Manual de Laboratorio de Bioquímica Farmacéutica

Manual de prácticas del Laboratorio de Bioquímica farmacéutica.UPIBI-IPN
Rodríguez Pascual P., Pérez Sánchez R., Morales Martínez Martha, Martínez Zúñiga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE BIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
El presente manual fue elaborado por: Biol. Leonor Patricia Rodríguez Pascual Q.B.P. Refugia Pérez Sánchez QBP Martha Morales Martínez M. en C. Rodrigo Martínez Zúñiga M. en C. Sergio Oliva Maheda
Primera versión ENERO 2008
PRÓLOGO El presente manual de laboratorio es para la asignatura de Bioquímica Farmacéutica, tiene como objetivo familiarizar al estudiante con las substancias, métodos y equipo utilizados en la asignatura de Bioquímica Farmacéutica; darle experiencia personal en algunas técnicas y ponerlo en contacto con el método científico y seguir estimulando su interés por esta rama de la ciencia, para lograr este objetivo es necesario que el estudiante tenga presente: a.- Qué debe leer sus experimentos antes de ejecutarlos b.- Qué debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para aclarar dudas y comprender el porque de las operaciones que se han de ejecutar c.- Qué debe hacer cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqué de los hechos d.- Qué debe observar minuciosa y críticamente cada uno de los cambios ocurridos e.- Qué debe anotar sus observaciones y buscar la explicación científica. Cada una de las prácticas contiene la metodología necesaria para el desarrollo experimental de la práctica, así como los antecedentes teóricos necesarios para la comprensión de cada uno de los experimentos y poder reforzar los aspectos teóricos del curso. En el caso de algunos aspectos teóricos complejos, éstos pueden ser aclarados a través de la lectura suplementaria de la bibliografía recomendada al final del presente manual o bien la sugerida al inicio del curso. El manual está integrado por prácticas representativas y secuenciales de las unidades del curso teórico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este manual fueron: 1) Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico. 2) Que fuera lo más simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3,0 h 3) Que fueran de utilidad para sus cursos posteriores.

INSTRUCCIONES GENERALES I.- EVALUACIÓN I.1.- El laboratorio se evalúa como sigue: Trabajo* - laboratorio...............3,5 puntos Discusión................................ 3,0 puntos Reporte de la práctica........... 3,5 puntos
En el trabajo se evalúa
Antecedentes (lectura de la práctica)…………………..0.5 puntos Limpieza en todos los aspectos…………………………0.5 puntos Organización (para trabajar en equipo)………………..1.0 punto Habilidad…………………………………………………..1.0 punto Resultados obtenidos y registrados al momento……..0.5 puntos
El reporte se evalúa:
Objetivo y bibliografía................................. 0,5 puntos Resultados y análisis de resultados............ 1,5 puntos Discusión y glosario........................ 1,0 puntos Conclusiones................................... 0,5 puntos
I.2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas, aprobar el 80% de las prácticas efectuadas, entregar el 80% de los reportes y obtener un promedio mínimo de seis.
I.3.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte correspondiente.
I.4.- La calificación final del laboratorio será el promedio de las calificaciones de todas las prácticas
I.5.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
I.6.- Cada profesor elegirá un reporte, revisando que todos los alumnos miembros del equipo hayan elaborado el reporte. Si no es así el alumno que no lo presente tendrá cero en el reporte.
I.7.- Los equipos que no laven el material correspondiente de la práctica y/o dejen sucias las mesas tendrán cero en la práctica.
II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

II.1.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
• Una bata limpia y con botones, de preferencia debe ser de algodón, manga larga y blanca.
• Instructivo de laboratorio
II.2.- Por equipo deberá traer:
Un rollo de Masking tape Un marcador indeleble Un metro de franela Encendedor o cerillos
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.
III.1.- Se impartirá una sesión por semana de 3.0 h, cada sesión principiará y terminará a la hora indicada
III.2.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica
III.3.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos
III.4.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del profesor, se considerará que no asistió a la práctica.
III.5.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.
III.6.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el alumno adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada para la práctica, con una tolerancia de 10 minutos. No habrá retardos y se pondrá falta a quien no llegue a la hora establecida con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar tarde ya no se le permitirá la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta.

III.10.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un lugar de trabajo.
III.11.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir bebidas y mascar chicle dentro del laboratorio además deberá lavarse las manos al final de cada práctica: Recordar que se maneja un tejido(sangre) así como diversas sustancias. Todo material biológico residual deberá tratarse con el desinfectante que indique le profesor (benzal o cloro) a fin de evitar riesgos a la salud.
III.12.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo que visiten a los alumnos.
III.13.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por la persona o personas responsables de él.
III.14.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
III.15.- Después de terminada la práctica, el material deberá ser entregado limpio, a la persona encargada del almacén del laboratorio y deberá limpiar la mesa al iniciar y terminar la práctica.
III.16.- El alumno evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.
III.17.- Todo material contaminado con sangre se depositará en el lugar asignado para su esterilización.
III.18.- Esta prohibido el uso de celular durante la práctica, por lo que se le pide al alumno que lo apague durante el desarrollo, y discusión de la misma.
NOMBRE DEL ALUMNO:__________________________________________
PROFESOR DE TEORÍA: __________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________ __________________________ __________________________
ÍNDICE PRÓLOGO_________________________________________________________
Instrucciones generales ______________________________________________
PRÁCTICA No. 1 Naturaleza química de las enzimas y actividad biológica
PRÁCTICA No. 2 Transporte de electrones y su inhibición
PRÁCTICA No. 3 Determinación de glucosa y lactato en suspensión de eritrocitos
PRÁCTICA No. 4 Formación de liposomas. Determinación de lipoproteínas y triglicéridos en suero humano.
PRÁCTICA No. 5 Determinación de transaminasas, urea y ácido úrico en suero humano.
PRÁCTICA No. 6 Determinación de colesterol en suero humano.
PRÁCTICA No. 7 Transferencia de material genético.
PRÁCTICA No. 8 Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (GCH)

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Relación con Unidad Temática II. Catabolismo de carbohidratos
I. OBJETIVOS El alumno determinará el consumo de glucosa por parte de células sanguíneas. El alumno evaluará la producción de un metabolito de desecho propio del metabolismo anaerobio de la glucosa.
II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. La glucosa es la principal fuente de energía para los seres vivos. En el ser humano, su concentración debe mantenerse entre 60 y 100 mg/dl, valores por abajo (hipoglucemia) y por arriba (hiperglicemia) de estos provocan trastornos fisiológicos. La glucosa para ser aprovechada por el organismo debe ser introducida al citoplasma celular donde se encuentran las enzimas responsables de su degradación, el proceso se llama glicólisis, en el, ocurre una degradación incompleta de la glucosa, por lo que se requieren de otros sistemas enzimáticos así como de otros espacios celulares para su degradación total hasta CO2 y H2O. Durante el proceso de degradación de la glucosa se genera energía en forma de ATP, la producción de ATP ocurre en las diversas fases del proceso, por lo que si ocurre una degradación incompleta, la cantidad de energía generada también será incompleta y desde luego se generarán productos intermediarios de esa incompleta degradación.
La degradación total de la glucosa hasta CO2 y H2O, requiere de la presencia de oxígeno en las reacciones posteriores a la glicólisis y desde luego los sistemas enzimáticos correspondientes, mismos que están presentes en la mayoría de las células del organismo, sin embargo en algunas células como las musculares, pueden reorientar su metabolismo cuando la cantidad de oxígeno disponible no es suficiente, por lo que llevarán una degradación incompleta, otras “células” como los eritrocitos circulantes, carecen de los sistemas enzimáticos para la fase oxidativa de la degradación de la glucosa y también llevan una degradación a medias, en ambos casos el producto de este metabolismo incompleto es el ácido láctico, o lactato porque realmente se encuentra ionizado, por lo que su producción contribuye a la disminución del pH de la sangre, las reacciones que llevan a la producción de ácido láctico se conocen como fermentación láctica.
En los organismos superiores, el lactato no es liberado del cuerpo como desecho dado que aún tiene mucha energía utilizable, por lo que, el lactato producido en músculo o eritrocitos es liberado a la sangre y será capturado en el hígado y reconvertido en glucosa, por un proceso llamado gluconeogénesis para su posterior reutilización. En otros organismos, propiamente bacterias, el lactato es liberado a su medio ambiente y comúnmente es aprovechado por otros microorganismos para extraerle la energía que aún contiene, lo que es utilizado para la generación de diversos productos de interés económico.

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III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 1. Espectrofotómetro 2. Kit para determinación de glucosa, por el método de glucosa oxidasa. 3. Kit para determinación de lactato por método colorimétrico 4. Dos celdas de vidrio para el espectrofotómetro. 5. 9 tubos de ensaye de 6x100 6. 2 pipetas de vidrio de 5ml. 7. 2 pipetas automáticas, una de 10 a 100 mcl y una de 100 a 100mcl. 8. Puntas estériles para pipeta automática de 100 y 1000mcl. 9. Un agitador orbital 10. Cuarto estufa a 37°C 11. Frasco de cultivo de 50ml. 12. Heparina en solución (ProparinMR de Probiomed) de 1000 UI/ml 13. 4 tubos Eppendorf de 1.5ml 14. Microcentrífuga
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Extraer de un integrante del equipo 10 ml de sangre y depositarlo en condiciones de esterilidad, en un recipiente (tubo de ensayo, frasco de cultivo de 50ml o placa de cultivo 5cm de diámetro) estéril conteniendo 500µl de heparina. 2. Homogenizar la sangre con la heparina. 3. Tomar una muestra inicial de 0.5ml y depositarlo en un tubo Eppendorf, el frasco de cultivo colocarlo en agitación a 50 rpm en el cuarto de incubación. 4. Centrifugar la muestra de sangre 30seg a velocidad máxima en microcentrífuga. 5. Separar el plasma en otro tubo limpio. 6. Preparar dos series de 3 tubos como se señala en los cuadros, uno para determinar glucosa y el otro para determinar lactato.
7. Determinación de glucosa
Blanco Patrón Muestra Reactivo p/ Glucosa(ml) 1.0 1.0 1.0 Patrón (µl) 100mg/dl - 10 - Muestra (µl) - - 10
8. Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C o 30 minutos a temperatura ambiente. 9. Leer la absorbancia (As) del patrón y la muestra frente al blanco de reactivos a 505nm.
Para calcular la concentración de glucosa aplicar la siguiente formula.
As muestra
As Patrón X 100 = mg/dl de glucosa en la muestra
Factor de conversión: mg/dlglc X 0.0555 = mmol/lglc

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10. Determinación de lactato
Blanco Patrón Muestra Reactivo p/ Lactato (ml) 1.0 1.0 1.0 Patrón (µl) 100mg/dl - 10 - Muestra (µl) - - 10
11. Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o 10 minutos a temperatura ambiente. 12. Leer la absorbancia (As) del patrón y la muestra frente al blanco de reactivos a 505nm.
Para calcular la concentración de lactato aplicar la siguiente formula.
V. RESULTADOS Anote sus resultados de As en los cuadros siguientes.
Calcule las concentraciones de lactato y glucosa de acuerdo a las formulas dadas y anote los resultados en la siguiente tabla.
Construya las gráficas de decaimiento de glucosa y de producción de ácido láctico en el mismo eje cartesiano. No olvides anotar el pie de figura.
VI. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Tiempo As Glucosa As Lactato 0
X1 X2 X3
As Patrón X 10 = mg/dl de lactato en la muestra
As Patrón de glucosa
As Patrón de lactato

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Describe la glicólisis y explica porque es una vía de degradación incompleta apóyate haciendo un esquema de la ruta. Explica como se enlaza la glicólisis con la fermentación láctica, anota las reacciones. Indica porque se dice que la glicólisis es una ruta anaerobia. Di con tus palabras que información nos da la gráfica. Incluye la respuesta a estas preguntas en tu discusión ¿Fue consumida realmente la glucosa?, ¿Qué relación estequiométrica se establece entre la glucosa consumida y el lactato generado? ¿Por qué los eritrocitos no llevan la degradación de glucosa hasta CO2 y H2O? ¿que les falta?, en cuanto a la cantidad de energía generada ¿que consecuencias trae esto? ¿Cual es la función de los eritrocitos? ¿Por qué los eritrocitos no requieren tanto ATP como las demás células del organismo? Describe que le ocurre a lactato que es liberado por los eritrocitos y anota las transformaciones que le ocurren.

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PRACTICA No. 3
Unidad Temática: Catabolismo de Carbohidratos.
I. OBJETIVOS.
El alumno aislará mitocondrias a partir de riñones de rata. El alumno determinará la hidrólisis de ATP en mitocondrias de riñones de rata. El alumno utilizará inhibidores y aceptores artificiales de electrones que afectan el transporte de
electrones en mitocondrias. El alumno evaluará el transporte de electrones en mitocondrias y determinará su importancia desde
el punto de vista farmacéutico.
II. FUNDAMENTOS.
El termino respiración es usado para hacer referencia al proceso en el cual la energía es generada a través de moléculas nutrimentales, con O2 como el máximo aceptor de electrones, éste término es también llamado respiración celular para distinguirlo del término respiración regular.
Existen tres estados de la oxidación metabólica de compuestos orgánicos:
1. Generación de un fragmento activado de dos carbonos (el grupo acetilo de la acetil-CoA) del piruvato (citoplasma), ácidos grasos (mitocondria), o aminoácidos (citoplasma/mitocondrias).
2. Oxidación de los carbonos del fragmento de acetilo mediante el ciclo del ácido cítrico (mitocondrias).
3. Transferencia de electrones desde la oxidación en el paso 2 a través del sistema de transporte de electrones para producir ATP de la fosforilación oxidativa.
Transporte de electrones. El transporte de electrones es un sistema en el que los electrones generados por la oxidación son transferidos. La transferencia de los electrones mediante este sistema genera energía potencial que es usada para sintetizar ATP en la fosforilación oxidativa.
El valor de E0´ para los acarreadores de electrones en la membrana de la mitocondria se incrementa en el mismo orden en el que son usados en el transporte electrónico. Dichas reacciones ocurren en el siguiente orden:
NADH y NADH Deshidrogenasa (Complejo I) – La molécula de NADH se genera mediante numerosas deshidrogenasas en la célula. Éste se reoxida a NAD+ por el Complejo I de la mitrocondria (también llamado NADH deshidrogenasa).
Complejo II (Succinato deshidrogenasa) – El complejo II no es la forma en la que los electrones viajan desde el Complejo I. Este es un punto de entrada de los electrones desde FADH2 producido por la enzima succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico. Estos complejos I y II donan sus electrones al mismo aceptor coenzima Q.
Coenzima Q (CoQ) - CoQ es una benzoquinona ligada a un número de unidades de isopreno. El tallo de isopreno da a la molécula un character apolar que permite a la CoQ dispersarse rápidamente a través de la membrana mitocondrial interna. La CoQ tiene la capacidad de aceptar electrones en pares y pasarlos uno a la vez mediante un intermediario semiquinona hacia el complejo III.

Citocromo c - Esta pequeña proteína es la única del sistema de transporte de electrones que no es un complejo. Esta acepta los electrones del complejo III y los envía al complejo IV.
Complejo IV – El Complejo IV es también conocido como citocromo oxidasa, porque toma los electrones del citocromo c. El complejo IV contiene citocromos a y a3. Los citocromos a y a3 evidentemente representan dos grupos hemo A Asociados a la misma cadena polipeptídica. Ellos se encuentran en diferentes ambientes en el interior de la membrana aunque tienen diferentes potenciales de membrana idénticos, sus potenciales de reducción son diferentes. Cada uno de los hemos esta asociado a un ión cobre, localizado cerca al hierro hemo. Los electrones que pasan por el complejo IV pueden ser bloquedos por el cianuro, azida de sodio y monóxido de carbono y el acarreador artificial de electrones, ferrocianuro, puede aceptar electrones del citocromo a en el complejo.
Un inhibidor del transporte de electrones crea un punto de cruce o lugar específico de inhibición. Cuando una ruta es bloqueada totalmente, los acarreadores de electrones se encontrarán en un estado reducido antes del punto de inhibición y oxidado después de este. Esto puede monitorearse fácilmente diferencias de espectro y es de hecho, una de las formas en las cuales la acción de los acarreadores de electrones en la cadena respiratoria fue establecida.
Los aceptores artificiales de electrones tienen un efecto opuesto a los inhibidores. Esto es, reestablecen el flujo de electrones en un punto específico al presentarse un inhibidor. Por ejemplo si las mitocondrias fueran tratadas con antimicina A (un inhibidor) y azul de metileno (un aceptor artificial de electrones), el Complejo I sería oxidado respecto a CoQ debido a la liberación de electrones del complejo I al azul de metileno. El CoQ permanecería reducido, así mismo la transferencia de electrones hacia el siguiente acarreador, Complejo III, estaría bloqueada.
III. EQUIPOS Y REACTIVOS.
Material:
1 Tijeras de disección. 1 Mortero con pistilo. 1 Tubo de centrifuga con camisa. 11 Tubos de ensayo de 16 X 150 mm. 5 Pipetas de 1 mL. 3 Pipetas de 5 mL. 1 Pipeta de Kahn. 1 Propipeta. 1 Vaso de precipitados de 100 mL. 2 Gradillas. 1 Celda espetrofotométrica. 1 Baño de hielo. 1 Incubadora a 30oC por sección. 1 Incubadora a 4oC por sección. 1 Centrifuga por sección. 1 Espectrofotómetro por sección. 2 Termómetro de 0o a 100oC.
Material Biológico.
10.0 mL de regulador de sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM, Tris 10mM pH 7.3 frio. 0.5 mL albúmina 10 mg/mL 1.0 mL de glicerol. 1.0 mL de KCl 1M. 3.5 mL de regulador Tris 0.1M pH 7.3 0.5 mL de MgCl2 0.1 M 0.5 mL de ATP 60 µg/mL. 0.1 mL de azida de sodio 0.1 M 3.5 mL de preparado mitocondrial. 0.1 mL de Polixin ofteno. 0.1 mL de 2,4 Dinitrofenol 0.3 mg/ml.
Parte II
Material.
7 Tubos de ensaye de 16 X 150 mm 1 Gradilla 1 Celda espectrofotométrica. 1 Bureta de 20 mL 1 Soporte universal 1 Pinzas para bureta. 1 Vaso de precipitados de 100 mL. 7 Pipetas de 1 mL. 2 Pipetas de 2 mL. 1 Incubadora de 37oC por sección. 1 Espectrofotometro por sección. 1 Termómetro.
Reactivos.
16.2 mLde regulador de fosfatos 0.3 M, pH 7.4 0.7 mL de DPIP (diclorofenol indofenol) 5.5 mL de succinato de sodio 0.5 M 0.5 mL de malonato de sodio 0.5 M 0.5 mL de KCN 0.1 M 0.2 mL de citocromo c 0.6mM 1.0 mL de preparación mitocondrial.
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
PARTE I. FOSFORILACIÓN.
A. PREPARACIÓN DE LA FRACCIÓN CON MITOCONDRIAS.
4.1 Obtener los riñones de una rata y separar la corteza de ambos.
4.2 Macerar las 3 cortezas en un mortero, utilizando 10 mL. de regulador de sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM, pH 7.3 fría. Mantener todo en hielo.
4.3 Centrifugar durante 10 min. Cuidar de equilibrar bien los tubos.

B. ACTIVIDAD DE ATPasa.
4.6 Preparar una serie de tubos como se indica en la siguiente tabla.
Tubo 1 (Testig
Regulador de Tris 0.1 M pH 7.3
(mL) 1.1 0.6 0.5 0.7 0.6 0.5 0.5
Mg Cl2 0.1 M (mL)
0.1 0.1 0.1 _____ 0.1 0.1 0.1
ATP 60 mg/mL (mL)
Azida de sodio (mL)
nota 0.5 0.5
*Nota: Para este tubo primero se incuban las mitocondrias a -20oC en hielo seco, durante 15 min y después se adicionan la tubo.
4.7 Incubar a 30oC durante 15 min.
4.8 Después de transcurrido el tiempo de incubación, adicionar a todos los tubos 1.0 mL de TCA al 30 %.
4.9 Al tubo 1, adicionar 0.5 mL de la preparación de mitocondrias (después del TCA).
4.10 Centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.
4.11 Tomar 0.6 mL de los sobrenadantes y tratarlos como al tubo 4 de la curva tipo pero en lugar de solución tipo de fósforo se adiciona ésta muestra problema y luego el resto de los reactivos como marca la tabla. Atención: Se debe tener cuidado de No adicionar la solución tipo de fósforo, pues en su lugar estamos adicionando los sobrenadantes.
4.12 Determinar la densidad óptica a 660 nm de cada tubo.
C. CURVA TIPO DE FOSFORO.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Slución tipo de fósforo 1mM (mL)
0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ____

Molibdato de amonio 6.6 % (mL)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada (mL) 3.5 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 3.6
Agitar
FeSO4 al 10% (ml) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
4.14. Agitar y leer en el espectrofotómetro a 660 nm. Utilice como blanco el tubo 7.
PARTE II. TRANSPORTE Y ACEPTORES ARTIFICIALES DE ELECTRONES.
A. ACTIVIDAD DE SUCCINICO DESHIDROGENASA Y DE CITOCROMOS.
4.15 Preparar una serie de 5 tubos y adicione los reactivos que se muestran en la siguiente tabla y en orden estricto.
¡CUIDADO!
El KCN ES VENENOSO, UTILICE BURETA PARA ADICIONARLO A LOS TUBOS.
Sustancia
3.3 2.3 2.1 2.6 1.8 2.1
DPIP 1 M (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Malonato 0.5 M (mL) ____ ____ 0.2 0.2 ____ ___
KCN 0.1 M (mL) ____ ____ ____ ____ 0.5 ___
Cit C 0.6 mM (mL) ____ ____ ____ ____ ___ 0.2
Succinato 0.5 M (mL) ____ 1 1 0.5 1 1
Incubar los tubos a 37oC durante 5 minutos
4.16 Tomar el tubo 1 (Testigo) y adicionarle 0.1 mL de la fracción de mitocondrias e inmediatamente determine la densidad óptica a 660 nm.

V. RESULTADOS, ANÁLISIS DE RESULTADOS.
5.1 Escriba los datos generados de la curva tipo de fósforo en la tabla 5.1
Tubo Concentración de fósforo ( moles) As 600 nm
1
2
3
4
5
6
7
5.2 Construya la curva tipo de fósforo en papel milimétrico, colocando en las ordenadas la densidad
óptica a 660 nm y en las abscisas la concentración de fósforo en µmoles.
5.3 Determine la pendiente de la recta y utilícela como coeficiente para el cálculo de la concentración de fósforo en el experimento de ATPasa. ¿Diga que parámetro permite determinar si la curva tipo es válida?
5.4 Escribir los resultados del experimento de ATPasa en la tabla siguiente.
Tubo Condición As 660 nm Concentración de
Fósforo ( moles)
5.5. Explique lo ocurrió en el tubo 2.
5.6 ¿Cuál es el efecto de eliminar el Mg+2 del tubo de reacción?
5.7 ¿Qué ocurre en el tubo con mitocondrias preenfriadas a –20oC?
5.8 ¿Qué ocurre en el tubo con azida de sodio?
5.9 ¿Qué ocurre en el tubo con gramicidina?
5.10 ¿Qué ocurre en el tubo con 2,4 DNF?
5.11 ¿Cómo afecta la gramicidina el transporte de electrones?

5.12 ¿Cómo afecta el 2,4 DNF el transporte de electrones? ¿A qué nivel de la cadena respiratoria actúa? ¿Cuál es su uso terapéutico?
5.13 ¿Cuál es el objetivo de adicionar el TCA?
5.14 Escriba los resultados obtenidos en el experimento 4.3 en la siguiente tabla.
Tubo Condición As 660 nm
1
2
3
4
5
6
5.15 ¿ Por qué el tubo 1 disminuye el color, a pesar de que no se adicionó el succinato?
5.16 ¿Qué tipo de sustancia es el malonato y a que nivel actúa en cadena respiratoria? Explique ya que nivel actúa en cadena respiratoria? Explique como demostró este resultado.
5.17 ¿A qué nivel actúa el CN- como inhibidor de la cadena respiratoria? Explicar como demostró lo anterior.
5.18 Escriba la reacción de reducción del DPIP, con fórmulas.
5.19 Explique que tipo de sustancia es la gramicidina, y cuál es su uso terapéutico.
VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Analice y discuta en base a los resultados obtenidos y a la bibliografía consultada.
VII. GLOSARIO DE TÉRMINOS TÉCNICOS.
7.1 POTENCIAL REDOX.
7.6 DESACOPLANTE.
VIII. CONCLUSIONES.
Con los resultados obtenidos, el análisis, la discusión, los objetivos de la práctica y a la bibliografía consultada dar las conclusiones de este reporte.
IX. BIBLIOGRAFÍA
Registre la bibliografía consultada para la elaboración de éste reporte.
X. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
10.1 Lenhinger, A., “Principios de Bioquímica”, 3ª. Ed. Omega. España 2001.
10.2 Mathews, V. H. , “Bioquímica”, 3ª. Ed. Prentice-hall. España 3003.
10.3 Bohinski, R. C., “Bioquímica” 2ª. Ed. Pearson education. México 2000.
10.4 Murray, R. K., “Bioquímica Ilustrada Harper”, 17ª. Ed. El manual moderno. México. 2007.

PRÁCTICA 4
FORMACIÓN DE LIPOSOMAS. DETERMINACIÓN DE LIPOPROTEÍNAS Y TRIGLICÉRIDOS EN SUERO HUMANO.
UNIDAD III. Catabolismo de lípidos
Tema: 3.1. Movilización y transporte de lípidos (TG y Colesterol) Tema: 3.1.1 Estructura y función de partículas VLDL, LDL, IDL y HDL
1.- OBJETIVOS Objetivo general. El alumno formará experimentalmente liposomas y determinará lipoproteínas y triglicéridos en suero humano. Objetivos particulares. El alumno formará liposomas a partir de fosfolípidos. El alumno comprobará la capacidad de los liposomas de encapsular sustancias. El alumno determinará triglicéridos y la lipoproteína HDL- colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIÓN Los lípidos son compuestos orgánicos, muy heterogéneos insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos. Los lípidos tienen diferentes funciones en el organismo, entre las cuales están las siguientes: 1.- Estructural. Forman las membranas celulares (fosfolípidos y esfingolípidos). 2.- Reserva energética. Triglicéridos (TG o TAG). 3.- Transporte. Lipoproteínas. 4.- Compuestos funcionales. Vitaminas (vitamina D), sales biliares y hormonas como: progesterona, testosterona, estrógenos y corticoides. 5.- Aislante térmico y protector. Tejido adiposo
Los lípidos de la dieta y aquellos que se sintetizan en las células son necesarios para los organismos superiores, donde se utilizan para construir membranas, moléculas combustibles o para biosíntesis. Los lípidos más importantes para el transporte son los triglicéridos y el colesterol (colesterol libre y ésteres del colesterol). Los lípidos se transportan en la sangre como complejos lipoproteícos, los cuales se componen de proteínas específicas y de combinaciones de triglicéridos, colesterol y ésteres de colesterol, denominadas lipoproteínas o apolipoproteínas. Los lípidos y las proteínas están asociados como complejos hidrosolubles no covalentes.
Las principales lipoproteínas se clasifican en: Quilomicrones: son las lipoproteínas menos densas y se componen de 98 a 99% de lípidos, principalmente de TAG. Se pueden considerar como gotas de grasa cubiertas con una capa de proteínas y lípidos polares. Estos se ensamblan en el intestino con los lípidos de la dieta y se absorben al torrente sanguíneo para ser transportados a los tejidos periféricos. Ahí, una lipoproteína lipasa libera los ácidos grasos de los TAG. Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL ): Son agregados moleculares que se forman en el hígado con los TAG que ahí se sintetizan, su función es llevarlos hacia el tejido adiposo y otros tejidos periféricos para ser almacenados o para utilizarse como fuente de energía. Los ácidos grasos se liberan por acción de la lipasa. Lipoproteínas de baja densidad (LDL): Estas partículas son las principales transportadoras de colesterol en la sangre, movilizan a los ésteres de colesterol del hígado donde se sintetizan, hacia los tejidos periféricos. Los lípidos predominantes son los ésteres de colesterol que contiene un ácido graso poli insaturado (ácido linoleico).

atrapan el exceso de colesterol y lo llevan al hígado. A las HDL, se les conoce como el colesterol “bueno” porque disminuyen los niveles plasmáticos de éste.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades físicas y composición de las principales lipoproteínas:
Composición (% peso) Lipoproteína Densidad
Proteínas Colesterol Fosfolípidos Triglicéridos TAG
Quilomicrones <0.95 800-5000 2 4 9 85 VLDL 0.95-1.0 300-800 10 20 20 50 LDL 1.0-1.063 180-280 25 45 20 10 HDL 1.063-1.2 50-120 55 17 24 4
Los individuos con altos niveles séricos de colesterol de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor incidencia a sufrir ataques cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor concentración de HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
En general se promueve en la población reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen factores que no podemos modificar como el genético, el de género: las mujeres tienden a acumular menos colesterol y sus niveles de HDL son más altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades cardiovasculares que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hábito de fumar, el consumo de alcohol, una dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrés, que en su conjunto aumentan los niveles de colesterol y TAG.
Triglicéridos: son un grupo de lípidos formados por tres ácidos grasos y un glicerol. Son las principales moléculas energéticas e ideales como reserva de energía a largo plazo, porque proporcionan más del doble de energía por unidad de masa que los carbohidratos. Los triglicéridos, como son no polares, se almacenan en forma anhidra en el tejido adiposo. Para utilizar la energía de los ácidos grasos, primero deben ser liberados de los TAG, y después ser transportados de los tejidos periféricos a las mitocondrias para su degradación metabólica. El catabolismo se realiza por β-oxidación, un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA, que entra posteriormente al ciclo de Krebs. Si la cantidad de moléculas disponibles como combustible rebasa las necesidades fisiológicas, se inicia la síntesis de ácidos grasos, lo cuales se asocian con glicerol y se almacenan en el tejido adiposo. Los niveles de triglicéridos se elevan por una ingesta alta en grasas saturadas o carbohidratos, también por exceso de peso, consumo de alcohol, la edad (aumentan con la edad), algunos medicamentos como los anticonceptivos, esteroides, diuréticos causan aumento en los niveles de TAG, enfermedades como la diabetes, hipotiroidismo, enfermedades renales y hepáticas se asocian también con niveles altos, además del factor hereditario (trastornos genéticos). Un nivel elevado de triglicéridos se asocia como factor de riesgo de enfermedad cardiaca junto con el colesterol, además de ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.

favorable para la mayoría de los fosfolípidos y glicolípidos en medios acuosos es la bicapa lipídica en vez de la micela.
Fosfolípido Micela Bicapa lipídica
Liposoma
La formación de bicapas lipídicas a partir de fosfolípidos es un proceso rápido y espontáneo de auto ensamblaje, siendo las interacciones hidrofóbicas las principales fuerzas que determinan su formación, además de las fuerzas de Van der Waals que favorecen el empaquetamiento compacto de las colas hidrocarbonadas. La tendencia de los fosfolípidos a formar membranas, se ha utilizado para crear una importante herramienta experimental y clínica, los liposomas, que son compartimentos acuosos rodeados por una bicapa lipídica, con un arreglo similar al de las membranas celulares, pueden emplearse para el estudio de la permeabilidad de la membrana o para liberar fármacos en las células. Los liposomas pueden prepararse suspendiendo un lípido como la fosfatidilcolina, en un medio acuoso. Posteriormente, la mezcla se agita por medio de ondas sónicas de alta frecuencia, con lo que se consigue una dispersión de vesículas cerradas de tamaño bastante uniforme, las vesículas formadas según el procedimiento indicado tiene una forma esférica, con un diámetro de unos 50 nm (500 Å). Se pueden formar vesículas mayores de 1 µm de diámetro, mediante la evaporación lenta del disolvente

Se están realizando experimentos para desarrollar el uso de los liposomas, por ejemplo se pueden inyectar en pacientes liposomas que contengan DNA para tratamiento por terapia génica, o fármacos, ya que ha demostrado su potencial como sistema de liberación de ellos y capacidad para que lleguen a un órgano blanco específico. Estos liposomas se fusionan con la membrana plasmática y pueden introducir sustancias en células impermeables a ellas, el estudio de transporte a través de membrana, por ejemplo, la permeabilidad a los iones. Otros sistemas coloidales como los niosomas, transfersomas y nanoesferas, también se han utilizado, pero los liposomas son las formas que presentan mayor posibilidad para contener, transportar y ceder principios activos. Además de la capacidad de transportar y ceder principios activos, no son tóxicos, no son inmunogénicos, no son irritantes, son biodegradables y pueden incorporar una gran variedad de fármacos de naturaleza hidrofílica o hidrofóbica.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO
3.1 Triglicéridos y HDL-colesterol
EQUIPO y MATERIAL Baño a 25 o 30o C 1 gradilla 5 tubos de 13 x 100 2 pipetas de 2 ml 2 pipetas de 1 ml Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
Espectrofotómetro para luz UV 2 celdas espectrofotométricas 1 porta celdas 1 centrífuga
REACTIVOS Kit para Triglicéridos Kit para HDL-colesterol (lipoproteína de alta densidad)
3.2 Liposomas

2,0 mL de dodecil sulfato de sodio al 1%
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Primera parte. A. TRIGLICÉRIDOS.
FUNDAMENTO. Los triglicéridos incubados con la enzima lipoprotein lipasa (LPL), liberan glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por la acción de la enzima glicerol quinasa (GK) y ATP para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peróxido de hidrogeno (H
2 O
Al final, el peróxido de hidrogeno (H 2 O
2 ) reacciona con 4-aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reacción
catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja, cuya intensidad es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra:
Reacción Lipoproteína lipasa
Glicerol quinasa
2 →
H
2 + 4-AF + p-Clorofenol → Quinona (Complejo de color rojo)
Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el colesterol, son transportados a las células del organismo por las lipoproteínas en la sangre. Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicéridos. Su aumento es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas disfunciones hepáticas (cirrosis, hepatitis, obstrucción biliar) o diabetes mellitus, pueden estar asociadas con su elevación.
MUESTRA Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el coágulo durante 5’ a 35 o C y centrifugar durante 7’ a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100 utilizando una pipeta pasteur.Se puede utilizar suero o plasma heparinizado o con EDTA. . La muestra es estable 5 días a 2-8ºC.
REACTIVOS Nota: Dependiendo del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
R 1 Regulador

0,1 mmol/L 0,1 mmol/L
Patrón de Triglicéridos 200 mg/dL
PREPARACIÓN DE REACTIVOS. Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Regulador. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad del reactivo de trabajo: 6 semanas en refrigeración (2-8ºC) o una semana a 15-25ºC. Estabilidad: todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar reactivos fuera de la fecha indicada.
PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 505 (490-550) nm Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15-25ºC
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una celda:
Reactivos Blanco Patrón Muestra RT (mL) 1,0 1.0 1.0
Patrón (µL) -- 10 --
Muestra (µL) -- -- 10
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC o 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Leer la absorbencia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable durante 30 minutos.
CÁLCULOS A (Muestra) (x 200 Conc. Patrón) / A (Patrón) = mg/dL de triglicéridos en la muestra
Factor de conversión: mg/dL x 0,0113 = mmol/L.
5.1 RESULTADOS

CONTROL DE CALIDAD. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados. Sí los valores hallados se encuentran fuera del intervalo de tolerancia, se recomienda revisar el instrumento, los reactivos y el calibrador.
VALORES DE REFERENCIA Hombres: 40 – 160 mg/dL Mujeres: 35 – 165 mg/dL
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
B) HDL-COLESTEROL (Lipoproteínas de alta densidad)
FUNDAMENTO. Esta técnica permite la determinación directa del HDL-colesterol sin necesidad de pre- tratamiento o centrifugado de la muestra. El método se basa en las propiedades de un detergente que solubiliza sólo la fracción HDL, el cual se libera reaccionando con la enzima colesterol esterasa, la colesterol oxidad y los cromógenos. Las lipoproteínas LDL, VLDL y los quilomicrones son inhibidas debido a la adsorción del detergente en sus superficies haciéndolas resistentes a la enzima. La intensidad de color formado es proporcional a la concentración de HDL presente en la muestra.
MUESTRA. Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el coágulo durante 5’ a 35 o C y centrifugar durante 7’ a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100 utilizando una pipeta Pasteur, se puede utilizar plasma pero no con citrato. El HDL-colesterol es estable por 7 días a temperatura ambiente, en este método. No utilizar muestras hemolizadas.
REACTIVOS
R 1
GOOD pH 7,0 Colesterol oxidasa < 1000 U/L Peroxidasa < 1300 U/L DSBmT < 1 mM
R 2
GOOD p H 7,0 Colesterol esterasa < 1500 U/L 4-aminoantipirina < 1 mM Detergente < 2 % Ascórbico oxidasa < 3000 U/L
HDL-colesterol/ LDL-c CAL Calibrador. Suero humano liofilizado
PREPARACIÓN DE REACTIVOS. Los reactivos R1 y R2 están listos para usarse. El calibrador se reconstituye con 1 mL de agua destilada, tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver el contenido.
PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 600-700 nm Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC

3. Pipetear en una celda:
Reactivos Blanco Calibrador Muestra R1 (µL) 300 300 300
Calibrador (µL) -- 3 --
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC o 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Leer la absorbencia (A1) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo. 6.- Añadir:
Blanco Calibrador Muestra R 2 µL 100 100 100
7.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37o C 8.- Leer la absorbencia (A2) frente a blanco de reactivo. 9.- Calcular : A = A2 - A1
CÁLCULOS (A) Muestra x Conc. del calibrador = mg/dl de HDL colesterol en la muestra
(A) Calibrador
5. 2 RESULTADOS
Equipo HDL-colesterol (mg/dl) Equipo HDL-colesterol (mg/dl)
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de muy baja densidad (VLDL) se pueden determinar de acuerdo con la ecuación de Friedewald:
• VLDL-C= triglicéridos/5
VALORES DE REFERENCIA Hombres Mujeres

Segunda sesión.
C) LIPOSOMAS
Etiquetar 4 tubos de 16 x 150 y adicionarles las sustancias como se indican en el siguiente cuadro y en estricto orden.
Tubo 1 2 3 4
Lecitina (m L) 1 1 ----- ----
Almidón (mL) 1 1 1 1
AGITAR CON VORTEX DURANTE 5 MINUTOS (evitar la formación de espuma)
Pasar a el contenido de los tubos a los vasos de pp de 25 ml y Calentar a baño maría a 45o C hasta obtener un gel viscoso
Tomar una gota y observar al microscopio α – amilasa (mL) 1 1 1 ----
Incubar a 37o C durante 20 minutos
Agua destilada (mL) 2 2 2 2 Centrifugar a 4000 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante SDS (mL) ----- 1 ------ 1
Prueba de Lugol ( gota)
1 1 1 1
Observación del color de cada tubo
5.3 RESULTADOS Hacer esquemas de las observaciones al microscopio de cada tubo
Anota con signo + si la prueba de lugol es positiva, en los tubos probados, en la tabla siguiente.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. Con los resultados obtenidos de cada equipo analiza y discute los valores obtenidos en el grupo, la metodología utilizada, la importancia de las enzimas en las determinaciones. Incluye las preguntas del cuestionario para que realices tu discusión.
Parte 1 1.- Explica el fundamento del método de cada una de las determinaciones. 2.- En las determinaciones de TAG y HDL-colesterol, menciona cuales fueron las fuentes de error que pudieron alterar los valores obtenidos. 3.- ¿Qué ventajas y desventajas hay entre un método enzimático y uno colorimétrico? 4.- ¿Cuál es la importancia de las determinaciones de HDL-colesterol y triglicéridos?, explica las implicaciones clínicas. 5.- ¿Por qué se considera a las LDL y VLDL el colesterol “malo” y a las HDL el colesterol “bueno”? 6.- En base a los resultados obtenidos comenta si son valores normales o no y explica porque lo consideras así. 7.- Investiga mínimo 2 sustancias que se utilizan para catabolizar a los TAG del organismo y disminuir su concentración sanguínea. Explica como actúan a nivel molecular. Parte 2 8.- Explica los resultados obtenidos en cada tubo 9.-¿Para que se adiciona el SDS y la α-amilasa? 10.- De acuerdo a sus datos, ¿es posible considerar a los liposomas como modelo de membrana? Explica 11.- Menciona cómo es posible encapsular en los liposomas sustancias hidrofílicas e hidrofóbicas. 12.- Indica como podría un fármaco encapsulado alcanzar a las células de un órgano específico
CUESTIONARIO 1.- Diseña un método para formar liposomas y demostrar que pueden encapsular sustancias.
7.- CONCLUSIONES. Con el análisis y discusión de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la práctica y la investigación bibliográfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA. Cita la bibliografía consultada para hacer tu reporte.

PRACTICA No. 5
DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS, UREA Y ÁCIDO ÚRICO EN SUERO HUMANO.
UNIDAD IV: Metabolismo de compuestos nitrogenados.
TEMA
4.2 Degradación de nucleótidos.
1.1 Objetivo General
El alumno analizará el metabolismo de compuestos nitrogenados y su inhibición, para entender el papel de los fármacos.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno obtendrá muestras de sangre humana para la determinación de transaminasas, urea, y ácido úrico en una muestra de suero.
1.2.2 El alumno determinará cuantitativamente la cantidad de transaminasas, urea y ácido úrico mediante el empleo de pruebas de diagnóstico clínico y los valores obtenidos los comparará con los de referencia
2. INTRODUCCIÓN
El metabolismo nitrogenado incluye a las proteínas y los aminoácidos, así como otros compuestos derivados de los aminoácidos como las bases purínicas y pirimidínicas, grupos hemo, moléculas relacionadas como la hemoglobina, poliaminas, creatina, diversos neurotransmisores y hormonas.
Sin embargo el ácido úrico es el principal producto de la degradación de las purinas, la mayor parte de la formación de ácido úrico se lleva a cabo en el hígado Los valores normales de ácido úrico varían ampliamente por diversos factores tales como edad, orígenes raciales, sexo, sociales y geográficos; además el método analítico utilizado. Igualmente numerosas enfermedades y alteraciones fisiológicas modifican la concentración de ácido úrico en la sangre, siendo el aumento más significativo lo que se denomina hiperuricemia.
El ácido úrico y sus sales son el resultado final del metabolismo de las purinas (partes de DNA y RNA). La mayor parte del ácido úrico se excreta por el riñón, y algo por el sistema intestinal. Cuando aumenta la destrucción de los tejidos (como en diversos tipos de cáncer) el ácido úrico aparece elevado en sangre, la consecuencia de la elevación es la gota.
En este padecimiento existe una sobre producción de ácido úrico, y la poca solubilidad del urato sódico hace que se depositen cristales de éste en las articulaciones y el riñón. Es un trastorno del metabolismo de las purinas (adenina y guanina) y no de las proteínas, como a veces se considera.
Las sales sódicas de ácido úrico tienen una muy escasa solubilidad en medio acuoso, dicha solubilidad disminuye al disminuir la temperatura y el pH de manera que por encima de concentraciones plasmáticas de 7 mg / dl de ácido úrico pueden precipitarse en forma de cristales.
Por su similitud estructural con sustratos y productos el alopurinol es un inhibidor competitivo de la xantina oxidasa, reduciendo la producción de ácido úrico, de ahí su utilidad en el tratamiento de la gota donde favorece la acumulación de la hipoxantina y xantina, que se van eliminando por la orina
Existe una enfermedad hereditaria denominada xanturia que es la falta de xantina oxidasa que impide la formación de ácido úrico, por lo que los productos catabólicos consisten fundamentalmente en xantina, que se depositan en forma de cálculos en el tracto urinario.

la cual aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Si el riñón no funciona bien la urea se acumula en la sangre y se eleva su concentración.
La aspartato aminotransferasa (AST) es una enzima intracelular que se encuentra en niveles altos en el músculo del corazón, las células del hígado, las células del músculo esquelético y en menor cantidad en otros tejidos.
Aunque un nivel elevado de AST en suero no es específico de enfermedad hepática se emplea principalmente para su diagnóstico y seguimiento, junto con otras enzimas como la ALT y ALP. También se utiliza en el control post-infarto, en pacientes con desordenes del músculo esquelético, y en otras afecciones. La AST cataliza la transferencia reversible de un grupo amino del aspartato al α-cetoglutarato con formación de glutamato y oxalacetato. El oxalacetato producido es reducido a malato en presencia de malato deshidrogenada (MDH) y NADH. La alanina aminotranferasa (ALT) cataliza la transferencia de un grupo amino de la alanina al α- cetoglutarato con formación de glutamato y piruvato. El piruvato producido es reducido a lactato en presencia de lactato deshidrogenasda (LDH) y NADH. En la determinación de estas dos enzimas la velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio determinada espectrofotometricamente es proporcional a la c concentración catalítica de la AST y ALT en la muestra.
3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
3.1. Material por equipo
1 gradilla
1 jeringa con aguja estéril de 5 mL
Torundas impregnadas con alcohol
3.2. REACTIVOS
Kit de reactivos para la detección cuantitativa de aspartato aminotransferasa AST (GOT) o un juego de reactivos para la detección cuantitativa de alanina aminotransferasa GTP (ALT)
Para la determinación de aspartato aminotransferasa GOT (AST)
R 1 Tampón
NADH Lactato deshidrogenasa (LDH) Malato deshidrogenasa (MDH) α-Cetoglutarato
0,18 mmol/L 800 U/L 600 U/L 12 mmol/L
Kit de reactivos para la detección cuantitativa de nitrógeno en urea.
R 1 o-Ftalaldehido 4,8 mmol/L

R 2 Solución borato 87 mmol/L
UREA CAL Patrón primario acuoso de Urea 50 mg/dL
Kit de reactivos para la detección cuantitativa de ácido úrico.
3.3. Equipo
Centrífuga clínica
Muestra de orina
Urea en orina: Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilución). Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4.
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera aséptica 5 ml de sangre siguiendo las instrucciones del profesor en un tubo de ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- En un frasco de toma de muestra de orina limpio y seco depositar aproximadamente 50 ml de orina, de preferencia la primera de la mañana.
c.- Determinación de transaminasas
1.- Encender el aparato y seleccionar la longitud de onda de:340 nm
2.- Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3.- Disolver una tableta de R2 (sustrato) en R1 (regulador)
4.- En la celda espectrofotométrica pipetear lo que se indica en el siguiente cuadro.
RT (mL) 1,0 Muestra (µL) 100
5.- Mezclar e incubar por 1 minuto
6.- Leer la absorbancia (As) inicial de la muestra, poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos.
7.- Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto ( A/min).
R 1 Tampón
50 mmol/L 4 mmol/L
60 U/L 660 U/L 200 U/L

Datos
A= As60s – Asinicial
CÁLCULOS:
A/min x 1750 = U/L de AST
Unidades: La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 µmol de substrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se expresa en unidades por litro (U/L).
Valores de referencia orientativos.
d.- Determinación cuantitativa de urea en suero (marca SPINREACT)
1.- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda de 510 nm
2.- Cinética: Preparar una serie de tres tubos como se muestra en el siguiente cuadro
Blanco Patrón Muestra R 1 (ml) 1,0 1,0 1,0 Patrón
(µl) -- 50 --
Muestra (µl) -- -- 50
3.- Mezclar e incubar por un minuto a 35 °C y añadir 1 ml del reactivo (R2) a cada tubo.
4.- Inmediatamente colocar el contenido del tubo a una celda espectrofotometrica y leer la absorbancia a los 60 y 120 s.
5.- Calcular el incremento de Absorbancias As= As 2 – As
1 .
Datos:
CÁLCULOS
( As) muestra ---------------------X 50 (conc. del patrón)= mg/dl de urea en la muestra. ( As) patrón
Orina: de 20 a 35 g/24 horas
e.- Determinación cuantitativa de ácido úrico (marca SPINREACT)
1.- Preparar el reactivo de trabajo, disolviendo el contenido de R2 (enzimas) en el frasco de R1 (regulador), el reactivo así preparado es estable por un mes de 2 a 8 °C o 10 días a temperatura ambiente.

3.- Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
4.- Colocar y etiquetar una serie de tres tubos y adicionar lo que indica la siguiente tabla
Blanco Patrón Muestra RT (ml 1,0 1,0 1,0 Patrón (µl) -- 25 -- Muestra (µl) -- -- 25
5.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37 °C o 10 minutos a temperatura ambiente
6.- Leer la absorbancia (A) del patrón y la muestra, frente al blanco de reactivos. (La reacción es estable por 30 min)
CÁLCULOS:
Recordar que hay que ajustar con agua destilada a cero y luego leer el blanco de reactivos y al valor obtenido de la muestra, restarle el valor del blanco de reactivos.
As de la muestra ______ As del patrón: _______ Concentración del patrón: _______
Suero o plasma
(As) muestra ---------------------X 6 (conc. del patrón)= mg/dl de ácido úrico en la muestra. (As) patrón (As) muestra ---------------------X 6 X vol (dl) orina / 24 h = mg/24 h de ácido úrico en la muestra. (As) patrón
Las siguientes preguntas se deben emplear para fortalecer el reporte.
¿Cuál es la sensibilidad del método utilizado para cada prueba?, ¿Cómo determinamos la sensibilidad analítica? ¿Existen para las determinaciones algunas sustancias que pueden interferir con los valores orientativos de referencia? ¿Por qué en el caso de la urea utilizamos una cinética para la determinación de este parámetro?, ¿Por qué decimos que son valores orientativos de referencia?, dado que estos compuestos nos indican la degradación de proteínas y ácidos nucleicos, Qué interpretación le damos a un aumento o una d disminución de los valores?, ¿Cómo te percatarias que los reactivos ya no son funcionales?
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
Devlin, T. M. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 5ta. Edición. Ed. Reverté. España. 2000. 1298pags.

PRÁCTICA 6
UNIDAD V. Anabolismo celular
Tema: 5.4. Metabolismo de colesterol.
1.- OBJETIVOS 1.1 Objetivo general. El alumno analizará el anabolismo de lípidos mediante la determinación de colesterol.
1.2 Objetivo específico. El alumno realizará la determinación experimental de colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIÓN. El colesterol es un lípido esteroide presente en las células de los tejidos animales, hidrofóbico, poco soluble en medio acuoso, se puede encontrar libre o esterificado con ácidos grasos, se une a diversas proteínas formando las lipoproteínas plasmáticas para ser transportado. La determinación de la concentración plasmática de colesterol tiene gran interés clínico, pues está demostrada la relación entre los niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y cardiopatía isquémica.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en exceso es potencialmente dañino. Su transporte por las lipoproteínas y captura en las células está regulado, pero demasiado colesterol en la sangre lleva a que se acumule, en especial en las arterias a las que puede obstruir (ateroesclerosis).
Los mamíferos pueden obtener el colesterol por dos vías, la exógena y la endógena. La vía exógena es por la ingesta de alimentos de origen animal, como el hígado, lácteos, carnes rojas y yema de huevo. La vía endógena es la biosíntesis de colesterol en el organismo, que se realiza en el retículo endoplásmico liso y cuyo precursor es la acetil-coenzima A. Diariamente el hígado produce alrededor de 800 a 1000 mg de colesterol, aunado a los cientos de miligramos que ingerimos en la dieta, daría una elevada concentración de este, pero la ingesta de colesterol disminuye la síntesis en el organismo.

El proceso de captación inicia con la unión de las LDL que contienen colesterol con lugares de unión específicos en las células, conocidos como receptores proteicos de la membrana plasmática. Las LDL se invaginan en la membrana plasmática y se fusionan como parte de ella para formar una vesícula endocítica. Dentro de la célula, la vesícula se fusiona con los lisosomas, y las enzimas lisosomales catalizan la hidrólisis de los ésteres de ácido graso dejando al colesterol libre para la construcción de membranas. Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles altos de colesterol sanguíneo) es un defecto genético, donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y desarrollan el síndrome conocido como hipercolesterolemia familiar. Esta enfermedad ocasiona que los niveles de colesterol lleguen hasta 700 mg/100 ml, los niveles normales están entre 150-200 mg/100 ml). El colesterol se deposita como placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias), muchos de las personas que padecen esta enfermedad mueren de ataques cardiacos durante su infancia.
En general se promueve en la población reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen factores que no podemos modificar como el genético y el de género: las mujeres tienden a acumular menos colesterol y sus niveles de HDL son más altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades cardiovasculares que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hábito de fumar, el consumo de alcohol, una dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrés, que en su conjunto aumentan los niveles de colesterol y TAG.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO Baño a 25 o 30o C 1 gradilla 5 tubos de 13 x 100 2 pipetas de 2 ml 2 pipetas de 1 ml Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
EQUIPO Espectrofotómetro para luz UV 2 celdas espectrofotométricas 1 porta celdas 1 centrífuga
REACTIVOS Kit para Colesterol
MUESTRA: Obtener 3 ml de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el coágulo durante 5’ a 35 o C y centrifugar durante 7’ a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100 utilizando una pipeta pasteur.Se puede utilizar suero o plasma. La muestra es estable 7 días a 2- 8ºC y varios meses si se mantiene la muestra congelada (-20ºC).

Fundamento: En estos métodos enzimáticos, la primera reacción consiste en la hidrólisis de los ésteres de colesterol por acción de esterasas bacterianas inespecíficas con respecto al ácido graso esterificado; a continuación se produce la oxidación del colesterol (el formado en la reacción anterior y el preexistente, o colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, produciéndose H2O 2, el cual con la participación de peroxidasa da lugar a la formación de un compuesto colorido. El esquema de las reacciones acopladas es el siguiente:
CHE Ésteres colesterol + H
POD 2 O
2 O
→ Compuesto colorido
CHE: Colesterol esterasa CHOD: Colesterol oxidasa POD2O: Peroxidasa

El colesterol es una sustancia presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La determinación del colesterol es uno de las herramientas más importantes para el diagnóstico y clasificación de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
Dependiendo del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las reacciones pueden variar.
REACTIVOS R 1 Regulador
PIPES pH 6,9 Fenol
90 mmol/L 26 mmol/L
300 U/L 300 U/L 1250 U/L 0,4 mmol/L
Patrón de Colesterol 200 mg/dL

PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . 505 nm (500-550) Cubeta o celda. . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC /15-25ºC
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una celda:
Blanco Patrón Muestra
Patrón de colesterol (µL) -- 10 --
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC ó 10 min. a temperatura ambiente. 5. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable durante 60 minutos.
CÁLCULOS
A (Muestra) (x 200 (Conc. Patrón) / Patrón) A = mg/dL de colesterol en la muestra
Factor de conversión: mg/dL x 0,0258= mmol/L.
5.-RESULTADOS
Equipo Colesterol (mg/dl) Equipo Colesterol (mg/dl)

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. Analiza y discute los resultados obtenidos, así como la metodología utilizada. Discute la importancia del uso de las enzimas en el diagnóstico clínico. Contesta las siguientes preguntas e inclúyelas en la discusión.
1.- ¿Cual es la importancia clínica de las determinaciones de colesterol? 2.- Explica 3 enfermedades ocasionadas por la alteración de los niveles de colesterol y que otros parámetros hay que tomar en cuenta. 3.- ¿Por qué los valores de colesterol pueden variar de una localidad a otra? 4.- ¿Por qué la ingesta de colesterol, disminuye la síntesis de colesterol en el hígado? 5.- Investiga 2 fármacos que se utilicen para disminuir la concentración de colesterol en la sangre 6.- ¿Qué enfermedad genética ocasiona la hipercolesterolemia, y que proteína se ve afectada?
7.- CONCLUSIONES. Con el análisis y discusión de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la práctica y la investigación bibliográfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA. Cita la bibliografía consultada para hacer tu reporte.

Practica No 7
Relación con Unidad Temática VI. Aspectos Genéticos del Metabolismo
I. OBJETIVOS El alumno trasferirá material genético a un microorganismo. El alumno verificara que el material genético contiene la información específica.
II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. El DNA (ácido desoxirribonucleíco) es el almacén de la información genética de los seres vivos, en el se encuentran codificadas todas la características que definirán a un ser vivo como miembro de una determinada especie, así como un organismo con características propias individuales.
La expresión de material requiere primero de su amplificación por el mecanismo de transcripción, donde se generan moléculas de RNA que llevan la información genética hacia el sistema donde ésta será decodificada mediante el proceso de traducción, en el, la información es traslocada a una proteína específica, las diversas proteínas generadas por la transcripción y traducción de diversos genes darán origen a los complejos macromoleculares enzimáticos o estructurales que generarán en última instancia las características propias de cada individuo.
Si bien el “pool” genético es propio de cada especie e individuo, en la naturaleza existen diversos mecanismos que permiten el intercambio de material genético entre organismos de modo tal que las características de un individuo así como de su descendencia pueden modificarse y ser expresadas como propias. Desde hace varios años los investigadores han logrado manipular los diversos mecanismos de transferencia de material genético para lograr un fin determinado, intentando incluso la manipulación genética en el ser humano empelando para ello las técnicas modernas de biología molecular.
La transducción, la conjugación y la transformación son las vías, mediante las cuales se puede introducir material genético exógeno a una célula. La transformación genética se presenta cuando, el DNA desnudo es incorporado a la célula, después de esto, el DNA puede o no ser integrado al propio material genético. El material genético puede ser un plásmido que ha sufrido o no la manipulación por el hombre, por lo que podría contener genes de resistencia o de importancia industrial o farmacológica.

En esta práctica se empleará el plásmido pGLO, el cual, contiene el gen para la proteína verde fluorescente, aislada de la medusa Aequorea victoria, (un eucariota), unida al promotor PBAD de arabinosa, el gen ara C , y el gen para resistencia a ampicilina el cual actúa como gen reportero. Éste plásmido se introducirá a una célula bacteriana para dotarla de la capacidad de producir la proteína verde fluorescente (GFP) y se inducirá su expresión con el catabolito arabinosa.
III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS Plásmido pGLO. Solución de transformación con cloruro de calcio estéril. Caldo Luria Medio Luria con Ampicilina (50µg/ml) Medio Luria con Ampicilina y Arabinosa (1mg/ml) Tubos de microensayo de 1.5 ml estériles. Pipetas automáticas de una 1000µl y otra de 10µl Puntas estériles Asa bacteriológica Pipetas estériles de 1ml. Varilla acodada Baño de hielo Baño Maria a 42°C Lámpara de luz UV Incubadora a 37°C
IV. DESARROLO EXPERIMENTAL Todo el trabajo se realizará en condiciones de esterilidad, cerca de un mechero encendido.

14. Tomar 0,1ml de cada tubo y colocarlos en las diferentes cajas de petri según el siguiente esquema: (Usar una pipeta estéril para cada tubo)
Tubo con pGLO Tubo sin pGLO LB + Amp LB + Amp + Ara LB + Amp LB
15. En condiciones estériles, realizar extensión con varilla 16. Etiquetar las cajas e incubar a 37°C, durante 24 horas. 17. Observar las colonias a luz normal y bajo luz UV. Contar el número de colonias en cada caja y bajo los dos tipos de luz.
V. RESULTADOS Anote lo que se pide.
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VI. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Incorpora cada uno de los siguientes puntos en tus análisis y discusión de resultados.
Haz un esquema del DNA y explica como es que la información genética se encuentra almacenada ahí. Haz un esquema de un plásmido, señala sus partes importantes, explica que es y cual es su función, explica también que es un gen reportero y que propiedad confiere el gen. Amp a los organismos que lo poseen. Di cual es el papel de la arabinosa en éste sistema. Di que es la proteína verde fluorescente y que características tiene.
Con pGLO Sin pGLO Medio LB + Amp. LB+Amp+Ara LB + Amp LB No de colonias
Color
Forma
Aspecto
Fluorescencia
Tamaño
Que características tiene el medio LB. Explica que información se desprende de la tabla, explica porque hay diferente número de colonias en cada cuadro, explica el porque de cada resultado. En cuanto a la morfología colonial ¿es igual en los diferentes medios o diferente? di porque. Di que pasa al iluminar con luz UV las placas y porque sucede eso, que fenómeno ocurrió en la columna dos que no ocurrió en la columna uno. Puedes afirmar, que ocurrió incorporación de material genético a las bacterias, explica tu respuesta. Puedes afirmar con estos experimentos que la información genética se encuentra en el DNA, explica tu respuesta. Que te dice el resultado de la frecuencia de transformación, ¿para que nos sirve éste dato? En tu campo para que podrías ocupar este conocimiento, sobre la transfor

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Manual de Laboratorio de Bioquímica Farmacéutica