1  

Live Cell Imaging: The Future for Discoveries 

Webinar 22 May 2013 

 [0:00:15] Slide 1 Sean Sanders:  Hello everyone and welcome to this Science/AAAS webinar. I’m Sean 

Sanders, editor for custom publishing at Science.    For a variety of practical reasons, cellular  imaging  is currently most 

often  performed  on  specimens  that  have  been  fixed  and  labeled. However,  live  cell  imaging although  technically more  challenging  is often preferred as it enables researchers to study cellular events and dynamic  processes  that  cannot  be  visualized  in  fixed  specimens allowing them to gain deeper insights into the complex mechanisms of cell biology.  

   In today’s webinar, we will explore the benefits of  imaging  live cells 

and  discuss  how  to  overcome  some  of  the  technical  challenges  in this  type  of  imaging  modality.  It’s  my  pleasure  to  introduce  my guests  for  today’s  event.  To my  left  is Dr.  Edward  Campbell  from Loyola University  in Chicago. Next to him, we have Dr. Nick Thomas from GE Healthcare  in Cardiff, Wales and  finally we have Dr. Lynne Turnbull  who  has  joined  us  all  the  way  from  the  University  of Technology  in Sydney, Australia. Thank you so much  for being with us. Great to have you. 

 Dr. Nick Thomas:  Thank you Sean.  Dr. Edward Campbell:  Thanks.  Sean Sanders:  Before we  get  started,  I have  some  important  information  for our 

audience. Note  that  you  can  resize or hide  any of  the windows  in your  viewing  console.  The  widgets  at  the  bottom  of  the  console control  what  you  see.  Click  on  these  to  see  the  speaker  bios, additional  information  about  technologies  related  to  today's discussion, or to download a PDF of the slides. 

   Each of our guests will give a short presentation followed by a Q&A 

session  during  which  our  panelists  will  address  the  questions 

 

2  

submitted by our live online viewers. So if you're joining us live, start thinking about some questions now and submit them at any time by typing them into the box on the bottom left of your viewing console and clicking the submit button. If you can't see this box, just click the red Q&A widget at  the bottom of  the  screen. Please  remember as usual keep your questions short and concise, as  this will give  them the best chance of being put to the panel. 

   You can also  log  in to your Facebook, Twitter, or LinkedIn accounts 

during the webinar to post updates or send tweets about the event, just  click  the  relevant  widgets  at  the  bottom  of  the  screen.  For tweets, you can add the hash tag, #sciencewebinar. 

   A  quick  note  that  in  today’s  presentation  there  are  a  number  of 

videos.  If  your  connection  is  not  very  strong,  it might  take  a  few seconds for these to upload so please do be patient.  If you do miss the videos, you will be able  to watch  this webinar again when  it  is released as an on‐demand presentation within a day or two. 

   Finally, thank you to GE Healthcare for sponsoring today's webinar.  Slide 2   Now,  I'd  like  to  introduce  our  first  speaker  for  today, Dr.  Edward 

Campbell.  Dr.  Campbell  completed  both  his  undergraduate  and graduate  studies  at  the  University  of  Illinois,  at  the  Champaign‐Urbana  and  Chicago  campuses,  respectively.  Dr.  Campbell  is currently an assistant professor at Loyola University Stritch School of Medicine  in  Chicago.  His  research  focuses  on  the mechanisms  by which endogenous cellular proteins  impact  retroviral  replication.  In this work, Dr. Campbell has made extensive use of quantitative, live cell  imaging  techniques  to  monitor  the  formation  of  TRIM5α assemblies  around  HIV‐1  virions  during  restriction.  Welcome,  Dr. Campbell. 

 Slide 3 Dr. Edward Campbell:  Thank you, Sean. I appreciate being here. So what I’d like to do is talk 

to you today about some of the ways that we’ve utilized cell imaging in our research. 

 Slide 4   But  I’d  actually  like  to  start  out  by  laying  some  groundwork  and 

establishing or explaining to you a  lot of the things that maybe new users that aren’t familiar with live cell imaging can do to enhance the likelihood that their experiment succeeds. Because  live cell  imaging 

 

3  

as  Sean  mentioned  is  not  a  trivial  thing  and  I  have  kind  of  an anecdote up here that happens all the time  in my  lab. When I ask a student how that live cell imaging went, he or she will say something along the lines of it was more of a dead cell imaging experiment but I learned  a  lot  of  things  about  apoptosis  but,  you  know,  since  we study viruses, apoptosis is not very valuable to us. 

 Slide 5 to Slide 6   So how can we approach our experiments in a way that allows us to 

image  live  cells? Because obviously  I  think we  could  all  agree  that that’s a pretty important aspect of live cell imaging. So the first thing that  I want  to  emphasize  is  the  importance  of  keeping  your  cells happy not  just during your experiment but  in the period  leading up to that. A  lot of these experiments can either work or not based on your relationship that you have with your cells.  

 Slide 7   So  the  foundation  of  that  relationship,  right,  is  tissue  culture.  You 

know, in many ways my relationship with cells when I culture them is very much  like my  relationship with my wife. Maybe  it’s  not  like every marriage  but,  you  know,  you  come  in  on Monday  and  your cells got a little overgrown, they look unhappy, their media is yellow and  then  you passage  them  and  the media  looks better  then next day and they look a little bit better and you think, oh, they’ve totally forgiven me  for  that,  right? Well  they haven’t,  right. What  they’re going to do is remind you of your misdeeds when you need them to perform the most. 

[0:05:05]   A key to keeping your cells alive during a live cell imaging experiment 

is making sure that they know that you love them well in advance of that because  it’s  just  a matter of  fact  that happy  cells  live  longer. Since really our goal  is to extract all of the  information that we can from  them before  they make  the ultimate  sacrifice  in many  cases, the goal of going in with happy cells that can’t be understated. 

   Something  else  that,  you  know,  a  lot  of  people  that  use  the 

microscope  in my  lab  they’ll  come  in with  transfected  cells.  I  also want  to  emphasize  the  importance  between  transfection  and transduction. So you know no one has ever rained liposomes on my head right, but I can tell from looking at transfected cells that they’re fundamentally  less happy  than say cells  that have been  transduced with a  retroviral  vector or a  lentiviral  vector. Viruses have evolved for millions of years to not really  let the cell know that they should be upset, right. Exploit this. If you make a stable cell  line expressing 

 

4  

your GFP or your Cherry proteins, by the time you get them into your experiment, they’re not going to really remember the assault if they remember  it at all,  right. The  transient  transfection  you’re  starting from behind the eight ball right, you know, from the beginning of the experiment.  

 Slide 8   So what  can we  do  to  improve  viability  during  an  experiment?  So 

there are many ways that one can do this. So you can see here is the microscope  in my  lab where we  have  an  environmental  chamber. We keep the cells at 37 degrees. We pump CO2 over them. But those things, you know, those are great  if you have them. If you have the means,  I highly  recommend you pick up  things  like  this. But we’ve done a lot of live cell imaging before these technologies existed and there’s  a  lot  of  alternatives  to  environmental  chambers  that  you might be able to do at your university even if you don’t have access to  things  like  this.  Using  things  like  CO2  independent media  or  a buffer to keep the pH of your media at an appropriate level to keep your  cells  happy,  the  importance  of  these  things  cannot  be understated. 

   Again, humidity, evaporation  is a big deal over  the course of a  live 

cell imaging experiment. We use Kimwipe wicks. You can keep water in  the  environmental  chambers.  The  humidity  there  is  a  very important thing because, you know, when you evaporate water from the media in which your cells are, the concentration of all the solutes in  that media  changes  and  those  are  precisely  calibrated  to  keep your cells happy, right. So appreciate that evaporation is a big deal in live cell imaging experiments.  

   Also  temperature,  if  you  don’t  have  an  environmental  chamber, 

which can be pretty pricey, there’s  lens collars that you can at  least keep  that objective  that  you’re bringing up  to  your  specimen  at  a temperature that’s more consistent with the viability of cells. These are  the  little  things  that  you  can do  to  kind of on  the  cheap  keep your  cells  happy  and  alive  through  the  course  of  your  imaging experiment. 

 Slide 9   So  the next  thing  I want  to emphasize  is  the  idea  that especially  in 

live cell imaging, less is more, okay.   Slide 10 

 

5  

  When  you’re  imaging  a  fixed  cell  or  in  fixed  cell  imaging,  right, essentially the rules are price  is right rules. You want to use the full dynamic range of your detector without going over. Live cell imaging it’s  important  to  appreciate  that  quite  the  opposite  is  true,  right. When you’re setting up an experiment, you don’t need that picture to  look beautiful  in your first frame because  if you do, usually what you’re doing  is you’re acquiring much more signal than you need  in that frame and the consequences of that over time is going to be the graph you can see on the left. You have a great first picture but you have rapid photo bleaching. Often your cells will die, you know. But if  you  tolerate what  you  consider  to be, on  your monitor,  an ugly first picture, what that will do  is that will give you signal that’s well above background that you’d be surprised how little signal you need to be able to move forward with an experiment. 

   You will always going to have some element of photo bleaching. You 

can  see  I have  kind of drawn  that  in  there. But  starting out  really seeing  how  little  signal  you  can work with  is  always  a  better  idea than working  from  that other end because  I  can  tell  that you  that that’s an unpleasant experience. 

 Slide 11 to slide 12   And so finally live cell imaging is just that. It’s a dynamic relationship 

and experiment where  you have  to monitor how  things are going. Pay attention. Assess the quality of your data as it is being acquired. So sometimes, if you want to measure specific aspects of biology or in our case  infection,  it’s difficult to know  if you had an experiment succeed when you’re acquiring  it. But  I could also  tell you  that  the failures  are  usually  quite  obvious,  right.  The  number  of  times  I’ve come in and somebody is kind of sitting by the microscope and I can see  in a moment  that  their cell  is dead,  it maybe even has  floated away, right. Stop taking pictures, find a new cell. 

   These things seem  like simple things but they’re really  important to 

getting the most amount of data that you can while your cells are on the stage. Then finally don’t take it so hard. If you think that live cell imaging is hard and you need an expert to do it, I think that perhaps the  people  on  this  panel  really  just  have  an  excessively  high tolerance for pain, right. 

[0:10:17]   Live  cell  imaging  is  always  an  iterative  series  of  less  spectacular 

failures.  So  if  your  cells  are dying,  it’s not because  you’re doing  it wrong. Just change your technique or your approach slightly and try to get a little bit better. That’s something that we all go through and 

 

6  

you know you shouldn’t feel bad about  it or make yourself feel  like it’s never going to work.  

 Slide 13   So from there, what I’d like to do is talk a little bit about some of the 

ways we’ve used live cell imaging to approach some of the questions that  we  ask  in  my  lab.  So  the  primary  focus  of  my  lab  is understanding how restriction factors,  in this case TRIM5α, which  is protein from rhesus macaques can  inhibit HIV1  infection. So to give you a little bit of the punch line, because I really want to focus on the techniques rather than the biology of  it all,  is TRIM5α restricts viral infection  very quickly after  the  virus has entered  the  cytoplasm.  It does that by what we think is forming a hexameric lattice around the viral  core.  The  data  I’m  going  to  show  you  are  data  that  we generated well before we appreciated what these assemblies might look like. 

 Slide 14   But so when we’re studying this, what we had in the lab is the ability 

to  fluorescently  label  individual  viral  particles  with  a  GFP‐VPR protein. So what you can see this on the red color is this red TRIM5α protein  and  in  these  cells  what  we’ve  done  is  we’ve  arrested restriction. We could basically phase  restriction  into  two  steps and arrest the second one by adding a proteasome inhibitor.  

 Slide 15 to Slide 16   In that case  if you do that and you ask where did the virus end up, 

the virus ends up arrested  in these cytoplasmic body complexes.  In this  case  by  preventing  the  TRIM  protein  from  degrading  or destroying  the  virus,  we  could  get  these  very  beautiful  fixed  cell images  of  the  interaction  between  TRIM5α  and HIV. But  getting  a fixed cell image of this interaction in the absence of drug prove to be very difficult and  that’s when we had  to switch  to  live cell  imaging approaches.  

 Slide 17 to Slide 18   Now here I’m going to switch colors on you here a little bit. We can 

now fluorescently label our HIV virus with a Cherry‐VPR protein and we’re going to use it to infect a cell line expressing YFP TRIM5α and we can see why it was so hard for me at the time to get some fixed cell images showing these complexes. 

 Slide 19 

 

7  

  What  you  can  see  here  if  you  focus  on  the  larger  red  dot  that  is moving a little bit, you’ll see that separate into two red puncta. What we believe that is, is one of the viruses is escaping an endosome and what you can see is the formation of one of these cytoplasmic bodies around that virus that escapes the endosome.  

 Slide 20   So we can actually quantify  this  interaction and we can see  that  in 

the green  line  that you see shoot up here,  that  is  the  formation of one of those assemblies around the individual virus. If you watch the red track, which is the fluorescent intensity of the virus, you can see there’s only a two or three‐minute window that exists between the time the TRIM5α engages the virus and the loss of the viral signal. 

 Slide 21 to Slide 22   Another way we’re able to quantify this in a pretty pleasing way is to 

use that other virus as a control. What you can see is the virus that is not  engaging  the  TRIM5α  protein  in  the  cell,  that  fluorescent intensity remains constant during the acquisition period whereas we only  lose  the  virion  signal  in  the one  that does engage  the  TRIM5 protein. 

 Slide 23   So  another  dynamic  interaction  that  we  can  see  and measure  is 

demonstrated by this movie here.  If you watch the virus that starts out on the far left‐hand side of the screen, what you can see is that engages a TRIM5α preexisting assembly. Then what it seems to do is it peels off and  it takes with  it this coat of TRIM5 protein.  It kind of gets slimed in the Ghostbuster sense is what we describe it as.  

Slide 24   So what we can actually do there is measure on the right side of this 

plot, which  you  can  see  is when  the  virion  leaves,  it  takes with  it some  of  the  fluorescent  intensity  that  was  originally  with  that original  complex  leading  to  two  individual assemblies of  smaller or less intensity.  

 Slide 25   So another type of approach that we’ve been using a lot lately in lab 

that I’m very much in love with is the utilization of RoGFP, which is a redox sensitive form of GFP. This has two surface‐exposed cysteines positioned very close to the chromophore that allow disulfide bond formation conditionally depending on the redox state of the cell. 

 Slide 26 

 

8  

  This disulfide bond changes the fluorescent properties of these two RoGFP proteins that are available, RoGFP1 and RoGFP2, and you can therefore use  that  change  in  fluorescence  to  sense  changes  in  the redox state in the cell over time. 

 Slide 27 [0:15:12]   So  what  you  can  utilize  this  to  do  is  we  have  a  mitochondrially 

targeted protein  that we got  from another  lab, we didn’t  invent  it. What you can do  is you can measure the redox state of  these cells and then what you have to do  is you have to add a strong reducing agent  like DTT  and  then  a  strong  oxidizing  agent  like  aldrithiol  to essentially measure the basement and the ceiling of where that cell could be. From there, you can get a sense of the relative redox state of individual cells that you’re examining. 

 Slide 28   We’ve used this in our studies that we just recently published about 

alpha‐synuclein. I’ll go into that a little bit now. So what we’ve been doing is measuring alpha‐synuclein vesicle rupture. What we observe is that alpha‐synuclein can enter cells and rupture vesicles and to do that  we  used  this  fixed  cell  assay,  but  it’s  worth  talking  about because  I  really  think  it’s one of my  favorite  things  lately  that’s  for sure. 

   So galectin3  is a  soluble cytoplasmic protein  that has  the ability  to 

bind carbohydrates or sugars and  importantly,  these carbohydrates and  sugars  are  universally  on  the  outer  leaflet  of  the  plasma membrane  such  that  when  you  have  endocytosis,  they’re  on  the luminal  side  of  an  endocytic  vesicle.  Galectin3  relocalization  to ruptured  vesicles  in  the  last  couple  of  years  has  really  been revolutionary  in  studying  the  life  cycle of viruses and bacteria  that enter cells using vesicle rupture. 

   What  you  can  see  over  here  on  the  right  from  our  recent  PloS 

pathogens  paper  is  we  can  do  the  exact  same  thing  with  alpha‐synuclein. So alpha‐synuclein  is colored  in green on  this picture on the  right  and  you  can  see  it  forming  these  arc  surfaces  on  the periphery  of  these  ruptured  vesicles. What  we  think  it’s  doing  is bending or inducing curvature of those membranes to cause cellular pathology.  That  cellular pathology  is  read out  as  redox  stress.  You know, in lysosomes and endosomes are all the digestive enzymes of the  cell. When  those  get  released out  into  the  cytoplasm,  there  is real consequences for the cell such as mitochondrial dysfunction. 

 

9  

 Slide 29   So  what  we  just  showed  and  we  used  this  system  that  I  just 

described to you using reactive oxygen species sensitive GFP to show that the addition of alpha‐synuclein increases the redox stress or the reactive oxygen species present in these cells and we don’t show it in this experiment, in a cathepsin dependent manner. You know, this is really a valuable tool because it allows us to measure the redox state of individual cells. 

 Slide 30   What  we’re  doing  now  is  we  are  doing  our  live  cell  imaging 

approaches  and  then  thanks  to  the precision of  the motors  in our stage and our coordinate system then what we can go back and do is examine whether or not the cells that were feeling the most stressed had  the  most  ruptured  vesicles.  This  is  one  of  I  guess  the combination of live cell and fixed cell imaging approaches that we’re starting to use to ask individual cells how they feel. 

 Slide 31   So  finally,  the  last  thing  I want  to  talk  about  is  a  technique  called 

FRET, which  is Fluorescent Resonance Energy Transfer. What  I want to stress here, you know,  I  think a  lot of people use FRET  to  really just get below  the  resolution  limit of  light microscopy  to  say  these things  are  interacting  directly,  thank  you  very much. We’ve  been guilty of  that. We’ve used  that  technique  in a  lot of our published data  to  say  that  two molecules  are  indeed  interacting. But what’s important here  in the technique that  I want to talk to you about  is the  idea  that FRET efficiency can be used  to measure dynamic and conformational  changes  that  occur  between  two  interacting proteins.  This  occurs  because  FRET  efficiency  is  dictated  by  the physical separation of the FRET pairing fluorophores. 

 Slide 32   So what a colleague of mine Seth Robia is doing also at Loyola is he’s 

examining  the  interactions  between  a  protein  called  SERCA  and phospholambam, which are critical in regulating intracellular calcium concentrations during cardiac muscle contraction. What you can see on the left panel is that these two proteins generally always interact. But what’s  important  is depending on the calcium  levels of the cell and  the  physiology  relevant  to  the  cardiac  biology, which  I won’t really get deeply  into  today,  there can be a  shuttle conformational shift between the way that these two proteins are interacting. 

 

 

10  

Slide 33   So what Seth has done is exploited this by pairing, by attaching FRET 

fluorophores to the proteins of interest.  Slide 34   What he can  then do  is he can  look  in  individual cardiac myocytes 

and measure FRET differences or differences  in  the FRET efficiency that occur during the beating of a heart  if you will. You know, I was lucky enough to be on one of his students committees and this to me just  really  blew my mind. When we  all  think  of  FRET, we  ask  are these  two molecules  interacting. What  Seth  is  doing  is measuring conformational  changes  that  are  very  biologically  relevant  and important  in  the  context  of  FRET  efficiency.  So  you  know  when you’re  thinking  about  that  just  appreciate  that  FRET  efficiency  is much more than just showing that two things can interact. 

 Slide 35 [0:20:24]   So  I  really  appreciate  your  attention  and  the  opportunity  to  talk 

today. The people on the left are the people in my lab and those that did the work that I’ve showed you. So thank you very much for your attention. 

 Sean Sanders:  Great. Thank you so much, Dr. Campbell.   Slide 36   Our  next  speaker  for  today  is  Dr.  Nick  Thomas.  Dr.  Thomas  is 

principal  scientist  in  Cell  Technologies  at  GE  Healthcare  based  in Cardiff, Wales. He  is the  inventor or co‐inventor of over 60 patents covering  a  wide  range  of  technologies  including microfabrication, molecular and cellular sensors, and cellular imaging. Dr. Thomas has worked  on  the  development  of  cellular  analysis  instrumentation, software,  and  reagents  for  the  past  decade  and  has  published  a number  of  review  papers  and  book  chapters  on  this  subject. Welcome, Dr. Thomas. 

 Slide 37 Dr. Nick Thomas:  Thank you, Sean. It’s great to be here. So I guess my talk has a dual 

purpose title. So  from what to how  I’m going to talk about  live cell imaging in HCA, what it is and how to do it but the other way to read that is it’s one of the key aspects of why people do live cell imaging. Fixed cell imaging, which I guess for HCA that’s probably 95% of what people do and that tells you what happened. Live cell imaging comes 

 

11  

in to  its own when  it tells you what happened or how  it happened. So basically we got sort of a list. 

 Slide 38   What I’m looking at here is various aspects of biology. Biology is not 

fixed. We choose  to  look at a  lot of biology as  if  it  is a  fixed event because  let’s  be  honest  that’s  the  easiest way  to  do  it.  Fixed  cell imaging is easier than live cell imaging. But if we think about biology, you  know,  it  varies  in  its  dynamics  from  things  like  iron  flux  in cardiomyocytes when they’re beating, happens very rapidly through to something like the cell cycle which will maybe take 18 to 24 hours in the typical cell through to something  like the differentiation of a stem cell  to a cardiomyocyte or  to a hepatocyte and  that will  take many, many days.  So all of  these are dynamic processes.  So when we’re  using  fixed  cell  imaging,  we’re  looking  at  a  particular  time point or a particular series of time points. So I think that tells us what happens. Live cell  imaging has the potential to tell you how the cell actually got to the state at which you’ve observed. 

 Slide 39   So,  you  know, why do people do  live  cell  imaging?  There’s  lots of 

reasons. I’ve kind of summarized on this side some of the key ones. First important one is nonfixable assays. There are some things that you  just can’t do as a  fixed cell assay. Typical example  is  looking at mitochondrial membrane potential, looking at calcium fluxes and I’ll show  you  an  example  of  that.  Calcium  flux  assays whether  you’re interested  in cardiomyocytes perhaps or GPCR signaling again  it’s a dynamic response. 

   Then obviously the ones  I guess the people think more about when 

you  talk  about  live  cell  HCA  is  long  term  event,  studying  the  cell cycle, studying as I’ll show you say a gene knockdown impact on the cell cycle. So  remember  important  thing  is  fixed cell assays  is what happened,  live cell assay  is how  it actually got  there. You generally need  both  of  those  to  understand  the  complexities  of  cell  biology pretty much whatever you’re working on. 

 Slide 40   So a few things to think about before we get  into  just showing you 

some examples of  live cell HCA. There are a number of key aspects and  it’s really doing  live cell assays as  I’ve said  is more complicated than fixed cell assay so you’ve always got to think, you know, there’s a certain amount of pain in doing this so what’s the gain versus that pain. 

 

12  

   So things to think about, environmental control, okay. Cells generally 

if you’re working with mammalian cells, they like to be warm so you got  to  keep  them warm.  Are  you  going  to  keep  them warm  and supplied with  gas  for  some  term,  depending  on  how  long  you’re going  to  go?  You  need  to  have  flexible  imaging  conditions  with flexible  instrumentation. You don’t want to kill your cells, you don’t want to bleach them. Basically, you know, as we’ve heard already be kind to your cells. The main mantra from my point of view  if you’re doing  live cell  imaging  is don’t perturb  the biology you’re  trying  to study by  the way  you  look  at  it because  then  it becomes  a  rather pointless  exercise.  Imaging  speed,  yeah,  you’re  going  to  have  to consider how fast do you need to image to capture the event you’re imaging  in and you’re going to get some data out of that so you’ve got to have the appropriate software to generate your data. 

 Slide 41   So what I’m going to show you today are some ranges of applications 

done on a range of IN Cell Analyzer instruments that we supply.   Slide 42   So  I’m  going  to  start  about  short‐term  imaging.  So  basically, what 

I’ve done  is divided  this  talk up  into short  term examples and  long term examples. 

 Slide 43 [0:25:07]   So  first  of  all  let’s  look  at  some  short  term  examples.  So  this  is  a 

cardiotoxicity  assay  done  in  human  embryonic  stem  cell  derived cardiomyocytes and this  is an example of an assay that you have to do live because you can’t fix it. Basically, it’s a multi‐parameter assay looking  at  mitochondrial  integrity,  mitochondrial  membrane potential, calcium hemostasis, and vulnerability. What we do  is we generate multi‐parameter data having  treated  the  cells with drugs and  then  staining  them  with  the  appropriate  fluids. We  use  this multi‐parametric  profiling  approach  and  here  you  can  see  in  the bottom  left, tasocitinib, that profile  is  invariant with dose  indicating nontoxicity, and  if you  look  top  right, you  can  see  sunitinib, which dramatically changes  its profile due to  impact on mitochondria and calcium homeostasis. So that’s an assay that you cannot do fixed. 

 Slide 44   Another thing so this  is another example.  It’s basically a cell health, 

an  apoptosis  assay,  a  very  straightforward  assay  to  do.  But 

 

13  

something  that  you  have  to  consider  when  you’re  doing  live  cell assays  is  that  if  you  are  using  fluids  that  you  need  to wash  then washing  cells generally don’t  like  to be washed particularly mitotic cells.  They  will  detach  and  actually  again  this  comes  down  to perturbing the system. If you’re trying to measure dead cells, which if you wash the cells, they’ll disappear, you’re defeating the object in doing your assay. 

   So this is an example of using an instrument, which has modulatable 

confocality so  that we don’t have  to do a wash.  It’s a homogenous assay and you can see in the top image there, you’re retaining dead mitotic  cells,  which  have  gone  from  an  assay,  which  is  done,  via washing.  So  again  something  to  consider  when  you’re  setting  up your assays. 

 Slide 45   Here’s an example of a short term assay. This is probably going back 

in the history of HCA one of the most performed short‐term live cell imaging  assay,  a  GPCR  inducing  calcium  flux  signaling.  Done  in population measurements a lot, great advantages of doing it in HCA that’s  shown  in  the bottom  left  there  is you can get  individual cell data as you can see here. 

 Slide 46   Control image is on the left‐hand side, carbachol treated in this case 

images on the right‐hand side. So the purpose of this is you’re doing an assay, which you could do on a population mode on another type of instrument, a plate read or a flipper like that the advantage here is you’re getting individual cell data. 

 Slide 47   Here’s  a  slightly  longer  term  assay.  This  is  actually  an  example  of 

where  live  cell  imaging  is actually used as a precursor  to  fixed  cell imaging. So what we’re looking at here is a p38‐MAPKap GFP fusion protein  in cells. P38  is a general  integrator of stress  responses and therefore  it’s  translocation  that we can  see  in  the  series of  images there  can  vary  in  its  temporal  nature  depending  on  the  stress impetus.  So  this  experiment  actually  came  from  the  precursor  to running  a  p38  GFP  translocation  screen.  The  purpose  of  this experiment  is  to determine  the optimum  time  in which  to perform the fixed cell assay. 

   So  you  can  see  in  the  upper  left  panel  there  the  change  in  the 

subcellular  localization of p38 and the arrow  indicates the optimum 

 

14  

time. So basically here you’re doing one  live cell experiment doing that experiment very carefully and then using the data from that to set  up  a  very  large  cell  screen,  which  will  be  run  in  a  fixed  cell fashion. 

 Slide 48   Here’s a further example of that experiment. So what we actually did 

was  because  we  know  that  p38  can  respond  to  a  number  of stressors, what we were doing was to set up in this case an IL‐1beta screen. So here as you can see in the top below the pictures here are cells stimulated with  IL‐1beta but below two other types of screen, anisomycin and an osmotic shock. Again because p38  is responding to those stimuli in different way, this data allows us to set up a fixed cell assay screen that will only  look at that particular type of stress response  that  we  want  to  look  at.  So  here,  the  live  cell  imaging experiment  is very much  the  setup  subsequent experiments  rather than the actual endpoint. 

 Slide 49   So this is a couple of example of short term assays, now we’re going 

to move on to some longer term ones.  Slide 50    So this is quite a simple example. It’s actually looking at the mode of 

action of toxicity of drugs. Again, a fairly simple assay but this time rather than doing as fixed cell assay, which tells you yes this drug  is toxic and this is a result you got at the end of the assay, by doing live cell imaging, we can actually look at how things occurred. 

[0:30:14] Slide 51   So what we’re  looking at here  is a series of stills  from  the assay at 

zero  to  eight  hours  and  you  can  see  that with  the  top  drug  here, you’re actually getting at the beginning of the assay and at the end of the assay the  images look  identical. So what’s happening there  is that drug is impacting our membrane integrity right at the beginning of the experiment.  

Slide 52   In contrast, diclofenac  the middle drug,  looks different  through  the 

assay.  So  it’s  actually  having  the  same  effect  and  the  eight‐hour images  for both drugs  look  the  same  so  the what  they both  killed cells,  they  both  impacted membrane  integrity.  But  if  you  actually look at the how, they actually differ very significantly  in their mode of action. Similarly, at the bottom with another drug, you’re actually 

 

15  

getting both a slow induction of apoptosis. So sometimes, you know, that  live cell approach actually the pain of  it  is offset by the gain of getting additional information of how the drug is impacting on cells, which you can’t tell from just looking at the endpoint.  

 Slide 53   Another aspect when you get into live cell imaging over longer time, 

obviously  it becomes more  complicated because your  cells are not going  to,  you  know,  behave,  sit  there  and  just  stay  in  the  same position. They’re going to move. So collecting data  from those cells means  your  software  has  to  be  able  to  track  those  cells.  Because what  you’re doing obviously  is  you want  to have  individual  cell by cell data from each of your cells. If your software can’t tell is that the same cell,  is that cell  in the previous  image, you’re just going to get lost. So you’ve got to have good software that will do cell tracking. 

 Slide 54   I mentioned  cell  cycle  before.  Here’s  an  example  from  and  sRNA 

screen  that we did  several years ago using  live cell  imaging of GFP fusion proteins that are caught on the cell cycle. Again, I come back to the point I made earlier, the whole main mantra you should have in  your  head  is  you  shall  not  perturb  the  biology  you’re  trying  to study. So what we used here is very low level of expression of those GFP fusion proteins and that allowed us to find some novel findings like  the  ones  illustrated  on  the  right‐hand  side where we  found  a protein  that  actually  are  knocking  that  protein  down  has  a  very significant effect on  the  cell  cycle. This  is actually a  retinal binding protein,  something  that  you  would  not  have  expected  to  have  a dramatic  impact on  the cell cycle and something  that you can only find by live cell imaging.  

 Slide 55 to Slide 56   Coming  back  to  the  difference  between what  and  how,  this  is  an 

example  from  looking  at  drug  treatment  of  cells.  This  time  again drug  impact on  impact on  the  cell  cycle.  In  the middle  is  the data from  classical  fixed  cell  assay  looking  at  DNA  content  and  BrdU labeling  to  look  at  the way  cells  are  progressing  through  the  cell cycle. It looked like from the drug treated cells that they were going through endoreduplication and  that was  confirmed by  the  live  cell imaging.  So  the  control  cells  on  the  left‐hand  side  you  can  see they’re replicating nicely. 

   The hesperidin treated cells, what’s happening there is they attempt 

to go  through mitosis but mitosis  fails and  they  then  jump directly 

 

16  

into G1.  You  can  tell  that  from  the  subcellular  localization  of  that GFP.  

 Slide 57   Another  example  of  long  term  tracking,  so  looking  at  how  drugs 

impacting the cells and what we’re  looking at here  is data from our IN Cell 6000.  In  the upper panel, you  can  see  images  taken over a long period of control cells and the lower image drug treated cells in this  case  treated  with  colecemid.  You  can  see  I’ve  put  squares around the data on the right‐hand side. That data is coming directly from  the video, which  is analyzed. Each cell  is  tracked and you can see  in  the upper panel  you’ve  got proliferation of  cells  and  in  the lower panel as you would expect you’re blocking cells in mitosis and they’re dying and you can see the fall of the cell number. 

 Slide 60   So  live  cell  imaging,  why  do  it?  Basically  to  find  out,  get  more 

information of what’s going on in your biology and get from what to how. So you can do assays  that can’t be  fixed, you can  follow very fast dynamic events. You can understand very long and complicated cellular processes like the cell cycle. Really, the bottom line is you get to understand what’s going on in your biological system more. 

 Slide 61   Thank you.  Sean Sanders:  Fantastic. Thanks so much, Dr. Thomas.   Slide 62   We’re  going  to move on  to our  final  speaker  for  this webinar  and 

that is Dr. Lynne Turnbull. Dr. Turnbull is a senior research fellow at the  I3  Institute at the University of Technology  in Sydney, Australia. In  addition  to  her  research  focus  on microbial  biofilms,  bacterial motility, and pathogenicity, Dr. Turnbull is also the OMX Application Specialist  for  the Microbial  Imaging  Facility.  In  this  role,  she works with many  collaborators  to  facilitate  implementing  superresolution microscopy into their research programs as well as developing novel techniques for microbial live cell imaging. Welcome, Dr. Turnbull. 

 Slide 63 [0:35:28] Dr. Lynne Turnbull:  Thank you, Sean. Thank you for having me. So today,  I’m  just going 

to  talk  briefly  about  live  cell  imaging  of  bacteria  using 

 

17  

superresolution microscopy and cell biology and bacteria using  live imaging. 

 Slide 64   So  for  bacterial  live  imaging  especially  for  cell  biology,  size  does 

actually matter. So  if you  look at  the  images on  the  screen on  the right‐hand  side you have a bone  cell, a normal  sort of mammalian cell and it’s quite large. You can see on the left‐hand side, there are some  typical‐sized bacteria and  they both have 15 micron mark on scale bars. 

 Slide 65   If we now adjust the scale bars to be the same size, you can see that 

we’re working  in a much smaller area. So when we want to  look at things that are happening  inside each  individual cell, we’re working in a much smaller volume, about the volume of a mitochondrion. So size does matter. 

 Slide 66   So  there are  some  challenges  for  imaging  cell biology  that are  the 

same for bacteria as for mammalian cells. But we have a few other things that happen in bacteria that we have to contend with. 

 Slide 67   So one of the things is actually keeping cells still and I think I mean I 

by  that  that  keeping  cells  the  same  cell  over  time  in  your  field  of view  so  that you can  see what happens  in  that  individual cell over time.  So when  you mount  bacterial  cells  in  a  liquid medium,  you might  have  to  contain with  Brownian motion  and  sometimes  that can  confound  things  and  sometimes  that  it’s okay,  you’re  tracking software  over  time  can  cope with  it.  But  also  that many  bacteria actually  are  actively motile  through  structures  such  as  flagella  and pili and you actually have to contend with them moving out of your field of view and sometimes very rapidly. 

   So we have  some  strategies  to cope with  that. We can change  the 

mounting substrate so we can try and embed them in a sloppy gel or use gel pads. We  can use mutants  that are no  longer motile. That depends  on what  you’re  studying.  If  you’re  studying motility,  you can’t do that of course. We can try and  lower the temperature that we’re working at if you can. It all depends on your biology to try and slow them down so that you can keep them in your field of view a bit longer.  

 

 

18  

  Another  thing  that  is coming  into  fashion  is  to use microfabricated chambers or  channels  to  trap  your  cells  into  a much  smaller  area. Now again  it depends on whether that fits your biological question. That’s always the first thing is am I going to change biology by doing any of these things.  

 Slide 68   Again, as already been iterated for bacteria, we have to try and keep 

them healthy. The same as you do with eukaryotic cells and where possible we  use  transmitted  light  because  it’s much  healthier  and helps the long term imaging. You can’t do that with superresolution unfortunately  but  for  other  live  cell  imaging  experiments  with bacteria, we definitely try to use a transmitted  light channel where possible.  Again media  choice,  keeping  your  cells  healthy  but  also being  aware  of  things  like  autofluorescence,  you  don’t want  your media  to  be  brighter  than  your  bacteria.  Again,  choose  low excitation when you can and short exposures. It’s more important to get  information  than  to get  the perfect  image as you would with a fixed cell experiment. 

   We  often  try  to  use  the  minimal  amount  of  z‐slices  during  an 

experiment  to  get  the  information  we  need  not  necessarily  to actually get every bacteria in the field of view or the whole bacteria if we think that the question that we’re asking doesn’t need that.  

 Slide 69   Again, I’m just going to reiterate, they’re small. They’re small things 

up  to  2 microns  thick  sometimes  and  that  gives  you  a  small  focal point  to  work  within.  So  what  we  found  is  that  some  of  the automatic  focal  systems  that  come with  the  fancy microscopes we have  today  don’t  necessarily  always work  because  some  of  them work on a drifting where  they  find  the coverslip by drifting  slightly and  coming back  to  the  same point.  If you’re working with a very, very thin specimen, sometimes that drift is enough to lose your cells. Things like using a confocal on a confocal laser‐scanning microscope with  the pinhole closed, you actually can  lose  information because there’s  not  enough  fluorescence  being  generated  by  the  whole bacteria  to actually need  to cut  it out using a pinhole. So we often actually open  the pinhole wide up and use  it as a wide  field at  the end of the day. 

   So  you  have  to  ask  the  questions  about  whether  using  different 

styles of microscopes suit the biological question that you’re asking. Again  I’ll  just  say  conventional  resolution  is  sometimes  insufficient 

 

19  

for  subcellular  imaging  in bacteria because  the volume  that you’re working with,  you don’t have  enough  resolution  to  see  if proteins move  individually or move  in  relationship  to each other within one individual cell. 

 Slide 70 [0:40:14]   So  we’ve  turned  to  superresolution  microscopy  and  the  one  I’m 

going  to  talk  about  is  three‐dimensional  structured  illumination microscopy  or  3D‐SIM.  It  gives  you  a  doubling  in  resolution  in  all three dimensions and there’s been a number of reviews and this one is  reviewed  by  Schermelleh  that  shows  that  your  point  spread function is actually doubled in all three dimensions. 

 Slide 71   The way that this technique works  is you actually have a structured 

light pattern  that  is  imposed on  to  the  sample  and  you’re  able  to extract  high  resolution  information  from  the  image  by  taking multiple  images  using  the  grid,  moving  the  grid  around  at  the different  orientations  over  the  course  of  the  experiment  or  the course of the image. You do that for each z‐slice.  

   The good thing about this technique, it actually works with standard 

dyes  and  fluorescent  proteins  so  as  long  as  your  dyes  and  your proteins match  the  filter set and  the  lasers as you need  to do with any  fluorescent microscopy,  you  can  use  tools  that  are  hopefully already in your toolkit. The lateral resolution is between 80 and 130 nanometers and your axial resolution 250 to 350 nanometers.  It’s a widefield imaging technology and it’s well described in the literature now and the two references at the bottom are good starting points to read all about this.  

 Slide 72   So  I’m  going  to  just  use  one  study  that  we’ve  performed  as  an 

example of why superresolution and  live superresolution  is actually giving us better answers or more detail than we’ve ever had before. This was published  last year  in PLoS Biology and you can download any of the images or movies that are involved with this study to get a better look at what I’m talking about.  

   So we  looked  at  bacterial  cell  division  and  cell  division  in  bacteria 

starts with the  formation of a z‐ring at midcell and then that z‐ring constricts over  time  to pinch off  and  then  you have  two daughter cells. Of course,  it’s much more complicated than that but that’s all 

 

20  

you really need to know. The z‐ring is formed of a protein called FtsZ and  it  acts as  a  scaffold  for other proteins  to  come  to  the midcell division  site  during  cell  division  and  it’s  essential  for  bacterial  cell division.  

   So we studied it in two gram‐positive bacteria, Bacillus subtilis as you 

can  see  in  the  left hand  image  there and Staph aureus, which  is a well‐known bacterial pathogen.  

 Slide 73   So when we  looked at this  in conventional resolution  if you  look at 

the top left‐hand panel, you can see that Bacillus subtilis is a big long sausage that sits flat on the coverslip. When you want to look at it in any depth, you can rotate the cell and you can see that it is actually a ring.  In  this  image,  the  bottom  left‐hand  image  is  the  equivalent sample  done  with  3D‐SIM  and  when  you  zoom  out,  actually  you can’t really see much difference. But  it’s actually when you zoom  in and  look at  individual z‐rings that you can actually see a difference. So we  can  see here  in  the  two  images on  the  right‐hand  side  that with  the GFP‐FtsZ  fusion,  you  can  see  z‐rings  in  different  times  of constriction during the cell cycle, two very constricted ones that are probably  almost  about  to  pinch  off  and  larger  ones  that  haven’t started  to go  through  the constriction cycle yet.  If you  turn off  the GFP,  you  can  actually  see  with  the  red membrane  dye  that,  you know, those cells, the membrane is being pulled in ready to pinch off during cell division. 

 Slide 74   If  you  now  zoom  up  and  look  at  individual  z‐rings more  carefully, 

what we  can actually  see  is  that  the distribution of  that protein  is heterogeneous throughout the ring. This was something that wasn’t really known before we started this study because with conventional microscopy we didn’t have enough resolution to see these very small gaps. We  thought  that  it  was  just  a  continuous  structure.  So  by turning  the  ring  on  its  side  in  the  z  dimension  now  going  up  and down  in your  screen, you  can actually  see  that at  the  top and  the bottom of  the  ring,  there’s  small gaps  in  fluorescence where  there appears to be  less protein. This was  like quite exciting for us at the time. 

 Slide 75    The great thing about working with Staph aureus is that because it’s 

a  spherical  cocci,  you  can  actually  catch  the  z‐ring  lying  in many different orientations  just by chance because  it’s a  little ball.  If you 

 

21  

look at the panel on the left there, you can see that we’ve caught a field of view of Staph with z‐rings in all orientations. You can sort of tell  by  the  angle  tilting  and  also  in  many  different  times  of constriction of the ring. We’ve even actually caught a couple that  is sitting on their side like you see them in Bacillus subtilis. Again, if we zoom up and look at individual z‐rings as in the right‐hand panel, you can see that there’s gaps  in the fluorescence again and we’ve been calling these beads on a string because that’s what it really looks like. So we  can  see  that  it’s  the  same  in  the  two  different  species  and we’re  quite  excited  to  see  that  it wasn’t  just  something  that was special to bacillus. 

 Slide 76 [0:45:20]   But  3D  Structured  Illumination  is  hard  on  a  cell  in  classical  terms 

because  you  have  to  take  15  images  in  each  z  plane  to  get  a reconstructed  image. That’s 135  images per channel  for a 1‐micron section  and,  you  know,  that  repeated  exposure  causes  higher phototoxicity for your cells. So when we try to look at how dynamic these things were over time, we found that the cells were not liking it  very much  and were  dying  very  quickly.  So we wanted  to,  you know, get something that would help us look at the dynamics of the z‐ring over time. 

 Slide 77   So we actually were lucky enough to become one of the first people 

to  get  a hold of  the OMX Blaze  technology, which  is basically  fast structured  illumination.  It works by  getting  rid of  the physical  grid that  was  normally  used  in  structured  illumination  and  using interfering beams to create that pattern that grid pattern on to your sample in conjunction with the new shutter designs, scientific CMOS cameras, and really fast computers. 

 Slide 78   So combining all these things, we’ve now able to actually do 3D‐SIM 

at a  rate of 1 micron per  second. We  found  that by doing  this, we have shorter exposures and the cells are lasting longer and we were really happy  then  to be  able  to  look  at  the dynamics of  the  z‐ring over time. What we found  is that heterogeneous distribution of the FtsZ  in  the  cell  is  actually maintained over  time  and  that  the  gaps actually change position so that we think it’s a very dynamic process. So what you can see in these panels is an image taken every minute and  it’s  from  a  series where we went  out  to  between  12  and  16 minutes and following the constriction of the z‐ring. 

 

22  

   The gaps appear  in the z‐ring and change  in their distribution  in the 

z‐ring no matter what the stage of constriction. So for big rings and also when the rings are constricted just before they’re about to split off. We were really excited because that wasn’t known either and it also helped us with the model of how constriction happens with the z‐ring.  It actually provided more data about how  this happens over time  to build a model of how  z‐rings are constricting. So  the other thing that this technique allowed us to do is to look quantitatively at how that fluorescence changes over time.  

 Slide 79   So  you  can  see  in  the  panel  on  the  right‐hand  side  that  that’s  an 

image of a  z‐ring  taken every  five  seconds and  for a  full  time of a minute  and  then  on  the  left‐hand  side  is  a measurement  of  the fluorescence intensity in the whole ring changing over time. You can see  that  the peaks and  troughs  in  the  fluorescence  intensity move around in the z‐ring over time. So we were very, very excited by this and it shows that this is a very dynamic process. We also went on to show that  in other proteins that were recruited to this division site during  this,  they’re also dynamic and move over  time and  that  the movement of the FtsZ occurs in rings that don’t even constrict if you use mutants that don’t constrict. So this was a really nice study that wasn’t possible before  the  advent of  superresolution  and  also  live superresolution.  

 Slide 81   Again, what  do we  need  to  do  in  the  future?  So  this  is  a  sort  of 

where can we go  from here. Well the technology delivers what the manufacturer tells us  it’s going to do but of course we want faster, faster and more sensitive as always because we’re greedy.  

   The  other  thing  is  that we  need  to  think  about  developing  better 

fluorophores really for fluorescent proteins and dyes. A  lot of these are  developed  for  eukaryotic  cells  and  they  work  really  well  but again we need to develop them with microbiology  in mind because bacteria and other microbes are different. 

   Biology versus  lasers  I guess what  I mean here  is that at the end of 

the day, the lasers will always win the battle. No matter how careful you  are when  you  put  excitation  energy  into  live  cells  they’re  not going to  like  it and they’re going to die. So we need to think about better  antifades  and  there’s  been  some  movement  in  this  very recently with publications coming up  in  the  literature on adding or 

 

23  

subtracting  different  vitamins  into  tissue  culture  media  for eukaryotic cells. We need to develop these for microbiology as well. Some  of  the  things  that  work  in  eukaryotes  actually  kill  bacteria because we’ve tried them and you know, this is the sort of thing we need to move to.  

   The other thing is to increase your signal to noise ratio. So there’s a 

number of ways of doing this so one of the ways is to use denoising algorithms and so you can  lower your excitation energy even more than  we  already  do.  But  doing  things  like  finding  better  ways  to increase the density of the labeling of the structures within your cells so that you actually get more signal out of each  individual cell. So  I think  these  are  the  future  directions  that  live  cell  imaging  will improve if we can move on some of these things. 

 Slide 82 [0:50:31]   So again I would just like to thank the people who fund me and help 

us purchase  these  things, which  is  the University of  Technology  in Sydney, the Australian Research Council, and the New South Wales Office for Science and Research that sponsors buying our equipment. And the people who worked on the study that I just showed you, Liz Harry  and  her  very  talented  team  of  students  and  post  docs  and Cynthia Whitchurch. Thank you. 

 Sean Sanders:  Great. Thank you so much, Dr. Turnbull, and my condolences  to all 

the cells that died in the making of these experiments. It sounds like there was a  lot of  that going on. Many  thanks  to all of you  for  the wonderful  presentations.  We’re  going  to  move  right  on  to  the questions submitted by our online viewers.  

   Just a quick reminder to those watching us  live, you can still submit 

your questions. We have about ten minutes left in the webinar. Just type them into the text box and click the submit button. If you don’t see the box on your screen, click the red Q&A icon.  

   So the first question I’m going to put to all of you and I think I’ll start 

with Dr. Campbell is one of the key issues for live cell imaging of any duration seem to be maintaining focus in Z. Do you have any tips and tricks you can share with the audience about that?  

 Dr. Edward Campbell:  Sure. You know,  I think he mentioned one of the new technologies 

that’s very valuable are  these  laser guides  systems  that detect  the distance between your lens and your specimen. These are invaluable 

 

24  

in  term  of  especially  long  duration  imaging  experiments.  But  you know, the other thing  it comes back to again paying attention. You will  lose focus  I think to a certain degree at times  if you don’t have one of these laser guided systems. If that’s the case, you can notice it and okay you lose a time point from your movie but pay attention to the  data  as  it’s  coming  in.  You  know,  you  can’t  really  tell  if  an experiment is going perfectly but you can tell when you’ve lost focus right,  that’s  clear. And  then  you  know  often  a  little  trick  between time points, you can get right back  into your focal plane and take  it from there.  

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Thomas?  Dr. Nick Thomas:  Yeah, the issues HCA are kind of different from what these two guys 

do. The main thing I would say here, you know,  instrumentation for HCA  is  set  up  to  do  imaging  automatically.  Generally,  you  have hardware  autofocus,  the  main  thing  is  make  sure  that’s  working properly and use the right plates. A lot of people don’t care, take so much  care  about  selecting  their  plates.  If  you’re  doing  live  cell imaging,  it’s even more  important  to have  the  right  size of plates, make  sure  that  they’re  clean  and  you don’t  get dust  in  them  that might throw things off and generally that it. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Turnbull?  Dr. Lynne Turnbull:  I guess more old school  is there’s a  lot of things you can do  just to 

help yourself whether you have automatic systems or not. We keep everything  hot  so  we  never  turn  off  the  live  cell  environmental chambers  and we  take  the microscope  and  the objectives  and  the whole box at 37 or 38 degrees depending on the system all the time so  that  you’re  not  having  any  of  the  metal  expanding  and contracting. We keep all of that oil. All of the spare objective are all kept  inside  the box  to  keep  them nice  and warm. The other  thing that  happens  is  that  a  lot  of  your  focal  drift  during  experiment maybe due to evaporation so even  though  it changes  the solute  to do  using  something  like  gel  pads  as  we  do,  you’re  going  to  get change of focus because the gel pad will dehydrate. So we keep the environmental chambers  full of beakers of water and soggy  tissues to keep the evaporation to a minimum. 

 Sean Sanders:  Excellent. Next question  is about photo bleaching.  It seems  to be a 

fairly popular topic. How can this be avoided? I know you’ve spoken a  little bit about  this but maybe you can speak  in more depth. We also had a viewer who said  I thought  it’s an  interesting question,  is 

 

25  

phototoxicity observable at all wavelengths? So  is  it possible to use different wavelengths to reduce the amount of phototoxicity. So Dr. Campbell? 

 Dr. Edward Campbell:  So I mean I think for photo bleaching, one of the big advancements, 

you  know,  EMCCDs  really work.  You  know,  the  ability  they have  a function called  In Chip gain, which basically allows you to collect all of the  imaginable data using tricks of physics that might be outside of  this  conversation.  The  other  thing,  you  know,  is  the  platform you’re  using.  You  know,  we  kind  of  talked  about  the  difference between  confocals  and  widefield  deconvolution  microscope.  So there’s an article by John Murray out there who’s a real microscope wonk right and he can show that the photon capture efficiency of a deconvolution  microscope  is  more  efficient  than  many  or  these other systems. So essentially the deconvolution people think, oh,  it makes my data prettier, right? 

 [0:55:10] Sean Sanders:  Uh‐huh.  Dr. Edward Campbell:  Okay it does that but what it does is it restores light to where it came 

from and scattered. So if you have something very small like a virus, you’re  losing  wavelength  as  it  forms  a  cone  out  in  your  other dimensions  and  the  ability  to  not  only  remove  that,  to  make  it prettier but  to put  it back where  it came  from means  that you can get by with less exposure. Getting by with less exposure is the key to all photo bleaching.  

 Sean Sanders:  We have agreement I guess.  Dr. Edward Campbell:  Yeah.  Sean Sanders:  Any other comments?  Dr. Nick Thomas:  I mean  from  an  HCA  perspective  it’s  yeah,  cells  don’t  like  being 

baked by light. Now we would if you walked outside under an ozone hole the same thing. You know, it’s basically have the most sensitive instrument  you  have.  That  means  you  don’t  have  to  have  long exposure times. The thing that we do particularly on our IN Cell 6000 system, you can dial  in confocality when you need  it but you don’t have  to  have  it  running  in  all  different  channels.  So  that  means you’re not blasting all of your cells  in all of the channels with more light than they need to get you the data. It comes back to what I’m saying before, you know,  if you have a  live cell  imaging experiment 

 

26  

and you’re perturbing it by blasting them with photons – you’re not measuring the biology you set out to measure. It’s a rather pointless exercise.  

 Sean Sanders:  Right. Dr. Turnbull?  Dr. Lynne Turnbull:  The point is less is more.  Sean Sanders:  Yeah.  Dr. Lynne Turnbull:  If  you  can  get  away  with  fewer  time  points,  less  Z‐slices.  Do 

everything  you  can  to  keep  your  cells  healthy  and  you’ll  get  less photo  bleaching  but  you  can’t  avoid  it  completely.  It’s  going  to happen.  You  just  have  to  make  sure  that  you  have  some measurement of how healthy your cells are and stop when  they’re not healthy.  

 Dr. Edward Campbell:  And you know cells are very much like us where the light that upsets 

them  the most  is  UV  to  get  to  the  viewer’s  question.  You  know, there’s UV filters you can put to prevent the UV light from getting to your sample that will sometimes preclude the use of CFP, right. But if I had to keep my cells alive, I would generally go GFP and Cherry or YFP  and  Cherry  because  they’re  just  further  away  from  that  UV spectrum of light.  

 Sean Sanders:  Right. Dr.  Thomas,  a  quick  question  on HCA  I  believe.  This  viewer 

says that when they’re imaging in a multiplate format, they have say 384 wells and  it  takes a minute  to scan each well by  the time  they get  to  the end, you know,  it’s a  few hours  since  they  scanned  the first one.   

 Dr. Nick Thomas:  Yeah.  Sean Sanders:  How do you deal with that?  Dr. Nick Thomas:  That brings up a whole  range of very  interesting  things  I guess we 

could  discuss  for  hours  and  people  do  discuss  them  for  hours.  It really  does  depend  on  you  know,  I  covered  very  quickly  a whole range of different applications, which will run over lots of times. So I guess the quick answer  is  if you’re doing quick  imaging  like calcium imaging  then  you  generally  do  what  we  call  a  spit  and  stare.  So basically, you treat each well as an individual entity. So you will add the drug, you image that for maybe 30 seconds and you’re done and you move on  to  the next. So you basically work your way  through 

 

27  

your plate. So depending on how many wells you got to do, you got to schedule it. Again, it’s all about keeping those cells happy. In this case,  those cells are  sitting  there and you got  to keep  them happy until you actually use them in the experiment and then they’re done. If you’re doing long term live cell imaging or time lapse, what you’re doing there is you’re visiting a well and then you may not come back to that well until an hour later. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Nick Thomas:  So each type of experiment has its own set of issues and problems to 

solve. There’s no generic fix. That’s why there  is more pain  in doing live cell assay. But if you really want to know you know I treated my cells for 24 hours with this drug and they look like this at the end but I’m not sure what happened. 

 Sean Sanders:  Right.   Dr. Nick Thomas:  You have to do that experiment to find out.  Sean Sanders:  Right. Can we talk a  little bit about software that’s used and maybe 

we’ll start with, Dr. Turnbull? This is really a question about whether there’s any standard for software or whether there’s  just a number of packages  and  they  also  ask  if  there’s any open  source  software that you use. 

 Dr. Lynne Turnbull:  Most of the microscopes that you’ll buy will come with some form of 

acquisition  software  that will have  some ability  to do analysis with and some are better than others and they all have  it. And there are many options for software to do analysis including people write a lot of their own stuff these days because they want to do quantitative analysis based on things like Matlab or there’s plenty of commercial things. 

   But  one  of  the most  powerful  free  software  out  there  is  ImageJ, 

which  is developed by or housed by the NIH. Because  it’s  freeware and  it’s  built  by  a  lot  of  people  who’ve  asked  a  lot  of  different questions over  the  years  and  it’s maintained,  almost  anything  you want to do there’ll be an ImageJ plug‐in for it. You just have to figure out how to use it sometimes. Once you get your head around ImageJ logic, it’s not that bad. 

 [1:00:12] Sean Sanders:  Uh‐hum. 

 

28  

 Dr. Lynne Turnbull:  And that’s what we get our students to do because they can do it on 

their own laptop. They don’t have to sit in front of a computer.  Sean Sanders:  Right.  Dr. Lynne Turnbull:  But yeah, I think that that’s probably the most powerful freeware.  Dr. Edward Campbell:  And  I  think  I  totally  agree  and  I  think  one  of  the  people,  a  lot  of 

people download  ImageJ and they see what  it can do, right? But as she  said  the number of plug‐ins you can get… And  I  think  there’s  I want to say, I wouldn’t even try to come up with at name off the top of my head but  there’s places you can go  to  install  these packages and there’s a number of them that have like really a huge wealth of packages that you can  install all at once  if you  just poke around on the internet. The amount of functionality that that adds to the basic ImageJ package is you know considerable. 

 Sean Sanders:  Great.  I’m  going  to  stay with  you, Dr.  Campbell,  a  question  about 

tracking  vesicles, manual  tracking  or  automated  tracking?  Do  you use software when you track? 

 Dr. Edward Campbell:  So  we  have  used  manual  tracking.  Usually  that  requires  a  small 

number of events and good time resolution.  Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Edward Campbell:  But we’ve used, you know, automated particle tracking and certainly 

that makes life a good deal easier. Usually those packages are more expensive. You know,  I’ve never used or  tried them on  ImageJ. But the  software  packages  that we’ve  used,  it’s  generally much more reliable because even  the data  that  I  showed where you could  see the  particle  fluorescent  intensity  change  over  time,  that  was me going  in with  the data  inspector at each time point being  like 4338 plug into Excel, right? 

 Sean Sanders:  Right.   Dr. Edward Campbell:  That’s great, good times.  Sean Sanders:  Right. [Laughs] Isn’t that what graduate students are for?  Dr. Edward Campbell:  Yeah, that was me, yeah.  

 

29  

Sean Sanders:  So any other comments?  Dr. Lynne Turnbull:  I  guess  the  software  packages  that  you  can  buy  that  have  these 

really good  things, they cost a  lot of money but the people who’ve developed  them  spend  a  lot of  time doing  it  and  they do  it  really well.  So  that’s  the  advantage  and  therefore  at  our  end  it’s  a  lot quicker. 

 Sean Sanders:  Right.  Dr. Lynne Turnbull:  But yeah,  ImageJ and  things  like  that a  lot  cheaper. So you always 

have to balance the resources that you have available at the time.   Sean Sanders:  Uh‐hum. Okay. A question  about  the pros  and  cons of  fluorescent 

chemical probes versus fluorescent proteins and I noticed that most of  you  have  used  proteins,  fluorescent  proteins  but  maybe,  Dr. Thomas, you could start us off with this? 

 Dr. Nick Thomas:  Yeah.  I mean  some  of  those  GFP  experiments  that  I  showed  you 

there you know, we did ten years ago. Those techniques they work. You know,  if ain’t broke, don’t fix  it. You know, nowadays there are more advanced fluorescent proteins. A wider choice of colors, more stable. We won’t get  into the further toxicity of GFP and others but now you can – you know, there are tagging systems where you can put a  tag on  to a protein and deliver  fluorine  to a cell.  I guess you pays  your money  and  takes  your  choice.  I  like GFP.  I  always  have done.  You  know,  there’s  a  certain  essence  about  you’ve  got  all of that  in  the  literature  precedent.  And  generally  within  general increase  in sensitivity of  instrumentation over the years, you know, you can actually cut down on the amount of protein you express  in the cell and again I don’t want to hammer the point too much but it is. You know,  if you ask a cell to make 100,000 GFP  fusion proteins that’s kind of distracting it from its normal business. 

 Sean Sanders:  Right.  Dr. Nick Thomas:  Right?  Sean Sanders:  Right.  Dr. Nick Thomas:  If you ask it to make a thousand or two thousand, it can probably do 

that.   

 

30  

Dr. Edward Campbell:  I think it’s relevant to think that it’s not an either/or, right? So we’ve never really found a far red fluorescent protein that we enjoy. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum.  Dr. Edward Campbell:  But a  lot of these conjugatable dyes, you can utilize them and they 

work very well in the Cy5 five range. So, you know, when you’re just focusing on fluorescent proteins, you’re somewhat constrained. You know,  the  dyes  are  a  little  bit  –  you  know,  often  there’s  a pretreatment and you really have to have the ability to wash things, right. So either you have to be able to wash all the things off before you  go  to  the  stage  or  treat  something  and  remove  the  dye  by dialysis. The dyes can be – they’re a little bit dicier in that regard but they’re  certainly  very  valuable  and  you  just  have  to  think situationally.  

 Sean Sanders:  Great. So we’re just over the hour but I want to squeeze in one more 

question before  I  let you guys go and that’s  just  looking at some of the possible applications of  the work  that  you’re doing. Could  you talk about  that  in  terms of healthcare, public health and you know disease research. So, Dr. Campbell, we’ll start with you. 

 Dr. Edward Campbell:  Sure. Well I think you know, Yogi Berra said you can see a lot just by 

looking right and he was right. You know, all of the down –you know, in the field of HIV, a lot of the therapies that are effective are derived from a molecular and cellular biological understanding of the events that are going on, right? 

 [1:05:13]  Dr. Edward Campbell:  And  to  delineate  them  and  to,  you  know, what we’re  doing  using 

jellyfish protein  like  that’s not  going  to help  somebody  that’s  sick, right. But  if you’re developing a drug or you need an understanding of a biological process to target it, to reveal intervention points, you know,  I  think  that’s  really  where  from  my  perspective  live  cell imaging pays the bill. 

 Sean Sanders:  Uh‐hum. Great. Dr. Thomas?  Dr. Nick Thomas:  Yeah. I mean I only showed you one example there of a drug toxicity 

assay  but  that’s  something  that we  spend  a  lot  of  time  in  looking how you can use these new technologies to  look both at the safety and  the  efficacy  of  drugs.  You  know,  because  I  think  in  the  past couple  of  years  a  game  changer  has  been  people  recognizing  the 

 

31  

potential of the stem cell derived models for looking at drug toxicity and efficacy. And companies making those available on an industrial scale basically has allowed people  to  conceive of experiments  that they couldn’t do before. So for cardiotoxicity, we use both fixed cell assays, we use live cell assays and we integrate that data from both of those types of imaging with other analytical platforms. So you get what I call a holistic surveillance of what that drug is doing to a cell. And again, you know, doing a fixed cell  imaging experiment will tell you  something but doing a  live  cell  imaging will often as  I actually illustrated  distinguish  the mode  of  action  between  two  drugs  that would  look the same. You know, and  it’s all about there’s really no such  thing  as  a  completely  safe  drug,  we’ll  probably  never  have completely safe drugs but what we don’t want to do  is to fail drugs for  reasons, which  aren’t  real because  then  you  know  the  general population  is  not  getting  the  best  drugs  that  they  could  have.  So that’s kind of what drives me in what I do. 

 Sean Sanders:  Excellent. And  look out  for a webinar  from Science on that topic  in 

the future. It’s going to be coming. Dr. Turnbull, last word for you.  Dr. Lynne Turnbull:  I guess with live cell imaging, you’re seeing the sort of the time scale 

that things happen and you can understand where you might break up an  infection process for us because we study bacterial  infections or microbial  infections.  So  if  you  can  understand  how  the  process occurs  better,  you  could  understand  where  the  stop  points  are where  you might  be  able  to  intervene  as we  enter  an  era where antibiotics aren’t quite as useful as they used to be so we’re coming up with different strategies. So what live cell imaging does is gives us a better understanding of the basic process and then how we might lock it or if we do have a new novel drug or something that we want to try how  it works and then which part of the process that stops  it which you don’t always get from fixed  imaging. So yeah,  I guess  it’s the same answer really.  

 Slide 83 Sean Sanders:  Fantastic. Well unfortunately, we are out of time for this webinar so 

on behalf of myself and our viewing audience, I wanted to thank our speakers for being with us today, Dr. Edward Campbell from Loyola University,  Dr.  Nick  Thomas  from  GE  Healthcare,  and  Dr.  Lynne Turnbull from the University of Technology in Sydney, Australia.  

 Slide 84   Please go to the URL now at the bottom of your slide viewer to learn 

more about resources related to today’s discussion, and look out for 

 

32  

more  webinars  from  Science  available  at  webinar.sciencemag.org. This webinar will be made available to view again as an on‐demand presentation within about 24 to 48 hours from now. 

   We'd be  interested to hear what you thought of the webinar, send 

us  an  email  at  the  address  now  up  in  your  slide  viewer; webinar@aaas.org. 

   Again, many thanks to our panel and to GE Healthcare for their kind 

sponsorship of today's educational seminar. Goodbye.  [1:08:48]  End of Audio