Caracterización meidante imte marcadores

M, Elena Torres LamasSmtiago Moreiao Vhzquez

Opto. 13;iolo~ía Vegetal

Universidad Politécnica de Madrid

- RFLPs (Restriction Fragrnent Length Polymorphisms)* Minisatélites- RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNAs)* AFLPS* Microsatélites. PCR-intermicrosatélites

Desde la década de los 80, se han desarrollado numerosas técnicasque permiten detectar variaciones en la secuencia de ADN al comparardistintos individuos. Colectivamente se han denominado marcadoresmoleculares basados en ADN. Entre las ventajas que presentan estosmarcadores frente a los morfológicos e isoenzimáticos destacan las -siguientes: 1) detectan mayor variabilidad, por lo que es más fácilencontrar diferencias; 2) no están afectados por el ambiente, ya que seanaliza directamente el ADN; 3) mayor objetividad, puesto que el resul-tado del análisis no depende tanto de la apreciación del sujeto que rea-liza la observación; y 4) la posibilidad de obtener ADN de cualquier teji-do de la planta. No obstante, debe entenderse que el uso de estas nue-vas técnicas no implica prescindir de las metodologías clásicas.

En la actualidad existen numerosos marcadores basados enADN; pero solo algunos han sido aplicados eficazmente a la conser-

c

236 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTIAGO MORENO VÁZQUEZ

vación y gestión, de los recursos fitogeneticos. A continuación se des-cribe la metodología de los más utilizarlos, así como- el tipo de poli-morfismo que detectan y las ventajas e inconvenientes de cada unode ellos. Estos tres aspectos son básicos a la hora de decidir la técni-ca más adecuada para abordar un determinado estudio.

..’IWWs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

La metodologfa WLP requiere la -utilización de enzimas de res-tricción y sondas. Las enzimas de restricción son endonucleasas ais-¡adas de bacterias que reconocen secuencias específicas, normal-mente de cuatro”a seis pares de bases (Pb), y cortan el ADN en esasecuencia concreta. En la actualidad, se han aislado y caracterizadocientos de estas enzimas que se diferencian en la secuencia de reco-nocimiento y el lugar de corte (http://internalmed.wustl.edu/divi-sions/enzvmes/INDEX.HTM). Las sondas son fragmentos -de ADN(normalmente de 0,5 a 3 Kb) de secuencia conocida, marcados con unisótopo radiactivo PP) o con digoxigenina. ‘i

La técnica consta de las etapas siguientes:1. Extracción del ADN.2. Digestión completa del ADN con’enzimas de restricción. Es muy

importante que la digestión sea completa para que los resulta-dos sean repetibles.

3. Separación y desnaturalización de los fragmentos de restricción.Los fragmentos de ADN generados se separan por electroforesisen un gel de agarosa en función de su peso molecular y, poste-riormente, se desnaturalizan.

4. Transferencia de los fragmentos de..ADN a una membrana denitrocelulosa o nylon (transferencia Southern).

5. Preparación de una sonda.6. Hibridación de los fragmentos de restricción con la sonda. La

sonda hibridará con todos los fragmentos de ADN que sean com-plementarios a su secuencia.

7. Visualización de los fragmentos hibridados por autorradiografía,en el caso de utilizar 32P, o mediante quimioluminiscencia si seemplea digoxigenina. n -.

h'bWADORESMOLECULARESBASADOSEN~N 237

El polimorfismo detectado por los RFLPs se basa en el hecho deque pequeños cambios en la secuencia de ADN pueden modificar lospatrones de corte de las endonucleasas de restricción (Figura 1). Porejemplo, la sustitución de una base por otra en la secuencia de reco-nocimiento de una enzima de restricción produce diferencias en laslongitudes de los fragmentos de restricción del ADN de esa zona. Lasinserciones o deleciones entre los sitios de restricción twrbién hacenvariar el tamaño de los RFLPs. La utilización de distintas combina-

a

88 bb CC W ab ao ad

F - ías <ll

b - - 96 Kb

= - we- 8A <b

d - B.9 OJ

d28

4, *.I.U1.1

- Doble hélice de ADN

* Sitio de restricción

Sonda

dInset-ción

I,‘. Deleción

Figura L Polimorfismo detectado por la técnica RFLP en un locus con cua-tro variantes alélicas. A) Descripción de las variantes alélicas: a) No haymutaciones. La enzima de restricción corta en tres sitios de restricción pro-duciendo dos fragmentos de ADN. Solo se detecta el fragmento que hibridacon la sonda; b) se ha producido una inserción entre los sitios de restric-ción; c) se ha producido, una mutación puntual en uno de los sitios de res-.att;tricción, de manera quela endonucleasa solo corta en dos puntos; d) se haproducido una deleción entre los sitios de restricción. Los números indicanel tamaño de los fragmentos en Kilobases (Kb). B) Visualización de los geno-tipos de siete individuos. Los cuatro primeros son homocigotas, y los tressiguientes heterocigotas para el alelo ‘a’ y otro de los alelos.

238 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTIAGO MORENO VÁSQUEZ

ciones enzima de restricción-sonda permite explorar distintas zonasdel genoma en busca de polimorfismos.

Entre las ventajas de la técnica RFLP podemos señalar lassiguientes: 1) es altamente reproducible, es decir, cuando se repite elexperimento utilizando la misma combinación enzima-sonda se obtie-nen los mismos resultados,. incluso en laboratorios diferentes; y 2)proporciona marcadores codominantes.

Sin embargo, esta técnica presenta varios inconvenientes: 1)para detectar diferencias entre cultivares o poblaciones, es necesariodisponer de numerosas sondas. En ocasiones, se pueden utilizarsondas de otras especies relacionadas (sondas heterólogas) en cuyocaso la técnica se puede aplicar directamente; pero si esto no es posi-ble hay que aislar nuevas sondas, lo cual requiere un considerableesfuerzo en tiempo y dinero; 2) el proceso para su obtención és largoy laborioso; 3) se necesitan grandes cantidades de ADN (10 pg porensayo) y de buena calidad para que la digestión sea completa y lareproducibilidad elevada. Cuando el tejido utilizado para la extrac-ción tiene altos contenidos en polifenoles o polisacáridos cumplireste requerimiento puede resultar difícil; y 4) el coste, tanto eninfraestructura como en fungible, es elevado.

Minisatélites

Dentro del ADN genómico existen unas regiones denominadasminisatélites (Jeffreys et al. 1985) que están formadas por la repeti-ción en tándem de unidades de 10 a 60 pb. El número de repeticionespor locus es variable incluso entre individuos emparentados.

La metodología es muy similar a los RFLPs; pero en este caso seutiliza como sonda un minisatélite, que normalmente permite explo-rar simultáneamente numerosos loci.

El polimorfismo detectado por los minisatélites se debe a dife-rencias en la longitud de los fragmentos de restricción que se corres-ponden con variaciones en el número de repeticiones de la unidadbásica del minisatélite en los distintos individuos analizados. Estetipo de polimorfismo se denomina VNTR (Variable Number of TandemRepeats).

MARCADORES MOLECULARESBASADOSENADN 239

Entre las ventajas de los minisatélites podemos señalar lassiguientes: 1) no se requiere información previa del genoma; 2) losresultados son altamente reproducibles, incluso en laboratorios dife-rentes; 3) los loci minisatélites son abundantes en el genoma; y 4) sonmuy polimórficos.

Los inconvenientes son similares a los de los RFLPs: 1) el proce-so para su obtención es largo y Iaborioso; 2) se necesitan grandescantidades de ADN (10 pg por ensayo) y de buena calidad para que ladigestión sea completa y la reproducibilidad elevada; 3) el coste,tanto en infraestructura como en fungible, es elevado; y 4) son mar-cadores dominantes (a diferencia de los RPLPs).

RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNAs)

Desde comienzos de los 90, se han desarrollado una serie de téc-nicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (vercuadro de la página 239) que, a diferencia del método básico de PCR,no requieren un conocimiento previo de secuencias específicas ogenes de los organismos examinados. Entre ellas la PCR/RAPD(Williams et al. 1990) es la más utilizada debido a su sencillez. En cadareacción se utiliza un único cebador más corto (6-10 nucleótidos) quelos generalmente empleados para amplificar fragmentos específicos,con las únicas limitaciones de poseer un contenido en G+C compren-dido entre el 50-70 % y carecer de secuencias palindrómicas de másde 6 bases. Distintos laboratorios ofrecen cebadores especialmentediseñados para el ensayo RAPD, a priori utilizables en un ampliorango de especies que incluye tanto organismos eucariotas comoprocariotas, y tanto para su uso con ADN nuclear como con ADN plas-tídico (http://web712dO.ntx.net/ss2bl/stockproducts/; http://www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers.html). Un programa típico dePCR/RAPD consta de unos 3545 ciclos, cada uno con las etapas dedesnaturalización del ADN molde, unión y elongación del cebador. Latemperatura de unión del cebador debe estar entre 35-37 “C. Al tra-tarse de un cebador corto, por encima de 38-40 “C no suele permane-cer unido al ADN molde, y por debajo de 35 “C el porcentaje de unio-nes inespecíficas es elevado.

240 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTIAGO MORENO VÁSQUEZ

La técnica consta de las etapas siguientes:1. Extracción del ADN.2. Amplificación de los fragmentos de ADN mediante PCR.3. Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis en geles

de agarosa.4. Tinción de los fragmentos de ADN con bromuro de etidio y

visualización con iuz ultravioleta.El polimorfismo detectado mediante RAPDs es de tipo presen:

cia/ausencia y se debe a mutaciones en la secuencia del ADN moldea la que se une el cebador, o bien a inserciones o deleciones entre lasdos zonas de unión de los cebadores.

Esta técnica ofrece las siguientes ventajas: 1) no se precisa unconocimiento previo del genoma; 2) se necesitan pequeñas cantida-des de ADN (5-50 ng de ADN por reacción). Esto es especialmenteimportante cuando se trabaja con especies amenazadas; 3) los méto-dos de extracción de ADN son sencillos, ya que es suficiente-un ADNmolde de calidad media para obtener buenas amplificaciones; 4) encomparación con otras técnicas, el coste en infraestructura es medio.Básicamente se necesita un termociclador, un equipo de electrofore-sis y una fuente de luz ultravioleta; 5) los ensayos son fáciles y rápi-dos; 6) son marcadores abundantes en el genoma y se encuentrandistribuidos al azar; y 7) el número de polimorfismos que se puedenencontrar es teóricamente ilimitado. i.

Los principales inconvenientes de esta técnica son: 1) la bajareproducibilidad de los fragmentos amplificados, especialmente delos de alto peso molecular (>1600 pb). Desde que se describió estemarcador, numerosos trabajos han mostrado que pequeños cambiosen las condiciones de reacción, tales como el tipo de polimerasa, laconcentración de ADN molde, la concentración de cloruro de magne-sio, las condiciones de temperatura de la reacción de amplificación oel termociclador pueden modificar el patrón de los fragmentos RAPDsobtenidos (Williams et al. 1990; Ellsworth et al. 1993; Schweder et al.1995; Pérez et al. 1998). Sin embargo, los resultados de diversos auto-res parecen indicar que, una vez optimizadas las condiciones de reac-

MARCADORES MOLECULARESBASDOSENADN 241

Los tres pasos de la técnica PCR

La reacción en cadena de la polimerasa más conocida como PCR (PofymeraseChain Reaction) es una técnica que permite producir in uitro muchas copias de uno omás fragmentos especificos a partir de un ADN molde de una manera fácil y rápida(Saiki et al. 1985). Por analogía, se puede decir que si un libro completo representa lainformación genética de un organismo, la técnica PCR sería comparable a fotocopiaruna o varias páginas de ese libro millones de veces.

Para amplificar un determinado fragmento de ADN (secuencia diana) mediantePCR, se requiere una ADN polimerasa termoestable, dos cebadores oligonucleótidosde secuencias complementarias a las que flanquean el ADN diana, dNTPs (desoxirri-bonucleótidos trifosfatados) y ADN que contenga dicho fragmento y que sirva demolde para la obtención de nuevas copias.

La técnica PCR consiste en la repetición, entre 25-40 veces, de los tres pasossiguientes (Figura 2):

1. Desnaturalización del ADN molde. Las dos hebras de ADN se separan porcalentamiento a 92-95 “C.

2. Unión de cebadores. Los cebadores se hibridan con las secuencias que flan-quean el ADN diana. En este paso se utilizan temperaturas entre 35 y 65 “Cdependiendo de las características de los cebadores.

3. Elongación de cebadores. Cada cebador se elonga por adición repetida deuno de los cuatro dNTPs al grupo 3’OH libre de la unidad precedente. Cadaunidad monomérica colocada es complementaria a la unidad correspon-diente de la secuencia diana. La enzima que cataliza esta reacción es unaADN polimerasa termoestable con óptimo funcionamiento a 72 “C.

Un requisito imprescindible para que se produzca la amplificación es que laelongación de cada cebador se prolongue hasta llegar a incluir la secuencia del otro.Solo de esta forma cada producto de amplificación obtenido en un ciclo puede ser-vir como molde para la amplificación en el ciclo siguiente, y llegar así a producirseun incremento exponencial de los productos de PCR en función del número de ciclos.Tras los primeros ciclos, el principal producto es un fragmento de ADN de longitudexactamente igual a la suma de las longitudes de los dos cebadores y la secuencia deADN diana situada entre ellos.

La primera polimerasa que se utilizó en la PCR procedía de Escherichia cofi. Sinembargo, dado que esta enzima pierde su actividad irreversiblemente a la tempera-tura de desnaturalización del ADN (92-95 “C) y era necesario adicionar nueva poli-merasa después de cada ciclo, Saiki et al. (1988) la sustituyeron por una polimerasatermoestable aislada de Thermus aquaticus (Taq polimerasa), una bacteria aeróbicaque vive en aguas termales y duplica su ADN a elevadas temperaturas.Posteriormente se han aislado polimerasas de otros organismos termófilos comoPyrococcus woesei (Pwo), Pyrococcus furiousus (PFu), Thermococcus litoralis (Vent) oThermotoga maritima (Tma). La utilización de este tipo de polimerasas ha permitidola automatización del proceso en máquinas que controlan la temperatura en funcióndel tiempo (termocicladores).

242 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTIAGO MORENO VÁZQUEZ

7

secuencia dianaI I

ADN molde 4 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 0

1. Desnaturalización/

1 ciclo2 Unión al Cebador.

2’ copias

3. Elongación del Cebador

iiiiI

n ciclos

2’ copias

I I

i ii i

2’ copias

Cebador

Qp~ ADN pohmerasa

w,:j-. ,.--A-c smi**>.*. producto amplificadc

Figura 2. Los tres pasos de la técnica PCR. La reacción permite obtener millo-nes de copias de un fragmento del ADN molde mediante la repetición de unciclo compuesto por una etapa de desnaturalización, otra de unión de ceba-dores a las secuencias flanqueantes de dicho fragmento y una final de elon-gación de los cebadores mediante una ADN polimerasa termoestable. Losextremos 5’ de las moléculas de ADN se representan mediante un círculo.

MARCADORES MOLECULARES BASADOSEN ADN 243

ción y manteniéndolas estrictamente, se puede obtener un porcenta-je elevado de bandas repetibles intralaboratorio (Meunier & Grimont1993; Tommerup et al. 1995); 2) la incertidumbre acerca de la homolo-gía de los fragmentos amplificados de igual peso molecular, esto es, sitienen la misma secuencia. No obstante, al realizar hibridacionesSouthern sobre geles RAPD utilizando como sonda bandas RAPD, seha observado que más del 90% de las bandas que migran la mismadistancia en dos muestras de individuos de la misma especie e inclu-so de especies muy próximas son homólogas (Wilkie et al. 1993;Williams et al 1993; Rieseberg 1996); y 3) son marcadores dominantes.

Otras técnicas incluidas en este grupo son la metodología DAF(DNA Amplification Fingerprinting) (Caetano-Anollés et al. 199i) queutiliza cebadores~de 5 a 8 nucleótidos, y la técnica AP/PCR (ArbitraryPrimed PC??) (Welsh & McClelland 1990) que utiliza cebadores de 20nucleótidos o más.AFLPS

Esta técnica fue desarrollada en 1993 por la compañía privadaKeygene, poseedora de la patente (Zabeau &Vos 1993; Vos et al. 1995). Elnombre AFLP no debe utilizarse como acrónimo tal como se hace conRFLP puesto que Amplified Fragment Length Polymorphism fue propues-to anteriormente por otros autores para denominar todas las técnicasen las que el polimorfismo se basa en diferencias de longitud de los frag-mentos amplificados (por ej. STMS, Sequence-tagged microsatellites).Además, este nuevo marcador molecular detecta la presencia o ausen-cia de los fragmentos de restricción más que diferencias de longitud. Apesar de esto, es muy frecuente encontrarlo citado de esa forma.

El fundamento de esta técnica es simple y combina las metodo-logías RFLP y PCR (http://www.keygene.com/html/aflp.htm). Básica-mente consiste en lo siguiente (Figura 3):

1. Extracción de ADN.2. Tratamiento con dos enzimas de restricción específicas.3. Adición de pequeños oligonucleótidos de secuencia conocida

(adaptadores) que se unen a los extremos de los fragmentos derestricción por acción de una ligasa.

244 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTIAGO MORENO VÁSQUEZ

4. Marcaje de uno de los cebadores con 33P.5. Amplificación selectiva de los fragmentos de restricción utili-

zando dos cebadores especiales. Cada cebador consta de dospartes: una secuencia complementaria al adaptador y al sitio derestricción en el extremo 5’, y una secuencia selectiva compues-ta por l, 2 ó 3 nucleótidos en el extremo 3’. Esta secuencia haceque sólo amplifiquen aquellos fragmentos de restricción quetengan la secuencia complementaria al nucleótido o nucleótidosadicionales.

6. Separación de los fragmentos amplificados por electroforesis engeles de poliacrilamida (v. http://www.cpro.dlo.nl/cgn/lettuce/sla-tour3.html).

7. Visualización por autorradiografía.En la actualidad existen protocolos que evitan el uso de radiacti-

vidad utilizando cebadores sin marcar o bien marcados con sustratosfluorescentes. En el primer caso, la visualización se realiza mediantetinción con plata 0 quimioluminescencia (Lin et al. 1997) y en elsegundo mediante secuenciadores automáticos.

El goliaaaofisaaao detectado mediante AFLPs puede resultar devarios tipos de cambios: 1) mutaciones en los sitios de restricción oen la secuencia complementaria a los nucleótidos selectivos de loscebadores; y 2) inserciones o deleciones dentro de los fragmentos derestricción, lo cual se pone de manifiesto por la presencia de bandasde diferentes tamaños.

Las ventajas más importantes de esta técnica son: 1) no serequiere un conocimiento previo del genoma; 2) mayor eficiencia (nobandas/reacción) para encontrar polimorfismos frente a otras técni-cas como RAPD y minisatélites. En general, en cada amplificación seobtienen entre 50-100 fragmentos por muestra; 3) las regiones que seanalizan se encuentran distribuidas por todo el genoma; y 4) la repro-ducibilidad es alta.

Entre los inconvenientes hay que señalar los siguientes: 1) senecesita ADN de buena calidad y en cantidades entre 0,3 y 1,0 kg porreacción; 2) el elevado coste tanto en fungible como en infraestructu-

MARCADORES MOLECULARES BASADOS EN ADN 245

Figura 3. Pasos para la obtención de AFLPs. Inicialmente se procede a unadigestión total del ADN con dos enzimas de restricción. A continuación seadicionan dos adaptadores que se unen a los extremos de los fragmentos derestricción. Finalmente se realiza una amplificación selectiva usando doscebadores especiales. Cada cebador consta de una secuencia que es com-plementaria al adaptador y al sitio de restricción en su extremo 5’, y de unasecuencia selectiva de l, 2 ó 3 nucleótidos arbitrarios en el extremo 3’. Estosnucleótidos adicionales tienen por objeto reducir el número de fragmentosde restricción que pueden ser amplificados.

246 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTLAGO MORENO VÁZQUEZ

ra; 3) en la mayoría de los casos los AFLPs se analizan como marcado-res dominantes. Aunque se ha desarrollado un software que permitediferenciar heterocigotos y hornocigotos dominantes en función de laintensidad de bandas (http://www.kevgene-products.com/html/aflp-quantar-pro.htm), su elevado coste hace que se haya difundido poco;y 4) la incertidumbre acerca de la homología de los fragmentos ampli-ficados de igual peso molecular.

Se ha desarrollado un método que dirige la técnica AFLP ‘prefe-rentemente hacia el estudio de regiones microsatélites (Hill et al.1996). En este caso, uno de los dos cebadores AFLP es sustituido poruna secuencia microsatélite compuesta. El polimorfismo detectadopresumiblemente se deba a variaciones de la unidad repetida..

Microsatélites

Además de los minisatélites, existe otro tipo de ADN repetitivo alque se denomina SSRs (Simple Sequence Repeats). Al .igual que losminisatélites, estas regiones están formadas por la repetición en tán-dem de secuencias de ADN; pero en este caso son de menos de 100 pbde longitud y las unidades que se repiten más cortas (1 a 10 pb). Lasrepeticiones más comunes en plantas son de dos nucleótidos, espe-cialmente las secuencias (AT/TA),. Las regiones SSR también secaracterizan por ser hipervariables, de manera que su análisis resul-ta muy adecuado para distinguir individuos muy emparentados,como por ejemplo los pertenecientes a una misma población.

El término microsatélite fue introducido por Litt & Luty (1989)para describir un nuevo marcador que permite analizar estas regio-nes mediante PCR. Para ello, es necesario diseñar dos cebadores(generalmente de más de 20 nucleótidos) que sean complementariosa las secuencias que flanquean la región SSR que se quiere amplificar.Las condiciones de amplificación son más restrictivas que las emple-adas en la técnica RAPD, así la temperatura de unión del cebador estápor encima de 45 “C.

La técnica consta de las etapas siguientes:1. Extracción de ADN.2. Marcaje de uno de los cebadores con 33P.

MARCADORES MOLECULARES BASADOS ENmN 247

3. Amplificación de los fragmentos de ADN mediante PCR.4. Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis en geles

de poliacrilamida (v. http://www.cpro.dlo.nl/cgn/lettuce/sla-tour4.html).

5. Visualización mediante autorradiografía.El uso de radiactividad se puede eliminar utilizando cebadores

sin marcar o bien marcados con sustancias fluorescentes. En el pri-mer caso, la visualización de los fragmentos amplificados se realizamediante tinción con plata, y en el segundo la detección se lleva acabo en secuenciadores automáticos.

El polimorfismo que se detecta mediante esta técnica se debe adiferencias en la longitud de los fragmentos amplificados que secorresponden con variaciones en el número de repeticiones de la uni-dad básica del microsatélite en los distintos individuos analizados.Cada longitud representa un alelo en ese locus microsatélite.

Entre las ventajas de esta técnica podemos señalar las siguientes:1) la cantidad de ADN que se necesita para la amplificación es pequeña(550 ng por reacción); 2) los loci microsatélite son muy abundantes enel genoma; 3) son hipervariables, por lo que es frecuente encontrar 4,5o más alelos por locus. Esto proporciona un elevado polimorfismo ypermite distinguir muchos individuos analizando muy pocos loci; 4) sonmarcadores codominantes; 5) los resultados son intercambiables entrelaboratorios puesto que la técnica es altamente reproducible; y 6)puede automatizarse todo el proceso.

El principal inconveniente es la localización y caracterización demicrosatélites útiles, así como el diseño de cebadores adecuados.Una vez que se dispone de los cebadores, el ensayo es sencillo y rápi-do. Lo más habitual es que los cebadores utilizados para analizar unmicrosatélite en una determinada especie no sean utilizables en otrasespecies aunque sean cercanas (Echt & MayMarquardt 1997;Witsenboer et al. 1997). Otro de los inconvenientes es la imposibilidadde diferenciar entre individuos heterocigotos y hornocigotos cuandoexisten alelos nulos debido a alguna mutación en el lugar de unióndel cebador.

248 M. ELENA TORRES LAMAS & SANTIAGO MOREN? VÁZQUEZ

PCR-intermicrosatélitesMediante la técnica PCR-intermicrosatélites o ISSR-PCR (Inter

Simple Sequence Repeat-PCR) (Zietkiewicz et al. 1994) es posible reali-zar una aproximación a las regiones microsatélites sin necesidad deun conocimiento previo sobre las mismas. Como en el ensayo RAPD,se utiliza un único cebador, pero en este caso es de mayor longitud(1422 nucleótidos) y de secuencia tipo microsatélite. Es frecuenteque lleven 1 a 3 nucleótidos arbitrarios en uno de sus extremos(‘anclaje’). Este anclaje tiene por objeto que la amplificación sea más

producto PCRcebador con anclaie en 3’

producto PCRcebador con anclaje en 5’

Figura 4. PCR-intermicrosatélites. Las amplificaciones se realizan general-mente con un cebador de secuencia microsatélite (CA), más 1,2 ó 3 nucleó-tidos, bien en su extremo 5’ (flechas verdes) bien en su extremo 3’ (flechasrojas). Estos nucleótidos adicionales tienen por objeto reducir el número deADNs molde que pueden ser amplificados. El resultado de la amplificaciónson varias secuencias genómicas flanqueadas por dos elementos (CA),inversamente orientados (Zietkiewicz et al. 1994, modificado).

MARCADORES MOLECULARES BASADOSEN~N 249

específica, restringiéndose solo a una parte de los loci que contienenel microsatélite analizado (Figura 4). Un programa típico de ISSR-PCRconsta de unos 30-45 ciclos, cada uno con las etapas de desnaturali-zación del ADN, unión y elongación del cebador. La temperatura deunión del cebador varía entre 40-60 “C.

La técnica consta de las etapas siguientes:

1. Extracción del ADN.2. Marcaje del cebador con 33P.3. Amplificación de los fragmentos de ADN mediante PCR.4. Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis en geles

de poliacrilamida.5. Visualización mediante autorradiografía.

Al igual que en otras técnicas, se puede evitar el uso de radiacti-vidad utilizando cebadores sin marcar. En ese caso los fragmentosamplificados se pueden visualizar mediante tinción con plata (si laelectroforesis se realiza sobre geles de poliacrilamida) o con bromu-ro de etidio (si se emplean geles de agarosa).

El p&mwEsrno detectado mediante ISSR se debe a cambios en lasecuencia del ADN molde en la zona de unión de los cebadores, así comoinserciones y deleciones que se hayan producido entre las dos zonas deunión de los cebadores, y es interpretado como presencia/ausencia.

Las ventajas son similares a las que se han descrito para los RAPDsya que no se requiere información previa del genoma y las cantidades deADN utilizadas son pequeñas (550 ng por reacción). Sin embargo, dadoque los cebadores que se emplean son más largos y la temperatura deunión del cebador es más alta, los resultados son más reproducibles.

Entre los inconvenientes hay que señalar la incertidumbre sobrela homología de los fragmentos amplificados de igual tamaño y elposeer herencia dominante.

Tabla I. Resumen de las características de los marcadores moleculares basados en ADN más utilizados en el estu-dio y conservación de recursos fitogenéticos

N O

Camblos en et nrimero derepfklones de la unldadb&sica demm del m;n¡sal&¡¡

Mini.sai&Res

Enzimas 08 msldaibn (2) /Ugasa PCR con 2 w’badores essecificos/PCR con 2 cebadores (1417ní)cxmpiemenladas B” su mayor+i a adqtadoms -

NO

(so ni)

sí NO

CambIos e” .sl número derepeticiones de ia unidad b&icademm dei micr@sav%m

npo 69 loel

Grado depolimofismo

Llomlname

Aumnadiogmfia/ ñwesmncwûuimlo~uminlscancia/ Plata

Repotibilidad

Coste deínfnlemruciua

Mejor que RAPDs

Coste de fungible

Coste do dssarmilo

MBdlo

aap

MARCADORES MOLECULARES BASADOS EN ADN 251

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