2
Pulkkinen L, Christiano AM, Gerecke DR, Wagman DW, Burgeson RE, Pittelkow MR, Uitto J: A homozygous nonsense mutation in the b3 chain gene of laminin 5 (LAMB3) in Herlitz junctional epidermolysis bullosa. Genomics 24:357±360, 1994b Pulkkinen L, Kurtz K, Xu Y, Buckner-Tuderman L, Uitto J: Genomic organization of the integrin beta 4 gene (ITGB4): a homozygous splice-site mutation in a patient with pyloric atresia. Lab Invest 76:823±833, 1997 Sonnenberg A, Calabat J, Janssen H, et al: Integrin a6/b4 complex is localized in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. J Cell Biol 113:907±917, 1991 Vidal F, Aberdam D, Christiano AM, Uitto J, Ortonne J-P, Meneguzzi G: Mutations in the gene for the integrin b4 subunit are associated with junctional epidermolysis bullosa with pyloric atresia. Nature Genet 10:229± 234, 1995 Long-Term Culture of Murine Epidermal Keratinocytes To the Editor: A recent JID paper by Hager et al reported the establishment of long-term mouse keratinocyte cultures isolated from the skin of C57/BL6 mice (Hager et al, 1999). Seeding of the keratinocytes on collagen IV, and the use of conditioned medium with special handling conditions, allowed the extension of the cultures up to passage 19. Cells had retained their capacity to differentiate only up to passage 10, however. We recently also established long-term mouse keratinocyte cultures from mice with the same genetic background as used in the study by Hager et al. Because the culture conditions are more simple and cells were maintained until passages 61, so far retaining their ability to differentiate, we would like to bring this alternative protocol to your attention. Primary mouse keratinocytes were isolated using a modi®ed protocol of this described for the establishment of long-term canine keratinocyte cultures (Wilkinson et al, 1987). Brie¯y, the skin of a 17.5-d-old embryo was removed and incubated for 7 h in de®ned keratino- cyte-SFM (Gibco-BRL #10744±019) with 5 U per ml Dispase II (10 mg per ml, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) and 103 antibiotics/antimycotics (1000 U per ml penicillin, 1 mg per ml streptomycin, 2.5 mg per ml amphotericin; Gibco/BRL, Basal, Switzerland) at 4°C. The epidermis was then separated from the dermis with scalpel and forceps, cut into pieces, and trypsinized (0.25%/0.1% trypsin-EDTA; Bioconcept, Allschwil, Switzerland) for 10 min. Cells were seeded at a density of 5 3 10 4 cells per cm 2 on uncoated culture ¯asks in de®ned keratinocyte-SFM, supple- mented with 10 ng per ml EGF and 10 ±10 M choleratoxin. This culture medium contains 0.07 mM calcium, a concentration reported to support proliferation of mouse and human keratinocyte cultures (Hennings et al, 1980; Jensen et al, 1990). At con¯uency, cells were subcultured by trypsinization (0.125%/0.05% trypsin- EDTA) and seeded at 3 3 10 4 cells per cm 2 in new culture ¯asks. Manuscript received November 24, 1999; accepted for publication February 28, 2000. Reprint requests to: Dr. Eliane Mu Èller, Institut fu Èr Tierpathologie, La Ènggassstrasse 122, CH-3012 Bern, Switzerland. Figure 1. Calcium-dependent differentiation of long-term mouse keratinocytes from various passages. (A) Immuno¯uorescence studies using an anti-pan-keratin antibody (LP34, DAKO) revealed the establish- ment of a well-organized keratin network anchoring to the plasma membrane within 6 h after elevation of the calcium concentration in the medium to 1.2 mM. The stabilization of adhesion structure components at cell±cell boarders indicated formation of cadherin-mediated intercellular adhesion structures within the same time frame, as assessed by E-cadherin staining (DECMA, a kind gift from R. Kemler, Max Plank Institute, Freiburg, Germany) and Desmoglein 3 (Dsg3) staining (our laboratory; antibodies were raised in rabbits against the extracellular domain of baculovirus-expressed human Dsg3 (Amagai et al, 1994)). To label surface- exposed adhesion molecules, cells were incubated with the respective antibodies prior to ®xation and permeabilization. Expression of proteins can be considered as semiquantitative since staining conditions and photographic exposure time were held constant. (B) Involucrin expression in keratinocytes cultured under low calcium or high calcium conditions for 3 d was assessed by western blot analysis. Immunoblots of whole cell lysates were probed with anti-involucrin antibody (SY5, a kind gift from F. Watt, Imperial Cancer Research Fund, London, U.K.). To induce differentia- tion, calcium concentration was raised to 1.2 mM in de®ned keratinocyte- SFM (KSFM or purge KSFM) or to 1.8 mM in supplemented Williams' Medium E (WME). Purged cells were depleted from additional growth factors 1 d before calcium elevation (purge KSFM: de®ned keratinocyte- SFM culture medium without supplementation with EGF or choleratoxin). The Ponceau S-staining of the immunoblot was used to evaluate loading and transfer of the proteins. 1064 LETTERS TO THE EDITOR THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY

Long-Term Culture of Murine Epidermal Keratinocytes

  • Upload
    eliane

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

6������ � � 3�������� +5 @ � !� �� &����� �& ���� �� �� 6��� ��/5� :��� H� + ��"���� ��� �� ������� �� �� �) !���� � � %������� 4 �4���"3 �� � ����" ,��!����� ��� ������� #�����* ������2>�)4G�);? '((>#

6������ � � C���" C D� J ��!�� �8��� ���� � :��� H� @ ���! �����"����% �� ��� ���� # �� > � � ��7��#3� � ��"���� ����! 8��� ������� �� ����� �� /��� �����! ��� ���* 4�' ����� G;�72)�7)) '((G

��� �# �� + 3���#�� H H���� � � �� ��� �� ���� �;<�> !��� . �� �!���" � ��� ��� ���� � ���� ����� � ��,� �� �� ��� ���� ! ��8#�� � ��� �#��� ��� ���* � ��� ��� '')�(?G�('G '(('

I���� 9 +# ���� � 3�������� +5 :��� H ����� H86 5 � ��""� @�5������� �� �� � � %� �� ��� ���� �> ��#���� �� ���!��� � /���,��!����� ��� ������� #����� /��� �����! ��� ���* ������ ���� '?�22(�2)> '((4

�� �:��� *������ �# 9�� � >�����!� '��!� ������

� �� ������

+ � ! �� H� ��� � #� ��� � �� �� � ��� � �� ���#����� �� %���8� �� ��� � �����!�� !����� � ����� � %�� �� ���� %34G<��; ��! ���� � �� �� '(((�* � ���� % �� � �����!�� � �!���� � I ��� �� �� % !������ � � ���� /��� �� !����������� !������� ���/ � �� .� ���� % �� !����� � �� ������� '(* 3 ��� ��� � ���� � �� �� !���!��� � ��%% � ����� ��� ��� ������ '? �/ $ �* & � ! ���� ��� ���#���� � ���8� ����� � �����!�� !����� � %�� ��! /��� �� ��� � � ��!#�!������ �� �� � �� �� ����� #� ��� � �� ��- � !��� �� !����� !������� �� �� ����� ��� ! ��� / � �������� � ����� ������ �;' � %�� � ������� �� �� �#����� � ��%% � ����� / /��� ��� �#���� ���� ��� �����$ ���!� � ��� ��� ����* 6������ ��� � �����!�� � / � ����� � ����� � ���0 � ���!� % ����� �!��# � %� �� ���#����� �� % ���8� �� !���� � �����!�� !����� � �&������� �� �� '(7G�* ��� K� �� ���� % � 'G*48�8�� �#�� /�� � �$ � ��� ��!�#�� � %� G � �� � 0� � � �����8!�� 8�95 �@�#!8��� S'?G>>�?'(� /��� 4 : � � �� ������ �'? �� � � �� � ����� � 5���� �� 5���� �� @ ������ ���

'?� ����#���!�<������!��!� �'??? : � � �� � ��!����� ' ��� � �� ��� ����!�� 2*4�� � � �� ����� ��!��1 @�#!<��� ����� �/��" ������ �� >�3* �� ��� ���� /�� �� � � ����� � %���� � ���� /��� �!��� � ��� %�! �� !�� ��� �� ! � ��� ��������" ��?*24M<?*'M �������8���+1 ��!�! �� +���!�/�� �/��" ������%� '? ���* 3 ��� / � � � � �� � � ����� % 4� '?> ! ��� � � !�2

� ��!�� � !����� K���� �� � 0� � � �����!�� 8�95 ����� 8� �� � /��� '? �� � � �� �@9 ��� '?�'? 5 !�� ���.��* ����!����� � ���� !������ ?*?G �5 !��!��� � !�! �������� ��� � � ������ ����% ����� % ��� ��� ����� � �����!�� !����� � �� ������ �� �� '(7?1 H �� � �� �� '((?�* +� !�K� �!� ! ��� / � ��#!����� � #� ��������"���� �?*'24M<?*?4M �������8���+� ��� � � � �� )� '?> ! ��� � � !�2 �� � / !����� K����*

5����!���� � ! �$ � =$ �# � 2> '(((1 �!! �� � %� ��#��!����9 #����� 27 2???*

� ����� � -� ��� �� ��* ����� 5�N�� � ������� %�N� �� �������� ��N������������ '22 3�8)?'2 � �� �/��" �����*

���� � *!��������� �� � �##��� �!�� �# �� ����� ��������!� ������ #��� $!���� �!��!�� ��� ����K�� �! �! ����� ������ �� ����8���8� ����� ����#�� ��6)> �+C�� � $ �� � �� ���#����8� �� % � / ��8�����" � � ����� � �/�� ��!����� � �� ������� �#��� /����� ; � �%� � � $���� % �� !��!��� !�! ������� �� �� � ���� � '*2 �5* �� ���#���"���� % ��� ��� ����!��� !��� ��� ��! ���! �� #��� �� ����!�� � %������ % !��� ���8� ���� � ��� �! ��������� ��� ����!��� � /����� �� ��� ��� %��� �� ��� �� � #� �8!��� ����������� ���35+ � ���� ��%� %�� �* C �� � 5�. 6���� ������� 9� �#��� @ ������ ��� � ���� �� ) ����)� �������� ��� ��#�����1����#�� � / � ���� � �� ��##��� ������� �� .���! ������ ����� %#�!��$����8 .�� �� � ����� ���) �+����� �� �� '((>��* � ��# � ���%�! 8 .�� � ��� ��� �� !�� � ! ��� / � ��!�#�� � /��� �� � �� !��$ ����#�� � ���� � 0.���� ��� � �� �#���"����* �.�� ���� % ��� ���!�� # !���� � � �� � ��-���������$ ���! �������� !������� ������������! .���� ��� / � � �� !������* ��� �$��!��� .�� ������ � �����!�� � !����� � ��� � �/ !��!��� � ���� !��!��� !������� %�) � /�� ��� �� � #� / �� �� #�� ��������* ����#��� % /�� ! �� ����� �/ � ��# � /��� ����8��$��!��� ����#�� ��J4 � ���� ��%� %�� 9* &��� �� ���� 3��! � � � ��!� 9��� ���� :*C*�* � ����! ��%% � ����8��� !��!��� !�! ������� /�� ���� � � '*2 �5 �� � 0� � � �����!�� 8�95 �C�95 � ���� C�95� � � '*7 �5 �� ����� � �� � &�������B5 ���� � �&5��* 6��� � ! ��� / � � �� � � %�� ��������� ��/��%�!��� ' � # %� !��!��� � $���� ����� C�95� � 0� � � �����!�� 8�95 !����� � ���� /����� ����� � ������ /��� �@9 � !�� ���.���*�� 6�! �� �8�������� % �� �����#�� /�� �� � � $����� ��������� �����% � % �� ��� ���*

���4 ������� �� ��� ����� ��� H�:�=+� �9 =I���@+�I� ���5+����@J

+%� � �� 0��� ������ � �����!�� � ����� � � ����% ��� /��� �!������ ��#���� ��� % 2 �* �� ��� ��! ��� /�� �� � � ���#���� ���8� �� � �����!�� !����� � %�� ��� �#��� /���� ��%% � �� � � ��! #�!������ �3��� ���� �� �� ����#���� � �����* ������ # � ���� � �� ������� ���� � �� !��� !����� ����������� !������� / � � -��� � !������ � �� 0������ %��� � �� �� �'(((�* =�� �� ����� ��� �� � / � ����� �� �� � ���%% � �! � / � #� �$ � /� � ������� ��������"���� /���� ���� !�������� � �/ � � ���� !��!��� !�! ������� ���! ��� / � !����� � ��� � ����� 3�2 !�� �� �4M�* & #� �$ � �/ $ � ���� � �����!�� ����% ����� /�� ����$ � /� �!����� � �� )>�3 ���� �� % )G�3*

� ��� �� �� ��%% � ������� �� ����� % �� ��� � �����!�� � / ������! � � !���� �� �� !��!���!�! ������� �� �� � ���� %�� ?*?G �5 � '*2 �5*�� $���� % �� !��!��� � $ � �� !����� ��� # � ��/� �����! ��%% � ������� % ��� ��� ����� � �����!�� ��� ������ �� �� '(7?1 H �� � �� �� '((?�* ��� � %��%% � ������� �� !����!� ��" � #� �� ���#����� �� % ! ���! ��!���!�� �� � ��� �#�� % ��� � �� ,��!���� %��/ � #�%������ % � ���� � �%� � $� / � @���� �� �� '((;1C/��!"�� �� �� '(((�* � �������� ��%% � ����� � ! ��� 0����� .�� �� ��$��!��� � ��,� ��� �� % �� !���0 � �$ �� /��!� /�� � 0� � �� ���� � %� � �����!�� � ��������%% � ������� �@���������� ��� &��� '((G1 Q�� ��� &��� '(((�* � �� ��� � �����!�� � !��!��� � $���� �� �� � ���� ����! � ������� ��%% � ��������� !���� � �� ������ 22 �� � ������ ;' �� � � #� �� %������ % � �������� � � � ����� � �/�� �� ���#���"���� % ��� ��� !��8� ��� �� �� ������ � �#��� /����� ; � �� ��� ��� �� .�� ���� % �� � ������ ��%% � ������� ���� � ��$��!��� �%� �) � �� � �* �� ����� % ��$��!��� .�� �� � /����� � �� �� % �� �� � �! � �#� �! % ��/�� %�!��� ���� !����� � ���� ���� � � $���� % �� !��!���!�! �������* �$��!��� .�� ���� /�� ��� ������� /� ������ � �� � &�������B 5 ���� � !�������� '*7 �5 !��!����&������� �� �� '(7G� /�� �� � ������ ��%% � �������*3�$ �� �� ! ��� !����$�� � �� �/ !��!��� � ���� ��/ ������ �� ��� �! ������ ���! � �� � � �� ���� !��������!��!�� ����� �� ��/�� ��� .��#�� � �/ .�� ���� %� ����� ��� ��� ��� �� !�� � �� ���* �$��!��� /�� ��

.�� �� � �� � � !��#� � $ �� �� ���� ���� * �� � �*� ������� / � ��� �� ���#����� �� % ���8� �� ���

� �����!�� !����� � /��!� / � ��/� �� � ������ ;'/����� ����� �� �� !���!��� � � ���� � �� � $���� % �� !��!��� !�! ������� �� �� � ���� #� � $ ��� �� % �/ ��8�����" � � ����� � �/�� ���#����� �� % ��� �! ��������� ��� ��� 0����� .�� ���� % �� � ������ ��%% � ����������� � ��$��!���*

7�� &��9 &�� ��������+ ', ��� %&�� ������ %���� 1��+��� "�-"8"#8-?"

� � 3��� ���� 5�,� 5* ��� � �����-� ������� +���� � ����� � ����� 5�N�� �

������� % +����� 6������ :��$ ����� % � �� � �� �/��" �����

�� ���� � �� % I � ������ ���!� �! � ��� ���� :��$ ����� 3���#�� ��� :*�*+*

��9���=3��

+����� 5 ������� � �����"� = =������/� �� +#������ % ����� ��!�������#�� � #� �� .���! ������ ����� % � ������� $������� ����� �����)� ����! � #� #�!��$����* � � ����� (>�4(�;G '((>

@���������� + &��� 95� !85�! ���� � ��%% � ������� % ����� ��� ���� �� �! ���* ���� ��� ''�27;(�2772 '((G

@���� � 3���� � 5 =��� +� � ���� �� ��%% � ������� � $ ��� �� ������!� ��� ��� �� * ��� �� ��� ��� 7�;G?�;G7 '((;

��� � � ��!� �#�!� H� 9� !���� 6� ���8� �� !����� % ����� ��� ����� �����!�� �* � ����� �������� ''2�(G'�(G; '(((

� ������ � 5�!�� � � 3� �� 3 �� �� �� 6 ��#�� C J���� ��� 3��!���� ������� % ��/�� ��� ��%% � ������� % ��� ��� ���� ! ��� �� !����� * ��� '(�2>4�24> '(7?

H �� � 6C+ =���T�� H�� C���� � 3 =� �� � I ����� �� �%% !�� % .���8 ��������! ������ !��!��� !�! ������� � �=+ � ���!���� ��� ��� ��/�� �����%% � ������� % ����� ��� ���� ! ��� �� !����� * @����&� ���� � 4(�'G�24 '((?

C/��!"�� +6 ������ � � �+ =�$ �� �5� � ���� �� ��� �! ������ ��� ��$ ,��!���� �� "����" � %� ����!�� �� % ��� �� ���� 0��� ���- �� 0�� ,���'74�2)G�)?2 '(((

&������� H� ����� 3 ��� � 5 � /�� �5� ��� � �� !����$���� % !���� � �����!�� �* � ����� �������� 77�2?2�2?; '(7G

Q�� +H &��� 95� # ��8!�� ��� ���������� ������ � ����% ����$ �� ����� % ����� ��� ���� � �����!�� � ��� � �� ���� % ��� �! ������ ��� ���* ����������'2;�2274�22(7 '(((

� (�$�� 3� � 9��!�� �# �"� ����� <� � ! =!�! ����!��� )�" �A�B�� ��!���� �� �����

� �� ������

�,N�� �������� ������ ����1 55S 2G?2??� �� �� �������� ! ���$ ����� � !����!� ��" � #� � ���� � �������� ��8 �� ����� ��� ��� !�� ����� �!������� ���"" '(()�* �� �!��������� ��� �� ������� �� � �� �� #���� #�� �� � ��$ # � � ���� % � ��!���� � �� � % �!������� �� �� �� % U ' � % �� * 5 ���� � �������� ��$����#� #�� �� � $ � �V U 4?� �� �#�� G?M % !�� �* +��������!����!�� % ���� � ��!��� ����� ���� /��� ��� � �� � ���� � �"�� � ���� ������ ��� �� !� � % !��* 6��� ��� /��� ��� ��$ � 0!� ���!��$��� % %���� ��� ��� � ����� ��� �9+���� �� �"�� ���� ��� ! ����� %� �� .������ % %���� ��!�� � %���� �!�� ��������� ��$�$ � ��� �� � !��� �� % �� %���� ��!���=+�L

.��� ��!��� �"�� !��� . ���"" ��� 3��%� '(('�*

�� 1�4�5 � � ��� # � ���� � � �� ��� �!�� � 'G�''*2��� �� �� �� '((4�* � �� ����.���� �� )' �# ��� !������ % '? .�� � ������� �� � !�=+ % '>44 #� /��!� �� �������� � ��� ���� �� /��� >74 ���� �!��� ��� �� �� �� '((G�* � � / � ��� ��$ � ���� ������� �� �� 1�4�5 � � �+�@ �����$ ���� ����!� ��� ''4G� � ������� �� �� !���� % ��������� � � ��� ������ �!�� )7; �* * =)7;� ��� ��/ �� ��!! ��%�� �=+�������� �� � %�����*

+ ' � �� ���� $���� � �� ���$ ����� !����! � H��� 'G '(((* �� �� � �� � /��� !�� ����� �!������� ��� ��/ � ������! � ����� ������ � ���� � ��������* �������! .�������� � $ �� � �����8� �� ������ �!������� ��� ������������ ��� �� �������� ! ����� � % �� ��� ���� /�� �������� ���!� � �* +�!�� � ����8� ��� �������� /�� � �%�� � � �� ���� % ���� ���� �� ��� ������ !���� �%� � %� "��� �� ����� � �� �� �3� !������!!����� � �� � ��� % H��� �� �� �'((?� ��� � $ �� � �� ��!��� �� ��!�� � ����� ��� �!��$��� ��� �� �� ���� ��B�����* � � ��� ��� / � �� � ����$ � ��� #�� % �� � / � � �����*

+%� � ��%�� � !�� �� #�� ����� � / � !�� !� � ���� ���! �=+ / � .���!� � %�� �� #�%%� !��� �V+@�= ���� � @ ������* @ ���! �=+ %�� ����� � ����� H���� �

5����!���� � ! �$ � H������ )' 2???1 �!! �� � %� ��#��!���� 9 #�����'; 2???*

� ����� � -� ��� �� ��* =����� +�� � ����� �� % � ������� =������ :��$ ����� �!�� % 5 ��!�� +������!��8��� =������ (4'�74'? H����*

I��* ''> =�* 4 5+J 2??? ������� �� ��� ����� ����