Pengaruh Pemberian Infusa Biji Adas (Foeniculum vulgare Mill.) terhadap Perkembangan Uterus Tikus Putih (Rattus norvegicus) Produktif dan Premenopause

The Effect of Fennel (Foeniculum vulgare Mill.) Infusion Treatment to Depelovment of Uterine of Productive and Premenopausal White Rats (Rattus Norvegicus)

Novrianto Albertino 1), Eva Harlina 2), Hera Mahsehwari 3)

1) Mahasiswa Program Sarjana, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor2) Staf Pengajar, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor3) Staf Pengajar Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor

ABSTRACT

Fennel is one of plant that can be used as medicine. Fennel seeds (Foeniculum vulgare Mill.) is known contain phytoestrogen that have effect like estrogen. This study aims to determine the effect of fennel seeds infusa at various doses toward endometrial thickness and number of uterine glands of white rat (Rattus norvegicus) at proestrus phase in histopatologically. 50 rat consists of 25 productive rat and 25 pre-menopause rat, each of them were divided into 5 groups namely negative control group (KN) were given 1 ml aquades, positive control group (KP) were given dose of 9x10-3 mg/200 g BW etinil estradiol, and three other groups were given a dose of graded fennel infusion namely dose 1 (D1) 36.5 mg/100 g BW, dose 2 (D2) 73 mg/100 g BW, and dose 3 (D3) 146 mg/100 g BW. Administration of etinil estradiol and fennel seeds infusa was done with orally every day for 16 days. The result of this study showed that treatment of fennel seeds infusa with a dose 36.5 mg/100 g BW and 146 mg/100 g BW has no effect on endometrium thickness and number of uterine glands of productive group of rat or pre-menopause group of rat.

Keyword : fennel, phytoestrogen, uterine

PENDAHULAN

Menopause didefinisikan sebagai suatu keadaan terhentinya proses menstruasi secara permanen karena ovarium tidak lagi memproduksi hormon estrogen dan progesteron. Seiring bertambahnya usia, kadar estrogen mulai mengalami penurunan sejak periode klimakterium (usia 40 tahun). Masa ini dikenal sebagai masa premenopause (Northrup 2006). Hal ini dikarenakan hilangnya folikel sejalan dengan bertambahnya usia karena atresia dan ovulasi bulanan. Kehilangan folikel mengakibatkan berkurangnya sekresi estrogen dan progesteron. Untuk mengatasi kekurangan hormon estrogen diperlukan hormon estrogen pengganti atau Hormon Replacement Therapy (HRT). Menyadari efek samping yang ditimbulkan HRT, telah dikembangkan penggunaan bahan alami yang berasal dari tumbuhan yang mengandung fitoestrogen. Fitoestrogen dapat menunda terjadinya menopause, membuat jantung lebih sehat, dan menurunkan resiko kanker (Muaris 2004). Purwoko dan Suyanto (2001) juga menyatakan bahwa fitoestrogen bermanfaat sebagai antiosteoporosis dan merupakan agen estrogenik. Fitoestrogen diketahui banyak terdapat pada kacang kedelai, dan kini diketahui pula terdapat pada tanaman adas (Rusmin dan Melati 2007). Adas (Foeniculum vulgare.Mill) mempunyai senyawa aktif trans-anethole dan golongan terpenoid yang dapat mempengaruhi jaringan endometrium (Glover dan asinder 2006). Dilaporkan bahwa trans-anethol mempunyai aktivitas estrogenik, tidak mempunyai efek anti-estrogenik dan progestasional (Silano dan Marisa 2005). Untuk mengetahui pengaruh fitoestrogen adas terhadap perkembangan uterus maka dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan hewan coba tikus (Rattus sp) yang diberi infusa adas secara peroral.

METODETempat dan Waktu PenelitianPenelitian dilakukan di Unit Pemeliharaan Hewan Laboratorium, FKH IPB, sedangkan pengamatan histologi uterus dilakukan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, FKH IPB. Waktu pelaksanaan penelitian dari bulan Juni 2012 hingga April 2013.

Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji adas manis (Foeniculum vulgare subspecies vulgare varietas dulce MILL), etinil estradiol, bahan-bahan pembuat sediaan histologi yaitu aquades, BNF (Buffer Normal Formalin) 10%, xylol, pewarna Mayers Hematoxylin-Eosin dan lithium karbonat. Hewan coba yang digunakan adalah 50 ekor tikus putih (Rattus novergicus) betina galur Spraque-Dawley umur produktif (3-4 bulan) dan premenopause (umur 18 bulan). Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, pengayak mesh 24 dan 30, gelas ukur, erlenmeyer, sonde lambung, peralatan untuk nekropsi, tissue cassette, tissue processor, rotary microtome, inkubator, mikroskop cahaya Olympus CH-1 dan digital eye piece camera microscope MD 130.

Metode Penelitian

Infusa AdasDeterminasi buah adas dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bogor. Simplisia buah adas yang telah kering kemudian digiling dengan grinder dan disaring dengan pengayak 24 mesh. Pembuatan infusa adas dilakukan dengan cara merebus sebanyak 10 g adas dalam 100 ml air dengan suhu 90oC selama 15 menit. Kemudian larutan adas disaring dengan pengayak 30 mesh, disimpan dalam botol dan siap digunakan.

Hewan CobaSebanyak 50 ekor tikus terdiri atas 25 ekor tikus produktif dan 25 ekor tikus premenopause, dibagi menjadi 5 kelompok yang masing-masing kelompok terdiri atas 5 ekor tikus. Pembagian kelompok tikus adalah sebagai berikut: kelompok kontrol negatif (KN), kelompok kontrol positif (KP), dan kelompok perlakuan dosis 1 (D1), dosis 2 (D2), dan dosis 3 (D3). Sebelum perlakuan tikus diaklimatisasi selama dua minggu. Selama penelitian tikus diberi pakan berbentuk pelet serta air minum ad libitum dan dicekok bahan-bahan perlakuan. Setelah perlakuan selesai, tikus ditidurkan menggunakan eter dan dilakukan dislokasio cervikalis. Selanjutnya tikus dinekropsi untuk pengambilan organ uterus, kemudian organ difikasasi dalam larutan BNF 10% untuk selanjutnya dibuat sediaan histopatologi.

Rancangan PercobaanTikus dicekok etinil estradiol dan infusa adas manis setiap hari selama 16 hari, dengan dosis sebagai berikut: kelompok kontrol positif (KP) diberi etinil estradiol dosis 9x10-3 mg/200 g BB, kontrol negatif (KN) diberi aquades 1 ml, dan tiga kelompok lain diberi infusa adas dosis bertingkat, yaitu dosis 1 (D1) 36.5 mg/100 g BB, dosis 2 (D2) 73 mg/100 g BB, dan dosis 3 (D3) 146 mg/100 g BB).

Pembuatan Sediaan HistopatologiJaringan uterus dipotong secara melintang kemudian direndam dalam larutan BNF 10% untuk fiksasi lanjutan. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dalam alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I dan II, xylol I dan II, parafin I dan parafin II, masing-masing selama 2 jam dalam tissue processor. Kemudian dilakukan embedding. Setelah itu blok jaringan dipotong dengan mikrotom dengan ketebalan 4-5 m, hasil potongan diletakkan di water bath yang bersuhu 45oC kemudian sediaan dimounting dan dikeringkan didalam incubator dengan suhu 60oC selama satu malam. Proses pewarnaan Hematoksillin-Eosin dengan metoda sebagai berikut: deparafinasi jaringan dalam xylol I, II, III masing-masing selama 2 menit, rehidrasi dalam alokohol 95% dan 80% masing-masing 1 menit, dicuci dengan air mengalir selama 1 menit dan diwarnai Mayers Hematoxylin selama 6 menit. Setelah itu dibilas dengan air mengalir selama 30 detik, dicelupkan ke dalam lithium karbonat selama 15-30 detik, dan dibilas kembali dengan air mengalir selama 2 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Eosin selama 6 menit dan dicuci kembali dengan air mengalir selama 30-60 detik. Tahap selanjutnya adalah dehidrasi dengan alkohol absolut I, II dan III masing-masing selama 2 menit dan clearing dalam xylol I dan II masing-masing selama 2 menit. Tahap akhir, sediaan ditetesi perekat Permount, kemudian ditutup dengan gelas penutup.

Pengamatan HistopatologiPengamatan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya, dan dihitung jumlah kelenjar uterus, tebal endometrium dan persentase kelenjar uterus aktif dan nekrosis. Hasil pengamatan diuraikan secara deskriptif dan kuantitatif.Analisis DataData dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat adanya pengaruh pemberian infusa adas dan dosis yang efektif menggunakan dua variabel uji.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ketebalan Endometrium

Uterus dipanen saat tikus berada pada fase proestrus. Proestrus adalah fase sebelum estrus, yaitu fase folikel de Graaf yang tumbuh dibawah pengaruh FSH dan menghasilkan sejumlah estradiol (Ihsan 2010). Pada fase ini terjadi inovulasi fungsional corpus luteum serta pembengkakan praovulasi folikel, kadar estrogen akan terus mengalami peningkatan seiring dengan pertumbuhan folikel. Gambaran histologi endometrium tikus produktif fase proestrus dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Uterus tikus produktif. Garis merah menunjukkan tinggi endometrium: L: lumen; E: endometrium; M: myometrium; P: Perimetrium. Pewarnaan HE, Bar : 100m.

Rata-rata ketebalan endometrium tikus produktif dan pre-menopause pasca pemberian infusa adas disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Rata-rata ketebalan endometrium uterus tikus produktif dan pre-menopause pasca pemberian infusa AdasPerlakuanTikus ProduktifTikus Premenopause

Kontrol N701.8247.0a761.8210.6a

Kontrol P407.5100.4a539.7127.3a

Dosis 1510.935.40a655.0144.6a

Dosis 2577.2*558.691.22a

Dosis 3594.1142.3a511.0126.0a

Rataan614.7140.2a556.2152.7a

Keterangan: Huruf supersripct yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p0,05) dibandingkan dengan kelompok tikus pre-menopause. Pada tikus kelompok produktif, pemberian infusa adas dengan dosis bertingat tidak berbeda nyata (p>0,05) dibandingkan kontrol positif maupun kontrol negatif. Demikian pula pada tikus kelompok pre-menopause, pemberian infusa adas dosis bertingkat tidak berbeda nyata (p>0,05) dibandingkan kelompok kontrol positif maupun kontrol negatif.Pemberian infusa adas dan etinil estradiol pada tikus produktif dan tikus pre-menupause tidak menstimulasi peningkatan aktivitas endometrium. Hal ini kemungkinan disebabkan reseptor endometrium tidak bisa menangkap estrogen eksogen yang diberikan, sehingga proses fisiologi perkembangan endometrium tidak terjadi. Fitoestrogen dapat berikatan dengan reseptor estrogen dan menghasilkan efek pro-estrogenik, atau anti-estrogenik pada jaringan target (Sari 2009). Hillisch et al. (2004) menyatakan bahwa potensi fitoestrogen 10-3-10-5 kali dibanding estrogen alami, dan fitoestrogen dapat bergabung dengan reseptor namun tidak dapat memunculkan efek yang sama kuatnya dengan efek estrogen alami. Kemungkinan diperlukan fitoestrogen dalam jumlah yang lebih besar lagi untuk memperoleh efek yang memadai seperti estrogen (Achadiat 2007). Pemberian infusa adas yang mengandung trans-anethol dengan dosis yang diberikan belum mampu bekerja sebagai fitoestrogen yang mempengaruhi perkembangan endometrium.Menurut Persky et al. (2002), fitoestrogen adas bertindak sebagai estrogen antagonis ketika estrogen endogen dalam konsentrasi tinggi, sedangkan bersifat sebagai estrogen agonis saat estrogen endogen dalam konsentrasi rendah. Ketebalan endometrium baik pada tikus produktif maupun pre-menopause juga tidak berespon terhadap pemberian etinil estradiol. Hal ini disebabkan kapasitas maksimum ikatan etinil estradiol dan reseptor estrogen telah tercapai, serta kadar estrogen dalam tubuh telah mencapai kadar maksimum sehingga efek estrogenik pada endometrium menurun.

Kelenjar UterusKelenjar endometrium maupun pembuluh darah mengalami perubahan struktur sepanjang siklus estrus. Peningkatan hormon estrogen yang terjadi pada siklus estrus menyebabkan pertumbuhan serta percabangan kelenjar. Gambaran histologi kelenjar uterus disajikan pada Gambar 3 dan hasil perhitungan jumlah kelenjar uterus tikus seluruh kelompok disajikan pada Tabel 2.

Gambar 3 Kelenjar uterus (KU) tikus pre-menopause. Pewarnaan HE, Bar:100m.

Tabel 2 Rata-rata jumlah kelenjar uterus tikus produktif dan pre-menopausePerlakuanTikus ProduktifTikus Premenopause

Kontrol N76.7580.25a55.251.10a

Kontrol P 32.514.84a 52.2520.85a

Dosis 139.7530.75a 54.7518.03a

Dosis 293* 53.6228.47a

Dosis 3 47.519.09a 30.516.26a

Rataan 5438.63a 53.918.86a

Keterangan: Huruf supersripct yang berbeda pada kolomyang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p0,05) dengan kelompok tikus pre-menopause. Pada kelompok tikus produktif, penambahan dosis infusa adas tidak berbeda nyata (p>0,05) dibandingkan kontrol positif maupun kontrol negatif. Demikian pula pada kelompok tikus pre-menopause, penambahan infusa adas dosis bertingkat tidak berbeda nyata (p>0,05) dibandingkan kontrol positif maupun kontrol negatif. Hal ini diduga karena fitoestrogen yang diberikan belum mampu berikatan dengan reseptor di kelenjar endometrium sehingga proses fisiologi perkembangan kelenjar uterus tidak terjadi. Fitoestrogen dapat berikatan dengan reseptor estrogen dan menghasilkan efek pro-estrogenik atau anti-estrogenik pada jaringan target. Perkembangan jumlah kelenjar uterus juga dipengaruhi oleh FSH (Follicel Stimulating Hormon) dan LH (Luteneizing Hormon) pada tahap proliferasi. Kelenjar uterus adalah kelenjar eksokrin, yang memiliki ujung kelenjar dengan kemampuan menghasilkan sekreta yang mengandung enzim. Sekresi kelenjar uterus dan plasma darah merupakan campuran cairan yang mengisi lumen uterus (Hafez et al. 2000). Endometrium memperlihatkan struktur epitel mukosa yang mengalami hipertrofi dan ditemukan neutrofil pada fase proestrus. Pada salah satu uterus tikus kelompok pre-menopause ditemukan peradangan hebat berupa endometritis purulenta. Secara histologi tampak sel radang netrofil memenuhi lumen kelenjar uterus dan lamina propria uterus. Endometritis dapat disebabkan oleh berbagai agen, diantaranya bakteri. Infeksi dapat timbul akibat bakteri yang sering kali ditemukan didalam vagina (endogenus) atau akibat pemaparan pada agen pathogen dari luar vagina (eksogenus) (Bobak 2004). Endometritis purulenta pada tikus pre-menopause disajikan pada Gambar 4, dan rata-rata persentase kelenjar uterus yang berisi eksreta dan sel radang netrofil dari seluruh kelompok tikus disajikan pada Tabel 3.

Gambar 4 Endometritis purulenta pada salah satu tikus pre-menopause. Sel radang netrofil tampak memenuhi lumen kelenjar uterus (panah kuning) dan lamina propria uterus. Pewarnaan HE, Bar: 100 m

Tabel 3 Rata-rata persentase kelenjar uterus yang meradang pada tikus produktif dan pre-menopausePerlakuanTikus ProduktifTikus Premenopause

Kontrol N11.592.25b12.471.32a

Kontrol P 1.700.32a 0.420.57a

Dosis 1 00a 5.865.89a

Dosis 2 4.93* 9.4715.18a

Dosis 3 3.825.40ab 2.363.33a

Rataan4.3584.90a7.5489.99a

Keterangan: Huruf supersripct yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p0,05) dibandingkan kelompok tikus pre-menopuse. Pada kelompok tikus produktif, rata-rata jumlah kelenjar uterus yang meradang pada tikus kontrol positif lebih rendah dan berbeda nyata (p0,05) jumlah kelenjar uterus yang meradang dibandingkan dengan kontrol negatif. Sebaliknya pada kelompok tikus pre-menopause, pemberian etinil estradiol maupun penambahan dosis infusa adas hanya merendahkan jumlah kelenjar uterus yang meradang namun tidak berbeda nyata (p>0,05) dibandingkan kontrol negatif. Pada periode pre-menopause, kadar estrogen dalam tubuh tinggi. Menurut Lestari (2006), estrogen dapat meningkatkan migrasi sel-sel penyebab inflamasi saluran reproduksi. Selain itu adas diduga mengandung senyawa yang bersifat sebagai antibakteri, sehingga pemberian adas dapat menurunkan persentase kelenjar uterus yang meradang.Kaur dan Aurora (2009) menyatakan bahwa tanaman adas memiliki beberapa kandungan senyawa aktif seperti alkaloid 2,8-4,23%, flavonoid 8,58-15,06%, tannin 19,71-27,7%, saponin dan glikosida 0,55-0,70%. Senyawa aktif adas yang diduga berfungsi sebagai antibakteri adalah alkaloid, flavonoid, dan tannin. Persentase kelenjar yang meradang pada tikus kontrol positif berbeda nyata (p0,05) dibandingkan tikus kontrol positif maupun kontrol negatif. Sebaliknya pada kelompok tikus pre-menopause, pemberian etinil estradiol cenderung menurunkan (p>0,05) persentase kelenjar nekrotik, dan pada pemberian infusa adas dosis bertingkat menurunkan persentase kelenjar nekrotik secara nyata (p