Lipid Carbohydrate DNA RNA Protein

8/3/2019 Lipid Carbohydrate DNA RNA Protein

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V o l . 5 2 , N o . 4P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , O c t . 1 9 8 6 , p . 7 8 8 - 7 9 30 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 6 / 1 0 0 7 8 8 - 0 6 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t D 1 9 8 6 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E f f e c t o f N u t r i e n t D e p r i v a t i o n on L i p i d , C a r b o h y d r a t e , DNA, RNA,a n d P r o t e i n L e v e l s i n V i b r i o c h o l e r a eMARY A . H O O D , ' * JAMES B . GUCKERT,2t DAVID C . WHITE,2t AND FRED DECK3

D e p a r t m e n t of B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f W e s t F l o r i d a , P e n s a c o l a , F l o r i d a 3 2 5 1 4 ' ; D e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e , F l o r i d aS t a t e U n i v e r s i t y , T a l l a h a s s e e , F l o r i d a 3 2 3 0 6 2 ; and A n a l y t i c a l S e r v i c e s , Monsanto F i b e r s and I n t e r m e d i a t e s C o . ,P e n s a c o l a , F l o r i d a 3 2 5 7 3 3R e c e i v e d 1 2 M a r c h 1 9 8 6 / A c c e p t e d 8 J u l y 1 9 8 6

T h e response o f V i b r i o c h o l e r a e t o l o w n u t r i e n t l e v e l s was d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e c o n c e n t r a t i o n s o fl i p i d s , c a r b o h y d r a t e s , DN A , R N A , a n d p r o t e i n s over a 3 0 - d a y s t a r v a t i o n p e r i o d . U l t r a s t r u c t u r a l i n t e g r i t y wa so b s e r v e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . T o t a l l i p i d s and c a r b o h y d r a t e s d e c l i n e d r a p i d l y w i t h i n t h e f i r s t7 d a y s , w h i l e DNA a n d p r o t e i n e x h i b i t e d a more c o n s t a n t d e c l i n e over t h e 3 0 d a y s o f s t a r v a t i o n . I n c o n t r a s t ,RNA s h o w e d l i t t l e d e c r e a s e upon s t a r v a t i o n . A l t h o u g h n e u t r a l l i p i d s were l o s t , t h e p e r c e n t a g e o f n e u t r al l i p i d sd i d n o t d e c l i n e as r a p i d l y as t h e p h o s p h o l i p i d s . D e t e c t a b l e l e v e l s o f p o l y - I 8 - h y d r o x y b u t y r a t e d i s a p p e a r e dc o m p l e t e l y b y 7 d a y s . C a r b o h y d r a t e p r o f i l e s r e v e a l e d t h e r e l a t i v e l o s s o f t h e f i v e - c a r b o n sugar r i b o s e andN - a c e t y l g l u c o s a m i n e an d a r e l a t i v e i n c r e a s e i n t h e t o t a l s i x - c a r b o n s u g a r s , e s p e c i a l l y g l u c o s e . M o r p h o l o g i c a l l y ,r i b o s o m e s a p p e a r e d t o e x h i b i t no s t r u c t u r a l c h a n g e , w h i l e i n c l u s i o n b o d i e s and m e s o s o m e l i k e s t r u c t u r e sd i s a p p e a r e d c o m p l e t e l y , and c e l l w a l l an d membrane i n t e g r i t y was l o s t . The d a t a s u g g e s t t h a t V . c h o l e r a ed i f f e r s somewhat f r o m o t h e r m a r i n e v i b r i o s i n i t s response t o l o w n u t r i e n t s b u t s h a r e s some c h a r a c t e r i s t i c s i ncommon w i t h t h e m . The d a t a a l s o s u g g e s t t h a t c e r t a i n l i p i d s an d c a r b o h y d r a t e s may p r o v i d e t h e e n d o g e n o u senergy sources n e e d e d f o r d o r m a n c y p r e p a r a t i o n and c e l l m a i n t e n a n c e under n u t r i e n t s t a r v a t i o n .

C o n s i d e r a b l e i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e o n t h e s u r v i v a l o fb a c t e r i a a t l o w n u t r i e n t l e v e l s ( 1 - 5 , 1 3 - 1 5 , 1 8 - 2 0 , 2 7 - 2 9 ;a l s o , r e v i e w s 1 1 , 2 6 , a n d 3 5 ) . A l t h o u g h a n u m b e r o f s t a r v a -t i o n s t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d w i t h many s p e c i e s o fb a c t e r i a , t h e m o s t e x t e n s i v e s t u d i e s h a v e u s e d t h e m a r i n ev i b r i o s A N T - 3 0 0 ( 2 - 4 , 2 8 , 3 1 ) a n d DW 1 ( 1 5 , 1 8 - 2 0 ) . I ne a r l i e r r e p o r t s ( 5 , 1 3 ) we o b s e r v e d t h a t s t r a i n s o f V i b r i oc h o l e r a e w e r e a b l e t o s u r v i v e l o n g p e r i o d s o f l o w - n u t r i e n ts t r e s s a n d t h a t l i k e A N T - 3 0 0 , t h e s t r a i n s e x h i b i t e d a t y p e 1s t a r v a t i o n s u r v i v a l p a t t e r n , i . e . , u p o n n u t r i e n t d e p r i v a t i o n i na c l o s e d s y s t e m , a n i n i t i a l i n c r e a s e i n v i a b l e c e l l s o c c u r r e df o U l o w e d b y a d e c r e a s e i n t h e v i a b l e p o p u l a t i o n u n t i l ac o n s t a n t l e v e l w a s r e a c h e d ( 1 ) . F u r t h e r m o r e , we h a v e i n o c -u l a t e d l o w l e v e l s o f V . c h o l e r a e ( 1 0 3 / m l ) i n t o s o l u t i o n s o fc a r b o n - f r e e b a s a l s a l t s ( 1 5 t o 2 0 % o ) , a n d a f t e r a s l o n g a s 5y e a r s a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e s , v i a b l e p o p u l a t i o n s w e r er e c o v e r e d t h a t w e r e a s h i g h a s t h e i n i t i a l i n o c u l u m ( u n p u b -l i s h e d d a t a ) .I n a n e f f o r t t o m o r e f u l l y u n d e r s t a n d t h e r e s p o n s e o f V .c h o l e r a e t o l o w n u t r i e n t l e v e l s , we d e t e r m i n e d t h e c h a n g e si n l e v e l s o f m a c r o m o l e c u l e s , i . e . , l i p i d s , c a r b o h y d r a t e s ,DNA, RNA, a n d p r o t e i n s , t h a t o c c u r w h e n t h e o r g a n i s m i se x p o s e d t o n u t r i e n t s t a r v a t i o n . T h i s r e p o r t p r e s e n t s t h er e s u l t s o f t h o s e s t u d i e s .

MATERIALS AND M E T HO DSM i c r o c o s m s . V . c h o l e r a e C A 4 0 1 w a s g r o w n i n s e a w a t e rc o m p l e t e b r o t h m a d e w i t h b a s a l s a l t s ( 5 ) f o r 1 8 h a t 3 5 C . T h ec e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d w a s h e d t h r e et i m e s i n b a s a l s a l t s . C e l l s w e r e i n o c u l a t e d i n t o s t e r i l e 2 - l i t e r* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , M o n t a n a S t a t eU n i v e r s i t y , B o z e m a n , MT 5 9 7 1 7 .t P r e s e n t a d d r e s s : I n s t i t u t e f o r A p p l i e d M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t yo f T e n n e s s e e , E n v i r o n m e n t a l S c i e n c e D i v i s i o n , P . O . Box X , OakR i d g e , TN 3 7 8 3 1 .

f l a s k s c o n t a i n i n g 1 l i t e r o f b a s a l s a l t s a t a n i n o c u l u m s i z e o f1 0 7 c e l l s p e r m l a n d i n c u b a t e d a t 2 2 C i n t h e d a r k . A t 0 , 7 , o r1 4 a n d 3 0 d a y s a f t e r i n o c u l a t i o n , c e l l s w e r e c o u n t e d b ys t a n d a r d p l a t e c o u n t i n g , a c r i d i n e o r a n g e d i r e c t c o u n t i n g ( 1 2 ) ,a n d d i r e c t v i a b l e c o u n t i n g ( 2 1 ) a n d h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a -t i o n f o r c h e m i c a l a n a l y s i s . F o r t h e s e c o n d l i p i d a n a l y s i s ,s e a w a t e r c o m p l e t e b r o t h w a s l i p i d e x t r a c t e d b e f o r e i t s u s e t or e d u c e e x o g e n o u s f a t t y a c i d s . T h r e e o r f i v e r e p l i c a s w e r eu s e d f o r e a c h a n a l y s i s , a n d t h e e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e dt w i c e , g i v i n g 6 o r 1 0 r e p l i c a s .C a r b o h y d r a t e s . T h e e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s o f c a r b o h y -d r a t e s w a s c a r r i e d o u t b y t h e m e t h o d s o f O a d e s ( 3 0 ) a n dShaw a n d Moss ( 3 4 ) a n d i n c l u d e d t h e f o l l o w i n g m o d i f i c a -t i o n s . A f t e r d i g e s t i o n w i t h H C l , s a m p l e s w e r e b l a n k e t e dw i t h n i t r o g e n a n d h y d r o l y z e d f o r 5 h a t 1 0 0 . 5 C . T h e c o o l e ds a m p l e s w e r e e x t r a c t e d t h r e e t i m e s w i t h c h l o r o f o r m - h e x a n e( 1 : 5 , v o l / v o l ) a n d d r i e d w i t h n i t r o g e n c o n c e n t r a t o r -e v a p o r a t o r s a t 4 5 C . A f t e r NH40H a n d s o d i u m b o r o h y d r i d et r e a t m e n t a n d n e u t r a l i z a t i o n w i t h g l a c i a l a c e t i c a c i d , t h es a m p l e s w e r e c o n c e nt r a t e d w i t h n i t r o g e n a t 7 5 C . M e t h a n o l -b e n z e n e ( 5 : 1 , v o l / v o l ) w i t h 2 5 1 . l o f a c e t i c a c i d w a s a d d e d ,h e a t e d t o 8 5 C f o r 5 m i n , c o o l e d , a n d e v a p o r a t e d w i t hn i t r o g e n e v a p o r a t o r s a t 3 7 C . T h r e e e x t r a c t i o n s w i t h m e t h -a n o l a n d n i t r o g e n e v a p o r a t i o n a t 7 5 C t o r e m o v e b o r o n w e r ef o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f a c e t i c a n h y d r i d e a n d p y r i d i n ea n d h e a t i n g a t 1 0 0 C f o r 3 0 m i n. A f t e r n i t r o g e n e v a p o r a t i o na t 3 7 C , s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h c h l o r o f o r m a n d w a t e re x t r a c t e d t h r e e t i m e s . T h e c h l o r o f o r m l a y e r w a s e v a p o r a t e dt o d r y n e s s w i t h n i t r o g e n a t 3 7 C , d i l u t e d w i t h c h l o r o f o r m ,a n d u s e d f o r g a s c h r o m a t o g r a p h i c i n j e c t i o n . S t a n d a r dp e n t o s e s , h e x o s e s , h e p t o s e s , a n d a m i n o a n d d e o x y s u g a r sw e r e o b t a i n e d ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) , a n dg a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w a s p e r f o r m e d w i t h a V a r i a nm o d e l 2 1 0 0 g a s c h r o m a t o g r a p h e q u i p p e d w i t h f l a m e i o n i z a -t i o n d e t e c t o r s a n d d u a l d i f f e r e n t i a l e l e c t r o m e t e r s .T o t a l l i p i d s . The e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s o f f a t t y a c i d s i nt o t a l l i p i d s o f w h o l e c e l l s w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d

7 8 8


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EFFECTS OF STARVATION O N V . CHOLERAE 7 8 9

d e s c r i b e d b y L i e b e r t e t a l . ( 2 2 ) . I n a d d i t i o n , a s e c o n d t o t a ll i p i d d e t e r m i n a t i o n w a s p e r f o r m e d b y s i l i c i c a c i d c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ( 9 ) . T h e r e s u l t i n g n e u t r a l , g l y c o l i p i d , a n dp h o s p h o l i p i d f r a c t i o n s w e r e s u b j e c t e d t o m i l d a l k a l i n em e t h a n o l y s i s , a n d t h e f a t t y a c i d m e t h y l e s t e r s w e r e q u a n t i -f i e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 9 ) .PHB. P o l y - p - h y d r o x y b u t y r a t e ( P H B ) ( p o l y - , - h y d r o x y -a l k a n o a t e ) w a s m e a s u r e d b y t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b yF i n d l a y a n d W h i t e ( 7 ) .RNA. RNA w a s e x t r a c t e d b y a p r o c e d u r e b a s e d o n t h em e t h o d s o f B o l t o n ( 6 ) , K i r b y ( 1 7 ) , a n d J o h n s o n ( 1 6 ) . C e l l sw e r e l y s e d w i t h 2% s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e a n d c e n t r i f u g e da t 1 7 , 0 0 0 rpm ( B e c k m a n J A - 2 0 r o t o r ) f o r 1 0 m i n t o p e l l e th i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t c h r o m o s o m a l DNA, i n s o l u b l e p r o -t e i n s , a n d c e l l f r a g m e n t s . T h e s u p e r n a t a n t was e x t r a c t e dw i t h 1% s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - t r i s - s a t u r a t e d p h e n o l t or e m o v e p r o t e i n s . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 1 7 , 0 0 0 r p m f o r 1 0m i n , t h e s u p e r n a t a n t was e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m - i s o a m y la l c o h o l ( 4 : 9 6 , v o l / v o l ) f o r a d d i t i o n a l p r o t e i n r e m o v a l . P u r i t yo f t h e RNA was d e t e r m i n e d b y t h e r a t i o o f A 2 6 0 t o A 2 8 0 .A b s o r b a n c e was m e a s u r e d w i t h a G i l f o r d s p e c t r o p h o t o m e -t e r , a n d t h e a m o u n t o f RNA was c a l c u l a t e d b y c o m p a r i n go u r d a t a w i t h a s t a n d a r d c u r v e .DNA. DNA was e x t r a c t e d b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b yMarmur ( 2 5 ) w i t h a p h e n o l e x t r a c t i o n a s t h e f i r s t s t e p ( 1 6 ) .T h e p u r i t y o f DNA was d e t e r m i n e d b y t h e r a t i o o f A 2 6 0 t oA 2 3 0 ( p r o t e i n ) a n d A 2 6 0 t o A 2 8 0 ( R N A ) . The a m o u n t o f DNAwas c a l c u l a t e d b y c o m p a r i n g o u r d a t a w i t h a s t a n d a r d c u r v e .

F I G . 1 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f t h i n s e c t i o n s o f V .c h o l e r a e . ( A ) N o n s t a r v e d V . c h o l e r a e c e l l ; Om, o u t e r m e m b r a n e ;C m , c e l l m e m b r a n e ; ( B ) s t a r v e d V . c h o l e r a e c e l l ; r b , r i b o s o m e ; ( C )s t a r v e d V . c h o l e r a e c e l l . B a r = 0 . 1 , u m .

P r o t e i n . P r o t e i n w a s d e t e r m i n e d b y t h e Lowry m e t h o d( 2 3 ) .E l e c t r o n m i c r o s c o p y . M o d i f i c a t i o n s o f t h e m e t h o d s d e -s c r i b e d b y B a k e r e t a l . ( 5 ) w e r e u s e d f o r e l e c t r o n m i c r o s -c o p y . N o n s t a r v e d a n d s t a r v e d c e l l s w e r e h a r v e s t e d b yc e n t r i f u g a t i o n , e n r o b e d i n 2 o r 4% ( w t / v o l ) g e l a t i n , a n d f i x e di n g l u t e r a l d e h y d e a n d o s m i u m t e t r o x i d e . I n t h e s t a r v e d c e l l s ,0 . 0 1 % C a C l 2 w a s a d d e d t o t h e f i x a t i v e s t o p r e v e n t c e l lr u p t u r e . S p e c i m e n s w e r e w a s h e d i n p h o s p h a t e b u f f e r a n dp o s t f i x e d f o r 8 h i n 2% o s m i u m t e t r o x i d e i n p h o s p h a t e b u f f e ra t 0 C . T h e s e c o n d s e r i e s o f p h o s p h a t e b u f f e r w a s h e s w e r es e q u e n t i a l l y g r a d e d t o d i s t i l l e d w a t e r , a n d c e l l s w e r e d e h y -d r a t e d i n a n e t h a n o l s e r i e s r a n g i n g f r o m 3 0 t o 1 0 0 % e t h a n o l .A f t e r d e h y d r a t i o n , t h e b l o c k s w e r e e m b e d d e d i n E p o n , a n dt h i n s e c t i o n s w e r e c u t o u t o n a n L K B U l t r a t o m e m i c r o t o m ew i t h g l a s s k n i v e s . P o s t s t a i n i n g c o n s i s t e d o f 2% l e a d c i t r a t ea n d 2% u r a n y l a c e t a t e a t pH 7 . 4 a n d 3 . 6 . T h i n s e c t i o n s w e r ee x a m i n e d o n a P h i l l i p s EM 2 0 1 t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o -s c o p e .

RESULTSUpon s t a r v a t i o n , V . c h o l e r a e e x h i b i t e d t h e f o l l o w i n g g r o s sm o r p h o l o g i c a l c h a n g e s ( F i g . 1 ) . ( i ) T h e c e l l s b e c a m e c o c c o i da n d d e c r e a s e d i n v o l u m e , l o s i n g o v e r 90% o f t h e i r o r i g i n a lv o l u m e i n 3 0 d a y s ; ( i i ) a l l g r a n u l e s a n d i n c l u s i o n b o d i e s w e r e

1 0

10

304DAYS

F I G . 2 . E f f e c t o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n on c e l l n u m b e r . S y m b o l s :0 , s t a n d a r d p l a t e c o u n t s ; A , d i r e c t v i a b l e c o u n t s ( K o g u r e ) ; * ,A c r i d i n e o r a n g e d i r e c t c o u n t s .

VOL. 5 2 , 1 9 8 6


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7 9 0 HOOD E T AL .l o s t ; ( i i i ) t h e d i s t i n c t t h r e e - l a y e r e d i n t e g r i t y o f t h e o u t e rm e m b r a n e a n d t h e c e l l m e m b r a n e w a s l o s t , b u t r e m n a n t s o ft h e s t r u c t u r e s r e m a i n e d ; ( i v ) t h e n u c l e a r r e g i o n ( e l e c t r o n -c l e a r a r e a ) w a s c o m p r e s s e d i n t o t h e c e n t e r o f t h e c e l ls u r r o u n d e d b y a d e n s e r c y t o p l a s m ; a n d ( v ) t h e c e l l w a l lf o r m e d a n e x t e n d e d o r c o n v o l u t e d s t r u c t u r e w h i c h p u l l e da w a y f r o m t h e c e l l m e m b r a n e . T h e r i b o s o m a l s t r u c t u r e ,h o w e v e r , a p p e a r e d t o b e c o n s e r v e d a s i t e x h i b i t e d n oa p p a r e n t c h a n g e i n t h e s t a r v e d c e l l s .I n t e r m s o f c e l l n u m b e r s , t h e r e w e r e n e a r l y t e n t i m e s m o r ev i a b l e c e l l s ( d i r e c t v i a b l e c o u n t ) a f t e r 3 0 d a y s o f s t a r v a t i o n( F i g . 2 ) . When l o w e r i n o c u l a t i o n s i z e s w e r e u s e d a s r e p o r t e di n a n e a r l i e r s t u d y ( 5 ) , i t w a s o b s er v e d t h a t 2 t o 2 . 5 l o gi n c r e a s e s i n v i a b l e c e l l n u m b e r s o c c u r r e d . S u c h i n c r e a s e s i nv i a b l e c e l l n u m b e r s a r e common a m o n g a q u a t i c b a c t e r i a ( 1 ) .T h e r es p o n s e o f t h e c e l l s w i t h r e g a r d t o t o t a l c a r b o h y -d r a t e s a n d l i p i d s f o l l o w e d a s i m i l a r p a t t e r n . A f t e r 7 d a y s o fs t a r v a t i o n , 8 8 . 7 % o f t h e c a r b o h y d r a t e s ( F i g . 3 ) a n d 9 9 . 8 % o ft h e t o t a l l i p i d s ( T a b l e 1 ) , h a d d i s a p p e a r e d f o l l o w e d b y s m a l ld e c r e a s e s a t 3 0 d a y s . P h o s p h o l i p i d s w e r e t h e m o s t a b u n d a n tl i p i d s , m a k i n g u p 9 9 . 8 8 % o f t h e t o t a l l i p i d s , w h i l e n e u t r a ll i p i d s made u p o n l y 0 . 1 2 % o f t h e t o t a l l i p i d s i n n o n s t a r v e dc e l l s ( T a b l e 1 ) . H o w e v e r , w i t h s t a r v a t i o n , p h o s p h o l i p i d sd i s a p p e a r e d m o r e r a p i d l y r e l a t i v e t o n e u t r a l l i p i d s . T h e r ew e r e n o g l y c o l i p i d s o r f r e e f a t t y a c i d s d e t e c t e d i n e i t h e rn o n s t a r v e d o r s t a r v e d c e l l s . S i m i l a r l y , P H B d i s a p p e a r e dr a p i d l y , a n d t h e r e w e r e n o d e t e c t a b l e l e v e l s a f t e r 7 d a y s o fs t a r v a t i o n ( T a b l e 1 ) . F a t t y a c i d p a t t e r n s i n t h e t o t a l l i p i df r a c t i o n c h a n g e d w i t h s t a r v a t i o n . S a t u r a t e d f a t t y a c i d s i n -c r e a s e d , w h i l e u n s a t u r a t e d a n d h y d r o x y f a t t y a c i d s d e -c r e a s e d ( T a b l e 2 ) . T h e m o s t d r a m a t i c c h a n g e s o c c u r r e d w i t hr e s p e c t t o t h e m o s t a b u n d a n t f a t t y a c i d s , i . e . , t h e 1 6 - c a r b o nf a t t y a c i d s . T h e r e w a s a d e c l i n e i n t h e u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d1 6 : 1 w 7 c ( f r o m 3 9 . 6 t o 1 4 . 1 % ) a n d a c o n c o m i t a n t r e l a t i v ei n c r e a s e i n t h e s a t u r a t e d f a t t y a c i d 1 6 : 0 ( f r o m 2 3 . 5 t o 3 7 . 0 % )w i t h s t a r v a t i o n .C a r b o h y d r a t e p r o f i l e s r e v ea l e d a r e l a t i v e d e c l i n e o f t h et h r e e - a n d f i v e - c a r b o n s u g a r s g l y c e r a l d e h y d e a n d r i b o s e , a sw e l l a s N - a c e t y l g l u c o s a m i n e , w i t h a c o n c o m i t a n t r e l a t i v ei n c r e a s e i n t h e s i x - c a r b o n s u g a r s m a n n o s e , g a l a c t o s e , a n de s p e c i a l l y g l u c o s e . O r i g i n a l l y , t h e s i x - c a r b o n s u g a r f r u c t o s ew a s b e l i e v e d t o b e t h e L - s u g a r f u c o s e , b u t when s t a n d a r df u c o s e ( a l d i t o l a c e t a t e d e r i v a t i v e ) w a s e x a m i n e d , a d i f f e r -e n c e o f 0 . 0 8 m i n u t e b e t w e e n t h e r e t e n t i o n t i m e o f f u c o s e a n d

3 0 0

2 2 0 0 -

1 0 0o 0

0

D a y sF I G . 3 . E f f e c t o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n on t o t a l c a r b o h y d r a t e s .

T A B L E 1 . C h a n g e s i n q u a n t i t i e s o f V . c h o l e r a e l i p i d c l a s s e sd u r i n g s t a r v a t i o nn m o l / 1 0 4 c e l l s ( % t o t a l l i p i d s )

C e l l s T o t a l G l y c o - N e u t r a l F r e el i p i d s P h o s p h o l i p i d s f a t t y P H Bl i p i d s r v e dlipids18 l i p i d s(9 8 0 41(.2 0a c i d sN o n s t a r v e d 3 , 6 7 9 . 1 8 3 , 6 7 5 ( 9 9 . 8 8 ) 0 4 . 1 8 ( 0 . 1 2 ) 0 0 . 3 7S t a r v e d7 d a y s3 0 d a y s 7 . 7 5 6 . 9 5 ( 8 9 . 9 4 )2 . 4 3 2 . 0 5 ( 8 3 . 5 5 ) 0 0 . 8 0 ( 1 0 . 0 6 ) 0 00 0 . 3 8 ( 1 6 . 4 5 ) 0 0

t h e u n k n o w n s u g a r was o b s e r v e d , s u g g e s t i n g t h a t t h e s u g a ri s p r o b a b l y f r u c t o s e i n a f u r an o s e f o rm . W i t h o u t m a s ss p e c t r o p h o t o m e t r y , h o w e v e r , t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h i s s u g a ri s u n c o n f i r m e d ( T a b l e 3 ) .DNA c o n c e n t r a t i o n s ( F i g . 4 ) a n d p r o t e i n l e v e l s ( F i g . 5 )e x h i b i t e d a g r a d u a l b u t c o n s t a n t d e c l i n e o v e r t h e 3 0 - d a ys t a r v a t i o n p e r i o d . By 3 0 d a y s , a p p r o x i m a t e l y 75% o f t h et o t a l DNA a n d 70% o f t h e p r o t e i n h a d d i s a p p e a r e d . I nc o n t r a s t t o DNA a n d p r o t e i n , RNA l e v e l s c h a n g e d v e r y l i t t l eu p o n s t a r v a t i o n ( F i g . 6 ) . F o r e x a m p l e , a f t e r 1 4 d a y s , t h e r ew a s o n l y a 2% d e c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n , a n d b y 3 0 d a y s ,o n l y a 20% d e c l i n e .

DISCUSSIONA n u m b e r o f e v e n t s h a v e b e e n s h o w n t o o c c u r w h e na q u a t i c b a c t e r i a a r e e x p o s e d t o n u t r i e n t d e p r i v a t i o n . Amongt h e s e a r e a n i n c r e a s e i n c e l l n u m b e r s , f i r s t d e s c r i b e d a sr e d u c t i v e d i v i s i o n o r f r a g m e n t a t i o n ( 2 0 , 2 8 ) , a n d s i z e r e d u c -t i o n c h a r a c t e r i z e d a s d w a r f i n g ( 1 5 ) .T h e m o r p h o l o g i c a l r e s p o n s e o f V . c h o l e r a e t o s t a r v a t i o ns h a r e d c h a r a c t e r i s t i c s b o t h common a s w e l l a s d i s s i m i l a r t ot h e m a r i n e v i b r i o ANT-300 ( 3 , 2 7 ) . A l t h o u g h V . c h o l e r a e a n dA N T - 3 0 0 d i d n o t r e s p o n d i n t h e s a m e way t o s t a r v a t i o n i n

t e r m s o f t o t a l s i z e r e d u c t i o n , i n t r a c e l l u l a r i n t e g r i t y d e -c r e a s e d i n b o t h o r g a n i s m s , g r a n u l e s d i s a p p e a r e d , a n d t h en u c l e a r r e g i o n s b e c a m e m o r e c o m p a c t . V . c h o l e r a e e x h i b -i t e d c o n s i d e r ab l e c o nv o l u t i o n o f t h e c e l l w a l l , w h i l eA N T - 3 0 0 s h o w e d l i t t l e d i s t o r t i o n i n t h e c e l l w a l l ( 2 7 ) . Whent h r e e m a r i n e s t r a i n s w e r e s h o r t -t e r m s t ar v ed ( 4 8 h ) , o n es h o w e d l i t t l e c e l l w a l l d i s t o r t i o n , w h i l e t w o s t r a i n s p r o d u c e dv e s i c l e s i n 2 4 h a n d r e l ea s ed t h e s e v e s i c l e s w i t h t i m e ( 2 4 ) . I tw a s c o n c l u d e d t h a t t h e s e v e s i c l e s w e r e r e l a t e d t o t h e c o n -t i n u o u s s i z e r e d u c t i o n d u r i n g s t a r v a t i o n . W e a l s o n o t i c e ds o m e v e s i c l e f o r m a t i o n e a r l y i n t h e s t a r v a t i o n p e r i o d ( w i t h i n2 4 h ) w i t h V . c h o l e r a e , b u t s u c h v e s i c l e s d i s a p p e a r e dq u i c k l y .A n o t h e r f e a t u r e common t o V . c h o l e r a e a n d ANT-300 w a st h e a p p a r e n t c o n s e r v a t i o n o f r i b o s o m a l s t r u c t u r e ( 3 ) , a l -t h o u g h t h e n u m b e r o f r i b o s o m e s a p p e a r e d t o d e c l i n e . T h ep r e s er v a t i o n o f t h e r i b o s o m e h a s a l s o b e e n n o t e d i ne n d o s p o r e s , a n d i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t b e c a u s e t h ep r o t e i n - s y n t h e s i z i n g m a c h i n e r y i s s o e n e r g y e x p e n s i v e , t h i si s a w i s e s u r v i v a l s t r a t e g y ( 8 ) . T h i s a r g u m e n t m i g h t s i m i l a r l yb e a p p l i c a b l e t o a n a q u a t i c o r g a n i s m t h a t f r e q u e n t l y e n c o u n -t e r s l o w n u t r i e n t s a n d m u s t b e c o m e d o r m a n t ( 3 5 ) t o s u r -v i v e .I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t c e l l s d o n o t m e r e l y g o i n t od o r m a n c y p a s s i v e l y b u t r e ar r an g e t h e i r c e l l u l a r c o n s t i t u e n t si n t o d i f f e r e n t c o m p o u n d s s o t h a t s u r v i v a l i s e n h a n c e d ( 2 ) ,a n d t h e r e h a v e b ee n a n u m b e r o f s t u d i e s w h i c h h a v ee x a m i n e d c o m p o s i t i o na l c h a n g e s i n a q u a t i c b a c t e r i a e x p o s e d

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


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EFFECTS O F STARVATION ON V . C H O L E R A E 7 9 1T A B L E 2 . C h a n g e s i n w h o l e - c e l l h y d r o x y a n d n o r m a l f a t t y a c i d so f V . c h o l e r a e

F a t t y a c i d N o n s t a r v e d S t a r v e d c e l i S ac e l l s a 7 d a y 3 0 d a y20H 1 2 : 0 3 . 7 2 . 1 0 . 01 4 : 0 7 . 3 8 . 1 9 . 8i 1 5 : 0 0 . 1 0 . 2 0 . 61 5 : 0 0 . 3 0 . 7 1 . 530H 1 4 : 0 1 . 4 0 . 3 0 . 4i 1 6 : 0 0 . 0 0 . 0 0 . 01 6 : 1 w 7 c 3 9 . 6 3 3 . 3 1 4 . 11 6 : l w 7 t 0 . 0 0 . 0 1 2 . 71 6 : 0 2 3 . 5 3 1 . 8 3 7 . 030H 1 5 : 0 0 . 0 0 . 0 0 . 01 7 : 0 0 . 6 0 . 5 1 . 41 8 : 2 2 . 6 0 . 3 0 . 030H 1 6 : 0 1 . 0 0 . 0 0 . 01 8 : 1 w 9 c 0 . 0 1 . 3 3 . 01 8 : 1 w 7 c 1 2 . 2 1 2 . 4 1 0 . 01 8 : 0 2 . 2 3 . 2 5 . 41 9 : 0 2 . 4 0 . 6 0 . 22 0 : 1 3 . 1 1 . 4 0 . 42 0 : 0 0 . 0 0 . 3 0 . 6S a t u r a t e d 3 6 . 3 4 5 . 2 5 5 . 9U n s a t u r a t e d 5 7 . 5 4 8 . 7 4 0 . 2H y d r o x y 6 . 1 2 . 4 0 . 4

a D a t a a r e e x p r e s s e d a s m o l e p e r c e n t .

t o l o w n u t r i e n t s . For e x a m p l e , i t was o b s e r v e d t h a t whenANT-300 was s t a r v e d f o r 2 1 d a y s a t 5 C , p h o s p h o l i p i d sd e c r e a s e d b y 65% w i t h a l a r g e r e l a t i v e i n c r e a s e ( 5 7 % ) i n t h en e u t r a l l i p i d f r ac t i o n e s p e c i a l l y d u r i n g t h e f i r s t week ( 3 1 ) . I nc o n t r a s t , t h e p h o s p h o l i p i d s o f V . c h o l e r a e d e c l i n e d 9 9 . 8 %d u r i n g t h e f i r s t week o f s t a r v a t i o n a t 2 2 C . N e u t r a l l i p i d s a l s od e c l i n ed ( f r o m 4 . 1 8 t o 0 . 3 8 n m o l / 1 0 4 c e l l s ) w i t h i n 3 0 d a y s ,b u t t h e r a t i o o f n e u t r a l l i p i d s t o p h o s p h o l i p i d s i n c r e a s e d .N e u t r a l l i p i d s were o n l y 0.12% o f t h e t o t a l l i p i d s i nu n s t a r v e d c e l l s b u t were 1 6 . 5 % o f t h e t o t a l l i p i d s i n 3 0 - d a y -s t a r v e d c e l l s . C h a n g e s i n t h e i nd iv i d u a l f a t t y a c i d s ared i s c u s s e d i n more d e t a i l i n t h e c o m p a n i o n paper ( 1 0 ) . T h er a p i d d i s a p p e a r a n c e o f p h o s p h o l i p i d s i n V . c h o l e r a e w i t h t h ev i s i b l e l o s s o f c e l l w a l l i n t e g r i t y suggests t h a t c e l l w a l l l i p i d sa re u s e d as an e n d o g e n o u s energy source t o prepare t h e c e l lf o r d o r m a n c y . F u r t h e r m o r e , t h e r a p i d d i s a p p e a r a n c e o f P H Bsuggests t h a t t h i s compound m i g h t s i m i l a r l y serve as a nenergy source f o r dormancy p r e p a r a t i o n .

T o t a l c a r b o h y d r a t e s i n V . c h o l e r a e e x h i b i t e d a r a p i d a n di m m e d i a t e d e c l i n e , w i t h a r e l a t i v e i n c r e a s e i n t h e s i x - c a r b o nsuga rs ( f r o m 3 2 t o 5 8 % ) a n d a d e c r e a s e i n t h e t h r e e - a n df i v e - c a r b o n sugars g l y c e r a l d e h y d e a n d r i b o s e a n d t h e a m i n osugar N - a c e t y l g l u c o s a m i n e . The c e l l w a l l o f g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a i s t y p i c a l l y composed o f an o u t e r m e m b r a n e a n d as m a l l p e p t i d o g l y c a n l a y e r . The o u t e r membrane i s c o m p o s e do f ( i ) t h e e s s e n t i a l l i p i d A ( h y d r o p h o b i c i n n a t u r e ) , ( i i ) an Rcore ( i n V . c h o l e r a e t h e r e i s no 2 - k e t o - 3 - d e o x y o c t u l o s o n i ca c i d ) , an d ( i i i ) 0 - s i d e c h a i n s o f many t e t r a - a n d p e n t a s a c -c h a r i d e u n i t s ( w h i c h ar e h y d r o p h i l i c i n n a t u r e ) . I t i s p o s s i b l et h a t t h e more h y d r o p h i l i c m o l e c u l e s o f t h e 0 - s i d e c h a i n s( w h i c h c o u l d b e composed o f t h e t h r ee - a n d f i v e - c a r b o nsugars i n V . c h o l e r a e ) are more r e a d i l y u t i l i z e d u n d e rs t a r v a t i o n c o n d i t i o n s , w h i l e t h e s e v e n - c a r b o n sugar ( m a n -n o h e p t o s e ) an d t h e s i x - c a r b o n sugars w h i c h p r o b a b l y m a k eup t h e o l i g o s a c c h a r i d e s o f t h e R core are r e l a t i v e l y con-

s e r v e d . T h i s i d e a i s c e r t a i n l y c o n s i s t e n t w i t h t h e f i n d i n g s o fK j e l l e b e r g a n d H e r m a n s s o n ( 1 8 ) wh o d e m o n s t r a t e d t h a t t h eo u t e r m e m b r a n e s o f c e r t a i n e n v i r o n m e n t a l v i b r i o s b e c a m em o r e h y d r o p h o b i c u n d e r s t a r v a t i o n .A l t h o u g h c e r t a i n c a r b o h y d r a t e s a p p a r e n t l y d e c l i n e m o r er a p i d l y r e l a t i v e t o o t h e r s , wh y t h i s o c c u r s i s r e a l l y u n c l e a r .H o w e v e r , t h e f a c t t h a t t o t a l c a r b o h y d r a t e s a n d l i p i d s d e c l i n es o q u i c k l y s u g g e s t s t h a t t h e y a r e u s e d t o p r e p a r e t h e c e l l f o rd o r m a n c y . I t w o u l d s e e m a l o g i c a l s t r a t e g y f o r a c e l l t o u s et h e m o r e e n e r g y - e f f i c i e n t a v a i l a b l e c o m p o u n d s ( l i p i d s a n dc a r b o h y d r a t e s ) t o c a r r y o u t t h e s e a c t i v i t i e s .C o n c e n t r a t i o n s o f p r o t e i n , DNA, a n d RNA i n s t a r v i n g V .c h o l e r a e c e l l s d i d n o t d e m o n s t r a t e t h e e x a c t p a t t e r n s a s i nA N T - 3 0 0 . F o r e x a m p l e , i n A N T - 3 0 0 , p r o t e i n , DNA, a n dRNA l e v e l s d e c l i n e d a p p r o x i m a t e l y 4 3 , 6 3 a n d 6 5 % , r e s p e c -t i v e l y , d u r i n g t h e f i r s t 4 d a y s o f s t a r v a t i o n , a n d a f t e r t h i si n i t i a l p h a s e , RNA a n d ( t o s o m e s m a l l e x t e n t ) DNA w e r er e s y n t he s i ze d , w h i l e p r o t e i n l e v e l s r e m a i n e d t h e s a m e ( 3 ) . I nV . c h o l e r a e c e l l s , p r o t e i n a n d DNA c o n c e n t r a t i o n s d e c l i n e da t a c o n s t a n t r a t e , f r o m 2 0 t o 80% a n d 3 0 t o 7 0 % , r e s p e c -t i v e l y , i n 7 t o 3 0 d ay s , w h i l e RNA l e v e l s d e c l i n e d o n l y 2% i nt h e f i r s t 1 4 d a y s o f s t a r v a t i o n a n d o n l y 20% b y 3 0 d a y s .W h e t h e r RNA i s l o s t a n d r e s y n t h e s i z e d b y V . c h o l e r a e ( a s i ti s s u g g e s t e d t o o c c u r i n A N T - 3 0 0 ) w i t h i n t h e f i r s t s e v e r a ld a y s c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s .I t m i g h t b e a s s u m e d t h a t t h e i n i t i a l r e d u c t i o n i n DNA p e rc e l l may b e r e l a t e d t o t h e i n c r e a s e i n c e l l n u m b e r w h i c ho c c u r s d u r i n g t h e f r a g m e n t a t i o n o r r e d u c t i v e d i v i s i o n s t a g e .H o w e v e r , a f t e r t h e f i r s t w e e k o f s t a r v a t i o n , t h e r e w a s n oi n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f c e l l s , b u t t h e r e w a s a c o n t i n u i n gd e c l i n e i n t h e a m o u n t o f DNA p e r c e l l . W h e t h e r t h i sr e p r e s e n t s a r e d u c t i o n i n e x t r a DNA c o p i e s , c o n f i g u r a t i o nc h a n g e s i n t h e m o l e c u l e , o r s o m e o t h e r p r o c e s s i s u n k n o w n ,b u t i t i s a n a r ea t h a t w a r r a n t s f u r t h e r s t u d y .I t h a s b e e n s h o w n t h a t u p o n s t a r v a t i o n , A N T - 3 0 0 ( 2 ) a sw e l l a s E s c h e r i c h i a c o l i ( 3 2 ) w e r e a b l e t o s y n t h e s i z e newp r o t e i n s . I n t h e c a s e o f E . c o l i ( 3 2 ) , i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a tT A B L E 3 . E f f e c t o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n o n c a r b o h y d r a t e s o f V .c h o l e r a e

C a r b o h y d r a t e N o n s t a r v e d Starved c e l i S ac e l l s a 7 - d a y 3 0 - d a yG l y c e r a l d e h y d e 4 . 6 3 . 6 3 . 52 - D e o x y r i b o s e 0 . 0 0 . 0 0 . 0Rhamnose T b 0 . 0 0 . 0F r u c t o s e ( o r a m e t h y l 1 . 8 7 . 5 1 1 . 6p e n t o s e ) cR i b o s e 3 6 . 8 1 3 . 3 1 1 . 5A r a b i n o s e T 0 . 0 0 . 0X y l o s e 0 . 4 1 . 3 2 . 02 - D e o x y g l u c o s e 0 . 0 0 . 0 0 . 0M a n n o s e 1 . 9 3 . 3 3 . 6G a l a c t o s e 0 . 5 6 . 5 6 . 6G l u c o s e 2 7 . 6 3 7 . 4 3 6 . 3I n o s i t o l 0 . 0 0 . 0 0 . 0L - G l y c e r o - D - m a n n o h e p t o s e 2 . 8 5 . 6 4 . 1M a n n o h e p t u l o s e 0 . 0 0 . 0 0 . 0N - A c e t y l g l u c o s a m i n e 1 6 . 6 1 2 . 5 1 1 . 8N - A c e t y l g a l a c t o s a m i n e 0 . 0 0 . 0 0 . 02 - K e t o - 3 - d e o x y o c t o n a t e 0 . 0 0 . 0 0 . 0Unknown ( C - 6 ) a m i n o s u g a r " 2 . 3 T 0 . 0

a D a t a a r e e x p r e s s e d a s m o l e p e r c e n t t o t a l .b T , T r a c e a m o u n t s d e t e c t e d .c U n c o n f i r m e d .d P o s s i b l y q u i n a v o s a m i n e , u n c o n f i r m e d .

V O L . 5 2 , 1 9 8 6


5/6

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .28 h

z050

250-

0 7 1 4 3 4D a y s

F I G . 4 . E f f e c t o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n o n t o t a l DNA.

s u r v i v a l was e n h a n c e d b y t h e s e new p r o t e i n s , a n d i t wasc o n c l u d e d t h a t t h e s e p r o t e i n s e n a b l e d t h e c e l l t o s h i f t i n t o as t a r v a t i o n - i n d u c e d m a i n t e n a n c e p h y s i o l o g y . W h i l e we h a v eno d e f i n i t i v e d a t a as y e t on p r o t e i n p r o f i l e s o f s t a r v i n g V .c h o l e r a e c e l l s , t h e p o s s i b i l i t y t h a t s u c h p r o t e i n s ar e s y n t h e -s i z e d a n d t h a t t h e y e n h a n c e s u r v i v a l i n V . c h o l e r a e i se n t i r e l y l i k e l y .A t y p i c a l e n d o s p o r e - f o r m i n g o r g a n i s m r e s p o n d s t o a d -

verse e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s b y p r o d u c i n g t h e d o r m a n te n d o s p o r e . T h i s m o d e l o f d o r m a n c y i s p r o b a b l y t h e mosto b v i o u s a n d w e l l u n d e r s t o o d o f t h e m i c r o b i a l d o r m a n tf o r ms . S i n c e d e s i c c a t i o n , UV l i g h t , a n d l o w n u t r i e n t s ar es t r e s s e s t h a t a t y p i c a l spore m i g h t e n c o u n t e r , t h e spore-f o r m i n g o r g an i s m p r o d u c e s a s t r u c t u r e w i t h many t o u g hp r o t e c t i v e l a y e r s s u c h as t h e e x o s p o r i u m , spore c o a t s , a n d ac o r t e x . H o w e v e r , a n a q u a t i c o r g a n i s m w o u l d c e r t a i n l y n o te x p e r i e n c e t h e l a c k o f w a t e r nor p r o b a b l y e x c e s s i v e UVl i g h t , b u t i t w o u l d e x p e r i e n c e l o w - n u t r i e n t s t r e s s e s . T h u s , ana q u a t i c b a c t e r i u m w o u l d n o t n e c e s s a r i l y n e e d t o p r o d u c ep r o t e c t i v e l a y e r s , b u t i t may n e e d t o carry o u t some o f t h esame m a c r o m o l e c u l a r c h a n g e s t h a t occur i n spore f o r m a -

300

200

o

DaysF I G . 5 . E f f e c t o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n on t o t a l p r o t e i n .

z

t 2 30F2 2

2 1 k

7 1 4 3 0Days

F I G . 6 . E f f e c t o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n o n t o t a l RNA.t i o n . T h e c o n s e r v a t i o n o f s t r u c t u r a l r i b o s o m e s a n d a d e -c r e a s e i n t o t a l l i p i d s , DNA, a n d p r o t e i n a r e r e s p o n s e so b s e r v e d i n s o m e s p e c i e s o f e n d o s p o r e f o r m e r s ( 3 3 ) . T h e s ea r e r e s p o n s e s t h a t a l s o o c c u r r e d when V . c h o l e r a e c e l l s w e r es t a r v e d . W h i l e i t i s c l e a r t h a t V . c h o l e r a e a n d o t h e r v i b r i o sd o n o t e x h i b i t t h e s a m e r e s p o n s e s t o n u t r i e n t d e p r i v a t i o n a se n d o s p o r e - f o r m i n g c e l l s , t h e b a c t e r i a c e r t a i n l y a p p e a r t or e a r r a n g e s o m e o f t h e i r m a c r o m o l e c u l e s , a n d t o c o n s i d e rs u c h r e a r r a n g e m e n t s i n t e r m s o f a s p o r e m o d e l may n o t b ei n a p p r o p r i a t e .V . c h o l e r a e a l s o d o e s n o t s h o w t h e e x a c t m a c r o m o l e c u l a rr e s p o n s e s t o s t a r v a t i o n a s A N T - 3 0 0 , b u t why s u c h d i f f e r -e n c e s o c c u r a r e u n k n o w n . V . c h o l e r a e i s a s p e c i e s t h a ti n h a b i t s t h e m o r e n u t r i e n t - r i c h e s t u a r i n e e n v i r o n m e n t a n d i sr a r e l y f o u n d i n p e l a g i c w a t e r s . I t may b e t h a t V . c h o l e r a e h a se v o l v e d d i f f e r e n t c e l l u l a r s t r a t e g i e s t h a t a l l o w t h e o r g a n i s mt o s u r v i v e t h e e st a u r i ne e n v i r o n m e n t w i t h i t s r a p i d f l u x i nn u t r i e n t s r a t h e r t h a n t h e m o r e c o n s t a n t s t r e s s o f l o w n u t r i -e n t s i n o p e n o c e a n w a t e r s . W e a r e c u r r e n t l y a t t e m p t i n g t ob e t t e r u n d e r s t a n d t h e s e s u r v i v a l m e c h a n i s m s b y e x a m i n i n gc o m p o s i t i o n a l c h a n g e s i n l i p i d s ( 1 0 ) a n d o t h e r m a c r o m o l e -c u l e s .

ACKNOWLEDGMENTSW e t h a n k C y n d y L i e b e r t , S u e Z u l k e , a n d C a r n e y H a m i l t o n f o rt e c h n i c a l a s s i s t a n c e w i t h t h e p r o t e i n , DNA, a n d RNA a s s a y s . A l s o ,we w i s h t o t h a n k t h e D e p a r t m e n t o f t h e N a v y , O f f i c e o f N a v a lR e s e a r c h ( N 0 0 0 1 4 - 8 2 - C 0 4 0 4 a n d N 0 0 0 1 4 - 8 3 - K 0 0 5 6 ) , a n d t h e N a -t i o n a l S c i e nc e F o u n d a t i o n, B i o l o g i c a l O c e a n o g r a p h y P r o g r am (OCE8 0 - 1 9 7 5 7 ) , f o r t h e l i p i d a n a l y s i s a n d M o n s a n t o , I n c . , f o r t h e u s e o ft h e i r i n s t r u m e n t s i n t h e l i p i d a n d c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s . P . A .

W i n t e r a n d J o d i H a r w o o d - S e a r s a r e a l s o t h a n k e d f o r t h e i r v a l u a b l ea s s i s t a n c e w i t h t h e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y w o r k a n d E r i cE n g l e r t f o r t h e a c r i d i n e o r a n g e d i r e c t c o u n t s a n d K o g u r e c o u n t s .T h e U n i v e r s i t y o f W e s t F l o r i d a R e s e a r c h C o u n c i l i s t h a n k e d f o rt h e i r f i n a n c i a l s u p p o r t .L I T E R A T UR E CITED

1 . Amy, P . S . , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 8 3 . S t a r v a t i o n - s u r v i v a l p a t t e r n so f s i x t e e n f r e s h l y i s o l a t e d o p e n - o c e a n b a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n .M i cr o b i o l . 4 5 : 1 1 09 - 1 1 1 5 .2 . A m y , P . S . , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 8 3 . P r o t e i n p a t t e r n s o f g r o w i n ga n d s t a r v e d c e l l s o f a m a r i n e V i b r i o s p . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 4 5 : 1 7 4 8 - 1 7 5 2 .3 . A m y , P . S . , C . P a u l i n g , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 8 3 . S t a r v a t i o n -

7 9 2 HOOD E T AL.

2 7

2 6 ~2 5 12 4


6/6

EFFECTS OF STARVATION ON V . C H O L E R A E 7 9 3s u r v i v a l p r o c e s s e s o f a m a r i n e v i b r i o . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .4 5 : 1 0 4 1 - 1 0 4 8 .4 . A m y , P . S . , C . P a u l i n g , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 8 3 . R e c o v e r y f r o mn u t r i e n t s t a r v a t i o n b y a m a r i n e V i b r i o s p . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 4 5 : 1 6 8 5 - 1 6 9 0 .5 . B a k e r , R . M . , F . L . S i n g l e t o n , a n d M. A . H o o d . 1 9 8 3 . E f f e c t s o fn u t r i e n t d e p r i v a t i o n o n V i b r i o c h o l e r a e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 4 6 : 9 3 0 - 9 4 0 .

6 . B o l t o n , E . T . 1 9 6 6 . T h e i s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f t h e t w o h i g hm o l e c u l a r w e i g h t f r a c t i o n o f E s c he r i c h i a c o l i r i b o s o m a l RNA,p . 4 3 7 - 4 4 3 . I n G . L . C a n t o n i a n d D . R . D a v i e s ( e d . ) , P r o c e d u r e si n n u c l e i c a c i d r e s e a r c h . H a r p e r & R o w , P u b l i s h e r s , I n c . , NewY o r k .7 . F i n d l a y , R . H . , a n d D . C . W h i t e. 1 9 8 3 . P o l y m e r i c b e t a -h y d r o x y a l k a n o a t e s f r o m e n v i r o nm e n t al s a mp l e s a n d B a c i l l u sm e g a t e r i u m . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 5 : 7 1 - 7 8 .8 . F r e e s e , E . , a n d J . H e i n z e . 1 9 8 4 . M e t a b o l i c a n d g e n e t i c c o n t r o l o fb a c t e r i a l s p o r u l a t i o n , p . 1 0 1 - 1 7 2 . I n A . H u r s t a nd G . W. G o u l d( e d . ) , T h e b a c t e r i a l s p o r e . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , New Y o r k .9 . G u c k e r t , J . B . , C . P . A n t w o r t h , P . D . N i c h o l s , a n d D . C . W h i t e .1 9 8 5 . P h o s p h o l i p i d , e s t e r - l i n k e d f a t t y a c i d p r o f i l e s a s r e p r o d u c -i b l e a s s a y s f o r c h a n g e s i n p r o k a r y o t i c c o m m u n i t y s t r u c t u r e o fe s t u a r i n e s e d i m e n t s . FEMS M i c r o b i o l . E c o l . 3 1 : 1 4 7 - 1 5 8 .1 0 . G u c k e r t , J . B . , M. A . H o o d , a n d D . C . W h i t e . 1 9 8 6 . P h o s p h o -l i p i d e s t e r - l i n k e d f a t t y a c i d p r o f i l e c h a n g e s d u r i n g n u t r i e n td e p r i v a t i o n o f V i b r i o c h o l e r a e : i n c r e a s e s i n t h e t r a n s / c i s r a t i oa n d p r o p o r t i o n s o f c y c l o p r o p y l f a t t y a c i d s . A p p l . E nv i r o n.M i c r o b i o l . 5 2 : 7 9 4 - 8 0 1 .1 1 . H a r d e r , W . , a n d L . D i j k h e i z e n . 1 9 8 3 . P h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t on u t r i e n t l i m i t a t i o n . A n n u . R e v . M i c r o b i o l . 3 7 : 1 - 2 4 .1 2 . H o b b i e , J . E . , R . J . D a l e y , a n d S . J a s p e r . 1 9 7 7 . U s e o fN u c l e p o r e f i l t e r s f o r c o u n t i n g b a c t e r i a b y f l u o r e s c e n c e m i c r o s -c o p y . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 1 2 2 5 - 1 2 2 8 .1 3 . H o o d , M. A . , a n d G . E . N e s s . 1 9 8 2 . S u r v i v a l o f V i b r i o c h o l e r a ea n d E s c h e r i c h i a c o l i i n e s t u a r i n e w a t e r s a n d s e d i m e n t s . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 5 7 8 - 5 8 4 .1 4 . H o o d , M. A . , G . E . N e s s , G . E . R o d r i c k , a n d N . J . B l a k e . 1 9 8 4 .T h e e c o l o g y o f V i b r i o c h o l e r a e i n t w o F l o r i d a e s t u a r i e s , p .3 9 9 - 4 0 9 . I n R . R . C o l w e l l ( e d . ) , V i b r i o s i n t h e e n v i r o n m e n t .J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , N ew Y o r k .1 5 . H u m p h r e y , B . A . , S . K j e l l e b e r g , a n d D . C . M a r s h a l l . 1 9 8 3 .R e s p o n s e s o f m a r i n e b a c t e r i a u n d e r s t a r v a t i o n c o n d i t i o n s a t as o l i d - w a t e r i n t e r f a c e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 5 : 4 3 - 4 7 .1 6 . J o h n s o n , J . L . 1 9 8 1 . G e n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n , p . 4 5 0 - 4 7 2 . I nP . G e r h a r d t , R . G . E . M u r r a y , R . N . C o s t i l o w , E . W . N e s t e r ,W . A . W o o d , N . R . K r i e g , a n d G . B . P h i l l i p s ( e d . ) , M a n u a l o fm e t h o d s f o r g e n e r a l b a c t e r i o l o g y . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o -b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .1 7 . K i r b y , K . D . 1 9 6 8 . I s o l a t i o n o f n u c l e i c a c i d s w i t h p h e n o l i cs o l v e n t s . M e t h o d s E n z y m o l . 1 2 B : 8 7 - 9 9 .1 8 . K j e l l e b e r g , S . , a n d M. H e r m a n s s o n . 1 9 8 4 . S t a r v a t i o n - i n d u c e de f f e c t s o n b a c t e r i a l s u r f a c e c h a r a c t e r i s t i c s . A p p l . E n v i r o n .

M i c r o b i o l . 4 8 : 4 9 7 - 5 0 3 .1 9 . K j e l l e b e r g , S . , B . A . H u m p h r e y , a n d D . C . M a r s h a l l . 1 9 8 2 .E f f e c t o f i n t e r f a c e s o n s m a l l , s t a r v e d m a r i n e b a c t e r i a . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 1 1 6 6 - 1 1 7 2 .2 0 . K j e l l e b e r g , S . , B . A . H u m p h r e y , a n d D . C . M a r s h a l l . 1 9 8 3 .I n i t i a l p h a s e s o f s t a r v a t i o n a n d a c t i v i t y o f b a c t e r i a a t s u r f a c e s .A p p l . E nv i r o n . M i cr o b i o l . 4 6 : 97 8 - 98 4 .2 1 . K o g u r e , K . , U . S i m i d u , a n d J . T a g a . 1 9 7 9 . A t e n t a t i v e d i r e c tm i c r o s c o p i c m e t h o d f o r c o u n t i n g l i v i n g m a r i n e b a c t e r i a . C a n . J .M i c r o b i o l . 2 5 : 4 1 5 - 4 2 0 .2 2 . L i e b e r t , C . A . , M. A . H o o d , F . H . D e c k , K . B i s h o p , a n d D . K .F l a h e r t y . 1 9 8 4 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a newC y t o p h a g a s p e c i e s i m p l i c a t e d i n a w o r k - r e l a t e d l u n g d i s e a s e .A p p l . E nv i r o n . M i c r o b i o l . 4 8 : 9 3 6 - 9 4 3 .2 3 . L o wr y , 0 . H . , N . J . R o s e b r o u g h , A . L . F a r r , a n d R . J . R a n d a l l .1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t . J .B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .2 4 . M a r d e n , P . , A . T u n l i d , K . M a l m c r o n a - F r i b e r g , G . O d h a m , a n dS . K j e l l e b e r g . 1 9 8 5 . P h y s i o l o g i c a l a n d m o r p h o l o g i c a l c h a n g e sd u r i n g s h o r t t e r m s t a r v a t i o n o f m a r i n e b a c t e r i a l i s o l a t e s . A r c h .M i c r o b i o l . 1 4 2 : 3 2 6 - 3 3 2 .2 5 . M a r m u r , J . 1 9 6 1 . A p r o c e d u r e f o r t h e i s o l a t i o n o f d e o x y r i b o -n u c l e i c a c i d f r o m m i c r o o r g a n i s m s . J . M o l . B i o l . 3 : 2 0 8 - 2 1 8 .2 6 . M o r i t a , R . Y . 1 9 8 2 . S t a r v a t i o n - s u r v i v a l o f h e t e r o t r o p h s i n t h em a r i n e e n v i r o n m e n t . A d v . M i c r o b . E c o l . 6 : 1 7 1 - 1 9 8 .

2 7 . N o v i t s k y , J . A . , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 7 6 . M o r p h o l o g i c a l c h a r a c -t e r i z a t i o n o f s m a l l c e l l s r e s u l t i n g f r o m n u t r i e n t s t a r v a t i o n o f ap s y c h r o p h i l i c m a r i n e v i b r i o . A p p l . E nv i r o n . M i c r o bi o l .3 2 : 6 1 7 - 6 2 2 .2 8 . N o v i t s k y , J . A . , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 7 7 . S u r v i v a l o f ap s y c h r o p h i l i c m a r i n e v i b r i o u n d e r l o n g - t e r m n u t r i e n t s t a r v a t i o n .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 6 3 5 - 6 4 1 .2 9 . N o v i t s k y , J . A . , a n d R . Y . M o r i t a . 1 9 7 8 . P o s s i b l e s t r a t e g y f o r t h es u r v i v a l o f m ar i ne b a c t e r i a u n d e r s t a r v a t i o n c o n d i t i o n s . M a r .B i o l . 4 8 : 2 8 9 - 2 9 5 .3 0 . O a d e s , J . M. 1 9 6 7 . G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f a l d i t o l a c e -t a t e s : a p p l i c a t i o n s t o a n a l y s e s o f s u g a r a n d c o m p l e x h y d r o l y -s a t e s . J . C h r o m a t o g r . 2 8 : 2 4 6 - 2 5 2 .3 1 . O l i v e r , J . D . , a n d W . F . S t r i n g e r . 1 9 8 4 . L i p i d c o m p o s i t i o n o f ap s y c h r o p h i l i c m a r i n e V i b r i o s p . d u r i n g s t a r v a t i o n - i n d u c e d m o r -p h o g e n e s i s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 7 : 4 6 1 - 4 6 6 .3 2 . R e e v e , C . A . , P . S . A m y , a n d A . M at i n. 1 9 8 4 . R o l e o f p r o t e i ns y n t h e s i s i n t h e s u r v i v a l o f c a r b o n - s t a r v e d E s c h e r i c h i a c o l iK - 1 2 . J . B a c t e r i o l . 1 6 0 : 1 0 4 1 - 1 0 4 6 .3 3 . S e t l o w , P . 1 9 8 3 . G e r m i n a t i o n a n d o u t g r o w t h , p . 2 1 1 - 2 5 4 . I n A .H u r s t a n d G . W. G o u l d ( e d . ) , T h e b a c t e r i a l s p o r e , A c a d e m i cP r e s s , I n c . N ew Y o r k .3 4 . S h a w , D . H . , a n d G . W . M o s s . 1 9 6 7 . Q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o fn e u t r a l s u g a r s b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g r .4 1 : 3 5 0 - 3 5 7 .3 5 . S t e v e n s o n , J . L . 1 9 7 8 . A c a s e f o r b a c t e r i a l d o r m a n c y i n a q u a t i cs y s t e m s . M i c r o b . E c o l . 4 : 1 2 7 - 1 3 3 .

V O L . 5 2 , 1 9 8 6

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