Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  1

  From Biology to Discovery™

 

Lipodin‐ProTM ‐ Protein Transfection Reagent  

Cat. No 500100 Cat. No 500110 

Description 

The delivery of proteins  inside  living cells represents an alternative to nucleic acids transfection and a powerful strategy  for  functional  studies  or  therapeutic  approaches.  Several  technologies  based  on  the  use  of  peptide transduction  domain  (PTD) were  developed  successfully  to  transduce  proteins  across  the  plasma membrane. However,  these PTD poorly  interact with proteins, and  covalent  linkage between  the protein and PTD  is most often  required.  Lipodin‐Pro™  is  a  formulation  of  lipids  able  to  capture  proteins  through  electrostatic  and hydrophobic interactions. There is no need for covalent linkage procedure, Lipodin‐Pro™ is directly mixed with the protein of  interest for 10 minutes. The mixture  is then added to the cells  in culture, the  lipid‐protein complexes are  internalized  by  the  cells  and  the  proteins  are  released  into  the  cytoplasm within  few  hours without  any cytotoxicity.  The  optimized  formulation  of  Lipodin‐Pro™  is  fully  biodegradable maintaining  a  high  cell  viability upon delivery. The proteins delivered  inside the cells with Lipodin‐Pro™ retain both their structure and function whether peptides, proteins or antibodies are used.  

1. Kit Benefits 

Lipodin‐Pro™  can be used  in  various  functional  studies  for  cell  signaling  and  apoptotic  assays, protein‐protein interaction, protein localization and compartment shuttling. When the protein is conjugated to a fluorescent dye, the functional assay can be carried out in living cells under multiple treatments with a single sample.  Principal Lipodin‐Pro ™ advantages:  

No need for DNA cloning or nucleic acid transfection 

No chemical ligation or crosslinking 

Serum compatible, no cytotoxicity and biodegradable 

Easier 2‐step protocol with ready‐to‐use reagents 

Deliver functionally active protein within hours 

Higher delivery efficiency with stable cell lines and primary cells 

2. Transfected Proteins 

Lipodin‐Pro™ successfully delivered numerous proteins in a wide variety of cells: 

B and R‐phycoerythrin 

bovine serum albumin 

‐galactosidase  human active caspase‐3, caspase 8 and caspase 9 

immunoglobulins (unconjugated or labeled with FITC, TRITC, AlexaFluor®488 and AlexaFluor®546) 

MBP‐fusion protein 

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  2

Impurities,  contaminants  and  additives  present  with  the  protein  of  interest  affect  delivery  efficiency.  We recommend using a protein  sample as pure as possible. We noticed  that protein preparations  containing high contents of detergents or sodium azide were not compatible with protein transfection, whereas glycerol has no effect. 

3. Cell Types Tested 

Lipodin‐Pro™  is  applicable  on  numerous  cell  types.  This  reagent  has  been  successfully  tested  on  a  variety  of immortalized  cell  lines  as  well  as  primary  cells  (Table  1).  By  submitting  end‐user  data  to  our  Technical Department, we can update this list and improve our technical support to the scientific community. If a particular cell type  is not  listed, this does not  imply that Lipodin‐Pro™  is not working  for that type but  that  it has not yet been tested. 

Table 1: Example of cells successfully tested with Lipodin‐Pro™ reagent. 

Cell Line Cell Type Source Efficiency3T6  Embryonic fibroblasts  Mouse 50% A549  Non‐small cell lung carcinoma Human 50‐80%B16‐F10  Melanoma  Mouse 50% BEAS‐2B  Bronchial epithelial cells Human 80% BHK21  Fibroblasts (Kidney)  Hamster 80‐90%CHO‐K1  Epithelial‐like (Ovary)  Hamster 50‐80%COS‐1, COS‐7  Fibroblasts (Kidney)  Green Monkey 50‐70%HaCaT  Keratinocytes  Human 50‐80%HEK‐293  Transformed Embryonic (Kidney) Human 80‐100%HeLa  Cervical Epithelial Carcinoma Human 50‐60%Jurkat  T cell leukemia  Human 50% L929  Fibrosarcoma  Mouse 80‐90%K562  Myelogenous leukemia  Human 10‐50%MDCK  Epithelial (Kidney)  Canine 10‐50%N2A  Neuroblastoma  Mouse 60‐80%NIH3T3  Fibroblasts  Mouse 50‐75%Raw264.7  Monocytes/macrophages Mouse 90% U87  Glioblastoma  Human 50% Vero 10A1  Epithelial (Kidney)  Monkey 50% Primary cells   Neurons  Rat 50% Glial cells  Rat 50% 

4. Delivery of B and R‐Phycoerythrin 

NIH3T3 A549

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  3

 B‐Phycoerythrin (1 µg, Sigma‐Aldrich) was delivered  in the  indicated cell  lines with 2 µl of Lipodin‐Pro™ reagent. Phycoerythrin/Lipodin‐Pro™ complexes were  incubated  for 24 hours  in 24‐well plates before unfixed cells were observed by fluorescence microscopy. 

RAW 264.7 BHK21

BEAS-2B BEAS-2B

3T6 HeLa

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  4

R‐Phycoerythrin  (1  µg, Molecular  Probes) was  delivered  in  the  indicated  cell  lines with  2  µl  of  Lipodin‐Pro™ reagent.  Phycoerythrin/Lipodin‐Pro™  complexes were  incubated  for  24  hours  in  24‐well  plates  before  unfixed cells were observed by fluorescence microscopy. 

5. Delivery of Beta‐Galactosidase 

HeLa CHO-K1

A549 A549

Vero Raw 264.7

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  5

‐Galactosidase (1 µg) was delivered in various cells with 2 µl of Lipodin‐Pro™ reagent. ‐Galactosidase/Lipodin‐Pro™  complexes  were  incubated  for  24  hours  in  24‐well  plates  before  fixed  cells  were  stained  for  beta‐galactosidase activity. 

 

6. Delivery of BSA‐TRITC 

Tetramethylrhodamine‐labeled BSA  (BSA‐TRITC,  2 µg) was  delivered  in  various  cells with  3 µl  of  Lipodin‐Pro™ 

reagent.  BSA‐TRITC/Lipodin‐Pro™  complexes were  incubated  for  24  hours with  cells  in  24‐well  plates  before unfixed cells were observed with a fluorescent microscope. 

 

BEAS-2B NIH3T3

Jurkat BHK21

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  6

7. Delivery of MBP Fusion Protein 

The MBP‐fusion protein (10 µg) was delivered with 25 µl of Lipodin‐Pro™ reagent in HEK 293 cells. After an 8‐hour incubation,  cells were  fixed and  immunostained with an anti‐MBP antibody. Then,  the  cells were observed by fluorescence microscopy. After a 10‐hour incubation, cells were lysed for protein detection by western‐blot.  

8. Delivery of Immunoglobulins 

A  control  antibody  labeled  with 

AlexaFluor488 (0.5 µg) was mixed with 2 µl of Lipodin‐Pro™  reagent  and  incubated  for  24 hours with BHK‐21 cells in 24‐well plates. Then, cells were  fixed with 2% pFA and observed by fluorescence microscopy. 

A  Nuclear  Pore  Complex  Protein  antibody 

labeled  with  AlexaFluor488  (0.5  µg)  was mixed  with  2  µl  of  Lipodin‐Pro™  reagent  and incubated  for 24 hours with BEAS‐2B cells  in a 24‐well  plate.  Then,  cells were  fixed with  2% pFA and observed by fluorescence microscopy. 

MBP‐Protein alone  MBP‐Protein delivery with the Lipodin‐Pro™ 

reagent  

MBP‐Protein Lipodin‐Pro 

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  7

9. Kinetics of R‐Phycoerythrin Delivery in NIH3T3 Cells 

R‐Phycoerythrin (1 µg) was delivered in NIH3T3 cells with 2 µl of Lipodin‐Pro™ reagent in 24‐well plates. Cells were collected  and  fixed with  2%  PFA  at  the  indicated  time  point.  The  number  of  fluorescent  cells  and  the mean fluorescence was determined by cytofluorimetry. The mean fluorescence was used to evaluate the amount of R‐Phycoerythrin internalized inside cells. 

10. Delivery of Active Caspase‐3 Induces Apoptosis 

HeLa cells in a 24‐well plate were treated with 15  ng  of  active  human  caspase‐3  (Biovision) mixed with 5 µl Lipodin‐Pro™  reagent.  Images were taken 6 h after treatment (top row). The bottom image is a control of cells treated with Lipodin‐Pro™  reagent  alone.  Identical  results were obtained with NIH‐3T3 cells. 

0

20

40

60

80

100

2h 4h 24h

Am

ou

nt

of

pro

tein

(ar

bit

rary

un

it)

0

20

40

60

80

100

Flu

ore

scen

t C

ells

%

Amount of protein/cell % Fluorescent cells

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  8

An apoptosis assay was performed to quantify apoptotic cells. HeLa cells were treated with 15 ng of active human caspase‐3 mixed to 5 µl of Lipodin‐Pro™ reagent  in 24 well plates. After a 7‐hour  incubation, cells were stained with  both  Annexin‐FITC  and  propidium  iodide.  Apoptotic  and  dead  cells were  counted  by  cytofluorimetry.  A positive control with staurosporine (100 nM) was used to induce apoptosis. Negative controls were cells treated with caspase 3 or Lipodin‐Pro™ alone.  

In another set of experiments, HeLa and A549 cells were treated with 15 ng of active human caspase‐3 mixed to 5 µl of Lipodin‐Pro™ reagent in 24 well plates. After a 24‐hour incubation, live cells were counted in each well and 

results plotted as percentage relative to non‐treated cells. A positive control with staurosporine (1 M) was used to induce apoptosis. Negative controls were cells treated with caspase 3 or Lipodin‐Pro™ alone.  

0

20

40

60

80

100

Apoptotic Cells % 86 52 11 8

StaurosporineCaspase-3 + Pro-DeliverIN

Pro-DeliverIN Caspase-3

0

20

40

60

80

100

Stau

1 µM

Casp-

3 + P

ro-D

elive

rIN

Pro-D

elive

rIN

Casp-

3

Non T

reat

ed

A549

HeLa

Caspase-3 + Lipodin-Pro

Lipodin-Pro

Stau 1 M Caspase-3 Lipodin-Pro Caspase-3 Non-treated +Lipodin-Pro

Lipodin‐Pro™ Experimental Results 

WWW.ABBIOTEC.COM  9

 Overall, Lipodin‐Pro™ reagent can efficiently deliver various types of proteins  in different  living cell  lines. The delivery efficiency is cell type and protein dependent with higher yield for acidic proteins. The delivered protein is still active once inside the cell for binding to target proteins and activating cellular pathways. 

11. Technical Support 

 If  you  need  assistance  with  your  experiments  using  this  product,  please  contact  our  Technical  Support Department:  ABBIOTEC 7985 Dunbrook Rd., Ste A San Diego, CA 92126, USA Toll Free:  1 800 854 7453 Telephone:  1 858 586 0500 Fax:    1 858 586 6252 Email:    techsupport@abbiotec.com Web:    www.abbiotec.com  

12. Product Use Limitations 

 Abbiotec,  LLC  agrees  to  provide  its  customers  with  products  under  the  following  terms  and  conditions.  By purchasing and receiving Abbiotec products, customers will agree to the following:   All Abbiotec products are provided solely  for  research use only. Abbiotec products have NOT BEEN APPROVED FOR HUMAN USE,  directly  or  indirectly.  Customers  agree  not  to  administer  any Abbiotec  products  to  human subjects  in any manner or  form or  to use Abbiotec products  for  therapeutic or diagnostic purposes. Abbiotec customers will also agree not to use its products commercially without prior consent and without the presence of a  signed agreement between  customer and Abbiotec,  LLC.  Licenses  for diagnostic,  therapeutic, or  commercial resale use of Abbiotec products may be available and can only be obtained by contacting Abbiotec directly.  Customers agree  to abide and  comply by all applicable  local and  federal  laws  that govern  the use of  research products for research use only. This  includes the correct use of Abbiotec products as  intended and described  in the  product  manual,  and  the  safe  handling  and  disposal  of  these  products  according  to  all  applicable governmental regulations.  These  product  use  limitations  represent  the  entire  terms  and  understandings  between  Abbiotec,  LLC  and  its customers.  These  use  limitations  supersede  all  previous  communications,  representations,  understanding  and agreements,  whether  oral  or  written,  by  or  between  Abbiotec,  LLC  and  the  customer  regarding  the  use  of Abbiotec products. No change, modification, extension, termination or waiver of any of these use limitations shall be valid unless made in writing and signed by a duly authorized representative of Abbiotec.  Abbiotec  trademarks  referred  to  in  this  publication:  From  Biology  to  Discovery™,  Lipodin‐Ab™,  Lipodin‐Pro™.  “Abbiotec”  and  the  Abbiotec  logo  are trademarks of Abbiotec, LLC. All content contained in this manual is property of Abbiotec, LLC and may be used only with the expressed written permission of Abbiotec, LLC. All rights reserved. Trademarks of other companies referred to in this publication: AlexaFluor® (Invitrogen, Inc.).