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. Universidad San Francisco de Quito

Manual del Laboratorio de Biología para Ingenierías

Segundo Semestre 2013- 2014

UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Semestre 2do, año 2013-2014

Instructores: Juan José Guadalupe E-mail: jguadalupe@usfq.edu.ecPablo Riera E-mail:priera@usfq.edu.ecHorario: LMIJV 2:00-5:00 pm

TEMAS A DESARROLLARNo. TEMA

1 Influencia de la concentración en la actividad de la amilasa

2 Fotosíntesis

3 Extracción de ADN

4 Selección Natural

El informe debe ser presentado en la siguiente práctica correspondiente a cada grupo

UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITOLABORATORIO DE BIOLOGÍA PARA INGENIERÍAS

PRÁCTICA No. 1Influencia de la concentración en la actividad de la amilasa

Objetivo:

Observar la acción de la enzima amilasa sobre polisacáridos (almidón) a distintas concentraciones

Comprobar la pre-digestión del almidón mediante el rompimiento de enlaces glucosídicos usando el colorante lugol.

Introducción:La amilasa se encuentra en la saliva de muchos animales, incluyendo seres humanos, que utilizan el almidón como fuente de alimento. El almidón es la principal reserva de carbohidratos de las plantas; éste es un polisacárido compuesto de un gran número de monómeros de glucosa unidos entre sí. Por otra parte, la amilasa es la responsable de la digestión preliminar del almidón. En adición, la amilasa rompe las cadenas de moléculas de almidón para transformarlas en azucares simples, rompiendo los enlaces glucosídicos (1,4) del almidón. Más aún, la digestión de este polisacárido requiere otras enzimas presentes en el páncreas y en las secreciones intestinales.

Para que se facilite observar el proceso de transformación del almidón a maltosa se va a utilizar una solución I2, KI (lugol). Al momento de la implementación de esta solución, se observará cambios en el almidón no así en la maltosa, el cambio que se produce es el viraje de color a púrpura oscuro.

La tasa de desvanecimiento del almidón con distintas concentraciones de amilasa permitirá una medición cuantitativa de la tasa de reacción.

Materiales: Tubos de ensayo de 15 ml 10 tubos de ensayo estándar Lápiz de cera(o etiquetas) Caja de muestra Agua destilada Vaso de precipitación con agua destilada 200ml Cilindro graduado de 5ml Pipeta calibrada de 1ml 2 Pipetas calibradas de 5ml Pipetas Pasteur desechables Pera de succión Solución buffer pH= 6.8 Solución Lugol (I2, KI, H2O). Solución de almidón 1% Solución de amilasa 1%

Procedimiento

Preparar una disolución de amilasa (tubo de ensayo set 1)

a. Numerar 5 tubos de ensayo de 1 a 5

b. Usando los 5mL de la pipeta graduada, añada 5mL de agua destilada en cada tubo.

c. Hacer varias disoluciones de la siguiente manera (use una probeta)

Tubo1: añadir 5mL de amilasa y mezclar frotando el tubo entre sus manos (disolución 1:1; 0.5% de amilasa)Tubo2: añadir 5mL de solución de amilasa del tubo 1 y mezclar (disolución 1:3; 0.25% de amilasa)Tubo3: añadir 5mL de solución de amilasa del tubo 2 y mezclar (disolución 1:7; 0.125% de amilasa)Tubo4: añadir 5mL de solución de amilasa del tubo 3 y mezclar (disolución 1:15; 0.063% de amilasa)Tubo5: añadir 5mL de solución de amilasa del tubo 4 y mezclar (disolución 1:31; 0.031% de amilasa)

Lave correctamente la probeta

1. Preparar los tubos de ensayo (set 2)

a. Numere un segundo set de cinco tubos de ensayo de 1 al 5.

b. Comience con el tubo 5 del primer set, transfiera 2mL de la disolución en el tubo 5 del segundo set. Use una pipeta de 5mL para hacer la transferencia. Lave la pipeta en agua destilada y repita el procedimiento para los tubos 4, 3 y 2 transfiriendo 2mL al tubo 4 del primer set al tubo 4 del segundo set y sucesivamente. Al finalizar todas las transferencias, el tubo 1 del primer set no será utilizado.

c. Añadir 40 gotas de pH 6.8 de la solución buffer a cada tubo in el segundo set, Mezclar los tubos adecuadamente entre sus manos y colocar los tubos a un lado.

d. Añadir de 1 a 2 gotas de lugol a cada compartimiento de las cuatro columnas de la caja de muestras. Se utilizara una columna diferente para cada concentración de amilasa.

e. Usando el segundo set de tubos, proceda con la prueba empezando con el tubo 5 de este set

(1) Utilice una pipeta limpia de 1mL y añada 1mL de la solución de almidón 1% al tubo 5 y mezcle el tubo entre sus manos. Registrar el tiempo (se llamara tiempo 0)

(2) Rápidamente remueva una gota de la mezcla a la pipeta Pasteur desechable, y añadir 1 gota de lugol en el primer compartimiento de la caja de muestra nombrada como tiempo 0.

(3) Testear la reacción de la mezcla en intervalos de tiempo de 10 segundos, cada tiempo usando un compartimiento de la caja de muestras. Continúe hasta que el color azul

desaparezca y el lugol continúe de color amarrillo ámbar (indicador de la digestión del almidón). Registre el tiempo que tomo la digestión del almidón.

(4) Repetir los pasos 1-4 para las otras 4 concentraciones de los tubos 4,3,2 y 1 del set 2 de los tubos de ensayo)

2. Finalice creando la tabla de resultados en la cual se registrara los mismos, y establezca sus conclusiones así como también sus discusiones.

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PRÁCTICA No. 2FOTOSÍNTESIS

Objetivos Visualizar en tiempo real la producción de oxigeno en hojas de espinaca Demostrar la importancia de la fuente de carbono y luz en las plantas la fotosíntesis

Introduccion

La fotosíntesis es un proceso metabólico cuyo objetivo es transformar la energía solar en energía química al formar carbohidratos. Los organismos fotosintéticos, como plantas, algas y cianobacterias son llamados autótrofos ya que producen su propio alimento. En términos generales el proceso involucra la liberación de oxígeno, la utilización de dióxido de carbono y luz para la síntesis de compuestos orgánicos:

CO2 + H2O + LUZ C6H12O6 + H2O + O2

El proceso de fotosíntesis se lleva a cabo en los cloroplastos, los cuales constan de una membrana externa, otra interna y una serie de sacos denominados tilacoides. El espacio que se encuentra al interior de este organelo está cubierto por un fluido denominado estroma.La fotosíntesis consta de dos etapas. En la primera, denominada Etapa Lumínica, la cual se inicia cuando los pigmentos, que se encuentran en las membranas de los tilacoides, absorben diferentes longitudes de onda de la luz, desencadenando una secuencia de transporte de electrones, en cuyo proceso se sintetiza ATP (Adenosin Trifosfato) y se reduce NADP+ (Nicotiamida- Adenina Dinucleotido fosfato), formándose el NADPH, otro producto de la etapa lumínica es el oxígeno. En la segunda etapa, Fijación del Carbono, se sintetizan glúcidos a partir del CO2 junto con los productos de la etapa anterior. En esta etapa se realiza el Ciclo de Calvin. La enzima que interviene se denomina RuBisCO (Rubolosa bisfosfato carboxilasa-oxigenasa) y está encargadas de fijar el CO2 atmosférico para producir glucócidos. El NADPH+ H+ actúa como agente reductor en la fijación de carbono para la formación de hexosas, de esta manera al oxidarse (donar sus electrones al CO2) puede continuar el ciclo como NADP+

Tomado de:Curtis, Barnes, Schnek y Massarini. Biología de Curtis. Séptima edición. Editorial Médica Panamericana. 2008.

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La fotosíntesis permitió la evolución de la vida en la tierra convirtiendo la atmósfera anoxigénica, permitiendo la aparición de organismos que usan oxigeno para vivir.

Objetivos

Comprender la importancia del Carbono y la luz para el proceso de la Fotosíntesis Visualizar la producción de oxigeno producto de la fotosíntesis de hojas de espinaca

Materiales

Agua Perforadora Hojas de espinaca Solución de Bicarbonato de sodio 0.2M Pinzas Jeringa 10cm3

Fuente de Luz Soporte para tubos

Procedimiento

Usando la perforadora hacer 20 discos de hoja de espinaca previamente sumergidas en agua toda la noche (se usan las hojas más oscuras)

Dentro de la jeringa colocar los discos, con la ayuda de las pinzas llevar los disco al fondo de la jeringa

Añadir el émbolo de la jeringa y empujar casi hasta llegar al fondo Tomar 10 cm3 de la solución de bicarbonato de sodio Tapando la punta de la jeringa con el dedo, usar el émbolo para sacar todo el aire de

la jeringa y de los discos, en este paso los disco perderán su flotabilidad y caerán al fondo de la jeringa

Cuando todas las hojas hayan llegado al fondo expulsar la solución de bicarbonato de sodio de la jeringa

Absorber 10 cm3 de agua sin bicarbonato en la jeringa que contiene los discos Colocar la jeringa en el soporte para tubos sobre la fuente de luz y esperar a que 5

de los discos floten (debido a la producción de oxígeno) por arriba de los 5 cm3

Llenar la tabla 1 que se presenta a continuación

Tabla 1.-

Con Luz / Con Luz / Sin Sin Luz / Solución Sin Luz / Sin

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Solución de Bicarbonato

Solución de Bicarbonato

de Bicarbonato Solución de Bicarbonato

Observaciones

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PRÁCTICA No. 5Extracción de ADN

PROTOCOLO CASERO PARA EXTRACCION DE ADN DE CEBOLLA

Objetivos

Comprender la importancia de aislar material genético de una célula como la premisa de la realización de estudios moleculares

Conocer los principios básicos de una metodológica de extracción de ADN casera

 Introducción

El ADN es una molécula que se encuentra en todas las células de los seres vivos, sean estos procariotas o eucariotas. Es una molécula larga que forma una doble hélice, compuesta de subunidades llamadas nucleótidos y cada nucleótido consta de tres partes: un grupo fosfato, una azúcar denominada desoxirribosa, y una de cuatro posibles bases nitrogenadas, que son adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). El ADN es una molécula formada por dos hebras que se encuentran unidas por enlaces débiles (puentes de hidrógeno) entre las bases nitrogenadas.

Para entender la importancia del ADN, es necesario entender qué es un gen. Dentro de la cadena de ADN existen regiones que codifican o crean proteínas y regiones que no, las regiones que codifican para hacer proteínas se denominan genes. Dentro de una cadena de ADN, la secuencia de bases nitrogenadas puede variar de un individuo a otro, y es por esto que el código de ADN es único para cada individuo. Para entender mejor esto se puede hacer una analogía con las letras y el lenguaje; depende de la disposición de las letras para formar palabras y dependiendo de la disposición de las letras formarán diferentes palabras que tendrán diferentes significados. De manera similar, un gen debe tener las bases correctas en secuencia adecuada. Así como “afecto” y “efecto” tienen diferentes significados y “ofecto” no significa nada, las distintas secuencias de las bases de ADN pueden codificar diferentes tipos de información formando diferentes tipos de características como el color de los ojos, tipo sanguíneo, el color de las flores, forma de alas, entre muchas otras características.

Siendo el ADN una molécula tan importante y tan llena de información, surgen diferentes usos en diversas áreas como la medicina para el diagnóstico de enfermedades, la ecología para determinar la diversidad de una especie dentro de una población, investigación forense para identificación de individuos de interés en investigaciones criminales, biotecnología en técnicas como ingeniería genética, etc.

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Materiales

Cebolla fresca Papaya Mortero Papel filtro de café Pinza Tubo de vidrio largo con boca ancha

Reactivos Detergente/solución de sal:

o 20 ml detergente (para lavar ropa) o 20 g NaCl o 180 ml agua destilada

10 mL de jugo de papayao (para que el jugo de papaya no esté con impurezas es importante cernirlo

con un papel filtro para café) Solución salina al 5% (NaCl)

 Metodología.-

Macerar una porción de cebolla en un mortero junto con 50 mL de detergente/solución de sal

Filtrar la mezcla con un filtro para café y colocarla en un tubo de vidrio largo Colocar los 10 mL de jugo de papaya en el tubo de vidrio y mezclar suavemente Colocar 20 mL de etanol al 70% a 10-12°C y dejarlo reposar de 1 a 5 minutos, esto servirá

para separar el ADN del resto de compuestos. Pronto se podrá observar que el ADN empieza a flotar entre la capa de etanol y la mezcla anterior.

Para poder recuperar el ADN es necesario usar una pinza, para trasladarlo a un tubo eppendorf en donde se le agregara 1000 uL de Solucion salina al 5% para conservarlo.

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PRÁCTICA No. 3SELECCIÓN NATURAL

Objetivos

Observar en un periodo corto de tiempo el proceso de evolución mediante selección natural

Conocer la importancia de la selección natural como un principio de la Evolución

Introducción

Se sabe por el registro fósil que las especies cambian (evolucionan) a través del tiempo. Darwin argumentó y ha sido subsecuentemente confirmado, que el principal mecanismo para el cambio evolutivo es el proceso de la selección natural. Dado que la teoría de evolución es el principio unificante más importante en biología, la importancia de entender la selección natural es obvia. El problema es que bajo la mayoría de condiciones los procesos son relativamente lentos, y ocurren después de varias generaciones. A excepción de organismos como las bacterias, las cuales bajo presión de selección (antibióticos), pasan por procesos de adaptación en poco tiempo gracias a tiempos cortos de generación. Así, en estos organismos se puede observar selección únicamente de aquellos que puedan tolerar los antibióticos

Afortunadamente, con modelos de simulación se puede estudiar la selección natural de manera fácil y rápida. Por muchos años los biólogos han usado simulaciones como una herramienta para el entendimiento de los procesos ecológicos y evolutivos. Estas simulaciones pueden ser extremadamente complejas y requieren el uso de una computadora, o pueden tomar la forma de “juegos” relativamente simples. En este laboratorio se propondrá un juego que simula la interacción entre predadores y presas en varias generaciones. Al final de este ejercicio se deberá entender de mejor manera cómo la selección natural cambia el componente genético en una población.

Factores importantes para que la selección natural ocurra

Variabilidad: Los individuos dentro de una misma población deben ser diferentes unos de otros. Estas diferencias pueden involucrar características como la resistencia al frío, la susceptibilidad a enfermedades, la eficiencia de fotosíntesis, la habilidad de atraer parejas, para nombrar algunas.

Heredabilidad: parte de la variabilidad entre individuos debe tener una base genética. Así, la descendencia se asemejará a los padres y tendrá los mismos atributos.

Reproducción diferencial: Los individuos con ciertas características dejarán más descendencia que otros. Puede ser porque sobreviven más (animales más rápidos son mejores escapando de predadores) o porque tienen un tasa de reproducción más alta (aves con plumajes más coloridos podrían atraer más al sexo opuesto).

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Bajo estas condiciones las características de los individuos más exitosos se volverán más comunes en la población. De hecho, el ambiente seleccionará a estas características sobre las demás. Este proceso de reproducción diferencial de los individuos más aptos en una población es la selección natural.

En esta simulación se observará la evolución por selección natural de dos características, camuflaje en una población de presas y la agudeza visual en predadores. Cada individuo en la población tiene un número que indica la efectividad de su camuflaje (en el caso de presas) o visión (en el caso de predadores). Durante la simulación, los individuos que sobrevivan se reproducirán periódicamente. Como en la naturaleza, la descendencia es similar, pero no idéntica, a sus padres. En esta simulación, la selección resulta de la mortalidad diferencial; las presas con un camuflaje pobre son más propensas a morir a manos de predadores y los predadores con poca agudeza visual son más propensos a morir de hambre.

Materiales

Tablero del juego Fichas diferenciadas para predadores y presas Calculadora

Métodos

Inicialmente asegurarse de tener 16 fichas de predadores y 16 fichas de presas (cada ficha estará marcadas, según la Tabla 1, con números del 2 al 8 según la agudeza visual de cada depredador o la capacidad de camuflaje de cada presa. Las piezas de los predadores tendrán también un número que indica la generación a la que pertenecen) (Figura 1)

Figura 1. Esquema de cómo debe ser una ficha de predador y de presa.

Predador Presa

Preguntas ¿Cuál es el promedio de valores iniciales de camuflaje en la población de presas?¿Cuál es el promedio de valores iniciales de agudeza visual en la población de predadores?

Una persona en cada grupo estará encargada de tomar los datos, otra persona se encargará de dictar la distribución aleatoria de los mismos según la tabla que se les entregará en clase.

En la primera ronda se colocarán las fichas en el tablero según la distribución dictada por la persona encargada.

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Puntaje de agudeza visual

Generación

4 Puntaje de camuflaje

Después de que las fichas que representan a ambas poblaciones han sido situadas en el tablero, los predadores tendrán la oportunidad de comer y de reproducirse únicamente si existen presas en el mismo espacio (cuadro) con menor valor de camuflaje que la agudeza visual del predador. Después de comer el predador se reproduce y la presa es eliminada del tablero.

o Si existen dos predadores en el mismo espacio, el que tenga mayor agudeza visual comerá.

o Si hay dos presas, la que tenga peor camuflaje será comida.o Un predador solo puede alimentarse de una presa, se alimenta y se

reproduce.o Al alimentarse el predador se reproducirá dando lugar a 2 descendientes, uno

con un número mayor al del padre y el otro con un número menor.o Si existen presas aún en el cuadro, la descendencia podrá alimentarse y

reproducirse en el mismo turno si su agudeza visual se lo permite.o Se debe marcar a cada descendiente con la ronda a la que pertenece.

En la primera ronda los predadores que no han comido no morirán de hambre. Todas las presas que se encuentren vivas y que se encuentre solas en su sitio se

reproducirán de igual manera dando lugar a un individuo con un puntaje mayor y a otro con un puntaje menor.

Segunda Ronda Quitar todas las fichas del tablero y posicionarlas nuevamente al azar, los

predadores comen y se reproducen al igual que en la primera ronda pero los que nazcan llevarán el número 2 indicando que nacieron en la segunda ronda.

Si al finalizar esto quedan predadores que no han comido, éstos mueren y son retirados del tablero; así todos los predadores que queden en el tablero que tengan el número 0 (que indica que estuvieron desde el inicio) serán eliminados.

Las presas se reproducen al igual que en la ronda anterior. Se toman los datos.Seguir con una tercera, cuarta y quinta ronda. Al final de cada ronda se deben calcular los promedios de agudeza visual para los

predadores y de camuflaje para las presas y registrarlos en la Tabla 2. En la última ronda (quinta ronda) llenar la Tabla 3. Finalmente, graficar en las Figuras 3los datos obtenidos con el fin de comparar

visualmente las poblaciones en las diferentes generaciones (rondas).

Preguntas:

1. ¿Existió un aumento o una disminución en la capacidad de camuflaje en las presas desde la generación (ronda) 0 hasta la quinta generación? ¿A qué atribuye el cambio registrado?

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2. ¿Existió un aumento o una disminución en la agudeza visual en los predadores desde la generación (ronda) 0 hasta la quinta generación? ¿A qué atribuye el cambio registrado?

3. ¿Cuáles son los factores de selección que actuaron en la evolución de las poblaciones estudiadas?

Tablas

Tabla 1. Distribución inicial de frecuencias para las características en las poblaciones de predadores y presas

Valores de camuflaje / visión # de fichas presas # de fichas predadores

Pésimo 2 1 13 2 24 3 35 4 46 3 37 2 2

Excelente 8 1 1Total # piezas: 16 16

Tabla 2 : Anotar el puntaje promedio y el número de individuos vivos al final de cada ronda

POBLACIÓN PRESAS POBLACIÓN PREDADORESRONDA Promedio

camuflaje# individuos

vivosPromedio

agudeza visual# individuos

vivos0 5.0 16 5.0 1612345

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Tabla 3.- Anotar los resultados finales de puntajes de presas y predadores en la quinta ronda y luego graficarlos en la Figura 3.

Puntaje # Presa # Predadores0123456789101112131415161718

Figura 1. Distribución inicial y final (Hacer) de los valores de camuflaje en las presas y de agudeza visual en los predadores

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Figura 3.- Comparación del promedio de agudeza visual de predadores y de camuflaje de presas por generaciones y tamaño de población de predadores y presas

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Anexo No. 1: Modelo del Informe de Laboratorio

El informe debe constar de un máximo de 4 páginas y debe incluir:

INTRODUCCIÓN Basado en información bibliográfica especializada, indique el o los principios científicos en que se fundamenta el tema de la práctica. Haga una reflexión sobre la importancia que tendría la práctica en términos de aprendizaje, y aplicación futura en la producción o para estudiar y entender los fenómenos biológicos de las plantas. Redactar en tiempo presente e impersonal y citar a los autores de la bibliografía consultada.

METODOSDescribir los procedimientos (a manera de párrafo) usados en la práctica. La descripción del procedimiento se debe hacer en tiempo pasado e impersonal (ej. Se preparó).

RESULTADOSPresentar los datos obtenidos en la práctica usando cuadros, tablas, figuras o fotos. Cada uno de éstos debe estar identificado con un número en forma secuencial creciente, y un título, por ejm: Cuadro No. 1.- Número de explantes brotados; Cuadro No. 2; ..... etc. Figura No. 1; Foto No. 1, etc. La información contenida en los cuadros, tablas, figuras o fotos debe ser descrita en forma concisa y usando el tiempo pasado, haciendo referencia al número del cuadro, figura, tabla o foto del (la) cual se está hablando.

DISCUSIÓNEs la interpretación de los resultados a la luz de los conocimientos científicos vigentes. Se debe hacer uso extensivo de bibliografía especializada a la cual se debe también identificar por medio de una cita entre paréntesis (Ejm. Arias, 1990). Escribir en tiempo presente e impersonal.

CONCLUSIONESCitar los aspectos más relevantes encontrados con la realización de la práctica y que merecieron especial atención durante la discusión. Son sentencias cortas en tiempo presente.

BIBLIOGRAFÍACitar en orden alfabético de autor los libros, artículos de revistas, o páginas web de donde se obtuvo la información usada para realizar el informe. Los datos a consignar son:

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