Manual

UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO1. EDICION

MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA I

MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Miguel Angel Aguayo Lpez FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Rector

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO Ramn A. Cedillo NakaySecretario General Francisco I. Lepe Aguayo Director General de Educacin Superior Jos Gerardo Cerrato Oseguera Delegado Regional No. 4

MICROBIOLOGIA I

Carlos Eduardo Monroy Galindo Director General de Planeacin y Desarrollo Institucional LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Daniel Jaramillo Cano Director del 2009 1. EDICION Plantel Mario Alberto Gaitn Hinojosa Coordinador del PE de QFB Joel Vzquez Galindo Coordinador Acadmico del PE de IQA Valentn Ibarra Galvn Coordinador Acadmico del PE de IQM Ana Lilia Peraza Campos Coordinadora Acadmico del Programa de Posgrado ESTUDIA -LUCHA-TRABAJA Patricia Campos Pulido Asesora Pedaggica Ma. Rosario Moreno Vjar Secretaria Administrativa MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

MANUAL DE PRACTICASSEPTIMO SEMESTRE

Qumico Farmacutico Bilogo

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Miguel ngel Aguayo Lpez Rector Ramn A. Cedillo Nakay Secretario General Juan Calos Ynez Velazco Coordinador General de Docencia Carlos Eduardo Monroy Galindo Director General de Educacin Superior Jos Gerardo Cerrato Oseguera Delegado Regional No. 4 Martha Alicia Magaa Echeverra Director General de Planeacin y Desarrollo Institucional Daniel Jaramillo Cano Director del Plantel Mario Alberto Gaitn Hinojosa Coordinador del PE de QFB Patricia Campos Pulido Asesora Pedaggica Juan Carlos Morales Ramrez Secretario Administrativo Mario Alberto Gaitn Hinojosa Profesor de la Materia


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INDICECLAVE No. DE PRACTICA NOMBRE DE LA PRACTICA PRESENTACIN Observaciones Generales en el Laboratorio Precauciones Generales en el Laboratorio de Microbiologa Medidas de Bioseguridad Elementos propuestos para que integran una prctica de laboratorio Introduccin al Laboratorio de Bacteriologa Manejo del Microscopio Preparacin del Material de Laboratorio. Citologa Microbiana Preparacin de Frotis y Fijado. Tincin de Bacterias. Coloracin Simple. Tincin Negativa de Microorganismos. La Tincin de Gram. Tincin de Ziehl-Neelsen. Estudio de la Motilidad de Microorganismos. Movilidad de las Bacterias. Demostracin de Vacuolas Grasas. Demostracin de los Grnulos Metacromticos (Volutina) Demostracin de las Endosporas de las Bacterias. Demostracin de las Cpsulas Bacterianas. Tincin para Flagelos. Demostracin del Ncleo y de la Morfologa General de las Levaduras. Tamao y Forma de Algunas Bacterias. Morfologa Colonial y Desarrollo de Diferentes Medios. Caracterizacin Citolgica de Una Bacteria de Identidad Desconocida. Nutricin Bacteriana Nutricin de los Microorganismos. Diferencias Metablicas de las Bacterias. Destruccin e Inhibicin Bacteriana DB-1 DB-2 DB-3 DB-4 DB-5 DB-6 EB-1 EB-2 EB-3 EB-4 EB-5 EB-6 EB-7 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Efectos de los Agentes Enzimticos sobre las Bacterias. Efectos del Calor y pH en la Supervivencia de las Bacterias. Efectos Qumicos Sobre las Bacterias. Sensibilidad a los Antibiticos. Los Efectos de la Presin Osmtica en los Microorganismos Agentes Bactericidas y Bacteriostticos Exoenzimas y Endoenzimas Bacterianas Produccin de Sulfuro de Hidrgeno por los Microorganismos. Demostracin de la Produccin de Indol. Ensayo de Rojo de Metilo-Vogues Proskauer Deteccin de la Catalasa en las Bacterias. Produccin de Hemolisinas. Reduccin del Azul de Metileno. Reacciones Enzimticas Microbianas 109 112 118 123 128 131 134 137 140 143 146 149 152 PAGINA 7 9 10 12 14 16 22 28 35 40 45 53 57 61 64 68 72 77 80 84 88 93 99 101 106

IL-1 IL-2 CM-1 CM-2 CM-3 CM-4 CM-5 CM-6 CM-7 CM-8 CM-9 CM-10 CM-11 CM-12 CM-13 CM-14 CM-15 CM-16 NB-1 NB-2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGACLAVE CM-1 CM-2 MA-1 MA-2 No. DE PRACTICA 34 35 36 37 NOMBRE DE LA PRACTICA Ecologa de los Microorganismos Mtodos de Cuantificacin de Microorganismos La Curva de Crecimiento Bacteriano. Algunas Tcnicas de Microbiologa Aplicada Cultivo de Microorganismos Anaerobios Mtodos Para Obtener Cultivos Puros BIBLIOGRAFIA ANEXO I. Reactivos Empleados en el Manual ANEXO II. Tinciones Empleados en el Manual Anexo III. Medios de Cultivo Empleados en el Manual PAGINA 161 166 173 176 181 182 185 188


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NOMBRE DEL ALUMNO(s) Y NUMERO DE CUENTA

FACULTAD AO GRUPO SEMESTRE PRACTICAS APROBADAS PROMEDIO MAESTRO


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PRESENTACION La Microbiologa es una disciplina extraordinariamente amplia, que abarca especialidades tan diversas como la bioqumica, la biologa celular, la gentica, la taxonoma, la bacteriologa de patgenos, la microbiologa industrial y de alimentos y la ecologa. Los estudiantes ajenos al tema necesitan una introduccin al conjunto antes de concentrarse en aquellas partes que ms les interesen. Este manual aporta una introduccin a las reas ms importantes de la microbiologa, adecuado a estudiantes de diversa procedencia. Gracias a esta adecuacin, el manual readapta a asignaturas con una orientacin que puede variar desde la microbiologa bsica hasta la microbiologa mdica. No solo ser til para estudiantes de Qumico Farmacutico Bilogo sino tambin para otras ciencias de la salud. No se exagera al destacar la importancia de la microbiologa. La sociedad humana se beneficia de los microorganismos de muchas formas. Son necesarios para la elaboracin de pan, queso, cerveza, antibiticos, vacunas, vitaminas, enzimas y otros productos importantes. De hecho la biotecnologa moderna se fundamenta en principios microbiolgicos. Los microorganismos son componentes indispensables de nuestro ecosistema; gracias a ellos, se desarrollan los ciclos del carbono, oxgeno, nitrgeno y azufre, que tienen lugar en los sistemas terrestres y acuticos. La primera persona que observ y describi con rigor cientfico los microorganismos fue el microscopista aficionado Anthony van Leeuwenhoek de Delft, Holanda en 1670. Sin embargo, Louis Pasteur logr el mayor reconocimiento de la relacin entre microorganismos y enfermedades. El objetivo general del manual de microbiologa es que los alumnos se familiaricen con el conocimiento biolgico de los microorganismos, su forma, estructura antignica, reproduccin, fisiologa, metabolismo e identificacin, como estn distribuidos en la naturaleza, sus relaciones con otros seres, los efectos benficos y perjudiciales que ejercen sobre el humano y las alteraciones fsicas y qumicas que provocan en su medio. Asimismo es importante que el estudiante adquiera habilidades y destreza en el manejo de microorganismos en el laboratorio. En virtud de que este manual esta dirigido a estudiantes de las ciencias de la salud y manejarn microorganismos en la realizacin de las prcticas experimentales, es de vital importancia incluir al principio recomendaciones generales relacionadas con los lineamientos generales del laboratorio y los principales procedimientos que deber de aprender, as como las medidas de bioseguridad indispensables para que sean capaces de manipular los microorganismos en forma adecuada sin comprometer su seguridad ni la de sus compaeros.


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El manual de prcticas est compuesto de 37 experimentos, de los cuales 10 estn diseados para que se familiarice con los procedimientos de cultivo y aislamiento de bacterias y levaduras. Estas 10 prcticas estn priorizadas para realizarse de acuerdo al programa terico de la materia de Microbiologa que se lleva a cabo en el sptimo semestre de la carrera de Qumico Farmacutico Bilogo en la Facultad de Ciencias Qumicas dependiente de la Universidad de Colima. Cada parte experimental contempla los objetivos generales y particulares, una introduccin para una mejor comprensin del tema a tratar, material y reactivos a utilizarse as como el procedimiento para la realizacin de la prctica, complementndose con figuras, cuadros, cuestionario y bibliografa recomendada. Como parte complementaria del manual de Microbiologa se presentan en forma de anexos, la preparacin de soluciones, tinciones (anexo I) y medios de cultivo (anexo II) indispensables para la elaboracin de cada una de la prcticas. Finalmente, considero que el manual ser una herramienta indispensable tanto para maestros del rea como alumnos para complementar el contenido terico de la materia, ya que fue elaborado de acuerdo al material y reactivos de laboratorio que se disponen en un almacn comn del rea de la salud, la infraestructura del laboratorio de Microbiologa y a la programacin semestral del curso con 3 horas prcticas por semana. M. en C. Mario Alberto Gaitn Hinojosa Coordinador del PE de QFB.


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OBSERVACIONES GENERALES 1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas para el trabajo correcto del laboratorio. 2. Todos los alumnos deben usar permanentemente una bata de laboratorio limpia y abotonada durante el tiempo que est en el interior del laboratorio. 3. Est absolutamente prohibido: fumar, ingerir lquidos (agua, refresco, etc.) o comer dentro del laboratorio as como ponerse cosmticos ni tocarse la cara con las manos o algn otro objeto. 4. No deber sacar del laboratorio equipo, cepas o medios de cultivo contaminados. 5. No poner ropa o libros sobre la mesa de trabajo, ni guardar material de laboratorio (cultivos) en las bolsas de las batas. 6. Los membretes o etiquetas deben ser humedecidos con agua y no con la lengua. El asa y porta-asa deben ser esterilizados en la flama antes y despus de su utilizacin. Calentar el asa verticalmente (no horizontalmente). Si esta cubierta con algn material, squese al lado de la flama antes de esterilizarla para evitar el chisporroteo del material y su diseminacin. 7. Al inicio y al final de la prctica limpiar y descontaminar las mesas de trabajo y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado. Colocar todo el equipo en su sitio. 8. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabn germicida y abundante agua una vez terminada la prctica, incluso si sale antes de la terminacin de la misma por breves momentos. 9. No se permite la visita personal de personas ajenas a la prctica ya que puede ocasionar distraccin del estudiante poniendo en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza. PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO 1. Comprobar que las llaves del gas y del agua estn cerradas antes de salir del laboratorio. 2. En caso de cualquier accidente personal (herida personal o incendio) o del material de trabajo, notifquese inmediatamente al maestro o al instructor. En caso de derrame de caldos o medios de cultivo debe primero conservar la calma y colocar servilletas o toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin y verter abundante solucin desinfectante sobre las toallas como cloro, yodo, fenol o benzal en cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya contaminado. Dejarlo actuar por lo menos 30 minutos,


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA retirar las toallas y tirarlas en el contenedor destinado a la eliminacin de material contaminado. 3. No se debe pipetear con la boca. Usar siempre pipetas automticas o micropipetas. 4. Todos los procedimientos se deben efectuar con cuidado para no formar aerosoles o contaminar reas limpias. De preferencia hay que trabajar en una campana de flujo laminar. 5. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente con un desinfectante despus de trabajar con muestras clnicas, material contaminado y animales infectados. 6. Todo el material sucio debe ser manejado con guantes. 7. Hay que separar las pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados del resto de material sucio y colocarlos en un contenedor punzocortante. 8. A todo el material contaminado de desecho se le deben quitar etiquetas y cintas adhesivas; se colocan en bolsas rojas para que no derramen los caldos o el agar fundido y se colocan en un carro para su transporte al rea de esterilizacin. 9. Las pipetas contaminadas se sumergen en una solucin de hipoclorito de sodio durante 30 minutos. PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA La sangre y los lquidos corporales de los pacientes o estudiantes deben considerarse infecciosos. 1. Todas las muestras de sangre y lquidos corporales deben guardarse en un recipiente adecuado con tapn para evitar su derrame durante el transporte. Hay que tener precaucin cuando se recoja cada muestra para evitar la contaminacin del exterior del recipiente y de la etiqueta que acompaa la muestra. 2. Todas las personas que analicen sangre y muestras de lquidos corporales deben llevar guantes. Ante la posibilidad de un posible contacto de la mucosa con sangre o lquidos corporales del paciente, es necesario el uso de mascarilla y gafas protectoras. Hay que cambiarse de guantes y lavarse las manos despus de tomar la muestra. 3. En anlisis rutinarios, como estudios histolgicos y anatomopatolgicos o cultivos microbiolgicos, no es necesario utilizar una cabina de seguridad. Sin embargo, estas cabinas deben emplearse cuando realicen anlisis de muestras con una posibilidad importante de generar aerosoles, por ejemplo en una agitacin intensa. 4. Hay que utilizar pipetas automticas para manipular todos los lquidos en el laboratorio. No se debe pipetear con la boca.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 5. Hay que limitar el uso de las jeringas y agujas a situaciones en las que no haya otra alternativa, y siempre hay que seguir las recomendaciones generales para evitar lesiones con agujas. 6. Hay que descontaminar todas las superficies de trabajo con un germicida qumico apropiado despus de un derrame de sangre y otros lquidos corporales y cuando se haya finalizado el trabajo. 7. Los materiales contaminados empleados en las pruebas de laboratorio deben limpiarse y descontaminarse antes de ser reprocesados, o bien, guardarlos en bolsas y eliminarlos de acuerdo con la norma para residuos infecciosos. 8. El equipo de laboratorio que se haya contaminado con sangre u otros lquidos corporales deben descontaminarse y limpiarse. 9. Todas las personas deben lavarse las manos despus de finalizar las actividades de laboratorio y quitarse la bata antes de dejar el laboratorio. 10.No se debe comer, beber ni fumar en el rea de trabajo.Fuente: Morbidity and mortality weekly report, 36 5S-10S, 1987, Center for Disease Control and prevention Guidelines.

Material indispensable que deber traer el estudiante por sesin. 1. Bata blanca de laboratorio. 2. La prctica a realizarse.


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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Las medidas de bioseguridad que deben seguirse en un laboratorio de Microbiologa y que deben considerarse las ms importantes se describen a continuacin: 1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas mencionadas anteriormente como observaciones generales en la hoja anterior, reglas establecidas para el trabajo correcto del laboratorio. 2. Se debe verificar diariamente la temperatura de la incubadora y de la estufa bacteriolgica y del estado de los aparatos que se utilizan en el laboratorio. 3. Hay que usar permanentemente la bata de laboratorio. Debe estar expresamente prohibido el consumo de alimentos y bebidas, as como fumar y aplicarse cosmticos. 4. Antes y despus de la jornada de trabajo, limpie y descontamine las mesas y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado. 5. No se debe utilizar el TELEFONO CELULAR dentro de las prcticas de laboratorio. 6. No guardar alimentos en el refrigerador de sustancias contaminantes o qumicos. 7. No se debe pipetear con la boca. Use siempre pipetas automticas o propipetas. 8. Todos los procedimientos se deben realizar con cuidado para no formar aerosoles o contaminar reas limpias. De preferencia hay que trabajar en una campana de flujo laminar. 9. Emplee mascarillas y cubrebocas durante procedimientos que puedan generar salpicaduras aerosoles- de sangre u otros lquidos corporales. 10. Evite deambular con los elementos de proteccin personal por fuera de su sitio de trabajo. 11. Utilice un par de guantes. 12. Abstngase de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento. 13. Evite accidentes y avise de inmediato si esto ocurre. Debe limpiarse con soluciones de yodo, cloro, fenol o benzal cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya contaminado. En caso de derrame de sangre u otros lquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio al 6% (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; despus limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentracin y realice limpieza con agua y jabn. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, cubreboca y bata. 14. En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro lquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos. 15. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente son jabn germicida o desinfectante despus de trabajar con muestras clnicas, material contaminado y animales infectados. 16. Todo el material sucio debe manejarse con guantes.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 17. Hay que separar las pipetas, cajas de petri y tubos de rosca contaminados del resto de material sucio. 18. Colocarlas cubreobjetos y portaobjetos en el contenedor de punzocortantes. 19. Abstngase de doblar o partir manualmente cualquier material punzocortante. 20. A todo el material contaminado de desecho se le debe quitar etiquetas, cintas adhesivas o despintarlos; se colocan en cubetas con solucin desinfectante (cloro diluido), despus de ser esterilizado para su posterior lavado. El material contaminado como agar se colocan en las bolsas rojas que lo identifique con el smbolo de RPBI y se depositan en el congelador del rea temporal para RPBI. 21. Las pipetas contaminadas se sumergen una solucin de hipoclorito de sodio durante 30 minutos. 22. En caso de accidente con material punzocortante reportar inmediatamente al maestro.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA ELEMENTOS PROPUESTOS PARA QUE INTEGREN A UNA PRCTICA 1. Portada de presentacin 2. Nmero de la prctica 3. Titulo 4. Objetivo de la prctica 5. Materiales (equipos, sustancias, aparatos, implementos, etc.) 6. Introduccin terica 7. Procedimiento o desarrollo 8. Cuestionario 9. Observaciones 10. Resultados 11. Discusiones 12. Conclusiones 13. Bibliografa 14. Vo. Bo. 15. Lugar y fecha Explicacin detallada sobre cada uno de los posibles elementos: Portada de presentacin con los siguientes datos: Nombre de la institucin: Universidad de Colima Nombre de la facultad: Facultad de Ciencias Qumicas Nombre de la carrera: Qumico Farmacutico Bilogo Nombre y nmero de la prctica Nombre del alumno Manual de prcticas de (Nombre de la Materia) Semestre Catedrtico Fecha de elaboracin. Nmero: Es l numero consecutivo que le corresponde a cada una de las prcticas Titulo: Se refiere al nombre que se le asignar a la prctica y que tiene la funcin de indicarnos de forma sinttica en que consistir el trabajo prctico que se va a realizar. Objetivo: En ste elemento se van a especificar claramente las acciones, habilidades, actitudes y destrezas que se pretende que adquiera o desarrollen los alumnos con la realizacin de la prctica, y que sin duda sern factor importante en su formacin profesional. Materiales: Es un listado de todos los elementos materiales necesarios que se van a utilizar en la realizacin de la prctica, como son: sustancias qumicas, implementos y consumibles as como, equipos especficos y aparatos especiales con sus respectivas caractersticas. Introduccin terica: Comprende una breve descripcin terica sobre el tema en particular del que se va a realizar la prctica correspondiente, as como su relacin con algunos otros temas de la forma ms concisa posible. Tratando de mostrar un panorama o marco referencial que le da sustento sobre la actividad a realizar. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 14

Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Procedimiento o desarrollo: Debe contener una serie de indicaciones o pasos secuenciados para poder realizar la prctica de la mejor manera posible sin descuidar todas las observaciones, sugerencias, esquemas, comentarios o notas pertinentes sobre los pasos o partes del procedimiento a realizar de ser necesarios. Cuestionario: Se integre con una serie de preguntas relacionadas con la introduccin terica, adems preguntas sobre las observaciones y los resultados obtenidos de la realizacin de la prctica. Se integran dos tipos de preguntas: preguntas de complementacin y por ltimo, preguntas de opcin mltiple, en las cuales se tenga que reflexionar; para contestar sta ltima, cada pregunta puede incluir una o varias opciones como respuestas. Deben responder el cuestionario ya que es parte de la evaluacin de la prctica. Observaciones: En este elemento se incluyen todos los dibujos, comentarios a situaciones importantes que resultaron decisivas durante la realizacin de la prctica. Resultados: Es el producto final que se obtiene de realizar adecuadamente el trabajo de una prctica, y pueden ser todos los clculos, tablas, grficas o esquemas, programas, comentarios, dibujos etc., que deben servir como evidencias de la realizacin del trabajo prctico y de las competencias adquiridas o desarrolladas. Discusiones: En este apartado, el cual es uno de los ms importantes para la evaluacin de la prctica, el estudiante tendr que investigar las observaciones realizadas en el experimento para justificarlas cientficamente. Conclusiones: Se refiere al punto de vista personal del alumno en el cual refleja mediante una o varias afirmaciones, la importancia de la realizacin de la prctica en la materia correspondiente y en su propia formacin como futuro profesionista. Bibliografa: Aqu se incluyen todas las referencias bibliogrficas, documentales y direcciones electrnicas de sitios en la pgina web que se consultaron para poder contestar las preguntas del cuestionario, o para ampliar y reforzar los resultados obtenidos. Evaluacin: Dentro del proceso enseanza aprendizaje la evaluacin ocupa un lugar muy importante por lo que es necesario que en el aprendizaje prctico se realice para saber si s esta logrando el objetivo particular de la prctica y el objetivo respectivo de la materia. En cuanto a los instrumentos utilizados para la evaluacin del trabajo prctico, se tomarn en cuenta el reporte mismo de la prctica donde debe tener el cuestionario con todas las respuestas correctamente contestadas, las observaciones, los resultados, las discusiones y las conclusiones especficas de cada prctica realizada. VO.BO. Visto bueno del profesor de la Materia. Lugar y Fecha: Es el lugar y la fecha de la realizacin de la prctica respectiva.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Prctica No. 1 MANEJO DEL MICROSCOPIO OBJETIVO GENERAL: Reafirmar los conocimientos bsicos adquiridos con anterioridad sobre el manejo del microscopio. OBJETIVOS INMEDIATOS: El estudiante debe ser capaz de: 1. Enumerar sobre un diagrama las partes constituyentes del microscopio, diferencindolas segn el sistema al que pertenezca. 2. Enfocar el microscopio para apreciar los detalles de los microorganismos a observar. 3. Mantener el microscopio limpio y en condiciones ptimas de trabajo. FUNDAMENTO: Para comprender el funcionamiento del microscopio es necesario conocer como amplifica y que factores pueden alterar la amplificacin. La amplificacin se logra con dos sistemas de lentes, los objetivos y los oculares. Los lentes objetivos enfocan los rayos de luz procedentes de la muestra, formando una imagen real dentro del tubo del microscopio, la imagen real se amplifica despus con los lentes oculares permitiendo que el ojo enfoque una imagen virtual de la muestra. La amplificacin total es igual a la amplificacin lograda por el objetivo multiplicada por la amplificacin del ocular. Adems de la amplificacin que se puede lograr, es necesario que el microscopio produzca una imagen visible de definicin adecuada y posea una capacidad de resolucin elevada. El poder de resolucin es la capacidad de producir imgenes independientes de pequeas partes cercanas de un objeto, que se encuentra a poca distancia. Esta capacidad de resolucin se mide por una cifra conocida como abertura numrica. La resolucin tambin depende de la longitud de onda de la luz empleada para la iluminacin. El poder de resolucin del microscopio es una expresin matemtica que denota la capacidad de los lentes para distinguir claridad de detalle. Puede decirse que un sistema de lentes pierde la resolucin de un objeto dado cuando ya no puede separar dos puntos muy cercanos entre s, es decir cuando los dos puntos estn tan cerca que aparecen como uno solo. Por lo tanto, si un microscopio no resuelve un objeto, de nada sirve aumentar la amplificacin puesto que solo se obtendra el efecto de aumentar el tamao de la mancha borrosa sin aadir definicin. Para propsitos prcticos, el lmite de resolucin de su microscopio es de aproximadamente 0,2 . IL-1


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PRECAUCIONES ESPECIALES: 1. Mantener el microscopio libre de polvo siempre. 2. Al manipular el microscopio, ste deber manipularse por el brazo y la base del mismo, nunca por el tubo, los objetivos o cualquier otra parte. 3. El microscopio no se deber sacudir, inclinar o volcar. 4. No se deber usar alcohol en las partes laqueadas ya que este acta como solvente. 5. No se deber manipular descuidadamente el tornillo micromtrico ya que esto ocasiona un contacto violento del objetivo con el portaobjetos, pudindose ocasionar quebrantamientos en ambos. 6. Se deber limpiar los objetivos con el papel adecuado y adems el lente objetivo de inmersin con xilol. 7. No deber dejarse el portaobjetos en la platina cuando el microscopio no est en uso. MANEJO DEL MICROSCOPIO: 1. 2. 3. 4. 5. Colocar el portaobjetos en la platina. Regular el voltaje. (no mayor de 5,5 volts) Ajustar la fuente de iluminacin. Regular la intensidad de la luz. Aproximar el portaobjetos al lente objetivo, primero debe utilizarse el primer aumento. 6. Cuando se encuentra una distancia de 0,6 cm, aproximadamente.; fijar el prefoco con la palanca. 7. Enfocar la muestra con los tornillos. (primero con el macro y despus con el micromtrico.) 8. Si desea cambiar el lente objetivo, girar el revolver hasta or un clic. Esto debe hacerse una vez enfocado un campo definido. 9. Volver a repetir los pasos 4, 5, 6, y 7. 10. Si desea usar el lente de inmersin, utilizar la menor cantidad de aceite posible, colocando una gota en el rea de inters del portaobjetos. 11. Sumergir el lente en el aceite y repetir los pasos 4, 5, 6 y 7. Evitar el choque violento del lente con el portaobjetos. 12. Limpiar el objetivo de inmersin con papel especial para lentes una vez finalizado el uso. No se utilice xilol o ningn otro solvente en la limpieza de este lente. MATERIAL: Microscopio ptico binocular. Aceite de inmersin. Papel para limpiar lentes. Un cabello. Un pedazo de papel con un borde rasgado. Solucin concentrada de cloruro de sodio. Fibras de algodn.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PROCEDIMIENTO: Examine todos los objetos en la lista de materiales a travs del objetivo de bajo poder. Es ms fcil mantener el cabello y las fibras de algodn en posicin fija para su observacin si se colocan en medio de una gota de agua sobre el portaobjetos. As, se previene que el aire las mueva fuera del campo durante la observacin. La solucin concentrada de cloruro de sodio debe dejarse secar sobre el portaobjetos antes de observarse. Eso causa la formacin de cristales de sal relativamente grandes. Repita sus observaciones usando ahora el objetivo de alto poder en seco. Al observar con este objetivo, coloque un cubreobjetos sobre cada una de sus preparaciones acuosas para proteger el lente del agua. Esto se conoce como un montaje hmedo. Dibuje bosquejos de cada objeto como se observan con el objetivo de bajo poder y con el de alto poder en seco. Asegrese de hacer sus dibujos precisos como bosquejos y con caracteres delineados. Es de gran importancia poner atencin a los detalles, de hecho debe dibujarse cada objeto discernible en el campo visual. Nunca se limite a dibujar puntos y rayas improvisadas o de memoria. CUESTIONARIO: 1. Dibuje las partes tpicas de trabajo del microscopio ptico.

2. De acuerdo con el nmero de lentes como se clasifican los microscopios?

3. Defina el trmino resolucin, apertura numrica y poder de resolucin.

4. Cul es la resolucin total combinado que se logra con el objetivo de 10X, 45X y 100X?

5. Cul es la funcin del diafragma del microscopio?

6. Cmo contribuy el trabajo de Leeuwenhoek en las contribuciones de Pasteur y Koch?


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7. Cuntas aplicaciones se obtienen, por lo comn, con el microscopio de luz?

8. Cul es la funcin del aceite cuando se usa con el objetivo de inmersin?

9. Si se observa una muestra con el objetivo de 43X en un microscopio con un ocular de 15X, Qu aumento tendr la imagen?

10. Cmo se producen las imgenes reales y virtuales en un microscopio ptico? Cul es la que realmente se ve?

Bibliografa Consultada.

DIBUJOS:

1. cabello humano 2. montaje hmedo 3. 10X

1. cabello humano 2. montaje hmedo 3. 45X


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1. fibras de algodn 2. montaje hmedo 3. 10X

1. fibras de algodn 2. montaje hmedo 3. 45X

1. papel con borde rasgado 2. montaje hmedo 3. 10X

1. papel con borde rasgado 2. montaje hmedo 3. 45X

1. cristales de cloruro de sodio 2. preparacin en seco 3. 10X

1. cristales de cloruro de sodio 2. preparacin en seco 3. 45X


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COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. 2000. Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. Microbiologa. (1997). McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D.A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Practica No. 2 PREPARACIN DEL MATERIAL DE LABORATORIO OBJETIVO: Que el alumno sea capaz de preparar el material de laboratorio que se utiliza con ms frecuencia en el trabajo rutinario, tomando como ejemplo el ms sencillo (cajas de petri, tubos de ensaye, matraces y pipetas). Que el alumno conozca los principios generales de las tcnicas de esterilizacin de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso comn en Microbiologa. Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminacin microbiana en el laboratorio. FUNDAMENTO: La preparacin del material de laboratorio se inicia desde el momento de que se colectan los recipientes o utensilios conteniendo sustancias de un estudio ya realizado, estos debern esterilizarse y lavarse, posteriormente se secan, se tapan y se envuelven adecuadamente para ser esterilizados al horno o autoclave. La aplicacin de calor es el mtodo mas simple para esterilizar material, a condicin de que el material por si mismo no sufra deformacin por el calor. Una temperatura de 100 C mata a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos. Generalmente se usa el vapor, tanto por que las bacterias se mueren mas rpidamente cuando se encuentran hmedas como por que el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente de esterilizacin. Para esterilizar material que debe permanecer seco se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que la distribucin del calor es menos efectiva en estos aparatos se acostumbra aplicar una temperatura de 160C durante dos horas asegurando en esta forma que todas las partes del interior del recipiente alcance cuando menos 120 C por quince minutos. MATERIAL: Caja de Petri 100 X 15 mm. Tubos de ensaye de 13 x 100 mm. Matraces Erlenmeyer de diferente capacidad. Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. Pipetas Pasteur. Mechero Fischer. Tapones con algodn y gasa. Papel Manila o de estraza para envolver. Gasa cortada en cuadros pequeos. Agar Nutritivo. Agar Papa Dextrosa. Medio Mnimo de Sales. Soluciones Amortiguadoras pH 4 y 7. Tripi. Algodn. Autoclave Potencimetro Horno de calor seco Incubadora a 37C IL-2


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METODO: El profesor explicar los principios generales de trabajo en el Laboratorio de Microbiologa, enfatizando en la desinfeccin de reas as como en la preparacin y esterilizacin de los medios de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. Tambin har las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver los materiales, as como su manejo en condiciones aspticas. Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo 1. Lavar perfectamente las cajas de petri y pipetas con escobilln y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente. 2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una pizeta por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn otro medio. 3. Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de petri y pipetas con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocar un capuchn de papel. 4. Preparar 20 ml de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y ajustar el pH con el potencimetro de acuerdo a las instrucciones del frasco del medio agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCl 0,1M o de NaOH 0,1M, en caso de que el pH sea ms alcalino o cido respectivamente. Vaciar 5 ml en cuatro tubos de cultivo con tapn de baquelita que debern cerrar sin llegar al tope. 5. Preparar 120 ml de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en un tripi agitando constantemente hasta ebullicin, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 ml de medio en tres tubos con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en autoclave. 6. Preparar 120 ml de medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, ajustar el pH del medio de acuerdo a las instrucciones del frasco con el potencimetro con agitacin constante y calentar a ebullicin durante 1 minuto, cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 ml del medio en tres tubos que se taparn con tapn de algodn y gasa. El resto se esteriliza en autoclave. 7. Preparar 120 ml de medio de cultivo Mnimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Esterilizacin del material de laboratorio y medios de cultivo 1. Las cajas de petri y pipetas envueltas se colocarn en horno a 160C durante 2 horas. Despus de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea asptica. 2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de calor hmedo de acuerdo a las siguientes instrucciones: a) Revisar que el nivel del agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario aadir agua destilada. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 23

Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA b) Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y los materiales en la canasta del autoclave y colocarla dentro. c) Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Despus cerrar este orificio con la vlvula de seguridad. d) Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 libras de presin revisando cuidadosamente la escala del manmetro. Una vez alcanzada esta temperatura deber bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e) Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos. f) Apagar la autoclave y dejar que baje la presin al valor de 0. Abrir la vlvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga hmeda abrir cuidadosamente la tapa, de adelante hacia atrs para evitar quemaduras por la salida del vapor. Preparacin de las cajas de petri y tubos con medio de cultivo 1) Los tubos con medios de cultivo con agar, se debern colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo. 2) Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado del autoclave se enfren a una temperatura aproximada de 40-50C, que coincida con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo. 3) Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con APD y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacan en las cajas de petri (aproximadamente 25 ml) en zona asptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar. 4) Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 15 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsas de plstico limpias. 5) Guardarlas en refrigeracin hasta 24 horas antes de utilizarlas. Prueba de esterilidad de materiales 1) Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de petri en forma invertida enana estufa de incubacin ajustada a 30C durante24-48 horas. 2) Revisar los tubos y cajas de petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparicin de turbidez, nata superficial y/o depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido; as como la formacin de colonias microbianas en la superficie de medios slidos. 3) Si no hay contaminacin de los medios, se abrir una de las cajas de petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetar como al aire. 4) La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetar en rea asptica. 5) La tercera caja se conservar sin abrir y se etiqueta como control.


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DATOS: A. Hacer la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo (AN, APD y MM) y con los distintos tratamientos en relacin a la caja control. B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa, (-) no hay crecimiento; (+) poco crecimiento; (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. C. Discuta los resultados y determine si la esterilizacin en el autoclave y horno fue adecuada, as como el manejo de los materiales.

Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de petri con diferentes medios de cultivo. Medio de cultivo Abierto al aire Abierta en rea asptica Control

AGAR NUTRITIVO

MINIMO DE SALES

AGAR PAPA DEXTROSA


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CUESTIONARIO: 1. Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en Microbiologa?

2. Explique cuales son las diferencias entre los procesos de esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Cmo se relacionan estos procedimientos con la pasteurizacin?

3. Mencione diferencias entre la esterilizacin con calor hmedo y el seco.

4. En qu consiste la esterilizacin con vapor a presin?

5. Cmo funciona la cinta testigo cuando se introduce al autoclave?

6. Por qu a los medios de cultivo previo esterilizacin se deben ajustar el pH y calentar?

7. Cmo ajustara el pH a un medio con agar?

8. Cul es ms eficaz como agente esterilizante, el calor seco o el calor hmedo? Por qu?

9. De una lista de materiales que deben esterilizar preferentemente en un horno de aire caliente en vez de autoclave. Indicar en el caso de cada material, porqu el aire caliente es el mtodo elegible para esterilizar? Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 26


10. Dibuje el material esterilizado.

11. Comparar las clulas vegetativas de las bacterias con las esporas bacterianas en relacin con su resistencia al calor.

12. Distinga entre las expresiones punto trmico letal, tiempo trmico letal y tiempo de reduccin decimal.

13. Qu es un autoclave?

14. Qu significado tiene la presin per se en la efectividad del proceso de esterilizacin con el autoclave para lograr esta operacin?

Bibliografa Consultada. BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman E., Allen S., Dowell V. R., Sommers H. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico.


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Prctica No. 3 PREPARACIN DE FROTIS Y FIJADO

CM-1

OBJETIVO: Que el alumno aprenda las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms utilizadas en el estudio microscpico de cultivos bacterianos obtenidos de medios slidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterizacin morfolgica de estos microorganismos. INTRODUCCIN: La palabra Citologa significa el estudio de las clulas. La citologa es similar a la anatoma, pero a nivel microscopio. La citologa estudia la clula y sus partes; sin embargo las estructuras con que trata la citologa son muy diferentes de las que trata la anatoma, ya que aquellas son microscpicas y sus lmites morfolgicos no estn bien definidos. A travs del desarrollo de la citologa, los cientficos han tenido que ocurrir a un gran nmero de trucos qumicos para tornar visibles las estructuras que componen la clula. Hasta hace poco, la falta de conocimientos sobre la naturaleza qumica de las estructuras subcelulares haba sido un gran obstculo para la citologa. Sin embargo, las recientes investigaciones en bioqumica y biologa molecular han esclarecido muchos problemas. Una de las herramientas principales en el estudio de las clulas es la tincin diferencial. Una tincin es diferencial cuando dos o mas reactivos se aplican para impartir color a la clula o sus partes especificas, mientras que una tincin simple implica la adicin de un solo reactivo. Como usted probablemente ya sabe, cuando se desea detectar la presencia de almidn en algunas estructuras, por ejemplo, una papa, se trata sta con una solucin de yodo. Una coloracin azul intensa o negra es indicacin de la presencia de almidn. Esta prueba se considera especfica para el almidn. Por lo tanto, como introduccin al estudio de las tcnicas de tincin el estudiante puede tratar una muestra de clulas con solucin de yodo para detectar partculas de almidn en el interior de las clulas. Normalmente, al tratar las clulas con la solucin de yodo, estas se colorean de un tono parduzco caracterstico del yodo y los grnulos de almidn resaltan al teirse de un azul intenso o negro, dependiendo de la concentracin de la solucin de yodo empleado. Al tratar ciertas substancias qumicas con otras substancias se producen reacciones coloreadas especficamente para las substancias as tratadas, como en el caso del yodo y el almidn. Se conocen gran cantidad de pruebas especficas que tienen selectivamente ciertos compuestos o grupos de compuestos. El valor de estos ensayos en citologa es incalculable. La acumulacin gradual de gran nmero de estas pruebas citoqumicas han hecho posible la identificacin de los constituyentes qumicos de la clula, tales como lpidos, cidos nucleicos, protenas, etc. Tambin se sabe que desde hace tiempo los aminocidos y protenas celulares reaccionan como cidos y bases dbiles con una gran variedad de materiales. En otras palabras, las protenas son sustancias anfotricas, se pueden ionizar ya sea como cidos o como bases. Esto significa que las protenas son sustancias de alta reactividad.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Como las protenas constituyen la mayor parte de los slidos en la clula, ellas participan en la mayor parte de las reacciones de teido. Para poder reaccionar exitosamente con una protena, una tincin biolgica debe ser capaz de ionizarse como cido o base, adems de producir coloracin. Generalmente, estas sustancias se llaman colorantes bsicos cuando presentan fuerte afinidad por las porciones cidas de la clula y colorantes cidos cuando muestran fuerte afinidad por las partes bsicas (alcalinas) de la clula. Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla de dos colorantes, uno cido y uno bsico, que tian de distintos colores. Al tratar una clula con esta mezcla, los componentes cidos aparecern de color distinto a las partes alcalinas de la clula. Un ejemplo de esto es la hematoxilina-eosina, tincin sumamente conocida en histologa animal. La hematoxilina es un colorante bsico que tie de azul parte cidas de la clula; la eosina es un colorante cido que tie de rojo o rosa las partes alcalinas de la clula. Puesto que el ncleo de las clulas es cido (principalmente DNA) y el citoplasma es ms alcalino, la aplicacin de la hematoxilinaeosina a una clula animal, generalmente resulta un ncleo azul y un citoplasma rosado, aunque a veces hay excepciones. Al aplicar estas tcnicas al estudio de los microorganismos, el estudiante se enfrenta con problemas especiales. Uno de los problemas principales se debe al tamao de los microorganismos. Los microorganismos son considerablemente ms pequeos que las clulas vegetales o animales y la diferenciacin o resolucin de las estructuras en el interior de las clulas tan pequeas presentan gran dificultad dentro de los lmites de resolucin del microscopio ptico ordinario. Otro problema se origina del hecho de que el interior de las clulas de los microorganismos no esta tan bien diferenciado como en las formas superiores, lo cual dificulta la observacin de las estructuras como entidades discretas. Sin embargo, grandes avances se han logrado que permiten hacer visibles las estructuras subcelulares de los microorganismos por medio de la combinacin de diversas tcnicas ingeniosas. El problema alcanzado con la introduccin del microscopio electrnico ha sido por dems espectacular, pero la mayor parte de los laboratorios estudiantiles no puede darse el lujo de ofrecer este tipo de facilidades. Existen otras tcnicas y procedimientos comunes para todos los estudios citolgicos. Una de estas tcnicas se trata de la preparacin de clulas para ser observadas. Al hacer una preparacin para el microscopio, debe depositarse en el portaobjetos una capa de clulas lo suficientemente delgada para permitir el paso de luz a travs d ella. En el caso de los tejidos vegetales y animales, el procedimiento habitual consiste en preparar cortes finos con el microtomo, es decir, se rebana el tejido en cortes muy delgados, que luego se tien y se observan al microscopio. Estos cortes tienen generalmente un grosor de 5 a 10 . En el caso de los microorganismos el problema es ms sencillo. Generalmente basta con preparar un frotis de clulas microbiales para luego teirlas. Puesto que las clulas son tan pequeas, el objetivo se logra simplemente preparando una suspensin de clulas en agua u otro lquido; una gota de esta suspensin se extiende en un rea del portaobjetos y se deja secar. Se obtiene as una delgada capa de clulas sin necesidad de usar aparatos especializados. Es posible seguir este mismo procedimiento para las clulas vegetales y animales, siempre y cuando se cuente con un medio para disociar los tejidos en suspensin de clulas individuales.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Cuando se desea hacer un frotis de un caldo de cultivo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al portaobjetos sin dilucin previa. Con el asa conviene hacer dos o tres aplicaciones en un rea reducida del portaobjetos, teniendo cuidado de no extender demasiado la suspensin. Al preparar un frotis de un medio slido el problema a evitar es la presencia de demasiadas clulas. Para esto, se toma del medio slido una minscula cantidad de material bacteriano (no mayor que la cabeza de un alfiler) el cual se emulsifica en una gota de agua de la llave sobre la superficie relativamente grande del portaobjetos. Una vez seco, el frotis debe aparecer ligeramente blanquecino, como el residuo que se obtiene al evaporar una gota de leche diluida. Una vez hecho el frotis, hay que fijarlo, para asegurarse que las clulas no se desprendan durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjetos para teir la preparacin. Durante la tcnica de fijado se intenta detener toda actividad enzimtica en la clula antes de observarla al microscopio. Muchas, si no todas las clulas, poseen protenas enzimticas capaces de destruir gran parte de las estructuras intracelulares despus de la muerte de la clula. Por lo tanto, si la clula no ha sido fijada adecuadamente antes de teirse, la accin destructora de estas enzimas impedir la aparicin de todo detalle. El calor, adems de inactivar las enzimas ayuda a adherir las clulas al portaobjetos minimizando as la prdida de clulas durante el proceso de tincin. En Microbiologa, esta destruccin de estructuras celulares se evita por medio de la fijacin por calor, mientras que los tejidos vegetales y animales, se fijan tratndolos con distintas sustancias qumicas. Muchos de estos fijadores qumicos son agentes bien conocidos; por ejemplo, el alcohol, formol y substancias de este tipo. Quizs ahora sea propicio realizar algunos experimentos sencillos para ilustrar lo expuesto. MATERIAL: Alcohol etlico (96%). Alcohol metlico. Cultivo bacteriano en agar inclinado. Hisopo de algodn. Azul de metileno de Loeffler. Palillo ordinario. Portaobjetos 100 X 15 mm. Mechero bunsen. PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos slidos de Escherichia coli, Staphylococcus spp., Klebsiella spp., y Pseudomonas aeruginosa. El estudiante preparar frotis de cada cepa obtenida de cultivo slido, las cuales fijar y teir con azul de metileno. 1) Lave tres portaobjetos meticulosamente con agua y jabn, luego enjuguelos con varias gotas de alcohol, pngalos a secar. Flamee por unos segundos, al mechero bunsen, el lado de arriba de cada portaobjetos. A no ser que se diga de otra manera este mtodo de lavar los portaobjetos habr de usarse en todos Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 30

Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA los experimentos futuros. Un portaobjetos sucio puede ocasionar prdida del material y adems dificulta la localizacin del espcimen bajo el microscopio. Sobre el portaobjetos nmero uno, coloque con el asa, una gota de agua de la llave. En esta gota, emulsifique una pequea cantidad del crecimiento bacteriano con que se le ha provedo, djalo secar al aire. Repite el procedimiento en el portaobjetos nmero dos, excepto que esta vez emulsifique material bacteriano raspado de sus propios dientes con el aplicador. A continuacin, con un palillo raspe suavemente la superficie interna de sus mejillas y deposite el material en el portaobjetos nmero tres. En cada caso, extienda el material hasta que forme una pelcula delgada sin cuajos densos. Despus de haber secado los tres frotis, fije los dos primeros con calor. Esto se hace simplemente tomando el portaobjetos con las pinzas y pasndolo lentamente a travs de la flama del mechero una y otra vez aproximadamente tres veces. No debe permitirse que el vidrio se sobrecaliente tanto que resulte doloroso al tacto. Deposite unas dos gotitas de alcohol metlico sobre el frotis nmero tres y, despus de esperar un minuto, squelo al aire. Ahora, aplique un par de gotas de azul de metileno Loeffler a cada uno de los tres frotis y djelos reaccionar por cinco minutos. Luego, elimine el exceso de tincin lavando suavemente los portaobjetos con agua de la llave, recuerde lavar los frotis de canto. Ponga las preparaciones a secar y una vez logrado esto, examnelas al microscopio, primero con el objetivo de bajo poder, y finalmente con aceite de inmersin. Observe las diferencias de tamaos entre las distintas clases de clulas con cada objetivo. Haga algunos dibujos de sus observaciones con el objetivo de aceite de inmersin. Observe la diferencia de tamao y estructuras de los distintos tipos de clulas.

2) 3) 4) 5)

6)

7) 8)

Como quizs ya se haya dado cuenta usted, los microorganismos son extremadamente pequeos y es muy difcil observar, con mas razn dibujar, los detalles internos. En este experimento como en todos los venideros se requiere que el dibujar los microorganismos observados los amplifique un poco a fin de que su instructor se de cuenta se de cuenta si usted ha observado correctamente todas las estructuras. Sus dibujos han de ser claros y bien definidos ejectelos a los colores observados en las preparaciones teidas. De los organismos observados limtese a dibujar varios ejemplos tpicos poniendo atencin a las variaciones de forma y tamao, especialmente a las maneras de agruparse caractersticas de los organismos en su preparacin.NOTA: El procedimiento para lavar los frotis ya usados es el siguiente: sostenga el portaobjetos sobre el fregadero y ponga varias gotas de xilol sobre el frotis y enjuguelo con agua y jabn. Repita la operacin por lo menos otra vez para eliminar todo microorganismo. Luego lave el portaobjetos como de ordinario y gurdelo para ser usado en otros ejercicios.

CUESTIONARIO: 1. Investigue cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. D ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 2. Porqu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor?

3. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple?

4. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin del frotis?

5. Defina los enunciados siguientes: colorante aninico, colorante catinico, preparacin hmeda y tincin simple.

6. Distinguir entre mtodos de tincin simple y tincin diferencial.

7. Seale una situacin en la cual sea preferible utilizar la tincin simple que la diferencial.

8. Explique el fenmeno de fijacin de los frotis. A que se debe que las bacterias se peguen en el portaobjetos.

9. Describa los dos tipos generales de fijacin. Cul de ellos empleara normalmente con bacterias? Con protozoos?



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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DATOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin y tamao relativo de cada uno de los microorganismos. B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la bibliografa.

1. Cultivo microbitico 2. Azul de metileno de Loeffler 3. Aceite de inmersin.

1. Material desprendido entre los dientes 2. Azul de metileno de Loeffler fijado con Calor. 3. Aceite de inmersin.

1. Raspado de la superficie interna de la mejilla. 2. Azul de metileno de Loeffler (fijado con alcohol). 3. Aceite de inmersin.



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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prcticas de Laboratorio en Microbiologa. Editorial Limusa. Mxico. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press.


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Prctica No. 4 TINCION DE BACTERIAS POR COLORACION SIMPLE

CM-2

OBJETIVO: 1. Que el alumno aprenda la forma de cmo deben de realizarse las tinciones de bacterias por los mtodos simples debido a que dichas clulas bacterianas son en su estado natural y forma, virtualmente incoloras. 2. La finalidad de un tinte sencillo es distinguir bacterias de material inerte, y revelar sus formas y tamaos. FUNDAMENTO: Preparacin de frotis.- Un frotis de bacterias se preparan tomando una porcin de cultivo lquido contenido en un tubo con un asa de platino esterilizada, y extendindola sobre unos tres centmetros cuadrados de superficie de un portaobjetos. Si se emplea un cultivo slido, se emulsiona primero una pequea cantidad de sta en una gota de agua destilada que previamente se habr colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende luego. Se seca el frotis calentando cuidadosamente el porta sobre una pequea llama de gas, para evitar que despida humos o vapores; una vez seco, se fija pasando rpidamente el porta 5 o 6 veces por la porcin superior de la llama de bunsen. Esto impide que se arrastre la extensin por el lavado durante el proceso de coloracin. El frotis seco y fijado se cubre entonces de solucin de colorante y se deja reposar por espacio determinado de tiempo, que variar segn la solucin empleada. Finalmente se lava el porta con agua, se seca con papel secante y se examina al microscopio. Viabilidad de microorganismos fijados y teidos.- se afirma generalmente que las bacterias, en frotis secos, fijados y teidos, no pueden vivir mucho tiempo, y no hay peligro de infeccin de microorganismos patgenos asi tratados. Thurh (1914) informa que cultivos de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae y Saccharomyces cerevisiae, fijados a la llama, pero no teidos, contena aun grmenes viables. 18 preparaciones de microorganismos patgenos y no patgenos mostraron que ninguno era capaz de vivir despus de teidos segn la tcnica de Gram; en cambio, el Bacillus anthracis despus de ser teido sobrevivi un minuto, y tres minutos el Bacillus mesentericus, al tratamiento con fucsina fenicada, y ambos bacilos resistieron 5 minutos a la accin del azul de metileno. Morton (1939) demostr que ciertos organismos pueden resistir al tratamiento con fucsina bsica, violeta cristal de Hucker, safranina acuosa y azul de metileno. TINCION SIMPLE Para poner en prctica este mtodo basta aplicar una o dos gotas de solucin de azul de metileno sobre la extensin ya seca. Al cabo de 30 o 60 segundos se lava el frotis cuidadosamente con un chorro de agua suave o se agita en el interior de un recipiente que contenga agua limpia, despus se seca la superficie inferior del portaobjetos con un pao, y el superficie con papel filtro adsorbente. Se coloca luego una gota de aceite sobre el frotis seco y teido, y se examina con el objetivo de inmersin. Puede usarse tambin otros colorantes en la misma forma, por ejemplo fucsina fenicada, safranina y violeta de genciana diluidas. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 35


COLORANTES SIMPLES. En los diversos mtodos bacteriolgicos se emplean muchas diferentes soluciones para teir; algunas son de uso general, y otras se destinan a fines especficos. Una solucin colorante simple es aquella que contiene un colorante disuelto en el disolvente; se aplica en una sola operacin a las bacterias, que toman el color caracterstico de la solucin colorante. Las soluciones simples que probablemente se emplean mas para tinciones usuales son las diluidas de fucsina fenicada, violeta cristal y azul de metileno. FUCSINA FENICADA. Este colorante se prepara disolviendo 0,3% de fucsina bsica en una solucin de fenol al 5%. Para usarlo como colorante simple, se recomienda generalmente diluir la solucin unas diez veces con agua destilada. CRISTAL VIOLETA El violeta cristal es tambin un miembro del grupo del triaminotrifenilmetano. Qumicamente es hexametil-p-rosanilina. Se conoce tambin por los nombres de violeta de metilo 10B, violeta de genciana, violeta hexametilo y violeta C, G o 7B. Produce el matiz ms intenso de las pararosanilinas, y entre todos los compuestos violeta, esta considerado como el colorante simple ms satisfactorio para usos generales. AZUL DE METILENO. El azul de metileno es cloruro de tetrametiltionina es un colorante bsico, es acaso el colorante mas usado en trabajos biolgicos. Por su condicin fuertemente bsica, tie con mucha intensidad ncleos y grnulos de cidos nucleicos. Es muy til para apreciar con rapidez la poblacin bacteriana de la leche. Para el diagnstico de la difteria, se prefiere teir los frotis con este colorante. En combinacin con eosina, se emplea como colorante en extensiones de sangre. Incorporado con eosina a una base de agar lactosa, sirve para distinguir Escherichia coli tpica de Enterobacter aerogenes tpico. Estas son tan solo una pocas de las numerosas aplicaciones del azul de metileno en bacteriologa. Los colorantes de anilina, como el violeta de genciana, son bacteriostticos para la mayor parte de los microorganismos Grampositivos pero su accin es casi nula contra los Gramnegativos y cidos-resistentes. Por su accin selectiva, solo son tiles cuando se conocen el tipo de microorganismos que deben inhibirse. COLORANTES DIFERENCIALES. Los colorantes diferenciales se componen de ms de una sustancia. En algunas tcnicas de coloracin, los colorantes se aplican por separado, y junto con otras, formando parte de una sola solucin. Las dos coloraciones diferenciales ms importantes que se emplean son las de Gram y las de grmenes cido-resistentes.


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MATERIAL: Cultivo de 24hr de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Hisopos estriles. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Mechero Fischer. Cristal violeta al 0,5% en una solucin acuosa. Asa de inoculacin. Safranina de Gram. METODO: 1. Colocar una asada de un cultivo en una gota de agua colocada sobre un portaobjetos. Agregar una gota de cristal violeta y observar a inmersin. 2. Hacer frotis de cada unos de los cultivos. Dejar secar a temperatura ambiente, fijar al calor, agregar cristal violeta durante un minuto, lavar con agua y secar. Observar a inmersin. 3. Repetir el paso 2 pero en lugar de cristal violeta usar safranina. 4. Con un hisopo tomar un exudado de su boca, de preferencia por el borde gingival. Hacer un frotis y teir como en el paso 2. observar a inmersin y tratar de identificar cocos, bacilos, etc. 5. Hacer esquemas. CUESTIONARIO: 1. Dibuje la estructura qumica orgnica del azul de metileno y cristal violeta.

2. Cmo actan los colorantes catinicos y aninicos?

3. Cmo se lleva a cabo el intercambio de iones entre el colorante y la clula bacteriana?

4. Cuando es necesario aplicar una tincin simple?

5. Defina los trminos cromforo y auxocromo.


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6. Por qu hay que esperar que los colorantes bsicos sean ms eficaces en condiciones alcalinas?


DIBUJOS:

1. S. cerevisiae teido con cristal violeta. 2. preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.

1. E. coli teido con Cristal violeta. 2. Preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.

1. S. aureus teido con Cristal violeta 2. Preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.

1. Exudado gingival con C. violeta 2. Preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.


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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D.A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F.


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Prctica No. 5 TINCION NEGATIVA DE MICROORGANISMOS OBJETIVO:

CM-3

Que el alumno aprenda a llevar a acabo la tincin negativa de microorganismos. Que el alumno observe estructuras bacterias especiales como la cpsula con tinciones selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin de las bacterias.

INTRODUCCION: En los estudios citolgicos a veces es importante tener una imagen ms exacta del tramo real de la clula. Esto se puede lograr de varias maneras. Un mtodo de uso frecuente en microbiologa es la tincin negativa. En este caso no son los microorganismos los que se tien, si no la superficie del vidrio sobre la que estos se encuentran. Asi, se pueden observar claramente la forma o contorno del organismo como una ventana contra el fondo oscuro. Esta tcnica, mejor que ninguna otra, permite evaluar el tamao real del organismo observado por que aqu no se emplean el fijado a la flama que de ordinario encoge a los organismos. Sin embargo este mtodo no permite discriminar detalles estructurales puesto que las clulas son de ordinario incoloras al microscopio. MATERIAL: Caldo de suspensin mixta de microorganismos. Cocos y bacilos. Nigrosina Dorner o tinta china nueva. Azul de metileno de loeffler. Xilol. Rojo Congo, solucin al 25%. Acido clorhdrico (HCl), solucin al 1%. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Asa de inoculacin. Mechero bunsen.

PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de Klebsiella spp. y Streptococcus spp. 1. Con tcnica asptica colocar una gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos, colocar junto una gota de cultivo lquido de Klebsiella spp, si se trata de un cultivo slido hay que hacer una suspensin con una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. 2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjetos perpendicular en ngulo de 45 sobre la muestra de tal manera que se extienda el material hasta formar una pelcula delgada. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 40

Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla. Quizs sea necesario extender la pelcula hasta cubrir toda el rea del portaobjetos. Si la dilucin es correcta el frotis debe aparecer gris, no negro. Si la mezcla es demasiado densa se vern grandes grietas en la nigrosina bajo el microscopio. 4. Permita que la mezcla se seque al aire; no fije a la flama. 5. Repetir el procedimiento pero ahora utilice la cepa de Streptococcus spp. 6. Examine sus preparaciones con el lente de aceite de inmersin y haga un dibujo de un campo representativo*. 7. Prepare adems, con la misma suspensin bacteriana original, un frotis simple fijado a la flama y teido con azul de metileno. Trate de detectar diferencias del tamao en los mismos organismos comparando la tincin negativa con la positiva. Sobre que se basan las diferencias?*Otro mtodo til emplea el rojo congo para teir. Coloque una gota de rojo congo en un extremo de un portaobjetos limpio. Adale un asa llena de caldo con suspensin bacteriana y mezcle con el asa. Ahora coloque una segunda laminilla a 45 del primero, hasta que la gota se difunda hacia los bordes del vidrio, luego empuje lentamente la laminilla inclinada manteniendo el mismo ngulo, hasta el otro extremo del portaobjetos. Squelo al aire, no fije a la flama. Una vez seco, vierta sobre l, HCl al 1% e inmediatamente sacdalo para eliminar el cido clorhdrico pero no lave. Seque al aire y examnelo con el lente de aceite de inmersin. Dibuje un campo representativo.

RESULTADOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en las figuras. B. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

CUESTIONARIO: 1. Explique el fundamento de la tincin negativa realizada en la prctica. Qu tipo de informacin se obtiene? 2.

3. Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar esta estructura bacteriana.


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4. Mencione la aplicabilidad de la tincin negativa.

5. Cules son las diferencias sobre el efecto que ejercen en la bacteria una tincin negativa sobre una tincin diferencial?

6. Cules son las ventajas del procedimiento de la tincin negativa para el estudio de la morfologa bacteriana?

7. En que tipo de microorganismos se podra aplicar la tincin negativa? Mencione ejemplos.


DIBUJOS:

1. Suspensin de Klebsiella spp. 2. Nigrosina de Dorner 3. Aceite de inmersin.

1. Suspensin de Klebsiella spp. 2. Rojo Congo sin fijar 3. Aceite de inmersin.


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1. Suspensin de Streptococcus spp. 2. Nigrosina de Dorner 3. Aceite de inmersin.

1. Suspensin de Streptococcus spp. 2. Rojo Congo sin fijar 3. Aceite de inmersin.

1. Suspensin de Klebsiella spp 2. Azul de metileno (fijado con calor) 3. Aceite de inmersin.

1. Suspensin de Streptococcus spp 2. Azul de metileno (fijado con calor) 3. Aceite de inmersin.



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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Clark G. L. (1993). Staining procedures. 5. Edition. Williams and Wilkins, Baltimore (USA). Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.


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Prctica No. 6 TINCION DE GRAM OBJETIVO:

CM-4

El alumno conocer y llevar a cabo la tincin diferencial de Gram. Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Grampositivas o Gramnegativas de acuerdo a la tincin de Gram. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones diferenciales para la caracterizacin e identificacin de las bacterias. FUNDAMENTO: La tincin bacteriolgica mas usada es la de Gram, de carcter diferencial, llamadas en honor de su inventor. La tincin de Gram es una herramienta de gran valor taxonmico. Al aplicar la tincin de Gram automticamente se divide todo el reino de microorganismos en dos categoras. Adems observando la forma de la clula en cuestin, es posible establecer dos subdivisiones o ms. La tincin de Gram se compone de 4 reactivos diferentes, y se requiere de algo de entrenamiento para que la tincin funcione correctamente. Estos componentes son los siguientes: cristal violeta (colorante primario), solucin diluida de yodo o yodo Lugol (mordente), una mezcla de alcohol 95% y acetona en proporciones de 70 y 30% respectivamente y por ltimo un colorante rojo llamado safranina (contratincin). A los organismos que retienen el cristal violeta con gran tenacidad a pesar del colorante se les conoce como Grampositivos, y a los organismos que se destieron con el colorante primario se han tornado incoloros, como estaban originalmente, por eso es que, para tornar visibles estos organismos se emplea una contratincin de diferente color que el colorante primario, a estos organismos se les llama Gram negativos. MATERIAL: Cultivo de 24hr. de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, y cultivo de 48hr. de Saccharomyces cerevisiae (levadura). Colorante violeta cristal de Gram. solucin de yodo de Gram. solucin decolorante, acetona-alcohol o alcohol (96%). Safranina de Gram. Palillo aplicador. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Mechero Fischer.

PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis y Saccharmomyces cerevisiae. El estudiante preparar frotis de cultivo lquido y de cultivo slido de los microorganismos y aplicar la tincin de Gram. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 45


1. Limpie 4 portaobjetos y prepare 4 frotis idnticos en cada porta, de la siguiente manera: cerca de uno de los extremos del porta (dejando suficiente rea para los dedos, al sostener el porta) prepare un pequeo frotis de E. coli ms o menos del tamao de una moneda de 5 centavos. Junto a este primer frotis, prepare otro ms o menos del mismo tamao pero con Staphylococcus epidermidis. Junto a este segundo frotis prepare un tercero con una gota de suspensin de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, en el otro extremo del porta, prepare un cuarto frotis usando algo de material raspado de su enca, con un aplicador y previamente emulsificado en una gota de agua. 2. Ejecute esta serie de cuatro frotis en cada uno de los 4 portaobjetos. Numere los porta del 1 al 4 con un crayn de cera. Ponga los 4 frotis a secar al aire y fjelos a la flama como de costumbre. 3. Cubra el portaobjetos nmero uno con cristal violeta de Gram (violeta de genciana), teniendo cuidado que el lquido bae los cuatro frotis, djelo reaccionar por 1minuto. Descarte el exceso de colorante y lave en la llave brevemente. Aplique yodo de Gram y djelo reaccionar por 1minuto. Lave en la llave. Ahora con cuidado agregue solucin decolorante, gota a gota a cada uno de los frotis con el porta inclinado sobre el fregadero. Tan pronto como las gotas de solucin ya no arrastren color lave en la llave para detener la accin de colorante. Finalmente, cubra el porta con la solucin de safranina de Gram. y djela reaccionar de 10 a 20 segundos. 4. Lave el exceso de colorante y seque a aire. 5. Repita el mismo procedimiento con el portaobjetos nmero 2 pero sin teir con safranina. En otras palabras detenga el procedimiento despus de decolorar; seque al aire. 6. Repita el procedimiento con el portaobjetos nmero 3 pero ahora detngase antes de decolorar, en otras palabras no decolore esta preparacin, seque al aire. 7. Ejecute nicamente el primer paso de la serie con el porta 4. Lave a la llave y seque al aire. 8. Observe las preparaciones con el objetivo de aceite de inmersin y haga un dibujo que muestre unos cuantos organismos de cada uno de los 16 frotis que usted prepar, indique claramente los colores de los organismos. El procedimiento que emple en el portaobjetos nmero 1 es el procedimiento completo de la tincin de Gram. Cuando vuelva ejecutar esta tcnica ignore los procedimientos parciales en los portas 2, 3 y 4. Estos fueron hechos como ejercicios, para que usted se diera cuenta de cmo se ven las clulas en cada paso del proceso. Cuando se le pida una tincin de Gram en el futuro, usted deber seguir el procedimiento que se us para el portaobjetos nmero 1. CUESTIONARIO: 1. Cules son las diferencias principales entre bacterias grampositivas y gramnegativas?


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2. Por qu la coloracin de Gram es una de las tinciones ms importantes y uno de los mtodos de tincin cuyo uso es ms amplio en bacteriologa?

3. Cmo es la reaccin de Gram en las levaduras? Estos resultados tendrn la misma importancia que para las bacterias? Por qu?

4. Cul es el fundamento de la tincin de Gram?

5. Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tincin diferencial.

6. Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram?

7. Por qu se utiliza la tcnica de Gram como un parmetro entre otros para la clasificacin taxonmica de las bacterias?

8. Cmo influye la pared celular en la retencin del color azul o rojo?


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9. Qu generalizaciones pueden hacerse con respecto a morfologa y reaccin de Gram?

10. Qu etapa de la tincin de Gram puede eliminarse sin perder su capacidad para distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas? Por qu?


RESULTADOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en el cuadro siguiente. B. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura. TINCION DE GRAM Aumento total Forma: cocos, bacilos, etc. Agrupamiento de las clulas Tamao: Reaccin de Gram Descripcin del cultivo: lquido o slido, edad del cultivo, etc. Escherichia coli S. epidermidis S. cerevisiae


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DIBUJOS: Portaobjetos 1

1. Frotis del material de las encas. 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin.

1. Staphylococcus epidermidis 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin.

1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin.

1. Escherichia coli. 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin. Portaobjetos 2

1. Frotis del material de las encas. 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin. Qumico Farmacutico Bilogo

1. Staphylococcus epidermidis. 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin. Pgina 49


1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin.

1. Escherichia coli 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin.

Portaobjetos 3

1. Frotis de material de las encas. 2. Solucin de lugol y C. violeta 3. Aceite de inmersin.

1.Staphylococccus epidermidis 2. Solucin de lugol y C. violeta. 3. Aceite de inmersin.

1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Solucin de lugol y C. violeta 3. Aceite de inmersin. Qumico Farmacutico Bilogo

1. Escherichia coli. 2. Solucin de lugol y C. violeta. 3. Aceite de inmersin. Pgina 50


Portaobjetos 4

1. Frotis de material de las encas. 2. Cristal violeta nicamente 3. Aceite de inmersin.

1. Staphylococcus epidermidis. 2. Cristal violeta nicamente. 3. Aceite de inmersin.

1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Cristal violeta nicamente. 3. Aceite de inmersin.

1. Escherichia coli 2. Cristal violeta nicamente. 3. Aceite de inmersin.

COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Pgina 51


Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Iinteramericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.


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Prctica No. 7 TINCION DE ZIEHL NEELSEN

CM-5

OBJETIVO: El estudiante ser capaz mediante el empleo de la tincin diferencial de Ziehl Neelsen de identificar los tipos morfolgicos ms corrientes, ya que por medio de l se hacen accesibles a la vista. FUNDAMENTO: La tincin acidorresistente se llama as debido a la naturaleza cida del agente decolorante empleado- una solucin de HCl al 3% en alcohol al 95%. Este decolorante es mucho ms fuerte que la mezcla de acetona-alcohol usada en el Gram, nunca debe usarse el cido para decolorar en el procedimiento de Gram. Los organismos acidorresistentes son capaces de retener el colorante primario debido a que este colorante es ms soluble en las sustancias lipoides presentes en estos organismos, que en la solucin decolorante. Por lo tanto, el proceso de decoloracin en la tincin acidorresistente no es un proceso tan delicado como en la tincin de Gram. Sin embargo los organismos acidorresistentes crecidos en cultivo artificial durante algn tiempo tienden a volverse menos acidorresistentes que aquellos recientemente aislados de su habitad natural. Otras caractersticas de la tincin acidorresistentes es el empleo de calor como agente intensificador del colorante primario. De hecho el colorante primario es forzado a penetrar en la clula hasta que el colorante empiece a vaporizarse Este procedimiento es necesario debido a que los miembros del gnero Mycobacterium poseen una concentracin elevada de material graso en el citoplasma. Por lo tanto, para que el colorante penetre a las clulas, se requiere el calor o algn agente surfactante (detergentes, por ejemplo). La tincin acidorresistente encuentra gran aplicacin en medicina, porque algunos organismos del gnero Mycobacterium se asocian con infecciones y existen muy pocas otras bacterias que dan reaccin positiva a la tincin acidorresistente. Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de la tuberculosis. En general, son raras las clulas que son acidorresistentes. MATERIAL: 1. Fucsina bsica saturada. Sol. Stock. Fucsina bsica 31,5 gr. Etanol 95% 1000,0 ml Mezclar en un matraz de 1Litro y dejar permanecer durante toda la noche. Filtrar antes de usar. 2. Fenol al 5% Fenol Agua 5,0 gr. 100,0 ml. 10,0 ml. 90,0ml Pgina 53

3. Carbolfucsina (solucin de trabajo) Fucsina bsica saturada. Sol. Stock Fenol al 5% Mezclar y filtrar antes de usar. Qumico Farmacutico Bilogo


4. Alcohol cido. Acido clorhdrico concentrado Alcohol 96%

3,0 ml. 97,0 ml.

5. Azul de metileno. Sol. Stock Azul de metileno 1,0 ml. Etanol de 96% 100,0 ml. Mezclar y esperar 24 horas. Filtrar antes de usar. MATERIALES: Un cultivo de 72 horas de Mycobacterium tuberculosis (una cepa avirulenta). Si es posible tambin se les facilitar un esputo de tuberculoso procesado en la autoclave. Un cultivo de 24 horas de Staphylococcus epidermis. Tincin carbolfucsina de Ziehl-Neelsen. Azul de metileno de Loeffler. Alcohol acidulado. Solucin de albmina de huevo (1,0%) en salina. Portaobjetos 25 X 75 mm. Mechero bunsen. PROCEDIMIENTO.Prepare un frotis mixto de Mycobacterium tuberculosis y Staphylococcus epidermidis despus de haber emulsificado las clulas en una solucin de albmina al 1%. La solucin de albmina ayuda a mantener la clula de M. tuberculosis adheridas al portaobjetos. Ya que de ordinario tiende a despegarse fcilmente, sin duda debido a su gran contenido graso. Si el esputo esterilizado del tuberculoso se puede conseguir, prepare tambin un segundo frotis de este material. Despus de secar al aire fije a la flama. Con las pinzas, mantenga el portaobjetos suspendido sobre el fregadero y belos con carbolfucsina de Ziehl Neelsen. Tome el mechero bunsen por la base y flame al colorante por abajo del porta hasta que se empiece a desprender el vapor. No hierva el colorante, mantngalo al punto

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