiente pequeño destinado a

este fin, para evitar la contaminación del material, debido a que este compuesto es cancerígeno.

50% glicerol 10 mL

0.1% azul de bromofenol 10 mg

0.1% xilen cianol 10 mg