Upload
ivana-vujkovic
View
512
Download
8
Embed Size (px)
DESCRIPTION
...
Citation preview
Lipidi
Smina M., Dušica P., Ivana V.B., Ivana S., Jelena M.
Slika:http://reputationdoctor.com/2006/11/trans-fat-is-the-new-cigarette-
packaged-food-companies-and-fast-food-chains-have-reputations-in-crisis/
UVOD Def. 1: Lipidi predstavljaju klasu jedinjenja, koja se
izdvaja po svojoj nerastvorljivosti u vodi i rastvorljivosti u
nepolarnim rastvaračima (etar, benzen, petroletar i dr.).
Def 2.: Lipidi su bitni za biološke sisteme, jer učestvuju u
izgradnji ćelijske membrane, obnovi ćelija i njenih
delova, ali i predstavljaju mehaničku barijeru koja štiti
ćelije od spoljnih uticaja.
Međutim, lipide nije dovoljno klasifikovati samo na osnovu njihove
rastvorljivosti, danas postoje različiti kriterijumi podele lipida!
Def. 3: Lipidi su masne kiseline ili neke druge supstancije
koje su biosintetski povezane sa masnim kiselinama
(trigliceridi, neki vitamini,fosfo- i glikolipidi, ali ne i terpeni,
steroidni hormoni i neke druge supstancije).
Def. 4: Jedna od definicija je i da su to hidrofobni ili
amfipatični mali molekuli koji nastaju iz karbanjonske
kondenzacije tioestara (masne kiseline, poliketidi i dr.) ili/i iz
karbokatjonske kondenzacije izoprenskih jedinica
(prenol,steroli i dr.).
Masne kiseline
Glicerofosfolipidi
Sfingolipidi
Poliketidi
Karbanjonski
intermedijer
Prenoli
Steroli
Karbokatjonski
intermedijer
Eritromicin
Aflatoksin B1
POLIKETIDI
PRENOL
Lipidi
Ne mogu se
saponifikovati
Mogu se
saponifikovati
Prosti Složeni Steroidi
Vitamini
(A,D,E,K)
Prostaglandini
Terpeni
Masti i ulja
Voskovi
Fosfolipidi
Sfingolipidi
Lipoproteini
Tip
lipida
uobičajeno ime hemijski tip jedinjenja Proizvodi hidrolize
I lipidi koji ne
hidrolizuju
ugljovodonici
alkoholi
masne kiseline
II jednostavni estri Masti masne kiseline (ili sapuni) + glicerol
Voskovi masne kiseline (ili sapuni) + alkohol
steroidni estri masne kiseline (ili sapuni) + steroidni alkohol
III fosfolipidi fosfatidne kiseline masne kiseline (ili sapuni) + glicerol + fosfat
Fosfatidi masne kiseline (ili sapuni) + glicerol + fosfat + aminoalkohol
IV sfingolipidi Ceramidi masne kiseline (ili sapuni) + sfingozin
Cerebrozidi masne kiseline (ili sapuni) + sfingozin + šećer
Gangliozidi masne kiseline (ili sapuni) + sfingozin + šećer + neuraminska kiselina
Struktura masnih kiselina
Struktura masne kiseline
Karboksilna
grupa
Ugljovodonični
skelet
Zasićene masne
kiseline
Smeša zasićenih i nezasićenih
masnih kiselina
Masne kiseline se dele dalje na: ZASIĆENE i NEZASIĆENE (mono- i polinezasićene)
Laurinska kiselina
Oleinska kiselina
Neutralne masti i ulja(trigliceridi).
Neutralni jer nemaju naelektrisanje niti jonizabilnih grupa.
Najzastupljeniji lipidi u prirodi.
Tripalmitin
Prost triacilglicerol
1-stearo-2,3-diolein
Složeni triacilglicerol
1-palmito-2-oleo-3-stearin
Složeni triacilglicerol
Masne kiseline
Nastaju u organizmu
biosintezom acetil-koenzima
A, uzastopnim enzimskim
reakcijama. Kako nastaju od
AcCoA, broj ugljenikovih
atoma u prirodnim masnim
kiselinama je skoro uvek
paran i masne kiseline su
uglavnom linearne.
Laurinska kiselina*
Zasićene i nezasićene masne kiseline
Zasićne masne kiseline:
Tačka topljenja raste sa porastom ugljovodoničnog lanca.
Masna kiselina C atomi Tačka topljenja
Laurinska
Miristinska
Palmitinska
Stearinska
Arahinska
Nezasićene masne kiseline:
Nezasićene masne kiseline imaju cis (Z) konfiguraciju na
dvostrukoj vezi, pa zbog toga dolazi do nepravilnog pakovanja
u lipidima, bez obzira na temperaturu.
Masna kiselina C atomi Tačka
topljenja
Palmitoleinska
Oleinska
Linolna
Linoleinska
Arahidonska
Omega broj*
Cis-Trans masne kiseline
Prirodno masne kiseline imaju cis veze, trans
veze se veštacki stvaraju hidrogenizacijom, pa
molekul može isparavati.
Cis konfiguracija 2-
buten.
Trans konfiguracija 2-
buten.
Visoka energetska barijera izmedju dve konfiguracije,
atomi su različito raspoređeni u prostoru, kao rezultat
imamo dva različita jedinjenja.
Efekat dvostrukih veza
(snižavanja tačke topljenja)
ne javlja se kod trans
izomera. Trans masne
kiseline se ponašaju kao
zasićene masne kiseline, pa
t.t. zavisi od dužine
ugljovodoničnog niza.
oleinska kiselina
oleinska kiselina
*trans-oleinska
kiselina=t.t. 450C
*cis-oleinska
kiselina=t.t. 13-140C
Linoleinska i linolna masna kiselina
mogu se konvertovati i dati
arahidonsku kiselinu.
ESENCIJALNE I NEESENCIJALNE
MASNE KISELINE
Mravlja kiselina
Sirćetna kiselina
Valerijanska kiselina
Butanska kiselina
Propanska kiselina
Ne javljaju se u
lipidima
Kapronska kiselina
Kaprilna kiselina
Kaprinska kiselina
Laurinska kiselina
Palmitinska kis.
Miristinska kiselina
Oleinska kiselina
Stearinska kiselina
Linoleinska kis.
Linolna kiselina
Arahinska kiselina
Arahidonska kis.
Behenska kiselina
Lignocerinksa kis.
Erukinskakiselina
Nervonska kiselina
Broj C atoma
Kapronska kiselina
Broj dvostrukih veza
Pozicija dvostrukih veza
Karboksilne kiselina
Ime
Esencijalne u ljudskoj ishrani
VOSKOVI Estri viših zasićenih monohidroksilnih alkohola i viših masnih kiselina:C16-C34
Karnauba vosak
Značajan udeo primesa ( i do 50%): oksikarboksilne kiseline, alkoholi, ugljovodonici i smolaste
materije.
Najpoznatiji voskovi:
Fosfolipidi su klasa lipida i značajna komponenta svih ćelijskih
membrana.
Dele sa u dve grupe na osnovu alkohola koji ih izgrađuje:
*A-glicerofosfolipidi
*B-sfingofosfolipidi -> SFINGOMIJELINI
voda
Hidrofilna
glava
Hidrofobni
rep
Vanćelijski matriks
Unutrašnjost
ćelije
Hidrofilna glava
Hidrofobni rep
Fosfolipid
Glicerofosfolipidi su fosfolipidi sa glicerolom kao osnovom.
Sfingolipidi su klasa lipida izvedeni iz
alifatičnog amino alkohola sfingozina.
Sfingozin je aminoalkohol dugačak 18
C-atoma, sa nezasićenim
ugljovodoničnim lancem.
Ceramid je zajednička strukturna
jedinica za sve sfingolipide. Sastoje se
od lanca masne kiseline vezanog
amidnom vezom za sfingozin.
Imaju važnu ulogu u prenosu ćelijskih
signala i u ćelijskom prepoznavanju.
Ceramid
Lipoprotein je biohemijski sklop koji se sastoji od lipida i proteina. Primeri takvih molekula su
lipoproteini visoke gustine(HDL) i niske gustine(LDL) koji omogućavaju prenos masti krvnim
sistemom, transmembranski lipoproteini mitohondrija i hloroplasta i bakterijski lipoproteini.
Steroidi - grupa jedinjenja koja sadrže ciklopentanoperhidrofenantrenski prsten.
Lanosterol
Ciklopentanofenantren
perhidro-sve vodonici
Obuhvataju lekove, vitamine, hormone i otrove.
Pojavljuju se slobodni ili kao glikozidi, estri i amidi.
Reakcije za identifikaciju
steroida:
1. Huppert-Salkowski-ova reakcija dokazivanja steroida:
Mesanjem 0,1% hloroformskog rastvora steroida i koncentrovane sumporne kiseline OH grupa na C3 se
dehidratise i dobija se konjugovani sistem dvostrukih veza, koji daje karakteristične bojene reakcije za
steroide. Žuta boja za holesterol, a boja za ergosterol može varirati od narandžaste do crvene.
2 .Libermann-Burchardt-ova reakcija dokazivanja steroida:
Dehidratisani holesterol međusobnim kuplovanjem, daje biholestadien. U prisustvu anhidrida sirćetne
kiseline i sulfonske kiseline, biholestadien se sulfonuje. Krajnji proizvod daje zelenu boju.
3. Whitby-jeva reakcija:
Dehidratacija steroidnog rastvora, i zatim oksidacija.
Fungisterol izolovan iz kvasca
(Saccharomyces cerevisiae).
Steroli ili steroidni alkoholi su jako zastupljeni u živom svetu,
bilo slobodni, bilo u obliku estara.
Podela:
* Zoosteroli
* Fitosteroli
* Mikosteroli
Glikolipidi
Glikolipidi
Glikoglicerolipidi
Glikosfingolipidi
Vitamini A, D, E i K
*Vitamin A-retinol
Holekalciferol (D3)
Ergokalciferol (D2)
Alfa-takoferol
*Vitamin E
Vitamin K1
Vitamin K2
Sada ćemo se malo podsetiti terpena...
Reakcije lipida
Hidroliza:
Masti i ulja se hidrolizom razlažu na
glicerol i dugolančane masne
kiseline.
Hidroliza može biti katalizovana
enzimima (isključivo način kada se
radi o živim sistemima), kiselinama
ili bazama. Baznom hidrolizom
dobijaju se soli masnih kiselina-
sapuni i glicerol.
Adicija halogena na dvostruke veze:
Dvostruke veze se dokazuju adicijom broma ili
joda iz njihovog rastvora. Dobijaju se dihalogeni
derivati.
Akroleinska reakcija:
Dehidratacijom glicerola (slobodnog ili u
lipidima) nastaje nezasićeni aldehid
akrolein, karakterističnog “oštrog mirisa”.
Reakcije karboksilne grupe:
Funkcionalni derivati karboksilnih kiselina:
Biodizel:
Tečno gorivo proizvedeno iz biljnih ulja, ili iz korišćenih masti i ulja. Proizvodi se od ulja koje se dobija od
suncokreta, soje ili uljane repice pomocu metanola i katalizatora. Po hemijskom sastavu je mešavina metil
estara masnih kiselina. Nižeg je energetskog sadržaja.
1. Masnih kiselina
2. Triacilglicerola
3. Fosfolipida
4. Sfingolipida
5. Holesterola (terpeni)
Biosinteza:
1. Biosinteza masnih kiselina
FAS I (fatty acid synthase - sintetaza masnih
kiselina) Enoil-ACP-
reduktaza
Β-Ketoacil-
ACP-reduktaza
Β-Hidroksiacil-ACP
dehidrataza
Β-Ketoacil-ACP
sintetaza
Malonil/acetil-CoA-
ACP transferaza
Dodavanje acetil- i malonil- grupe
Enoil-ACP-
reduktaza Β-Ketoacil-ACP-
reduktaza
Β-Hidroksiacil-
ACP dehidrataza
Β-Ketoacil-
ACP sintetaza
Malonil/acetil-
CoA-ACP
transferaza
Acetil CoA
Malonil CoA
Acetil- i malonil-
grupe vezane za
FAS kompleks
Kondenzacija
Malonil CoA
Acetil- i malonil- grupe
vezane za FAS
kompleks
1. Kondenzacija
Β-ketobutiril-ACP
Redukcija β-keto grupe (KR)
Β-ketobutiril-ACP
2. Redukcija β-
keto grupe (KR)
β-hidroksibutiril-ACP
Dehidratacija (DH)
β-hidroksibutiril-ACP
3. Dehidratacija
(DH)
trans- Δ2-butenoil-ACP
Redukcija dvostruke veze (ER)
trans- Δ2-butenoil-ACP
4. Redukcija
dvostruke
veze (ER)
Butiril-ACP
Premeštanje butanoil- grupe na Cys ostatak
β-ketoacil-ACP sintetaze
Butiril-ACP
5. Premeštanje
butanoil- grupe na
Cys ostatak β-
ketoacil-ACP sintetaze
Ponavljanje ciklusa dodavanjem još jedne
malonil- grupe na ACP
6. Dodavanje još
jedne malonil-
grupe na ACP
(MAT)
Putevi sinteze ostalih masnih kiselina
Palmitat
elongacija
elongacija
elongacija
desaturacija
desaturacija
samo u
biljkama
desaturacija
desaturacija
desaturacija
desaturacija
samo u
biljkama
Palmitoleat
Stearat
Zasićene masne
kiseline dugog
lanca Oleat
Linoleat
Linolenat
Linolenat
Eikozatrieni
Arahidonat Druge polinezasićene
masne kiseline
Dehidrogenizacija zasićenih masnih kiselina
Zasićen acil-
CoA
Nezasićen acil-
CoA
Acil-CoA
desaturaza
Biosinteza prostaglandina
arahidonat
Fosfolipid koji sadrži
arahidonat
Tromboksani Ostali
prostaglandini
2. Biosinteza triacilglicerola - prvi korak
dobijanje fosfatidne kiseline
Glukoza
glikoliza
Dihidroksiaceton
fosfat
Gicerol
L-glicerol-3-fosfat
L-glicerol-3-fosfat
Fosfatidna kiselina
Drugi korak - prevođenje do 1,2-
diacilglicerola
Fosfatidna kiselina
diacilglicerol
Treći korak - prevođenje u triacilglicerol
diacilglicerol
Triacilglicerol
3. Biosinteza fosfolipida
CDP-diacilglicerol
Kardiolipin
Fosfatidilinozitol
Fosfatidilserin
Fosfatidiletanolamin
Fosfatidiletanolamin
Fosfatidilholin
4. Biosinteza sfingolipida - prvi korak je
formiranje sfinganina
Palmitoil-CoA
Β-ketosfinganin
Sfinganin
Serin
Ceramid, sadrži
sfingozin
Cerebrozid
Fosfatidilholin
Diacilglicerol
Sfingomijelin
5. Biosinteza holesterola - podsećanje na
biosintezu terpena
Holesterol
Skvalen
Acetat
Mevalonat
Aktivirani izopren
Žučne kiseline
Karotenoidi
Steroidni
hormoni
Guma
Biljni hormoni:
Abscisinska i
giberelinska
kiselina
Hinonski
elektron
prenosioci:
ubihinon i
plastohinon
Izopren
Holesterol
Lanac fitola u
hlorofilu
Doliholi
Δ3-izopentenil
pirofosfat
Biološka uloga lipida
- Gorivo, hranljive materije
- Gradivna jedinica membrane
- Izolacija
- Specijalne uloge
Gradivna jedinica membrane
-Fosfolipidi
-Glikolipidi
-Holesterol
Gangliozidi
- Identifikovane dve forme:
GM1 i GM2
GM1
GМ2
Holesterol
- Utiče na stabilnost strukture ćelijske membrane i
pokretljivost.
- Lateralno smicanje.
Sadržaj u hrani
- žumance
- iznutrice
- riblja ikra
- punomasno mleko
- meso i mesne prerađevine
vrste namirnice holesterol(mg/100g)
mleko obrano 2
sa 3.6% masti 14
jogurt 13
majonez 105
iznutrice jetra 270
mozak 2000
mesne prerađevine mesni narezak 92
Оdаklе holesterol u bilјkama ?
Biljke imaji drugu vrstu sterola u svom
sastavu, npr. sitostanol.
Ceramid
Jedna od najvažnijih ispitivanih uloga ceramida se odnosi
na njegovu f-ju u apoptozi, ili tipu programirane ćelijske
smrti.
Studije su pokazale da ceramid aktivira apoptoticki put.
Mehanizam kojim ovaj lipid reguliše apoptozu jos uvek
nije jasan.
Takodje, ceramid je jedna od glavnih komponenti
epidermalnog sloja ljudske kože.
Sfingomijelin
Poremećaji usled nedostatka mijelinskog omotača:
- motoričke sposobnosti
- mišićna snaga i tonus
- gubitak sluha
Lecitin
U ćelijskim membranama omogućavaju prolazak hranljivih
materija u ćelije i izbacivanje štetnih.
Takođe, štite ćelije od oksidacije, što se odnosi i na
moždanu opnu.
Koriste ga i mišići i nervi.
Nedostatak lecitina
Digestivni problemi
Povišen krvni pritisak
Problemi sa zglobovima i mišićima
Kefalin
Značajan sastojak nervnog i moždanog tkiva.
Vitamin A
Vitamin D
Vitamin E
Vitamin K
hipovitaminoza
-noćno slepilo
-promene na koži
-smanjena
otpornost
organizma na
infekcije
-promene na
koštanom tkivu
(kod dece
rahitis,kod odraslih
osteoporoza)
-slabost mišića
-smanjen broj
crvenih krvnih
zrnaca
-ataksija
-pogoršanje
imunog odgovora
-pad koncentracije
protrombina u krvi
-poremećaj
koagulacije
hipervitaminoza
-crvenilo
kože,svrab
-akutno trovanje
-oštećuje
jetru,nerve,može
uticati na fetus
-višak beta-
karotena se
akumulira u
epiderm
-poremećaj
metabolizma
kalcijuma
(taloženje u
bubrezima)
-probavne
smetnje,anemija,
depresija
*u velikim
dozama,smatra se
najtoksičnijim
vitaminom
-nema štetnih
nuspojava
-pospešuje već
postojeći deficit
vitamina K
-nije toksičan čak
ni u velikim
dozama
-intravenska
primena može
izazvati probleme
sa
disanjem,kardiovas
kularni kolaps
PROSTAGLANDINI
Oni predstavljaju monociklične hidroksi-masne
kiseline, čiji se skelet sastoji od 20 C atoma. Imaju
izrazito fiziološko dejstvo.
Utiču i na transport vode kroz epitelne membrane.
Postoji više od 20 PG.
Ime prostaglandin
Ime je izvedeno iz žlezdi prostate.
Kada je prostaglandin prvi put izlovan iz
semene tečnosti od strane švedskog
fiziologa Ulf von Eulera, a u isto vreme i od
strane M. V. Goldblatta, verovalo se da je
prostaglandin sastavni deo izlučevina
prostate.
Kasnije se pokazalo da mnoga druga tkiva
izlučuju prostaglandine za različite funkcije.
Glavni medijatori nastali iz fosfolipida su
eikosanoidi ( prostanoidi i leukotrieni ) i faktor
agregacije trombocita ( PAF )
Termin “prostanoidi” obuhvata prostaglandine
(PG ) i tromboksane (TX )
Prostanoidni receptori
-Vezani za G protein-
Označeni su redom kao DP-,FP-,IP-,TP- i
EP- receptori, na osnovu pet klasa prirodnih
prostaglandina PGD2, PGF2alfa, PGI2,
tromboksana A2 i PGE2.
Tip Receptor Funkcija
PGI2 IP vazodilacija
inhibira agregaciju
trombocita
bronhodilatacija
PGE2 EP1 bronhokonstrikciju
kontrakcija glatkih misica GI
trakta
EP2 bronhodilatacija
relaksacija glatkih misica GI
trakta
vazodilatacija
EP3 kontrakcija uterusa
kontrakcija glatkih misica GI
trakta
PGF2alfa FP kontrakcija uterusa
bronhodilatacija
Prostaglandin E2 (PGE2)
-poznat u medicini kao dinoproston
-ima važnu ulogu pri porođaju
-prostaglandin koji indukuje groznicu
Tromboksan je
vazokonstriktor.On
posreduje u agregaciji
trombocita.
Prostaciklin (PGI2) sprečava formiranje
ugrušaka u toku hemostaze.
PGH2
Učestvuje u procesu
kontrakcije/relaksacije glatkih
mišića.
Luči se kod sisara, proizvodi se u materici kada je povišen nivo oksitocina, zaustavlja
proizvodnju progesterona, moze da podstakne razvoj trudnoće, ali i da je spreči.
Prostaglandin F2alfa
U većim količinama se sintetiše u mastocitima
u mozgu.
Sintetisani su u ćeliji iz arahidonske
kiseline,5-lipoksigenazom.
Primeri leukotriena su : LTA4, LTB4, LTC4,
LTD4, LTE4 i LTF4.
LTB4 je vazan medijator u svim tipovima
zapaljenja. Cisteinil-leukotrieni su posebno
značajni u astmi.
Leukotrieni
Izolovanje lipida
Izolovanje i frakcionisanje lipida se zasniva na različitoj rastvorljivosti lipida.
Univerzalni rastvarač za lipide je smjesa hloroform-metanol
Opšti postupci ekstrakcije lipida
Efikasnost postupka zavisi od hemijske prirode lipidnih komponenti i od asocijacija u kojima lipidi
učestvuju.
1. Van der Waals-ove (hidrofobne) asocijacije - adipozno tkivo
2. Vodonična vezivanja, elektrostatičke i hidrofobne asocijacije - ćelijska membrana
3. Kovalentne asocijacije - povezuju masne kiseline u estre sa polisaharidima bak. ćelijskih zidova
Opreznost u radu sa lipidima
Sprečavanje oksidovanja dvostrukih veza- svježe predestilovani rastvarači, dezaerisani rastvarači
Biljni materijal- sprečavanje enzimske degradacije lipida- alkoholne smjese
Alkohol povećava polarnost smjese što olakšava ekstrakciju polarnih molekula
Najpogodnija smjesa rastvarača je hloroform/metanol/voda (5/10/4, zapreminski)
Čuvanje lipidnog ekstrakta
Lipidi su nestabilni prema (peroksidnoj) oksidaciji i hidrolizi.
Najbolji rezultati se dobijaju korišćenjem svježeg lipidnog ekstrakta
Nekoliko nedjelja čuvanja- rastvoriti u smjesi hloroform/ metanol (2:1, zapreminski)
Kada se materijal čuva duže dodaju mu se antioksidansi (npr. BHT) i čuva na niskim temeraturama
Izolovanje lipida iz bioloških materijala
Izolovanje lipida iz jetre Ukupni lipidi mikroorganizama
metanol/ hloroform (2/1, v/v) metanol/hloroform/voda (2/1/0,8)
homogenizovanje
centrifugiranje
metanol/hloroform/voda (2/1/0,8)
Grubo frakcionisanje lipida po grupama
Silika gel u staklenoj koloni (oko 1g), nanese se 30mg lipida
Eluira se sa hloroformom ili dietil etrom , dobija se frakcija prostih lipida,
Acetonom , dobija se glikolipidna frakcija (nekad se izostavlja) i
Metanolom dobija se frakcija fosfolipida.
Acetonska precipitacija
Razdvajanje fosfatida od neutralnih lipida.
Metoda se zasniva na nerastvorljivosti većine fosfatida u hladnom acetonu, a istovremenoj
rastvorljivosti neutralnih lipida
U talogu: fosfatidi i tragovi neutralnih lipida
Frakcija rastvorna u acetonu: neutralni lipidi- gliceridi, steroli, ugljovodonici, pigmenti i tragovi
fosfatida
Particija u nemješljivim rastvaračima
Lipidi bogati gliceridima ili karotenoidima i hlorofilnim pigmentima
Smjesa lipida se raspodjeljuje u dva nemješljiva sistema rastvarača
Sistemi rastvarača koji se koriste: petroletar-85%etanol (1:1, v/v), ugljen-tetrahlorid/metanol/voda
(62/35/4, v/v/v), heksan/95% metanol (1:1, v/v)
Razdvajanje lipida na klase TLC-om
Razdvajanje lipida na klase hromatografijom na tankom sloju (TLC) silikagela
Ploče prevučene silika gelom
Eluent: heksan/dietiletar/mravlja kiselina (80:80:2, v/v)
Detekcija parama joda ili razblaženom sumpornom kiselinom
Razdvajanje TAG na RP TLC-u
klasa TAG vrsta TAG podeoni broj proporcija vode
zapreminski
S2M PPO, PStO, StStO 48, 50, 52 12
SM2 POO, StOO 48,50 14
S2D PPL, PStL, StStL 46, 48, 50 12
SMD POL, StOL 46, 48 18
SD2 PLL, StLL 44, 46 20
SMT POLn, StOLN, 44, 46 16
SDT PLLn, StLLn, ALLn 42,44,46 18
Razdvajanje TAG na RP TLC-u
S (saturated)- zasićena masna kiselina
M (monoenoic)- mononezasićena masna kiselina
D (dienoic)- dinezasićena masna kiselina
T (trienoic)- trinezasićena masna kiselina
P-palmitinska m.k.; St- stearinska m.k.; A - arahidonska m.k.; O- oleinska m.k.; L- linolna m.k. Ln-
linolenska m.k.
Ploče presvučene CaSO4
Mobilna faza: aceton/ acetonitril/voda, 70:30:X, X- voda
Podeoni broj = broj C atoma - (2xbroj dvostrukih veza)
Gasna hromatografija
Gasna hromatografija je mnogo brža od tečne hromatografije, separaciono vrijeme mjeri se obično
u sekundama.
koristi se za razdvajanje malih i srednje velikih prirodnih proizvoda- masne kiseline , etarska ulja,
steroida, ne koristi se za velike molekule- neki steroidi
Ograničenje- rastvori uzorka moraju biti isparljivi
Visoke temperature i do 300oC poboljšavaju isparljivost, ali mogu da dovedu do raspadanja
supstance
Neisparljive supstance se prevode u isparljive derivate npr. masne kiseline se prevode u isparljive
metil-estre
Razdvajanje lipida na klase GC-om
Mobilna faza u GC: vodonik ili helijum
Vodonik je eksplozivan, helijum je stabilniji, daje odlične rezultate, ali je poprilično skup
Upotrebom azota (sa manje od 5ppm kiseonika), zadovoljavajuća rezolucija pri standardnom
protoku sistema
Argon je skuplji od azota, ali ga je moguće nabaviti sa jako malim udelom kiseonika, što omogućava
analizu jako osjetljivih smjesa
Gasni hromatogram
ukupnih lipida
Razdvajanje lipida na klase HPLC-om
Reverzno-faznom HPLC na oktadecilsililnoj koloni (C-18) odvajaju se smjese slobodnih masnih
kiselina ili metil estara masnih kiselina iz fosfolipida u membranama ćelija sisara.
Eluiranje: smesa voda/acetonitril ili voda/metanol
Za odvajanje slobodnih masnih kiselina koristi se rastvor fosforne kiseline
Redosled eluiranja masnih kiselina u smjesama zavisi od koncentracije acetonitrila. Podešavanjem
polarnosti rastvarača, moguće je odvojiti bilo koju masnu kiselinu od važnosti iz smjese, ali i
razdvojiti njene strukturne i geometrijske izomere.
Razdvajanje lipida na klase HPLC-om
-Priprema slobodnih masnih kiselina i metil estara
Alkalnom ili kiselom hidrolizom
Alkalna hidroliza: miješanje uzoraka sa 1ml 0.5M NaOH u rastvoru metanol/voda (90:10), preko noći
pod N2. Zakišeljavanje, ekstrakcija sa 2 porcije 3ml heksana. Dvostruko ispiranje heksanske faze
vodom, uparavanje pod N2. Slobodne masne kiseline se drže u heksanu i rastvaraju u metanolu
neposredno prije ubrizgavanja u uređaj za HPLC.
Kisela hidroliza: 0.5M HCl u rastvoru acetonitril/voda (9:1) na 100°C, 45 minuta
Razdvajanje lipida na klase HPLC-om
-HPLC masnih kiselina i metil estara
Masne kiseline: ubrizgaju se u dve serijski povezane kolone. U prvoj koloni se eluiraju 60 minuta
70% acetonitrilom, i zatim 83% acetonitrilom tokom 4 minuta. Brzina protoka je 1mL/min. U drugoj
se eluira 58% acetonitrilom, u 50. minutu 61% acetonitrilom tokom 2 minuta, i u 90. minutu 83%
acetonitrilom tokom 2 minuta. Brzina protoka je 2mL/min
Metil-estri: razdvajanje smesom acetonitrila i vode. U kolonu se ubrizgava po 20μl uzorka,
temperatura kolone iznosi 35°C, eluiraju se 70% acetonitrilom.Unutrašnji standard je 50nmol
metil-trans-vakcenska kiselina (18C, 1 dvostruka veza) Nakon njegovog eluiranja, povećava se
koncentracija acetonitrila na 100% tokom 20 minuta.
Razdvajanje lipida na klase HPLC-om
-Fosfolipidi iz jetre pacova
Grubo frakcionisanje na silika gelu:
Fosfatidilholin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilinositol (PI) i fosfatidilserin (PS)
Hromatografija na C18 reverzno-faznoj koloni za određivanje pojedinačnih molekulskih vrsta. Iz
svakog od navedenih fosfolipida, moguće je odrediti 30-35 različitih molekulskih vrsta i izvršiti
njihovu kvantifikaciju.
Ekstrakcija, ispiranje, sušenje pod N2, ponovno rastvaranje u sistemu heksan-2-propanol-voda
(40:54:6) za HPLC fosfolipida. Određivanje na talasnoj dužini od 205 nm. Ekstrakt lipida se deli u
klase fosfolipida hromatografijom na Si-100 silika gelu.
Rastvarač za eluiranje: heksan/2-propanol/25 mM fosfatni pufer/etanol/sirćetna kiselina
(367:490:62:100:0.6).
Razdvajanje lipida na klase HPLC-om
HPLC fosfolipida:
PC, PE i PI: eluirani sa 20 mM holin-hloridom u rastvoru metanol/voda/acetonitril (90.5:7:2.5),protok
od 2.0mL/min.
PS: eluiran sa 30 mM holin-hloridom u rastvoru metanol/25 mM KH2PO4/acetonitril/sirćetna kiselina
(90.5:7:2.5:0.8 ), isti protok. PC i PE se dodaju na kolonu u 50-100 μl etanola, i PI i PS u 10-20 μL
hloroforma. Frakcije se suše pod N2 i ponovo ekstrahuju.
HPLC slobodnih masnih kiselina
Kolona SUPERCOSIL LC 25x4,6 mm, mobilna faza
tetrohodrofuran/ acetonitril/ 0,1% H3PO4
(21,6:50,4:28), temperatura: 350C, detekcija 220 nm,
koncentracija uzorka 1-2 mg/mL
18:3 (cis) linolenskaa kiselina, 16:1 (cis) palmitoleinska
kiselina, 16:1(trans) palmitoleinska kiselina, 18:2 (cis)
linolna kiselina, 18:2 (trans) linoelaidinska kiselina,
18:0 stearinska kiselina, 18:1 (cis) oleinska,18:1
(trans) elaidinska kiselina
Razdvajanje lipida na klase HPLC-om
Detekcija i kvantifikacija nezasićenih jedinjenja:
Na talasnoj dužini od 192 nm
Detekcija i kvantifikacija zasićenih jedinjenja:
Na talasnoj dužini od 250 nm
Masena spektrometrija
Tehnika kojom se analiziraju molekuli na temelju njihove mase i naelektrisanja.
Jonizacija molekula u jonizatoru.
Nastali joni se provode kroz analizator koji razdvaja jone u prostoru (i vremenu)
Iz jonizatora joni idu na detektor, gdje proizvode električni signal koji se može registrovati na
računaru.
Koristi se za ustanovljavanje nedvosmislene dužine ugljovodoničnog lanca ili pozicije dvostruke
veze.