Les granulocytes neutrophiles : morphologie, fonctions et ... · morphologie, fonctions et méthodes de quantification dans l’espèce bovine. Thèse d'exercice, Médecine vétérinaire,

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Dupont, Christophe . Les granulocytes neutrophiles : morphologie, fonctions et méthodes de quantification dans l’espèce bovine. Thèse d'exercice, Médecine vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse – ENVT, 2018, 78 p.

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ANNEE 2018 THESE : 2018 – TOU 3 – 4061

LES GRANULOCYTES NEUTROPHILES :

MORPHOLOGIE, FONCTIONS ET METHODES DE

QUANTIFICATION DANS L’ESPECE BOVINE

_________________

THESE pour obtenir le grade de

DOCTEUR VETERINAIRE

DIPLOME D’ETAT

présentée et soutenue publiquement devant l’Université Paul-Sabatier de Toulouse

par

DUPONT Christophe

Né, le 27 décembre 1992 à RIO DE JANEIRO (Brésil)

___________

Directeur de thèse : M. Gilles FOUCRAS

___________

JURY

PRESIDENT : M. Gérard CAMPISTRON

ASSESSEURS : M. Gilles FOUCRAS

M. Renaud MAILLARD

Professeur à l’Université Paul-Sabatier de TOULOUSE Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE

2

Mise à jour au 03/04/2018

Ministère de l'Agriculture de l’Alimentation ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE

Directrice : Madame Isabelle CHMITELIN

PROFESSEURS CLASSE EXCEPTIONNELLE

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M DELVERDIER Maxence, Anatomie Pathologique M. ENJALBERT Francis, Alimentation

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PROFESSEURS 1° CLASSE

M. BERTAGNOLI Stéphane, Pathologie infectieuse M. BERTHELOT Xavier, Pathologie de la Reproduction M. BOUSQUET-MELOU Alain, Physiologie et Thérapeutique M. BRUGERE Hubert, Hygiène et Industrie des aliments d'Origine animale Mme CHASTANT-MAILLARD Sylvie, Pathologie de la Reproduction

M. DUCOS Alain, Zootechnie M. FOUCRAS Gilles, Pathologie des ruminants Mme GAYRARD-TROY Véronique, Physiologie de la Reproduction, Endocrinologie Mme HAGEN-PICARD, Nicole, Pathologie de la reproduction M. JACQUIET Philippe, Parasitologie et Maladies Parasitaires M. LEFEBVRE Hervé, Physiologie et Thérapeutique

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PROFESSEURS CERTIFIES DE L'ENSEIGNEMENT AGRICOLE

Mise à jour au 03/04/2018

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MAITRES DE CONFERENCES HORS CLASSE

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1

Remerciements

Amonprésidentdethèse,

MonsieurleProfesseurGérardCAMPISTRON

Professeurdesuniversités

Praticienhospitalier

Physiologie–Hématologie

Quim’afaitleplusgrandhonneurd’accepterlaprésidencedemonjury

dethèse,

Hommagesrespectueux.

Amonjurydethèse,

MonsieurleProfesseurGillesFOUCRAS,

Professeuràl’EcoleNationaleVétérinairedeToulouse

Pathologiedesruminants

Quim’afaitl’honneurdeproposerceprojetetm’asoutenutoutaulong

desonélaboration.

Veuillezaccepterl’expressiondemonentièrereconnaissanceet

remerciements.

AMonsieurleProfesseurRenaudMAILLARD

Professeuràl’EcoleNationaleVétérinairedeToulouse

Pathologiedesruminants

Pourm’avoirfaitl’honneurd’accepterdeparticiperàmonjurydethèse.

Sincèresremerciements.

2

TabledesmatièresRemerciements..................................................................................................................1

Tabledesmatières.............................................................................................................2

Listedesfigures..................................................................................................................4

Listedestableaux...............................................................................................................5

Introduction.......................................................................................................................6

1 Lesgranulocytesneutrophiles.....................................................................................81.1 Présentationgénérale.....................................................................................................8

1.1.1 Morphologie......................................................................................................................8 Al’échellecellulaire...............................................................................................................8 Contenusubcellulaire:granulesetvésicules........................................................................9

1.1.1.2.1 Lesgranulesprimaires.....................................................................................................101.1.1.2.2 Granulessansperoxydase...............................................................................................111.1.1.2.3 Lesvésiculessécrétoires.................................................................................................11

Hématopoïèseetdifférenciation.........................................................................................12 Contrôledeladifférenciationcellulaireenneutrophile......................................................14 Distributiondesneutrophilesentretissus...........................................................................17

1.1.2 Migrationlorsd’inflammationaigüe...............................................................................19 Recrutement........................................................................................................................19

1.1.2.1.1 Lescytokines...................................................................................................................201.1.2.1.2 Leschimiokines...............................................................................................................201.1.2.1.3 Lesmoléculesvaso-actives..............................................................................................21

Rollingetadhésion...............................................................................................................22 Diapédèse............................................................................................................................23 Productionetlibérationdecytokines..................................................................................24

1.2 Lesneutrophilescommeeffecteursdel’immunité........................................................251.2.1 Rôledansl’immunitéinnée.............................................................................................25

Phagocytoseetexplosionrespiratoire.................................................................................261.2.1.1.1 Internalisationdesagentspathogènes...........................................................................261.2.1.1.2 L’environnementoxydatifdesphagosomes...................................................................26

Labactéricidienonoxydative:lerôledesgranulesspécialisés..........................................30 Nétose..................................................................................................................................30 Recrutementcellulaire.........................................................................................................31

1.2.2 Immunitéadaptative:présentationd’antigènesparlesPNN........................................331.2.3 ApoptoseetsurviedesPNNlorsd’infection...................................................................331.2.4 Propriétésanti-tumorales...............................................................................................35

1.3 Spécificitésrelativesàl’espècebovine..........................................................................361.3.1 Lesmédiateursdel’inflammationchezl’espècebovine.................................................371.3.2 Lesmécanismesdedéfensepermisparlesneutrophileschezlesbovins......................39

1.4 Lesmarqueursdel’inflammationchezlesbovins..........................................................411.4.1 Leucogramme..................................................................................................................42

Valeursusuelles...................................................................................................................42 Variationsphysiologiques....................................................................................................42 Variationslorsd’étatsinflammatoires.................................................................................43

1.4.2 Lesprotéinesdelaphaseaigüe.......................................................................................45 L’Haptoglobine(Hp).............................................................................................................45 SAA.......................................................................................................................................46 a1-AGP................................................................................................................................47

3

1.4.3 Myélopéroxydase............................................................................................................47 Structureetlocalisation.......................................................................................................47 Rôlebiologique....................................................................................................................48 Techniquesdemesureetlienaveclaquantitédeneutrophiles.........................................52

2 Analysesystématiquedesmoléculesspécifiquesdesneutrophiles...........................542.1 Introduction..................................................................................................................542.2 Matérieletméthodes...................................................................................................552.3 Résultats.......................................................................................................................56

2.3.1 Méthodesdécritespourlesespècesmurineethumaine:.............................................56 AutomatisationaveccolorationGiemsa..............................................................................57 Lesprotéinesmembranairesdesurface..............................................................................57 Lesmoléculesintracellulaires..............................................................................................61

2.3.2 Chezlesbovins................................................................................................................642.4 Discussionetpossiblesapplications..............................................................................66

3 Conclusion................................................................................................................72

Références:.....................................................................................................................73

4

ListedesfiguresFigure1:Morphologied'unneutrophileenmicroscopieoptique2etmicroscopie

électroniqueàtransmission.............................................................................................9

Figure2:Hématopoïèsedescellulessanguines......................................................................13

Figure3:Etapesdelagranulopoïèseneutrophilique..............................................................14

Figure4:Mécanismesdeladifférenciationetdelalibérationdesneutrophilesauseindela

moelleépinière3..............................................................................................................16

Figure5:ActivationetassemblagedelaNADPHoxydase24..................................................28

Figure6:interactiondesneutrophilesaveclesmacrophages(d’aprèsKumar31).................32

Figure7Dynamiquedelaréponseleucocytaireauxinfectionsbactérienneschezles

bovins35,60........................................................................................................................44

Figure8:StructuredunoyauhémiquedelaMPOhumaine69................................................48

Figure9:ProduitsformésparactionoxydantedeHOCletréactionsd'HOClavecd'autres

espècesactivéesdel'oxygèneetdel'azote.67................................................................50

Figure10:Schémad'uncytomètredeflux75..........................................................................58

5

ListedestableauxTableau1:Moléculeseffectricesdanslagranulopoïèse……………………………………………………17

Tableau2:LigandsdeMac-1etleurseffetssurl'apoptosedesneutrophiles(d'aprèsKebiret

Filep34)………………………………………………………………………………………………………………………………35

Tableau3:Numérationetformulesanguinechezlebovinadulte58…………………………………42

Tableau 4 : Récapitulatif des Antigènes Neutrophiliques humains et leurs caractéristiques

d'aprèsFungetal.(2011)76………………………………………………………………………………………………59.

Tableau 5 : Caractéristiques et fonctions des sous-types de neutrophiles (d'après

ChristoffersonetPhillison105)………………………………………………………………………………………………67

6

Introduction

Du point de vue didactique, le système immunitaire est décomposé en deux systèmes

complémentaires:lecompartimentinnéetlecompartimentadaptatif.Cettesubdivisionest

loind’êtretranchéecommenouspourronslevoirultérieurement

Les cellules épithéliales au contact avec le milieu extérieur, les neutrophiles et les

macrophagesrésidentsdanslestissu,lescellulesNaturalKiller(NK)pourlapartiecellulaire

lesanticorpsainsiquelesystèmeducomplémentetdiversesprotéinessolublespourlapartie

moléculairesontclasséscommeacteursdel’immunitéinnée.Ils’agitdel’immunitélaplus

rudimentaire,présenteégalementdanslesorganismeslesplussimples,elledevientdeplus

enplusélaboréeaucoursdel’évolution.Ellepermetuneréponsenon-spécifiquedel’agent

agresseur, même si elle est particulière à chaque catégorie d’agents susceptibles de la

mobiliser,rapideetspontanée,c’est-à-direqu’iln’yapasd’apprentissagenécessaire.Elleest

principalementunhéritagegénétique,mêmesi lestravauxlesplusrécentsmontrequ’une

forme d’apprentissage et de mémoire existe aussi pour ce versant de l’immunité. La

coévolutionentrelesmicro-organismesetlesorganismessupérieursapermisdesélectionner

des récepteursetdesmécanismescapablesde reconnaître lesmicro-organismesetde les

différencierdusoiimmunologique,étapeindispensableàl’initiationd’uneréponse1.

L’immunitéinnéeestcaractériséeparuneréponserapidementmobilisableetquiestprésente

partoutdansl’organisme,ycomprisauxbarrières,constituantainsiunedéfensedepremière

ligne dont lesmodes d’action sont relativement invariables pour tout organismeétranger

détectéaucoursdelaviedel’organisme.

L’immunitéadaptative,aucontraire,reposesurunprincipedebrassagedegènespermettant

laformationaléatoirederécepteurs,lesquelssontamplifiéslorsqu’ilsreconnaissentl’agent

étranger.L’immunorécepteursélectionnépermetainsiunedéfenseadaptéeetspécifiquede

l’intrusdétecté.L’immunitéadaptativeprésentedoncdeseffecteursspécifiquesdecetagent

étranger à l’organisme, qui s’acquièrent et permettent son élimination. Ces mécanismes

acquissontconservéssousformedecellulesàmémoirelesquellessontconservéespendant

despériodesplusoumoinslonguesdelaviedel’individu,créantainsiunrépertoirepropreà

chaqueorganismeetfonctiondesexpériencesantigéniquesrencontrées.

7

Parmilesacteursdel’immunitécellulaire,lesneutrophilesjouentunrôlecentralcarproduits

entrèsgrandnombre,ilsontlacapacitédetueretdégraderdesagentsinfectieuxdanstous

les tissus. Ce rôle de soldat n’est cependant pas dépourvu de risques, car leur contenu

cellulairericheenmédiateursinflammatoiresetenzymesprovoquedeslésionscellulaireset

tissulairesparfoissévèreset irréversibles.C’estpourquoi leurétudeet laconnaissancedes

mécanismesdel’immunitéquilesmobilisentestessentielleàlacompréhensiondelaréponse

anti-infectieuseetdel’inflammationassociée.

8

1 Lesgranulocytesneutrophiles1.1 Présentationgénérale1.1.1 Morphologie

A l’échelle cellulaire

Lesgranulocytesneutrophilesappartiennentàlalignéegranulocytairequiestcaractériséepar

laprésencedenombreuxgranules au seinde leur cytoplasme,d’oùdécoule leurnom. Ils

possèdentenoutreunnoyauplurilobé,cequiaconduitàlesdésignerpendantlongtemps

commedespolynucléaires.Lescaractéristiquesdeleursgranulescytoplasmiquespermettent

delesdiviserentroisgroupes:lesgranulocytesneutrophiles,lesgranulocytesbasophileset

lesgranulocyteséosinophiles,carlesgranulesontdesaspectsdifférentsenfonctiondeleur

affinitépourlescolorantsutilisésencytologie.Onemploisouventlenomdeneutrophilespar

simplification,etc’estcettedénominationquenousutiliseronsdanslasuitedutexte.

Lesneutrophilessontdescellulesarrondiesde10à15µmdediamètre,dontlenoyau

matureprésentedeuxàcinqlobesavecunechromatinedense.Lesgranulocytesneutrophiles

constituent50à70%deslymphocytesdusangchezlaplupartdesespècesmonogastriques;

lesruminantsontuneproportiondeneutrophilescirculantsplusfaiblesavecseulement30-

40%decescellulesparmilesleucocytessanguins.Lamoitiéd’entreeuxsontmarginaux,c’est-

à-direqu’ilssontattachésàlaparoidesvaisseaux,particulièrementdanslesorganescomme

larate,lefoieetlespoumons.Leurduréedeviedanslesvaisseauxsanguinsestgénéralement

brève,d’environ24heuresdansdesconditionsphysiologiques.Ilssurviventenmoyenne3

joursaprèsdiapédèsedans les tissus.Ceciexplique le fort tauxde renouvellementdeces

cellulesavecuneproductionquotidienneestiméeà1011neutrophiles.

Les neutrophiles jouent un rôle central dans la défense de l’hôte vis-à-vis des agents

pathogènes,notammentbactérienetenconséquencedanslaréactioninflammatoire.

9

Figure1:Morphologied'unneutrophileenmicroscopieoptique

2etmicroscopieélectroniqueàtransmission.

Contenu subcellulaire : granules et vésicules

Les neutrophiles possèdent des granulations distinctes morphologiquement et

biochimiquement de celles des autres granulocytes. Leurs granules contiennent une large

panopliedeprotéinesantimicrobiennes,ainsiquedesprotéases,desmoléculesparticipantà

l’explosion respiratoire et un grand réservoir de protéines membranaires de liaison à

l’endothélium, à la matrice extracellulaire, aux bactéries, et des médiateurs solubles de

l’inflammation.L’acquisitiondesgranulesestséquentielleaucoursdeladifférenciationdes

neutrophiles,avectroistypesdegranules:

- Les granules primaires ou azurophiles (à cause de l’affinité pour l’azur de

méthylène)sontprésentsdèslestadepromyélocyteparfusionàpartirduGolgi

contenantdelamyélopéroxydaseengrandequantitédontlaproductions’arrête

àlatransitiondupromyélocyteverslemyélocyte.

- Les granules secondaires apparaissent au stade de myélocyte et de

métamyélocyte ; elles contiennent de grandes quantités de lactoferrine et de

faiblesquantitésdegélatinase.Ilssontégalementappelésgranulesspécifiques.

10

- Les granules tertiaires différent peu des précédents mais contiennent des

concentrationsplusélevéesdegélatinasemaisplusfaiblesdelactoferrine,formés

au stade de neutrophile immature (band cells), ainsi que dans les cellules

polylobées.

Acesgranules,s’ajoutentdesvésiculessécrétoiresforméesdanslesneutrophilessegmentés;

ils contiennent des protéines plasmatiques, ce qui indiquerait une formation par le

mécanismed’endocytosedecesvésicules.

Toutes ces composants cytoplasmiques ont une structure commune avec une bicouche

phospholipidiqueetunematricegranulairecontenantdesprotéinesdestinéesàl’exocytose

oubienàlafusionauphagosome.

1.1.1.2.1 Lesgranulesprimaires

Les granules primaires contiennent des hydrolases acides ainsi que des protéines

antimicrobiennes, ce qui les a faits considérer pendant plusieurs années comme des

lysosomes primaires. Cependant, ils n’expriment pas les protéines LAMP-1 et LAMP-2

caractéristiques des lysosomes, ce qui leur confère plutôt un rôle de granules à sécrétion

contrôlée.

Les granules azurophiles peuvent être subdivisés en deux groupes en fonction de leur

apparitionaustadepromyélocyte:lespremiersproduitssontpauvresendéfensinestandis

queceuxformésàlafindustadepromyélocytesontplusriches.Lesgranulesazurophilessont

peusensiblesauxstimuli;ilssontdoncpeusécrétésetjouentmajoritairementunrôledans

ladestructiondesmicro-organismesauseinduphagolysosome.Lamyélopéroxydase(MPO)

peutquantàelleêtredéverséeauseinduphagosome,maisaussidanslemilieuextracellulaire

provoquant ainsi une suite de réactions pouvant à terme altérer la membrane des

microorganismes et conduire à leur destruction. Les alpha-défensines constituent en

moyenne5%desprotéinescontenuesauseindesneutrophileshumainsetpossèdentune

activitéantimicrobienneenversunlargepaneldebactéries,champignons,virusenveloppés

ainsi qu’envers les protozoaires. Elles provoquent également un rôle de chimioattractants

enverslesmonocytesainsiquepourleslymphocytesTCD4+ouCD8+aprèsexocytose.On

retrouveégalementdanslesgranulesprimairesdesBPI(bactericidal/permeabilityincreasing

11

proteins)quiontuneactivitébactéricideenplusdepouvoirselierauxneutrophilesetaux

macrophagesafindedéclencherlaphagocytosedesbactériesGram-négativesreconnuesvia

leurLPS.

Enfin,sontégalementprésentes:i)desserprocidinescapablesdelyserdescomposantsdela

Matriceextracellulaire(MEC)etderéagiraveclescellulesdel’endothélium,del’épithélium,

lesplaquettes,ainsiqu’avecdeseffecteursdelaréponseinflammatoire;etii)l’azurocidine

qui peut exercer une action chimioattractive sur lesmonocytes, les lymphocytes T et les

fibroblastes,ainsiquestimulerlavasodilatationlorsdel’extravasationdesneutrophiles.

1.1.1.2.2 Granulessansperoxydase

Commeditplushaut,laproductiondeMPOs’arrêtelorsdeladifférenciationenmyélocyte,

cequipermetdoncderegrouperlesgranulessecondairesettertiaires,carleursynthèsese

faitdemanièrecontinueentrelesstadesmyélocyte,métamyélocyte,neutrophileimmature

puissegmenté.Cependant,lesprotéinescontenuesdanslesgranulesspécifiquesettertiaires

fontqu’ilsexercentdesfonctionsdifférentes.D’unepart,lesgranulesàgélatinasesemblent

opéreressentiellementlorsdel’extravasationdesneutrophilesetdeladiapédèse,avecdes

protéinesdedégradationde laMECainsiquedesrécepteursessentielsàcesétapesde la

réponse inflammatoire. D’autre part, les granules spécifiques ont un arsenal protéique

antimicrobienutilelorsdel’éliminationdesmicro-organismesaussibiendanslephagosome

quedans lemilieuextracellulaire.Onretrouvedesmoléculesà fortpouvoirantimicrobien

dans ces granules telles que la lactoferrine, le CAP-18 humain (hCAP18) appartenant au

groupe des cathélicidines, la lipocaline associée à la gélatinase neutrophilique (NGAL), le

lysozymeetlaprotéineNaturalresistant-associatedmacrophage1(Nramp-1),ainsiquedes

métalloprotéases.

1.1.1.2.3 Lesvésiculessécrétoires

Ces vésicules de localisation cytoplasmique contiennent essentiellement des récepteurs

membranairesnécessaireslorsdespremièresphasesdelaréactioninflammatoirerégiepar

les neutrophiles. La fusionde ces vésicules à lamembraneplasmique répond à différents

stimulietpermetnotammentl’expressiondesb2-intégrinesCD11b-CD18,etdediversautres

12

récepteurs. L’exocytose des vésicules sécrétoires est accompagnée de l’apparition des L-

sélectinessurlamembranedesneutrophiles.Cesdifférentschangementsvontpermettrela

liaison fermedes neutrophiles aux cellules endothéliales activées par divers signaux de la

réponseinflammatoireauseindutissu.

Cesdifférentsgranulescytoplasmiquesvontjouerunrôleimportantenfonctiondesstimuli

delaréponseinflammatoireaigüequiestrégieparlesneutrophilesendéversantleurcontenu

danslemilieuextérieuroubiendanslephagosome.

Hématopoïèse et différenciation

L’hématopoïèseestl’ensembledesmécanismesquiconcourentàlaproductiondeséléments

figurés du sang. Till et McCulloch ont mis en évidence en 1960, les cellules souches

hématopoïétiquesprésentesdanslamoelleosseuseàpartird’expériencesréaliséeschezdes

souris.Parlasuite,laculturedecescellulesapermisdedifférencierdifférentesunitésformant

colonies(CFU)àl’originedegrandstypesleucocytaires:

- CFU-Gàl’originedesgranulocytesneutrophiles

- CFU-Mpourlesmonocytes

- CFU-Eoquigénèrentleséosinophiles

- CFU-GEMMcapablesdeproduirelesprincipalescellulesmyéloïdes

Ces cultures ont également permis de mettre en évidence une dépendance vis-à-vis des

facteursdecroissance,nommésFacteursstimulantdescoloniesouCSF,quiconduisentàla

productiondeprécurseursouCFUvariésàpartird’unemêmecellulesouchehématopoïétique

(HSC).

13

Figure2:Hématopoïèsedescellulessanguines

L’hématopoïèsesedérouleauseindelamoelleosseusechezlenouveau-néetl’adulte,dans

lesoslongs,certainsosplatsetlesvertèbres,alorsquechezlefœtus,cetteproductionest

assuréed’abordparlesacvitellinpuisparlefoie.Ils’agitd’unedifférenciationàpartird’une

HSC très peu différenciée et capable d’auto renouvellement. La différenciation suit un

programmemorphogénétiqueprécisetdonne lieuàuneorganisationpyramidaleavecau

sommet la cellule souche hématopoïétique et à sa base les différents types cellulaires

différenciésformantleslignéesmyéloïdeetlymphoïde.

Lorsdelagranulopoïèse,unprogéniteurmultipotentsedifférencieraenprogéniteurmyéloïde

commun,lequelalacapacitédedonnerunprogéniteurmégacaryocyte-érythrocytaireouun

progéniteur granulocyte-macrophage. Ce dernier va poursuivre la différenciation via des

stadessuccessifsallantdumyéloblastejusqu’auneutrophilemature.Laproductiontotaledes

neutrophiles peut atteindre jusqu’à 2.1011 cellules par jour. Seul le neutrophile mature

présenteunnoyaucaractéristiqueplurilobé;àcestade,cesontalorsdescellulestotalement

différenciées, incapables de se diviser, et de subir des changements majeurs de leur

phénotypeunefoisqu’ellesontquittélamoelleosseuse.

14

Contrôle de la différenciation cellulaire en neutrophile Auseindelamoelleosseuse,s’établitunmicroenvironnementoptimalappeléniche,oùsont

présentslesdifférentssignauxquivontguiderladifférenciationdescellulessouchesversle

phénotype neutrophile. En effet les cellules stromales présentent des caractéristiques

d’adhérence, permettant le contact et le lien avec les cellules en maturation. Elles vont

produiredeschimiokinesdeguidageetdelocalisation,ainsiquedesfacteursdecroissanceet

descytokinesquipromeuventladifférenciationetlamultiplication.Ilexistedoncdifférentes

nichesresponsablesdeladifférenciationdedifférenteslignées,avecdessignauxspécifiques,

provenantdedifférentescellules(fibroblastesspécialisés,cellulesendothéliales,ostéoblastes

etadipocytes).LescelluleslesmoinsdifférenciéesdontlaHSCsontsituéesprèsdelaparoi

avecunfluxsanguinbasainsiqu’unepressionpartielleenO2faible,tandisquelescellulesles

plusdifférenciéessetrouventplusprèsdusinuscentraletdoncde lacirculationsanguine

qu’elles rejoindront à la fin du processus de différenciation. Ainsi dans chaque

microenvironnement est mis en place une signalisation par contact entre cellules

hématopoïétiquesetcellulesstromales.Outrecetterégulationintrinsèque,ladifférenciation

de ces cellules est également sous la dépendance de facteurs diffusibles sécrétés par les

cellulesstromalesoubienprovenantdusang.Cela introduitdoncuncontrôleàdistanceà

l’échellede l’organisme.Demanièregénérale, laproductiond’IL-1, IL-6etdeGM-CSF lors

d’uneréponseinflammatoirestimulel’hématopoïèse.

Laproductiondesneutrophilescorrespondàlamajeurepartdelaproductiondelamoelle

osseuse(environ30%).Ils’agitessentiellementd’unéquilibreentredessignauxconstantsau

sein de la niche à l’équilibre, et des signaux de différenciation et de libération dans la

circulationsystémiquelorsd’inflammation.LerécepteurCXCR4joueunrôlemajeurdansla

Figure3:Etapesdelagranulopoïèseneutrophilique

15

rémanencedescellulessouchesmaisaussidescellulesplusdifférenciéesauseindelamoelle.,

LachimiokineCXCL12,expriméàlamembranedescellulesstromales,selieàcerécepteur.Le

signalinduit,provoquelarétentiondescellulesdanslamoellevial’interactionVLA4/VCAM1.

L’expressiondeCXCR4,ainsiquecelledeVLA4àlamembranedesneutrophiles,diminueau

cours de leur maturation, permettant in fine la libération des cellules matures dans les

vaisseauxsinusoïdes.Parailleurs,lerelargagedesneutrophilesestréguléparlesligandsde

CXCR2, parmi lesquels on trouve CXCL1, CXCL2, CXCL5 et CXCL6. Les deux premiers sont

synthétisésparlescellulesendothélialesdelamoelleosseuse,tandisquelesCXCL12présent

danslesnicheshématopoïétiques,provientessentiellementdesostéoblastes3.

Le facteur G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) est un stimulant essentiel de la

productiondesgranulocytes.Iln’estcependantpasnécessaire,lorsd’inflammation4.Lesignal

est responsablede la libérationdesneutrophilesmaturesàpartirde lamoelle,enplusde

stimuler la prolifération des cellules souches de la lignée et d’accélérer la maturation

nécessaire avant le relargage. G-CSF aurait un effet inhibiteur sur la production de

CXCR4/CXCL12,enréduisantrespectivementl’expressionsurlescellulesmyéloïdes,ainsique

lasécrétionparlescellulesstromales.

Lamoelleosseuseétantégalementunlieud’épurationdesneutrophilesâgés,unchangement

duniveaud’expressiondesrécepteursmembranairesseproduit,àl’origined’uneplusgrande

sensibilitéauxsignaux,etfavorisantainsiunretouràlamoelle,ou«homing».

Parailleurs,laproductiondeneutrophilesestlargementréguléeparletauxd’apoptosedes

neutrophiles matures, ceux-ci étant phagocytés par des macrophages et des cellules

dendritiquesdanslestissus.Cephénomèneestconnusouslenomd’efferocytose.Ceciestà

l’origined’uneréductiondelaproductionparlescellulesphagocytairesd’IL-23,interleukine

quistimulelaproductiond’IL-17A,elle-mêmeàl’origined’unestimulationdelaproduction

deG-CSF.Ainsi,uneaugmentationde laquantitédeneutrophilesdans lestissusengendre

une diminution de la production de G-CSF. Ainsi CXCR-4 joue un rôle primordial dans la

rétentiondesneutrophilesauseindelamoelle,créantainsiuneréservedisponiblelorsqu’un

signalpourlalibérationdanslacirculationsanguineestdétecté.CXCL-12présentàlasurface

descellulesstromalesdelamoelleosseuse(ancienSDF-1)estinhibéparG-CSF,alorsquece

facteurdecroissancestimulel’expressiondeKC/CXCL8etGrob/CXCL2,quisontdesligandsde

16

CXCR-2, inversant ainsi la balance de signalisation et favorisant ainsi la libération des

neutrophilesdanslacirculationsystémique.

Plusieursmoléculesparticipentàlarégulationdel’hématopoïèse,avecencoredenombreux

paramètresinconnus.Différentesétudesontainsipudémontrerlerôledecertainescytokines

dans le maintien des HCS au sein de la moelle ou bien la libération dans la circulation

périphérique.

Figure4:Mécanismesdeladifférenciationetdelalibérationdesneutrophilesauseindelamoelleépinière

3

CXCL1 (growth-regulated protein Į [GROĮ]), CXCL2 (macrophage inflammatory protein-2Į [MIP-2Į]), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 [ENA78]), and CXCL6 (granulocyte chemotactic protein-2 [GCP-2]) (1,23). CXCL1 and CXCL2 are constitutively expressed on endothelial cells of the BM (21,23), whereas osteoblasts are the major source of CXCL12 in this tissue (24,25). Reciprocal interactions between CXCR2/CXCR2-ligands and CXCR4/CXCL12 signaling are considered to play a major role in the trafficking of neutrophils from the BM to the systemic circulation (21,23).

Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is not only a primary regulator of granulopoiesis but also a disruptor of neutrophil retention (14). Under physiologic conditions, G-CSF induces the proliferation and differentiation of CD34+ granulocytic progenitors and reduces the transmit time through each differentiation stage (17). It also enhances the egress of mature neutrophils from the BM (15,17,26). The effect of G-CSF on the

300https://doi.org/10.4110/in.2017.17.5.298

Neutrophil Heterogeneity

https://immunenetwork.org

Stromal cells

Endothelial cells

Aged neutrophils

Sinusoidalblood vessls

Aged neutrophils are destroyedby BM macrophages

induce egressby inhibition of CXCR4/CXCL12

induce proliferation of CD34+ granulocytic progenitor cells

BM macrophage

G-CSF

CXCR1CXCR2

CXCR2

CXCR1

CXCR4VLA-4

CXCR2CXCR1

CXCR4

CXCR4

VLA4

VLA-4

VCAM

-1CX

CL12

Immature neutrophils

Mature, naive neutrophils

Dendritic cell

Osteoclast

Osteoblast

LT-HSC ST-HSC MPP LMPP GMP Myeloblast Pro-myelocyte

Myelocyte Meta-myelocyte

Band cell MatureNeutrophil

Mitotic pool Post mitotic poolStem cell pool

Bone marrow

Systemiccirculation

CXCR1 -CXCR2CXCR4CD62L

CXCL1CXCL2CXCL5CXCL6

Homing back

Retention

Egress

Figure 1. Trafficking of neutrophils in the BM. The granulopoietic compartments of neutrophils are divided into 3 different pools. Neutrophils express and shed various receptors according to their different developmental stages. CXCR2 is upregulated whereas CXCR4 and VLA-4 are downregulated. CXCR1 is constitutively expressed during neutrophil maturation. Retention of neutrophils is mediated by CXCR4/CXCL12 and VLA-4/VCAM-1 pathways. Immature neutrophils adhere to the marrow endothelial cells and stromal cells via the CXCR4/CXCL12 and VLA-4/VCAM-1 axes. The CXCR2/CXCL2-ligands induces neutrophil egress from the BM. Mature CXCR2hi CXCR4low neutrophils preferentially egress from the BM depending on CXCR2-ligands. G-CSF orchestrate s the trafficking of neutrophils in the BM. G-CSF induces the proliferation of granulocytic progenitors and enhances the egress of neutrophils by inhibiting CXCR4/CXCL12. DCs regulate G-CSF production in the BM. Aged neutrophils are cleared by the BM. Senescent neutrophils show decreased expressions of CXCR2 and CD62L with increased expressions of CXCR4 and CCR5. This surface marker profile of aged neutrophils ensures homing back to the BM where BM macrophages destroy the aged neutrophils.

17

Tableau1:Moléculeseffectricesdanslagranulopoïèse

Molécule Fonction

Angiopoïétine1,Tie2etN-cadhérine MaintienHSCquiescentedanslaniche,lienavec

contrôlecyclecellulaire

G-CSF RégulationdeSDF-1(CXCL-12)

SDF-1(CXCL-12) Expriméedanslescellulesstromales,attireHSC

CXCR-4 ExprimédansHSC,récepteurdeSDF-1

VLA-4,LFA-1,Opn,Intégrines,autrescellules

d’adhésiondesurface

Leuractivationestnécessairepourlamobilisation

deHSC

MMP-9,MMP-2etsKitL InduitesparG-CSFetSDF-1pourlamobilisationde

HSC

FGF-4 Formengradiententrelescellulesstromalesetle

réseauvasculairepourrecruterHSC

VEGF4,PLGF,,autresfacteursdecroissance MobilisationetrecrutementdeHSC

5D’aprèsZ.Li(2006)

D’aprèsFrenetteetal6lesystèmenerveuxsympathiqueparticipeàlamobilisationdesHSC

danslaniche.Cesmécanismesrestentcependantmalconnus6.Demême,ilaétémontréchez

des souris axéniques, qui ne possèdent pas de flore microbienne commensale, qu’une

neutropéniemarquéeétaitprésente.Celasignifiequelescellulesprogénitricesrépondentà

des stimuli spécifiques provenant directement de la flore ou du tube digestif lorsqu’il est

normalementcoloniséparlafloremicrobienne7.

L’équilibre entre renouvellement et différenciation des HSC est donc finement régulé par

différents mécanismes intrinsèques et extrinsèques au microenvironnement, avec une

participationcentraledescellulesstromalesdelamoelleosseuse.

Distribution des neutrophiles entre tissus

Al’étatphysiologique,lesneutrophilesmaturessontprésentsdanslacirculationsanguineou

biendanslestissus.Ilssontnormalementtransportésparlefluxsanguin.Ilsconstituententre

18

60et70%des leucocytescirculantschez lescarnivoresetenviron20-30%chez lesbovins.

Cependant,seuls1à2%dupooltotalsetrouventeffectivementdans lacirculationet les

vaisseauxsanguins,lavastemajoritéétantaucontactdel’endothéliumdescapillairesausein

delarate,dufoie,despoumonsetdanslamoelleosseuse.Desétudesontmontréqueles

neutrophiles résident plus longtemps au sein du parenchyme pulmonaire sans que les

mécanismesquiyprésidentsoientexactementdéterminés:ilsembleraitqueletempsaccru

ne soitpasuniquement imputableau faitque lespoumons reçoivent l’intégralitédu sang

éjectéparlecœur.Desdonnéessuggèrentquelesneutrophilespassentplusdetempsentant

que«sentinelles»danslesvaisseauxpulmonairesparrapportauxautresorganes,sansque

celasoitvraimentexplicité8.

La réserve de neutrophiles permet, dans le cas d’une infection par un ou plusieurs

microorganismes, demobiliser une grande quantité de neutrophiles, avec un nombre de

neutrophilescirculantsquipeutêtremultipliépar10.

Malgré l’idée communément admise que les neutrophiles constituent une population

homogène dans la circulation sanguine, plusieurs études ont montré qu’il existe des

différencesnonnégligeablesauseindecettepopulation.Ceciestretrouvédanslesconditions

physiologiques avec des changements dus à l’âge, ainsi que dans diverses conditions

pathologiques, avec une libération accrue de neutrophiles immatures. On retrouve ces

différencesauniveaufonctionnelainsiqu’auplanphénotypique9.Ceschangementsseront

détaillés par la suite. La quantité de neutrophiles circulants est un équilibre entre les

neutrophileslibérésparlamoelleépinièreetlaséquestrationdesneutrophilesâgésdansles

tissuspériphériques,oùilsvontêtreéliminés.Dansl’espècehumaine, lesneutrophilesont

uneespérancedeviemoyennede6à8heures 10.Cesontdescellulescapablesde fortes

pressions,enadaptantleurmorphologieetenmodulantleurinteractionavecl’endothélium,

afin de couvrir une large distribution au sein de l’organisme. Les neutrophiles sont

susceptiblesdemigrerlorsd’inflammation,àlasuited’uneinfectionoud’untraumatissulaire,

afind’yexercer leur rôle. Le caséchéant, ils vont subirdes changementsmorphologiques

traduisantlevieillissementcellulaire,ainsiqu’unepertedeleursfonctionscellulaires.

19

1.1.2 Migrationlorsd’inflammationaigüe

Dans sa forme classique, l’inflammation aigüe peut être décrite par cinq signes locaux

majeurs : chaleur, rougeur, douleur, tuméfaction et altération des fonctions. Ces singes

cliniquessontlaconséquencedelavasodilatationdespetitsvaisseauxpériphériquescausant

unebaissedudébitquilestraverse.Outrecommeconséquenced’uneinfection(bactérienne

notamment),celle-cipeutêtreégalementapparaîtreà la faceendothélialeà lasuitede la

mortdecellulesoudelésionstissulairesstériles. Ilestdifficiledesavoirsi lesneutrophiles

sontcapablesdedifférencieruneinflammationstériled’uncontexteinfectieux.Cependant,

dans les conditions décrites, les neutrophiles sont ralentis et ils peuvent s’arrêter à

l’emplacementoùlareconnaissancedesignauxinflammatoiresalieu,etmigrerensuitedans

lestissusaffectésouausiègedel’infection1,11.

Recrutement Lesmacrophagesetlesmastocytessontmajoritairementprésentsauseindestissusetontun

rôle de sentinelles. Ces cellules initient le recrutement des neutrophiles, ainsi que divers

processus tels que l’augmentation de la perméabilité vasculaire et la production de

chimiokines.Ceciestprovoquéparlareconnaissancedemotifsmoléculairesassociéssoità

aux micro-organismes (MAMPs pour Microbial Associated Molecular Patterns) soit à des

moléculesintracellulaires(DAMPspourDamageAssociatedMolecularPatterns,appelésaussi

alarmines). Ces motifs moléculaires particuliers sont reconnus par des récepteurs

membranaires ou intracellulaires dits PRR (pour Pathogen-Related Receptors) qui sont

exprimés dans ou sur les cellules sentinelles (macrophages, cellules dendritiques et

mastocytes)auseindes tissus.Cette interactionprovoque la libérationdecytokinesetde

chimiokines,quivontdéclencherdesmodificationsdel’expressiondemoléculesàlasurface

desendotheliaquisontalorsactivés.EnquelquesminutesilvayavoirexpositiondesP-etE-

sélectines,quiétaientauparavantprésentesdansdesvésiculescytoplasmiques;leursynthèse

estégalementstimuléeauseindescellulesdel’endothélium.Troiscytokinesmajeuressont

également synthétisées : le facteur de nécrose TNF-a (TumorNecrosis Factor alpha) , les

interleukine IL-1 et IL-6. Récemment, un rôle aussi été attribué aux plaquettes qui

interviendraientdansl’extravasiondesneutrophiles8,12.

20

1.1.2.1.1 LescytokinesTNF-aestproduitenonseulementparlescellulessentinellesactivéesparlesrécepteursTLR

(pourToll-likereceptors),maiségalementparl’endothéliumlésé.Sasécrétiondanslemilieu

extracellulairevaprovoquerlalibérationdecytokinesetchimiokinesparlescellulesvoisines

etparlasuitel’adhérence,lamigration,l’attractionetl’activationdesleucocytes,commeles

neutrophiles. Sa sécrétion peut également être stimulée par des neurotransmetteurs

(neurokin-1).Auniveausystémique,TNF-apeutdiminuerledébitcardiaque,augmenterla

perméabilité capillaire ainsi que provoquer la formation des thrombi. Son action sur les

neutrophilesvapermettredelesattireraulieudel’infection,d’augmenterleuradhérenceà

la paroi de l’endothélium, et promouvoir la phagocytose par ces cellules. TNF-a agit

égalementsurd’autresleucocytes,notammentenstimulantsaproprelibérationenplusde

celledel’IL-1parlesmacrophages,toutcommed’autresmédiateursdel’inflammation.

Enassociationavec l’IL-1,cettecytokinevaagirauniveaude l’endothéliumdescapillaires

sanguins,quisontessentielspourl’arrêtpuisl’adhérencedesneutrophiles.Cetteassociation

auniveausystémiquedéclenchelafièvre,laléthargieetlaperteplusoumoinsmarquéede

l’appétittandisqu’elleinduitlasynthèsedesprotéinesdelaphaseaigüeparlefoie.

Enfin,l’IL-6estproduitepardeslymphocytesT,desmacrophagesainsiquedesmastocytes,

notammentenprésenced’endotoxinesbactériennes.Cettecytokinejoueunrôleprimordial

dans la résistance aux infections bactériennes et semble être responsable de la transition

d’une inflammation précoce dominée par l’action des neutrophiles vers les phases plus

tardives de l’inflammation où les macrophages prédominent. Elle joue un rôle anti-

inflammatoirepar inhibitionduTNF-aet lastimulationde lasynthèsed’IL-10,quiestune

interleukinedontl’actionestprincipalementanti-inflammatoire.

1.1.2.1.2 LeschimiokinesIls’agitd’unefamilledepetitescytokinesauxpropriétéschimioattractives.Ellessontlibérées

par les cellules sentinelles activées. Elles vont guider lamigration des leucocytes et ainsi

l’initiationdelaréponseimmunitaireinnée.Différentesinfectionsvontprovoquerdesprofils

dechimiokinessécrétéesdifférents,conduisantaurecrutementdepopulationsvariablesde

leucocytes.Ainsi,CXCL-8quiestproduitepardesmacrophagesetdesmastocytes,vastimuler

ladégranulationdesneutrophilesainsiquel’explosionrespiratoire.

21

1.1.2.1.3 Lesmoléculesvaso-activesLesmolécules vaso-actives agissent au niveau des vaisseaux sanguins en provoquant leur

dilatation, avec pour conséquence une diminution du flux sanguin et l’extravasation, en

facilitantleralentissementdufluxcellulaire,l’adhésiondescellulesinflammatoiresàlaparoi

depetitscapillaires,puis ladiapédèse.Ceciprovoque l’apparitiondessignesclassiquesde

l’inflammationtelsquelarougeuretlegonflement.Deschangementscellulairesàlasurface

del’endothéliumontlieuenparallèle.Encasderupturedecedernier,l’agrégatplaquettaire

quiseformelibèreégalementdesmoléculesvaso-activesetpro-coagulantes.Lesmolécules

vaso-activesontdifférentesorigines,tellesquelestissuslésés,desprécurseurssanguins,des

moléculeslibéréespardescellulescirculantes,ainsiquedesneurotransmetteurs.

Parmi lesaminesvaso-actives, l’histamine,quiest libéréepar lesmastocytes,est l’unedes

plus importantes. Elle est à l’origine de la libération de l’oxyde nitrique, un puissant

vasodilatateuragissantsurlescellulesendothéliales.Latransductiondusignalpasseparles

récepteursH1.L’histamineprovoqued’autrepartunefuitedeliquideàtraversl’endothélium

quisedistend.

Laprotéolysedeprécurseurssanguinsinactifsgénèredespeptidesvaso-actifs.Desprotéases

agissantsurlesfacteursC3etC5ducomplémentconduisentàl’apparitiondesfacteursC3a

etC3b.Cesmoléculessontdesanaphylatoxines,c’est-à-direqu’ellessontcapablesd’agirsur

les mastocytes, pour provoquer la libération d’histamine et de C5a qui est un puissant

attractantdesneutrophiles.Onretrouveégalement leskinines,desmoléculesvaso-actives

responsablesdeladouleur,avecunrôlesemblableàceluidecertainsneurotransmetteurs

telsquelasubstanceP.

Enfin les leucotriènes qui font partie des lipides vaso-actifs sont formés à partir d’acide

arachidoniquelibéréàpartirdelamembranedediversescellulesdontlescellulessentinelles,

aprèsactiondel’enzyme15-lipoxygénase,tandisquelacyclooxygénaseproduitàpartirde

cette mêmemolécule, des prostaglandines vaso-actives. Les leucotriènes agissent sur les

neutrophilespermettantleurrecrutementainsiqueleuractivationetleursurvie.Onretrouve

parmi les leucotriènes, le LTD4 dont la libération est stimulée par l’IL-13 tandis que la

productiond’Il-13estelle-mêmestimuléeparlaprésencedeLTD4.Ils’agitdoncd’uneboucle

d’amplificationdontlerôleestcentrallorsd’inflammationsévère.

Parmilegrandnombredeprostaglandinesquetouteslescellulesnuclééespeuventproduire,

quatregroupesdesprostaglandinespro-inflammatoiresontétédécrits:lesPGE2,PGF2,les

22

thromboxanesetlesprostacyclines.Leureffetauseindedifférentssitesinflammatoiresest

complexe et variable. Cependant, au fur à mesure qu’ils infiltrent les tissus infectés, les

neutrophiles produisent de la lipoxine. En retour, la lipoxine inhibe la migration des

neutrophiles.Ilyaainsiuneaugmentationprogressivedelaconcentrationdecesmolécules

anti-inflammatoires,audépendduLTB4àl’actionpro-inflammatoire.

OnretrouveégalementunphospholipidenomméPAF(pourPlateled-activatedFactor).Ilest

produitpar lesneutrophilesetagit luiaussisur l’endothélium, lequeldevientplusépaiset

favorise ainsi l’adhésion des neutrophiles, leur chimiotactisme, la dégranulation avec la

libération d’oxydants. Il permet également l’agrégation des plaquettes et la libération de

moléculesvaso-actives,demêmequelasynthèsedethromboxane.

Lesproduitslibérésparlescellulessentinellesactivéesvontdoncaugmenterlaperméabilité

vasculaireetattirer les leucocytes,aupremier lieudesquels, lesneutrophiles.Cesderniers

vontdoncjouerunrôleessentieldanslaluttecontrelesagentsinfectieux,afindeleséliminer

leplusrapidementetefficacementpossible.Pourcelailsdoiventparveniràêtreencontact

decesmicroorganismesausitemêmedel’infection.

Rolling et adhésion Lorsquedesprotéinesbactériennestelque le lipopolysaccharide(LPS)oubiendesDAMPS

agissent sur les cellules endothéliales des capillaires, celles-ci surexpriment en quelques

minutesdesglycoprotéinesàleurmembrane:laP-sélectine(expriméeségalementparles

plaquettes)etlaE-sélectine13.Cesprotéinesexposéesàlasurfacecellulairesontcapablesde

se lieràuneL-sélectineexpriméeà lasurfacedesneutrophilescirculants.Cette liaisonest

transitoire, mais permet progressivement de ralentir les neutrophiles jusqu’à les arrêter

complètementàlasurfacedel’endothéliumdescapillaires.

L’interaction avec l’endothélium va provoquer, via le PAF d’origine endothéliale et une

protéineGtransmembranaire,l’expressiondeprotéinesd’adhésiontellesqueCD11a/CD18à

leurmembraneàpartirde l’exocytosedesvésiculessécrétoires.Cesprotéinespermettent

quantàellesdereconnaitredesintégrinesICAM-1surlescellulesendothélialesetd’établir

uneliaisonforteentrelesdeuxcellules,conduisantainsiàunarrêtcompletdesneutrophiles

collésàl’endothéliumenregarddutissud’oùproviennentlespremierssignaux.Lasécrétion

d’élastaseneutrophiliqueaugmenteencorelaforced’adhésion.

Sousl’influencedecytokinestellesquel’IL-1,IL-17oubienleTNF-a,lescellulesendothéliales

23

vontexprimerdesE-sélectinesàfortpouvoird’adhésion;enoutre,lasécrétiondeCXCL-8par

lesneutrophilesrecrutésprovoquel’attractiondenouveauxneutrophiles,amplifiantainsile

phénomène, et la libération d’IL-1 va intensifier le pouvoir d’adhésion ainsi que la

vasodilatationetl’attractiondescellulesdel’immunité14.

Ilsemblecependantqued’autresmécanismesprovoquentaussil’adhésiondesneutrophiles.

Danslescapillairespulmonairesdontlediamètreestinférieuràceluidesneutrophiles,ceux-

cisontcapablesdes’attacheretdes’infiltrersansqu’ilyaitexpressiondesintégrinesetdes

sélectines, mais uniquement par une action mécanique. Le contact avec l’endothélium

vasculairevapermettrel’activationdesneutrophilescommedéveloppéplusloin.

Diapédèse L’adhésion forte aux cellules endothéliales et l’influence des cytokines va permettre aux

neutrophiles de traverser la paroi vasculaire. Ce phénomène nommé diapédèse (« saut à

travers»dugrecancien)estfinementguidépardesagentschimiotactiques.Lecytosquelette

desneutrophilespermetunepolarisationde lacellule,avec la formationd’un lamellipode

concentrantlesrécepteursdechimiokinesetinducteursdephagocytose.Ceciestengendré

par des voies de transduction incluant des protéines G sensibles au phosphoinositol 3

Phosphate (PiP3) et à la RhoGTPase (Rac), qui provoquent unemodification de l’actine-F

intracellulaire13.

Alasuitedecesignal,leneutrophiles’immisceentredeuxcellulesendothélialesàtraversune

jonctionserréegrâceàuneinteractionentrelesmoléculesdeCD31,expriméed’unepartsur

les cellules endothéliales, et d’autre part à la membrane des neutrophiles. Les filaments

d’actine et de myosine vont donc profiter de l’appui permis par ces liaisons fortes pour

propulser les neutrophiles dans le tissus infecté ou lésé. Sont également nécessaires des

intégrinesetdesprotéinesd’adhésioncellulaire(CAM),dontICAM-1etICAM-2,ainsiquedes

moléculesd’adhésionjonctionnelles(JCAM)8.Desétudesontpermisdemontrerlerôledes

protéinesdeliaisonentredeuxcellulesépithéliales.Eneffet,lesVE-cadhérinesmembranaires

joueraientunvrairôledecontrôledupassagedesneutrophiles,ensedissociantsuiteàleur

phosphorylation et en permettant le passage des neutrophiles en restaurant l’étanchéité

aprèsleurpassage15.

Le passage à travers la membrane basale est facilité par le déversement dans le milieu

extracellulairedemétalloprotéasescollagéno-lytiques(collagénases,protéases…)contenues

24

dans les granulesàgélatinase. Lamajoritédesneutrophiles va traverser l’endothéliumde

cettemanière.Cependant,environ20%utilisentlavoietranscellulaire12,13.

Les neutrophiles nouvellement arrivés au sein du tissu doivent suivre un gradient, avant

d’entrerencontactavec lesmicro-organismes, lequeldoitdépasser legradientprécédent.

Ainsi,denouvellesmoléculesd’attractionvontcréercegradientauxalentoursdestissuslésés.

Le peptide N-formyl-methionyl-leucyl-phénilalanine dérivé des bactéries et le C5a du

complémentsontresponsablesduchimiotactismeauseindutissu.Lesneutrophilesvontalors

migrerverslesbactériesenprojetantleurslamellipodes8.

Production et libération de cytokines Le passage à travers la matrice basale permet l’activation des neutrophiles avec un

changementduphénotypeetdeleuractivitéoptimiséedanslestissus.Afindepromouvoir

l’attraction d’autres cellules inflammatoires, les neutrophiles sécrètent également des CC-

chimiokines, responsables du recrutement desmonocytes capables d’éliminer les cellules

mortesouapoptotiquesdans letissuaprèsdifférenciationenmacrophages.Laproduction

d’IL-8(CXCL-8),IFN-getG-CSFvastimuleretorienterlaréponseinflammatoire.Lalibération

d’IL-17 induit la libération de facteurs pro-inflammatoires par les cellules myéloïdes et

mésenchymateuses permettant le recrutement ainsi que l’activation de nouveaux

neutrophiles. De plus, la production de Leucotriène B4 (LTB4) attire de nouveaux

neutrophiles.Leschimiokinessontdesmoléculeschargéespositivementquivontselieràdes

héparanessulfateschargésnégativementquiserventd’ancresetpermettentlacréationd’un

gradientlelongdel’endothélium16.

Lorsqu’ilssontactivés,lesneutrophilesvontégalementlibérerdescytokines(MIP-1a,MIP-

1b, INF-g)agissantsur le recrutementdemacrophages.Réciproquement, lesmacrophages

activésvontagirsurlesneutrophilesensécrétantduTNF-a,G-CSFetGM-CSF,produisantune

augmentation des synthèses, du recrutement neutrophilique, ainsi que l’inhibition de

l’apoptose,accroissantdumêmecouplasurviedescellulesdanslesiteinflammatoire.

Cependant, ilaétémontréquelesneutrophilesmurinsproduisentpréférentiellementune

cytokineanti-inflammatoire,L’IL-10plutôtquedescytokinespro-inflammatoires17lorsqu’ils

sontstimuléspar laprésencedebactéries,via laco-activationdeTLR-2etd’unCLR/Syk.A

25

l’inversedesmonocytes, lesneutrophilesnesontpassensiblesà l’IL-10,cequienfaitune

cellulerégulatricedel’inflammationaprèslecontactavecunebactérie.

Lesneutrophilesontétéassociésà l’inductionde l’inflammationetsontcapablesd’influer

directementsurlescellulesdendritiques.Cependantlesneutrophilesactivéssupprimentles

fonctions des lymphocytes T, ainsi que la production de cytokines via la production de

péroxyded’hydrogène18.Zhangetal17ontmontrélerôlecentraldesneutrophilesactivés

danslarégulationdel’inflammationlorsd’infectionbactérienne,encontrebalançantlaforte

activité pro-inflammatoire des autres cellules effectrices de l’immunité (monocytes,

macrophagesetcellulesdendritiques).Lorsd’inflammationaigue,l’activitédesneutrophiles

correspondàunéquilibreentrel’éliminationdirectedesbactériesetl’inductiond’unprofil

anti-inflammatoire,sansexercerd’influencemajeuresurlacroissancebactérienne.

1.2 Lesneutrophilescommeeffecteursdel’immunité1.2.1 Rôledansl’immunitéinnéeL’activationdesneutrophilesvapermettreàl’organismedecombattrelesmicro-organismes

qui l’infecte.Celaa lieuà lasuitedudoublesignalproduitpar la liaisonauxintégrinesdes

cellules endothéliales, et à la stimulation par les facteurs TNF-a, CXCL-8 ou bien C5a. Les

vésiculessécrétoiressontlespluspropicesàladégranulation,suivisdesgranulesàgélatinase,

desgranulesspécifiquesetenfindesgranulesazurophiles.Lesvoiesdesignalisation,menant

àlalibérationdesgranulesetdesvésicules,sontcomplexesetencoreassezmalcomprises.

Lorsqu’ils sont au contact de bactéries, les neutrophiles activent divers systèmes anti-

microbiens(dépendantounondel’oxygène),enlibérantlecontenudesgranulesazurophiles

etdesgranulesspécifiquesdanslemilieuextérieuroudanslesphagosomes.Lessubstances

contenues dans ces granules permettent une variété d’activités envers les bactéries. Elles

agissentsurtoutendéstabilisantlamembranebactérienne,d’autrestellesqueleNGAL,les

lactoferrines,etNramp1perturbentlemétabolismebactérienquidépenddufer.Ilproduisent

égalementdesradicauxoxygénésouROSgrâceaucytochromeb558etàlaMPO19.

26

Phagocytose et explosion respiratoire

1.2.1.1.1 InternalisationdesagentspathogènesL’activationdesrécepteursTLRparlaprésencedebactériesdéclenchedifférentssignaux.Les

neutrophiles possèdent l’intégralité des récepteurs TLR connus, ce qui permet d’affiner la

réponse selon qu’il s’agit d’une bactérie à Gram positif ou bien à Gram négatif. Les

neutrophilesémettentdeslamellipodesendirectiondeszonescontenantuneconcentration

supérieurede chimio-attractants.Ce sontdifférentesmoléculesqui forment cegradientà

l’endroit où se trouvent des agents pathogènes, parmi lesquelles on retrouve le C5a, le

fibrinopeptide provenant du fibrinogène, et du peroxyde d’hydrogène, ainsi que des

chimiokines,desleucotriènesetd’autresmoléculeslibéréesparlesbactéries.

Lesneutrophilesvontdecettefaçonparveniràproximitédesbactéries.Laphagocytose la

plus efficace a lieu lorsque les bactéries sont préalablement opsonisées par des anticorps

permettant ainsi la liaison à des récepteurs membranaires présents à la surface des

neutrophiles.D’autresrécepteursmembranairespeuventparailleursreconnaîtrelafraction

C3bducomplément,liéeauxbactéries.Ilpeutaussiyavoirunereconnaissancedirectegrâce

auxPRRs20.

S’ensuit alors un recouvrement du corps étranger représenté par la bactérie par deux

pseudopodes composéesd’actineetdemyosinepar stimulationde leurpolymérisation. Il

s’agitdelaphagocytosedetypeIlorsdelaliaisonàdesanticorpsliésauxbactéries.Lorsd’une

interactiondirecteautraversd’unpudeplusieursPRR,oubienvialecomplément,labactérie

aurait tendance à s’infiltrer progressivement au sein du neutrophile. Il s’agit alors de la

phagocytosedetypeII.Enfinunetroisièmesorted’internalisationsembleexisterparémission

d’ununiquepseudopodequienglobel’agentpathogène.Ceciestfonctiondespropriétésde

surfacedelabactérierencontrée.Danstouslescasdefigure,ilyaformationd’unphagosome

àlasuiteduprocessusconduisantàl’internalisation.

1.2.1.1.2 L’environnementoxydatifdesphagosomesUnphagosomenéoforméne possède pas un contenupropice à la destruction desmicro-

organismes initialement. Il doit donc auparavant subir un processus appelé maturation

pendantlequelilyafusionavecd’autresorganitescellulaires.Cecipermetlaconcentration

d’une machinerie enzymatique, au niveau de la membrane ainsi que de la lumière du

phagosome,quiestpropiceàl’éliminationdel’agentpathogène.Ceprocessusdematuration

27

estmoinsbienconnupourlesneutrophilesquepourlesmacrophages,carcescellulessont

plusfacilementmanipulablesaulaboratoireetdoncmieuxétudiées.Ilestcependantconnu

que lamaturationduphagosomepermet l’acquisitiondu complexeNicotinamide adénine

dinucléopeptide phosphate hydrogène (NADPH) oxydase et d’ATPases. Le phagosome

acquiert notamment ses capacités bactéricides par fusion avec les différents granules

spécifiques des neutrophiles, qui contiennent différentes protéines et enzymes comme

détailléesplushaut.Cettefusionalieuàlasuitedusignaldéclenchantl’internalisationdes

éléments extracellulaires. On retrouve alors une augmentation du calcium intracellulaire,

libéréparleréticulumendoplasmiqueouprovenantdumilieuextérieur.L’augmentationdu

calciumlibredanslecytosolpermetunefusionvésiculaireséquentielle,étantdonnéquele

seuilvariepourchacundesquatretypesdegranules.Ainsi,lesvésiculessécrétoirespossédant

leseuildéclencheurleplusbassontlespremiersàêtrelibérésdanslephagosome,tandisque

selon le même principe, les granules azurophiles sont les derniers. Il semblerait qu’un

isoforme de la synaptotagmine soit impliqué dans cette réponse différentielle selon les

vésicules21.Lesvariationsdelaconcentrationcalciquedanslecytosolinfluentégalementsur

lestramesd’actine.Lesprotéineskinasesjouentvraisemblablementlerôled’uneancremal

connudanslafusiondesdifférentesvacuoles,enplusdeprobablesautresmécanismesencore

inconnus.

Les granules secondaires sont considérés comme ceux amenant l’essentiel des complexes

NADPH-oxidaseprésentsdanslephagosomesuiteàl’activationduneutrophile.Cecomplexe

enzymatiqueestforméenpartiepardesstructuresinitialementprésentessurlamembrane

cellulaire et qui sont assimilés à des structures contenues dans des compartiments

intracellulaires.Cecomplexehétéromériquepermetletransfertd’unélectronprovenantde

laNADPHversunemoléculed’O2donnantnaissanceàunanionsuperoxyde,quiestparla

suiteutilisédanslaformationdesdifférentsradicauxlibresoxygénés.

Lorsqu’ilssontstimulés,lesneutrophilessontdonccapablesdeproduiredesionssuperoxydes

(O2-) par consommation d’oxygène au sein des phagosomes. Il s’agit du processus appelé

explosionrespiratoireou«burstoxydatif»,médiéparlecomplexeNADPH-oxydasecatalyseur

delaréaction:NADPH+2O2->NADP++2O2-+H+.Cetteréactionjoueunrôleprépondérant

dans la réponse immunitaire assuréepar les neutrophiles, comme lemontre la sensibilité

accruedes individusatteintsde lamaladiegranulomateusechronique.Cespersonnessont

porteusesd’unemutationgénétiqueàl’origined’uneinactivationdelaNADPHoxydase22.

28

Ils’agitlàducomplexeenzymatiqueàl’originedetouteslesréactionsd’oxydo-réductionqui

ontlieuàl’intérieurduphagosome.L’essentieldelaproductiond’ionssuperoxydeetH2O2

danslesneutrophilesalieuàl’intérieurdesphagosomes.Laproductionàl’extérieurdeces

organitespourraitêtreimpliquéedanslatransmissiondemessagescellulaires,commeceux

quisontobservésdansd’autrescellulesavecdesmoléculesdelafamilledesNOXàlaquelle

appartientaussilaNADPHoxydase23.Celle-ciestpolariséedanslamembraneduphagosome

etpermetlalibérationdesuperoxydeàl’intérieurdel’organite,tandisquelaconsommation

deNADPHsefaitdanslecytosolduneutrophile.Lavoiedeshexosesmonophosphatespermet

decourt-circuiterlavoieglucidiqueetainsideformerànouveauduNADPHessentielpourle

maintiendelaproductiondesuperoxyde.

Figure5:ActivationetassemblagedelaNADPHoxydase

24

Le différentiel de charges créé par la formation d’ions superoxyde est compensé par le

transport de protons à l’intérieur du phagosome via des canaux voltage-dépendants. Les

protonsréagissentalorsaveclesionssuperoxydelorsdelaréactiondedismutation:2O2-+2

H+->O2+2H2O2.

D’autresthéoriesproposentuneentréedepotassiumdanslephagosomepourlemaintiende

l’électroneutralité,cequifaciliteraitparailleurslasolubilisationd’autresgranules25.

Dans les conditions à l’intérieur du phagosome, il est reconnu que les ions superoxyde

donnentnaissanceàduperoxyded’hydrogènelequeldonneessentiellementduHOCletdes

chloraminesgrâceàl’activitédelaMPOetmalgréunegrandevariétéderéactionschimiques

superoxide generation is also seen with stimuli that do notinduce phagosomal formation (121), and as reviewed by By-lund et al. (33), likely sites include vesicles or endosomes. Thenonphagosomal intracellular oxidase activity is apparentlynot involved in antimicrobial activity and it is possible that, asin other cell types, it has a signaling role that contributes to theinflammatory response (24, 33).

Enzymology, directionality, and electrogeniceffect of NADPH oxidase

A key feature of the NOXs is that the reaction they catalyzeis directional across the membrane (111, 119). The complex isoriented such that NADPH is consumed in the cytosol and theelectrons are transferred to FAD, then sequentially via the twohemes to oxygen (Fig. 2). As the external surface becomesinternalized during particle ingestion, superoxide is releasedinto the phagosome.

The Km for oxygen is only *10 lM, which enables the ox-idase to function at the low oxygen tensions present in tissue(67). At maximum capacity the isolated enzyme can transfer*160 electrons/(heme$s- 1) (111). It can be calculated that thefully activated oxidase would consume the basal concentra-tion of NADPH in the neutrophil (*50 lM) in less than asecond (45). Thus, NADPHmust be regenerated continuouslyfrom NADP + to maintain the oxidative burst. This occurs viathe hexose monophosphate shunt pathway (26, 214), withglycogen breakdown providing most of the glucose required(181). Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) is the firstenzyme in the hexose monophosphate shunt. G6PD defi-

ciency affects millions of the world’s population and occurswith differing severity depending on the specific mutation inthe protein (35). Although neutrophil function is in most casesunaffected, the most severe cases (with < 1% normal G6PDactivity) have CGD-like symptoms due to the inability of theirneutrophils to mount an effective oxidative burst (15, 72).

Because it is directional, the oxidase is electrogenic andtransfers electrons out of the cytoplasm into the phagosome(or surroundings if it is on the external surface). This creates acharge imbalance that needs to be counteracted to preventdepolarization of the membrane and shutdown of the oxi-dase. Charge compensation is provided primarily by hydro-gen ions transported by voltage-gated proton channels (44,47). The VSOP/HV1 channel appears to be primarily re-sponsible (55, 148, 155). With the balancing flow of protons,the negative charge in the phagosome is dissipated by su-peroxide dismutation (Reaction 2) and cytoplasmic acidifica-tion due to NADPH oxidation is overcome.

2O!"2 þ 2Hþ/O2 þH2O2 (2)

The neutrophil NADPH oxidase is viewed predominantlyas a source of toxic oxidants. However, an alternative functionhas been proposed (156, 157, 169) in which some of the neg-ative charge is counterbalanced by transport of potassiumions into the phagosome thus increasing the ionic strengthand aiding solubilization of antimicrobial granule proteins.While the proposed potassium transport mechanism has beendiscounted (59, 129, 133), other consequences of the electro-genic effect are theoretically possible (152). For example, there

FIG. 2. Activation and assembly of NOX2 on the phagosomal membrane. In the resting neutrophil, flavocytochrome b558,consisting of gp91phox and p22 phox, resides in the plasma and specific granule (sg) membranes. A complex of p47phox,p67phox, and p40 phox, and Rac2 (a member of the Rho family of small GTPases) in its GDP state associated with a Rho-dissociation inhibitor (GDI) are present in the cytoplasm. Ingestion of a particle (not shown) creates a phagosome (pink)formed by fusion of plasma and granule membranes and stimulates the cell to phosphorylate p47 on multiple Ser residues.This results in translocation of the p47/p67/p40 complex that binds to the gp91/p22 complex in the membrane. Rac2undergoes GDP-GTP exchange and also translocates in its prenylated form. The assembled oxidase complex is then activatedto oxidize cytoplasmic NADPH and shuttles electrons through FAD and the two stacked heme groups to molecular oxygen inthe lumen of the phagosome. Not shown is the concomitant activation of proton channels to transfer hydrogen ions into thephagosome and maintain charge balance. For more detail see Leto et al. and Nauseef (119, 135). (To see this illustration incolor, the reader is referred to the web version of this article at www.liebertpub.com/ars.)

REDOX REACTIONS IN NEUTROPHIL PHAGOSOME 3

29

possibles en théorie. Alors que l’essentiel de l’activité est couramment associé aux ions

superoxyde,celan’estpasréellementobservédanslesconditionsaqueusesdelacellule,dans

laquelleiln’estpasunfortoxydantniunfortnucléophile.Ainsisonactivitéconsiste-elleen

unréducteurfaible,unebasefortedeBronstedetunligandpourlescomplexesmétalliques.

C’estcelaquiluiconfèreuneréactivitéélevéepourlaMPOàl’originedeladismutationdu

superoxyde,libérantdupéroxyded’hydrogène.Laréactiondedismutationpeutégalement

avoir lieu spontanément. H2O2 est une molécule bactéricide efficace. Cependant, la

concentration dans le phagosome réduit cette activité, compte tenu d’une énergie

d’activationélevéepourpouvoiroxyderd’autresmolécules26.Ainsileperoxyded’hydrogène

élimine les bactéries surtout en agissant rapidement au niveau des déshydratases

bactériennes.Dans le phagosomeH2O2 réagi plus largement avec laMPOpar affinité aux

protéines héminiques. Les caractéristiques et réactions catalysées par la MPO seront

développéesdansunepartieultérieure,maisilsembleraitquedanslephagosome,laMPO

réagitavecleperoxyded’hydrogèneformantuncationradicalaire(appeléComposéI)capable

d’oxyderdifférentsélémentsàhauteurde1ou2électrons.Comptetenudesconcentrations

desdifférentscomposésdanslephagosomependantl’explosionrespiratoire,lesionschlorure

semblentêtreleprincipalsubstratdelaMPOavecH2O2.LaforteconcentrationdeMPOdans

lephagosomepermetderéagir rapidementavecH2O2,cequiévitesaconcentrationetsa

diffusionàl’extérieurduphagosomequipourraitêtredélétèrepourleneutrophile.

L’influxdeprotonsetd’ionschlorurepermetdonclaformationdeHOCl.Celui-ciseraitdirigé

versl’agentpathogènephagocytéafindel’éliminer.Desétudesontmontréquelesprotéines

du phagosome seraient également oxydées (sur les résidus méthionine et cystéine).

Aujourd’hui,malgré lapreuvequelesphagosomesdesneutrophilesproduisentduHOCl, il

n’est pas complètement déterminé si ces derniers sont entièrement responsables de la

destructiondesbactériesoubiens’ilyaformationdechloraminesàpartirdesprotéinesdu

phagosome,quiontelles-mêmesuneactivitébactéricide.

Ilrestetoutdemêmeétabliquel’acidehypochloreuxestproduitauseindesphagosomeset

qu’il permet l’élimination des bactéries, de façon directe ou indirecte. L’examen des

personnesatteintesd’undéficitdeNOX2oubiendelaMPOmontrequel’activitéoxydasique

auseindesphagosomesreprésenteunepremièredéfenserapideetimportante,coupléeà

d’autresmécanismesagissantàpluslongstermes.Eneffet,alorsquelessujetssouffrantd’un

défautdelaMPOsemblentplusrésistantsqueceuxsoufrantdeCGD, lespremiersrestent

30

tout de même largement sensibles à de fortes expositions à des bactéries pathogènes,

notamment lorsqueplusieursbactériessont impliquées27.L’activitéoxydasiquedureraiten

moyenneplusieursminutesaprès la formationduphagosome, tandisque lemécanismeà

l’originedesoninterruptionresteencoremalcompris24.

La bactéricidie non oxydative : le rôle des granules spécialisés Commedécritprécédemment,lesneutrophilessecaractérisentnotammentparunéventail

de granules dont le contenu est riche en molécules propices à l’élimination des agents

pathogènes. Il est soutenu que les neutrophiles expulsent rarement leur contenu

intracytoplasmique, et que l’équipement enzymatique est plutôt déversé au sein du

phagosome.Danslesdifférentesvésicules,onretrouvedescathepsines,desdéfensines,dela

lactoferrineetdu lysozymeparmid’autresmoléculesàpouvoirantimicrobien13.Cecivient

compléterlaproductionderadicauxoxydatifsprésentéedansleparagrapheprécédent.Ceci

explique que des individus ayant de déficiences des enzymes oxydatives ne sont pas

entièrementimmunodéprimésparlaprésencedecesmoléculeségalementbactéricides.Ils

restentcependantplusauxagentsinfectieux.

Nétose Au-delà de leur capacité à éliminer les agents pathogènes en les phagocytant ou bien en

libérantlecontenuenzymatiquedecertainesvésiculesdanslemilieuextérieuràleurcontact,

lesneutrophilespossèdentégalementuneautrepropriétépourl’éliminationextracellulaire

desagentspathogènes:lanétose,labactéricidieextracellulairedoitêtrecontrôléeafinde

minimiseraumaximuml’atteintedestissusenvironnants.Suiteàl’activationdesneutrophiles

par la présence de bactéries ou de chimiokines, il est possible d’observer l’émission d’un

réseaudefibrescapablesdelierdesbactériesquelquesoitleurtype.Ils’agitd’unprocessus

rapidequiapparaîtenunedizainedeminutes.Ceréseauestcomposéd’ADN,d’histonesainsi

que d’enzymes contenues dans certaines vacuoles des neutrophiles parmi lesquelles des

enzymescontenuesdanslesgranulesprimaires(élastases,cathepsinesGetMPO)ainsique

des protéines des granules secondaires et tertiaires (lactoferrine et gélatinase) 28. Suite à

l’inefficacitédesNETenprésenced’ADNase,ilaétédéduitqu’ils’agitd’unestructurefaite

principalementdechromatineetd’histones.Sasécrétionpar lesneutrophilesactivésreste

encoreincomprise.Eneffetils’agitd’unprocessusplusrapidequel’apparitiondel’apoptose

31

suiteà l’émissiondesignauxadaptés. Ilsepourraitcependantquecelasoitunévènement

précocedansl’évolutionapoptiquedelacellule.Ilsembleraitquedesneutrophilesayantémis

desNETspuissentcontinueràmigrerenréponseàungradientchimiotactique.Ilesttoutde

mêmeadmisquecesstructuresextracellullairespermettentuneconcentrationdesagents

pathogèneset leurdestruction,ainsiquel’inactivationdeleursfacteursdevirulencegrâce

notammentàl’élastaseetauxhistones.Desétudesontpumettreenévidenceavecclartéles

propriétés antimicrobiennes des histones même à des concentrations faibles29. Ceci est

efficacefaceàunegrandevariétédepathogènes.Eneffetlemaillagedensedechromatine

permetlaconcentrationdesagentspathogènesaucontactdesmoléculesdedéfenseetdes

agents chimiotactiques. Cela permet non seulement une réelle efficacité de la lutte

antimicrobiennemaisaussiunmoindreeffetsurlestissussituésautour.

Malgrélacapacitédeprotectionvis-à-visdespathogènesconféréeparlaformationdesNETs,

ilrestecependantplusieursquestionsconcernantleurmiseenplace.Ilestdifficiledeconcilier

lamigrationdesneutrophilesactivésaveclaformationd’unréseaudecapturedesbactéries,

ainsiquelerelaisamplificateurpourl’attractiond’autrescelluleseffectricesdel’immunité.Il

resteaussiàcomprendrecommentceréseaudensedechromatineestdéfaitunefoisque

l’infectionestcontrôlée30.

Recrutement cellulaire Lesneutrophilesjouentunrôleimportantauseindusiteinflammatoirepourlerecrutement

etl’activationd’autrescellulescommelesmacrophages.Lesneutrophilesactivéssont

capablesdelibérerunegrandequantitédechimiokines,quisontelles-mêmescapables

d’attiresdesmacrophages,aussibienquedesmonocytesetdescellulesdendritiques.En

effetdesneutrophilesactivésvontlibérerdanslemilieuextracellulaireMIP-1b(Macrophage

InflammatoryProtein)etMIP-1a.Cesmoléculespluripotentessontcapablesd’activerdes

macrophagesetdesmonocytes,aussibienquedescellulesdendritiquesimmaturesetdes

cellulesNK(NaturalKiller).TNF-a,IL-8etIL-17seraientaussilibérésparlesneutrophileset

influeraientsurl’activationdesmacrophagesetdescellulesdendritiques,aussibienquesur

lamaturationdesmacrophagesversunprofilantioupro-inflammatoire.Enfinles

macrophageslibèrentdesMMRs(MacrophageMannoseReceptors)capablesd’interagir

aveclaMPOproduiteparlesneutrophiles,cequistimuleégalementlalibérationde

cytokinespro-inflammatoires31.

32

Parailleurs,lesneutrophilesvontlibérerdesmoléculesquivontpromouvoirleurpropre

recrutementdanslesiteinflammatoire.Ceciestpermisparlalibérationd’IL-17déjàcitée

précédemmentquiagitindirectementenstimulantlaproductionduG-CSFquistimulela

productiondeneutrophiles.D’autrepart,lalibérationd’IL-8etdeGROα(Growth-related

geneproduct-a)créeungradientchimioattractantpourd’autresneutrophiles32.Ilconvient

enfinderappelerqu’enagissantsurlesmacrophages,ilyalibérationparcesderniersde

moléculesquivontégalementstimulerlamigrationdesneutrophilesverslesite

inflammatoireainsiqueprolongerlasurviedesneutrophilesprésents31.

Lelienentrecellulesdendritiquesetneutrophilesadéjàétélargementétudiéafindemontrer

que la réponse immunitaire Th1 est dépendante de l’activation des neutrophiles au site

inflammatoire 33.Eneffet lorsd’activationdesneutrophiles,plusieursmolécules sécrétées

danslemilieuontlepouvoirdedéclencherlamaturationdescellulesdendritiquesimmatures

etainsiconduireàl’apparitiondesversantsaussibieninnéqu’adaptatifdelaréponse31.

Figure6:interactiondesneutrophilesaveclesmacrophages(d’aprèsKumar

31)

immunity [100]. α-Defensins, human neutrophil peptide-1 and -2(HNP-1 and -2) secreted by human neutrophils exhibit chemotacticproperties for T cells and immature DCs only [101].

LL-37, a cathelicidins in humans and mouse cathelin-relatedantimicrobial peptide (mCRAMP) in mouse, encourage both activa-tion as well as differentiation of monocyte-derived DCs [102–104].Cathelicidin-mediated differentiation of monocytes into DCsinvolves the activation of mitogen-activated protein kinase(MAPK) pathway in vitro [102,105]. Cathelicidins in the presenceof self DNA potentially activate plasmacytoid DCs, increase theexpression of co-stimulatory molecules, type-1 interferon synthesisand exacerbate autoimmune diseases like psoriasis by stimulating

TLR-9 [106]. However, a recent study has shown that cathelicidinshave the potential to block DC TLR-4 activation and may inhibitallergic contact dermatitis [107]. Based on these observations, itremains to elucidate the exact role of cathelicidins in DC stimulationand maturation. Lactoferrin at higher concentrations (10–100 μg/ml) effectively stimulates monocyte-derived DCs and peripheralblood DCs [108,109]. This action of lactoferrin on DCs can stimulateadaptive immune response and may be responsible for the anti-tumor effect of lactoferrin [110–112]. The stimulatory effect oflactoferrin on DCs may be TLR-4-dependent as their activation isinhibited when TLR-4 is absent (i.e. DCs from C3H/HeJ mice) or isblocked by anti-TLR-4 antibodies [113]. HMG-B1is another alarmin

Infection or

Inflammation

Increase in neutrophil survival

through G-CSF1-

PIM α and MIP-

β

Macrophages, NK Cells and

immature DCs activation

IL-17 Increased Neutrophil Survival

MPO Blockade

TNF-α IL-8 IFN-

MMR Interaction

Macrophage Activation

PMN

Activation

Release of ROS (i.e. O2., H2O2), and TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 and

GM-CSF

Macrophages attraction at the site of infection or inflammation

Activation andrecruitment ofMacrophages

Increased neutrophil survival through G-CSF

Fig. 1. Activation and interaction of neutrophils with macrophages at the site of infection or inflammation. MIP-1α and MIP-1β activate monocytes, macrophages, NK cells andimmature DCs. IFN-γ released from neutrophils also causes activation of macrophages. MPO released from neutrophils binds to MMR expressed on macrophages leads to activationof pro-inflammatory function of macrophages, which in turn increases neutrophil survival. IL-17 released by neutrophils increases their survival through G-CSF (for details see text).

1328 V. Kumar, A. Sharma / International Immunopharmacology 10 (2010) 1325–1334

33

1.2.2 Immunitéadaptative:présentationd’antigènesparlesPNN

Lesneutrophilesjoueraientégalementunrôledirectdanslaréponseimmunitaireadaptative

parlalibérationdirectedemoléculesagissantsurlapopulationdelymphocytesainsiquepar

un rôle de cellule présentatrice d’antigènes au sein de lamoelle osseuse. En effet, après

injectiondevirusmodifiéAnkara, il aétémontréquedesneutrophilesont la capacitéde

migreràpartirdusitecutanéd’injectionverslamoelleosseuseoùilsinteragissentavecdes

cellulesmyéloïdesrésidentes.Cerôleestdeplusrenforcéeparlalocalisationdeneutrophiles

auseindesnœudslymphatiques8.

1.2.3 ApoptoseetsurviedesPNNlorsd’infection

Dansdesconditionsnormales,laduréedeviedesgranulocytescirculantestcourte,entre24

et48heures,cequifaitquelepoolsanguinestrenouveléentièrementenmoyenne2foispar

jourchezl’homme.L’apoptosedesneutrophiles lesrendinsensiblesauxstimuliextérieurs,

avecpourconséquence,l’expressiondesignaux«eat-me»àl’originedelareconnaissance

decescellulesparlesmacrophagescirculantsetleuréliminationdanslarate,lamoelle,ainsi

queparlescellulesdeKüppferdanslefoie.Cependantlorsd’inflammationetdemigration

transendothélialedesneutrophilesauseindestissus,ilestessentielqueceux-cirestentactifs

jusqu’à l’éliminationdesagentspathogènes.Cen’estqu’aprèscetteétapeque lescellules

immunitairespeuventsubir l’apoptose, lanécroseoubien laNETose(libérationdesNETs).

L’apoptoseneutrophiliquejoueunrôlemajeurdansleprocessusderégulationetdefinde

l’inflammationgrâceàlacapacitédecescellulesdeséquestrerdescytokinesinflammatoires

enplusdedevenirprogressivementinsensiblesauxstimuliavecarrêtdelaproductionetde

lalibérationdemoléculespro-inflammatoires.L’activitédesmacrophagesphagocytairesest

également influencée avec une polarisation vers le phénotype M2 dont la principale

caractéristiqueestdepromouvoir larésolutiondesprocessus inflammatoires.Cesderniers

libèrent des cytokines telles que l’IL-10 et le TGF-b, qui interviennent également dans le

processusderéparationdestissuslésés.

Lorsd’unretarddansledéclenchementded’apoptosedescellulesinflammatoires,oud’un

défautdephagocytosedesmacrophages,lesneutrophilespeuventpersisterauseindumilieu

34

inflammatoire et être à l’origine d’une réponse exacerbée avec production prolongée de

cytokinespro-inflammatoiresetàtermeuneatteintedestissusdel’hôte.

Lalutteefficacecontrelesagentspathogènesrésultedoncd’unéquilibreentreuneapoptose

tropprécocepouvantconduireàundéfautd’immunitédel’hôteàl’origined’uneinfection

chroniqueetsévèrepour l’organisme,ouà l’inverse,d’uneapoptosetroptardivequipeut

êtredirectementnuisiblepour l’organisme.C’est lecasdansdesmaladieshumainestelles

que le syndrome de détresse respiratoire aigüe, l’arthrite rhumatoïde, le sepsis parmi

d’autres.

On retrouve cettemêmeanalogie de l’équilibre au niveau cellulaire. Il existe un équilibre

constant entre les signaux apoptiques et les signaux de survie des neutrophiles. Lors de

l’absencedesignauxextérieurs,lesneutrophilessubissentuneapoptosediteconstitutive,par

défaut.Cependant,danslamajoritédescas,cescellulesreçoiventunensembledesignaux

antagonistesquilesmaintientvivantsetactifs34.

OnretrouveparmilessignauxdesurvieleGM-CSF,leleucotrièneB4,leC5a,laprotéineC-

Réactivedelaphaseaigüe, leLPSbactérienainsiquel’ADNbactérien.Cesontdessignaux

agissantsurdifférentescascadesdephosphorylationàl’originedelasurviedesPNN.

On retrouve également les b2 intégrines dans la régulation du temps de survie des

neutrophilesenplusdu rôle fondamentald’adhésionetdemigrationbienétabli,qui sont

essentielspourl’immunitédel’hôte.OnretrouvelamoléculeMac-1appartenantàlafamille

desb2-intégrinesavecunrôledans la liaisonaufibrinogène, lescomplexes immuns,et les

plaquettes.Ils’agit,aumêmetitrequeCD11c/CD18,derécepteursspécifiquesaupartiesC3ib

ducomplémentcapablesderégulerlaphagocytosedesbactériesopsoniséestoutenétant

capables de reconnaitre directement des fragments de ces agents pathogènes. Différents

ligandsdurécepteurMac-1aurontdeseffetssurlasurviedesneutrophiles.

35

Tableau2:LigandsdeMac-1etleurseffetssurl'apoptosedesneutrophiles(d'aprèsKebiretFilep34).

Ligand Action Rôlesurl’apoptose

ICAM-1 AdhésionetmigrationPNN Supprimeapoptose

Fibrinogène Précurseurdefibrine,initie

coagulation

Supprimeapoptose

Plasminogène Précurseurdeplasmine,

initiefibrinolyse

Supprimeapoptose

Angiostatine Inhibeangiogenèse

Pasd’effet

MPO Lysebactérienne,stimule

expressionMac-1et

libérationMPO

Supprimeapoptose

Héparine

Immobile

Soluble

Soluble,BPM

Anticoagulant

Int.adhésiondesleucocytes

Inhibeliaisonfibrinogène

Provoqueapoptose

Inconnu

Pasd’effet

Bactérieopsonisée Phagocytosedesbactéries Provoqueapoptose

1.2.4 Propriétésanti-tumorales

Desexpérienceschezl’animalontpermisd’étudierleprofildeneutrophilesetleurinfluence

sur lemilieu favorisant d’apparition d’une tumeur. En effet, des études indiquent que la

présencedeneutrophilesengrandequantitésigneraitunmoinsbonpronosticavecunprofil

pro-tumorigène. Il est également admis l’existencedeneutrophilesdont leprofil est anti-

tumorigène.

Eneffet,denombreusestumeurslibèrentdesmoléculesquivontattirerlesneutrophilesdans

lemilieutumoral,tellesqueCXCL6,CXCL8etCCL3.Unefoissurplace,cesneutrophilesdit

36

associés aux tumeurs (TAN, Tumor Associated Neutrophils) seront activés à leur contact,

augmentant ainsi le signal de recrutement. Les neutrophiles activés produisent alors des

moléculesquivontfaciliter ledéveloppementtumoraldontlesmetalloprotéasesMMP8et

MMP9, ainsi que des molécules stimulant l’angiogenèse telles que VEGF. De plus, en

désorganisant la lame basale de la matrice extracellulaire, les neutrophiles favorisent le

passagedescellulestumoralesdanslacirculationsanguineetainsil’apparitiondemétastases.

Les TAN vont également avoir un effet immunosuppresseur sur les cellules T CD8+ qui

possèdentuneactioncytolytiquesurlescellulestumorales.

Parailleurs, lesTANpeuventégalementexerceruneactionanti-tumorale localementdans

certainscancers.EneffetlaproductionlocaledeROSpermetuneactionlytiquedirectesur

lescellulestumorales,tandisquelalibérationd’unligandFASinduiraitl’apoptosedecellules

tumorales.Deplus,lalibérationdecytokinespro-inflammatoiresengendreunestimulation

decellulesTCD8+anti-tumorales.Enfin,plusieurstechniquesthérapeutiquessebasentsurla

production d’anticorps reconnaissant les cellules tumorales, afin de stimuler l’activité

phagocytairedesneutrophilespourlescellulestumorales.

Ainsi,parrapprochementaveccequiadéjàétédécritpourlesmacrophages,certainsauteurs

tendentàdifférenciercesdeuxprofilsdeTANsenN1pourlescellulesàprofilanti-tumoralet

N2pourcellesfavorisantledéveloppementtumoral7.

1.3 Spécificitésrelativesàl’espècebovine

Laproductiondesneutrophilesdansl’espècebovineestsemblableàcelledécriteauparavant

pourl’homme,avecuneduréemoyennede6jours.Cependant,danscetteespèce,ilssont

retenusunjoursupplémentairedanslamoelleavantderejoindrelacirculationsanguine.Ceci

estvalablemêmelorsd’inflammationaigüeetcomparativement,laréservedeneutrophiles

danslamoelleosseuseestinférieureàcellesdesautresespèces.Celaexpliqueenpartiela

raison pour laquelle une neutropénie est souvent observée lors des phases précoces de

l’inflammationàréponsegranulopoïétique35.Ceciestparlasuitecompenséparlastimulation

delagranulopoïèseetledécalageàgauchedelacourbed’Arneth,quitraduitlaproduction

de jeunes neutrophiles. D’autre part les bovins possèdent un troisième type de granules

37

neutrophiliques,plusamplesque lesgranulesprimaireset secondaires.Ce typeoccupe la

moitié du cytoplasme des neutrophiles de cette espèce. Des études cytochimiques et

immunocytochimiques ont permis de montrer l’absence de lysozyme à l’intérieur des

neutrophilesbovinsalorsqu’ils’agitd’unemoléculetrèsprésentedansd’autresespèces35.

L’absence de neutrophilie au cours des 3 à 5 premiers jours d’une inflammation rend la

distinctionentreuneinflammationchroniqueetuneréponserécente,difficileensebasant

surleseulleucogramme.Ainsi,est-ilplusaiséderechercheruneproductionenexcèsd’une

protéinedephaseaiguëcommelefibrinogèneoul’haptoglobine,afindedistinguerlesdeux

situations.Lorsd’inflammationaigüemarquée,onobserveuneneutrophiliemodéréesuiteà

lastimulationdelagranulopoïèse.Cependant,lorsd’inflammationchronique,onobserveune

concentrationnormaleoubienunelégèreneutropénielorsqu’ilyaunefortemobilisationde

neutrophiles.

Plusieurscausespeuventêtreàl’origined’uneneutrophilieavecenpremierlieulesinfections

d’originesbactériennes,viralesetfongiques.Cetteaugmentationestégalementobservéelors

d’affectionsdigestivescommeundéplacementdelacaillette,unprocessusnéoplasique,une

anémieimmuno-médiée,unetoxicose,unsyndromededétresserespiratoireaigüedueàune

hypersensibilitéainsiquesuiteàl’administrationdesomatotropine.

1.3.1 Lesmédiateursdel’inflammationchezl’espècebovineAinsiquedansd’autresespèces,lesneutrophilessontattiréspardeschimioattractantslibérés

lors d’une infection, parmi lesquels on retrouve essentiellement des chimiokines comme

CXCL8,lesleucotriènesLTB4etlesPAFs.CXCL8etLTB4sontnonseulementresponsablesde

l’attractiondesneutrophiles,maisaussidel’amplificationdelaréponseinflammatoirevuque

cesdernierssonteux-mêmescapablesd’ensynthétiseraprèsactivation.CXCL8anotamment

étéétudiéavecprécision,cequiapermisdedéterminerqu’ils’agitd’unemoléculelargement

expriméeparlesneutrophilesainsiquepardesmacrophagesdanslestissusenflammés.In

vitrolesneutrophilesactivésvontlibérercettemoléculeaprèsavoirsubiladiapédèseetle

chimiotactisme.CXCL8estdonclibéréepardesneutrophilespermettantuneamplification

de la réponse inflammatoire et également l’activation de la réponse oxydative des

neutrophiles36,37.

Les PAF sont des molécules dérivées de phospholipides produites par différents types

38

cellulaires. Elles sont capables d’attirer les polynucléaires neutrophiles et de les activer,

provoquantlalibérationdeROSainsiqueladégranulation.Cesontégalementdesmolécules

capables d’agir sur les neutrophiles qui peuvent eux même en libérer dans les tissus,

provoquantainsiuneamplificationdelaréponseinitiale38,39.

C5a est un des fragments du complément rapidement libéré lors d’inflammation. Il agit

égalementsur lesneutrophilesbovinsviaunrécepteurmembranaire(C5R)à l’origined’un

influx de calcium stimulant le chimiotactisme de ces cellules ainsi que leur activité

phagocytaireetlesdéfensesoxydatives,enplusderetarderl’apoptose.Aterme,cettevoie

designalisationpermetenpluslasynthèseetlalibérationdeCXCL8parlesneutrophiles.C5a

provoqueégalementl’apparitiondeCD14àlamembranedesneutrophiles.Ils’agitd’undes

corécepteur de TLR4, qui est stocké dans des vésicules intracellulaires40. Des études ont

également montré que la cytokine TNF-a possède une action similaire avec la capacité

d’activerlesneutrophilesetpromouvoirlaphagocytoseetl’explosionrespiratoire41.

Comme pour d’autres espèces, les neutrophiles bovins peuvent également détecter

directementlesagentspathogènesenreconnaissantdesfractionstrèsconservéessurleurs

membranes. Lors d’exposition à un agent pathogène, les neutrophiles expriment des

cytokinespro-inflammatoirestellesIL-1,TNF-α,etCXCL8,parmid’autres.Lareconnaissance

desMAMPSparlesPRRestmoinsbienconnuechezl’espècebovinequechezl’hommeoula

souriscommenousl’avonsdécritauparavant.AinsiConejerosetal42ontpudémontrerque4

PAMPsétudiésontproduitunchangementdelatailleetdelaformedesneutrophilesenplus

destimuler lespropriétésdephagocytose.Malgréuneréponsedifférentielleselon lesLPS

rencontrés, l’expressionensurfacedeTLR2etdeTLR4aétédémontréeparcytométriede

fluxainsiquel’augmentationdel’expressiondeTLR4membranaireaprèscetteexposition,qui

provoquelalibérationdeCXCL8danslemilieu43.IlexisteégalementdesPRRcytoplasmiques

NOD 1 et NOD 2 (Nucleotide bindingOligomerizing Domain) capables de reconnaitre des

composésbactériensetd’activerlatranscriptiondufacteurNF-kB(chezl’hommeseulNOD2

est présent). Il s’agit d’une voie importante chez les bovins, conduisant à lamigration et

probablementaurôleprotecteurdesneutrophiles.Cependantilnes’agitpasdel’uniquevoie

d’activationdeNF-kB43,44.

Delamêmefaçonquecelledécriteauparavant,lerôledesmoléculesd’adhésionlorsdela

réponse inflammatoireest reconnue,avecnotammentuneexpressionaugmentéedesb2-

39

intégrines sur les endothelia 45. Le syndrome de déficience d’adhésion leucocytaire a par

ailleursétélargementétudiédanscetteespèceoùàunemutationsurlegènecodantpourCD

18 a été identifiée. Elle causait undéfaut d’extravasationdes neutrophiles dans les tissus

infectés.Lesanimauxatteintsétaientsujetsàdesneutropéniespersistantesetdesinfections

récurrentesquientrainaientgénéralementlamortprécoce(avantl’âgedesixmois)dessujets

atteints46.

1.3.2 LesmécanismesdedéfensepermisparlesneutrophileschezlesbovinsOnretrouvechezlesbovinstroistypesdegranulescontenantdesmoléculesimpliquéesdans

lesdéfensesanti-bactériennes.Lesgranulestertiairessontlesplustardifsdansleurapparition

et sont les plus nombreux dans cette espèce 47. On retrouve également des vésicules

contenantdesprotéinesmembranairesainsiquelaphosphatasealcaline.Larépartitiondans

différents organites permet également la séparation de composés capables de s’activer

réciproquement et permettant une réponse contrôlée fidèle aux signaux reçus. Ainsi les

protéases sont généralement les derniers composés libérés lors de l’activation des

neutrophiles,laissantsupposerqu’ils’agitd’uneréponsededernièreligne,étantdonnéson

potentielnocifenverslestissusdel’hôte.Encomparaisonaveclesneutrophileshumains,on

trouvechezlesbovinsuneactivitéantimicrobienneaccrueavecdesquantitésplusmarquées

delactoferrine,deprotéineB12,dephosphatasesalcalinesetacides,ainsiquedeglutathion

peroxydaseetoxydase.Encontrepartie, lesneutrophilespossèdentmoinsdelysozyme,de

MPO,decatalasedeβ-gluconidaseetdeβ-galactosidase48.

Parmi les peptides antimicrobiens étudiés chez les bovins, il faut noter la présence de

cathélicidines de plusieurs formes (différemment de ce qui est vu chez l’homme) dont la

productionpeutêtrelargementamplifiéelorsd’inflammation.Cesontdesmoléculesstockées

sousformedepro-enzymesdanslesgranuleslargesetactivéesparl’élastasecontenuedans

les granules azurophiles.On retrouve également la présenced’uneuniquedéfensineb et

l’absence de défensine a. Ces molécules possèdent un spectre antibactérien ainsi

qu’antifongiques49,50.

EnplusilexistedesPGRPs(PeptidoglycanRecognitionProteins)quisontégalementprésentes

chezlesbovinsetquisontcapablesdereconnaitredesséquencesconservéeschezdifférentes

bactéries,enexerçantuneactivitéantibactérienneetantifongique51.

40

Defaçonanalogueàcequiaétédécritchezl’hommeetlasouris,laprésencedeNETsasuscité

de nombreuses études dans les derniers quinze ans, et dans l’espèce bovine, le même

mécanismeaétédécrit52,53.

Demanière semblableà cequi est connuchez l’homme, lesneutrophilesbovinsexercent

égalementuneactivitédecontrôledelaréponseinflammatoire,enplusdeleurrôlecentral

dans l’élimination des agents pathogènes. Ces capacités aussi bien pro- qu’anti-

inflammatoiresnesontpastrèsbienélucidéeschezlesbovins.Lesneutrophilessontcapables

d’attirer d’autres cellules inflammatoires en libérant des PAF et du LTB4. La libération de

glycoprotéineacidea1endiminuantlaproductiondeROSetenstimulantlaproductionde

CXCL 8, est également modulateur de la réponse neutrophilique54,55. Les neutrophiles

exercentdeplusuneactivitésurlesautrescellulesimmunitairesdontlesmacrophagesetles

monocytes.Cesdernierssontstimuléslorsdeladégranulationdesneutrophilesbovinsavec

la production de CD31 et CD11a par lesmonocytes.De plus, des expériences in vitro ont

montréquelesmonocytesdeviennentdesmacrophagesavecunprofilM2etunelibération

accrued’IL-10etd’IL-12,etuneplusgrandecapacitédephagocytoseetdeproductiondeROS

auboutde4joursd’incubationenprésencedesproduitsdedégranulationdesneutrophiles56.

Par ailleurs, il semblerait que les neutrophiles sont capables d’intégrer des protéines

membranairesdecellulesmortes,quiconserventleurspropriétésfonctionnelles.Ceciaurait

une influencedirecte sur l’immunité adaptative car lesneutrophiles joueraientun rôlede

cellulesprésentatricesd’antigènes57.

Commedansl’espècehumaine,lesneutrophilesconstituentunpooldecelluleshautement

différenciéesdontletempsdesurvieestcourt.Cependantils’avèrequelorsd’inflammation,

cescellulessontcapablesdesurvivrepluslongtempsdanslestissusenflammés.Cecipermet

uneaugmentationdeleurpotentielantibactérienmaisproduitégalementdesaltérationsdes

tissusdel’hôte.Onobservechezlesbovinsunretarddel’apoptosedesneutrophiles,ainsi

qu’un délai de la phagocytose par les macrophages ; ceci peut avoir des conséquences

importantesquiserontdétailléesplusloin.

41

1.4 Lesmarqueursdel’inflammationchezlesbovinsParmi les différents paramètres hématologiques, le leucogramme est le moyen le plus

appropriépourévalueruneinflammationcomptetenudel’influencedelalignéeblanchelors

d’inflammation. Il permet d’obtenir le nombre de leucocytes totaux, de neutrophiles

segmentésetnonsegmentés,deséosinophiles,desbasophiles(quisonttrèspeunombreux

dansl’espècebovine),desmonocytes,etdeslymphocytes.

Lateneurend'hémoglobineestvariablementaffectéelorsd'inflammation.Lorsd'affection

chronique,uneanémiehypochromemacrocytairepeutêtreobservée.Cependant,enraison

de sa faible sensibilité et de sa faible spécificité, ce paramètre n'est pas utilisé comme

marqueurdel'inflammationchezlesbovins.Ilestaujourd‘huidifficiled’établirdessensibilités

etdesspécificitéspourladétectiond’unprocessusinflammatoirepourunparamètredonné.

Lesétudespermettentcependantdetracerdesgrandeslignesavecdesvaleursseuilschezun

animalsain.

42

1.4.1 Leucogramme

Valeurs usuelles

Onpeutretrouverlesvaleursusuellesdelaformulesanguinedesbovinsdansletableau.

Tableau3:Numérationetformulesanguinechezlebovinadulte58

Variations physiologiques

Ilestimportantdenoterquecesvaleurssontvalableschezl’adulte,alorsquechezlenouveau-

né et le jeune, on observe une variation au cours des premières semaines de vie. A la

naissance, le rapport Neutrophiles : Lymphocytes (N:L) est supérieur à 2:1 voire 3:1 ; il

43

La numération et la formule leucocytaire permettent donc souvent de s’orienter vers un type de maladie en fonction de la quantité et de la répartition des différents leucocytes. Les résultats devront être examinés en parallèle de ceux de la numération érythrocytaire et thrombocytaire, explicités dans les parties précédentes, et rappelés ici. L’ensemble de ces paramètres constitue la numération formule sanguine (tableau 2). Tab 2: Numération formule sanguine normale du bovin adulte.

Numération formule sanguine Formule érythrocytaire

Paramètres Valeurs normales Moyenne

Numération érythrocytaire (x 106 /mm3) 5 - 10 7

Taux d'hémoglobine (g /100

ml) 8 - 15 11

Hématocrite (%) 24 - 46 35 VGM (µm3) 40 - 60 52 TGMH (pg) 11 - 17 14 CCMH (%) 30 - 36 32,7

Numération réticulocytaire 0 0 Diamètre érythrocytaire (µm) 4 - 8 5,8

Formule leucocytaire

Paramètres normaux (nombre/mm3) Ecarts normaux Moyenne

Pourcentage de la population

leucocytaire (%)

Pourcentage moyen

Numération leucocytaire 4000 - 12000 8000 Neutrophiles non segmentés 0 - 120 20 0 - 2 0,5

Neutrophiles segmentés 600 - 4000 2000 15 -45 28 Eosinophiles 0 - 2400 700 0 - 20 9 Basophiles 0 - 200 50 0 - 2 0,5 Monocytes 25 - 840 400 2 - 7 4

Lymphocytes 2500 - 7500 4500 45 - 75 58 Autres

Numération Thrombocytaire 100000 - 800000 500000

C. Les groupes sanguins des bovins et leurs conséquences pratiques

1. Les différents groupes sanguins des bovins

Comme dans les autres espèces de mammifères, les groupes sanguins des bovins sont déterminés par des antigènes portés sur la membrane des hématies. Ces antigènes sont soit de nature glucidique portés par des glycoprotéines ou des glycolipides, soit de nature protéique. Ils sont codés par différents gènes, et variables selon les individus d’une même espèce.

On distingue 11 systèmes de groupes sanguins chez les bovins, représentés par des lettres (A,B,C,F,J,L,M,S,Z,R’,T’) (tableau 3). Ces systèmes sont pour certains codés par un seul gène (un seul locus bi allélique), mais certains sont codés par une combinaison de gènes situés à des loci contigus, et représentent ainsi de véritables systèmes génétiques très polymorphes. Par exemple, jusqu’à 800 combinaisons sont possibles pour le système B [4, 5, 29].

43

s'inverseprogressivementdurantlespremièressemainesdevie,enraisondeladiminution

desneutrophilescirculantsetdel'augmentationsimultanéedunombredelymphocytes.

Uneautrevariationcourammentrencontréeestcelled’unleucogrammeditdestress,comme

conséquencedel’augmentationdelaconcentrationdecortisoletd’adrénaline.Onobserve

uneaugmentationdunombredeneutrophilesetdelymphocytes,quiengénéralnedépasse

pas le double des valeurs usuelles sous l’action de l’adrénaline. Dans le cas d’une

hypercortisolémie,lesvariationssontplusmarquées.Cependantlaneutrophilieobservée,qui

peutdurerjusqu’à72heures,n’estpasaccompagnéed’unedéviationàgauchedelacourbe

d’Arneth,comptetenudel’absencedelibérationdecellulesimmaturesdepuislamoelle.A

cause de la séquestration concomitante des lymphocytes dans les tissus lymphoïdes, on

observeégalementuneaugmentationdurapportN:L.Ceciestobservénotammentlorsde

situationsdestress,d’excitationouaprèsl’exercicephysique.Fréquemmentnotéaumoment

duvêlage,laneutrophilieestsuivied’unediminutionrapidedunombredeneutrophilesdans

les48h,avantderevenirauxvaleursdebaseauboutde4à6jours.Onl’observeégalement

danslecasd’atteintesavecdesréactionsinflammatoireslégères(déplacementdelacaillette,

hypocalcémiepuerpérale,dystociesimple…)59,60.

Onretrouvebienentendudesvariationssemblableslorsdemisesbassanscomplicationsou

bienlorsd’injectiondecorticostéroïdes.

Variations lors d’états inflammatoires Commedécritauparavant,comptetenudelaparticularitédelafaibleréservedeneutrophiles,

on observe chez les bovins une neutropénie accompagnée d’une lymphopénie lors des

premièresheuresdelaréactioninflammatoire.Laséquestrationdesneutrophilesauseindu

site inflammatoire génère cependant desmessagers hormonaux à l’origine d’abord d’une

libérationdupoolderéservesousl’actiondeNRF(NeutrophilReleasingFactor),puisd’une

néo-granulopoïèse libérant des neutrophiles immatures sous l’action de G-CSF. Ainsi un

décalageàgauchedelacourbed’Arnethestgénéralementobservé24à48heuresaprèsla

neutropénieprimaire.

44

Figure7Dynamiquedelaréponseleucocytaireauxinfectionsbactérienneschezlesbovins

35,60

Lesvariationsdeproportionsentre lesdifférents typescellulairespermettentd’orienter le

diagnosticenfonctiondelarépartitionobservée.Sions’intéresseplusparticulièrementaux

neutrophiles,ladiminutiondunombredces–derniersestprésentedanslespremièresheures

de l’inflammation mais également lors de septicémie et d’endotoxémie d’origine gastro-

intestinale.Lorsdescertainesinfectionsviralesetdecanceraffectantlamoelleproductrice

(possiblement accompagnés d’une anémie aplasique), une diminution du nombre de

neutrophilescirculantsestégalementpossible.

Al’inverse,laneutrophilieestprésentelorsd’inflammationsuppuréeetelleestengénéral

plutôtdebonpronosticindiquantl’activationdelaréponseimmunitaire.Ilconvientdenoter

aumêmemomentlaprésencedemonocytescirculants,normalemententrèsfaiblequantité

(entre25et840/mm3),dontlenombrepeutêtreaugmentélorsd’uneinfectionchronique,

oubiendiminuésdefaçontransitoireenréponseàunstresscorticoïde.

Laprésencedeneutrophiles non-segmentés circulants donc immatures enparallèled’une

neutropénie,estlesigned’uneinflammationsévèreleplussouventd’originebactérienne.La

régénérationdupooldeneutrophilescirculantsparlamoelleestinsuffisanteetpermetde

89

Figure 9 : dynamique de la réponse leucocytaire aux infections bactériennes aiguës chez les bovins, d'après [221].

Figure 10 : cinétique de variation précoce des différentes populations leucocytaires saguines lors d'inoculation intrammaire expérimentale d'endotoxine d'E.coli, d'après [127].

STOCK DE NEUTROPHILES IMMATURES ET ADULTES DE LA MOELLE OSSEUSE

(envoie dans le sang un nombre limité de cellules après un délai de quelques heures)

LEUCOCYTES CIRCULANTS

Valeurs moyennes normales 8.000 mm3

Neutrophiles 2.200

Eosinophiles 700

Lymphocytes 4.600

Autres 500

Diapédèse massive au sein du foyer inflammatoire

Désintégration dans la circulation générale

(20 à 50%)

6 à 24 h

Leucopénie

± 2.000

24 h

leucopénie avec

glissement à gauche

3 à 4 jours

leucocytose avec

neutrophilie

Temps en heure

Neu

trop

hile

s sa

ngui

ns

(x10

3 / µl

) N

eutr

ophi

les

de la

moe

lle o

sseu

se

% p

ar ra

ppor

t à h

0 (N

)

Neutrophiles segmentés Neutrophiles non segmentés (B)

Lignées prolifératives (P) Neutrophiles segmentés (M) Pool de réserve (R)

45

répondreauxbesoinsdelaréponseimmunitaire.

1.4.2 LesprotéinesdelaphaseaigüeLadéfinitiondonnéepar laSociétéFrançaisedeBiologieCliniquepour lesprotéinesde la

phase aigüe (PPA) est la suivante : ce sont des protéines plasmatiques dont le taux de

production hépatique est supérieur au taux du catabolisme, au cours de la réaction

inflammatoire,quellequesoitlacausedecettedernière».Enfonctiondel’augmentationou

de la diminution de leur production pendant cette réaction, on parle respectivement de

protéinespositivesounégatives.Différentesétudesontpermisd’isolerchezlesbovinsdes

glycoprotéineshydrosolublesrépondantàcescritères:l’haptoglobine,laSAAetl’alpha1-AGP

plasmatiques.DesvaleursseuilsontétéétabliesdontcellesproposéesparEckersalletal61:

- Haptoglobine(HP):50mg/L

- SérumAmyloïdeA(SAA):9,6mg/L

- a1-glycoprotéine(AGP):0,5mg/L

On peut donc affirmer que lors de différentes affections à l’origine d’un processus

inflammatoire, une augmentation de ces paramètres au-dessus du seuil établi est observée.

Cependant pour chaque paramètre, spécificité et sensibilité varient ce qui peut en partie être

expliqué par leur nature, leurs fonctions et leur métabolisme. La Protéine C-Réactive n’est pas

considérée comme une protéine de l’inflammation aigüe chez les ruminants.

L’Haptoglobine (Hp) L’haptoglobineestunemoléculecomposéededeuxchaînespolypeptidiquesreliéesparun

pontdisulfure.L’haptoglobinealacapacitédefixerl’hémoglobinelibreainsiquesesdérivés

provenantdelalysedesglobulesrougesparapoptoseoulorsd’hémolyse.Lecomplexeformé

(Hb-Hp) est par la suitemétabolisé par lesmacrophages ou dans le foie. Cettemolécule

possèdeégalementdespropriétésanti-oxydantesindirectesparinhibitiondelaproduction

deradicauxlibrespouvantendommagerlestissusendogènes.Elleparticiperaitégalementà

l’angiogenèse, jouant ainsi un rôle direct dans la cicatrisation. Chez les bovins, sa

concentrationaugmented’unfacteurx100lorsdeprocessusinflammatoire,cequienfaitune

des protéinesmajeures de l’inflammation dans cette espèce. Chez des animaux sains, les

concentrationsenhaptoglobinesonttrèsbassesvoirenulles(<0,2mg/mL)alorsquedansdes

46

conditions morbides, notamment lors d’infections bactériennes avec un processus

inflammatoire aigu (métrite, abcès hépatique, …), les concentrations augmentent très

fortement;lamêmeobservationaétéfaitedanslesconditionsd’inflammationprovoquée

expérimentalement62,63.

Plusieurstechniquesdedosagedel’haptoglobineontétédéveloppées,dontdesméthodes

rapides et peu onéreuses pouvant être utilisées en pratique médicale 64. Cependant des

interférences sont possibles notamment lors d’hémolyse marquée avec la formation de

complexesHp-Hb en grande quantité qui vont subir lemétabolisme hépatique à l’origine

d’une concentration circulante plus faible alors qu’un processus inflammatoire évolue en

parallèleprovoquantlahaussedesaconcentration.

Les variations de la concentration de l’haptoglobine semblent très spécifiques (valeur de

spécificité supérieure à 85%et de sensibilité comprise entre (60 et 90%). La haussede la

concentrationestlerésultatdelaproductiond’IL-6etdeTNF-a60,65.

SAA Le terme de Serum Amyloïde A (SAA) regroupe un ensemble d’apolipoprotéines dont la

structureestconservéeauseindedifférentesespècesetdefaiblepoidsmoléculaire.Elleest

liéeauxHDL(HighDensityLipoprotein)defaçonphysiologiqueetsaproductionhépatiqueest

largementamplifiéeparlescytokinesinflammatoires(TNF-a,IL-6,IL-1)lorsd’inflammation.

Saconcentrationpeutsubirunehaussede100à1000foisdansdebrefsdélais66.

Lerôledecesmoléculesn’estpasentièrementélucidémaisilsembleraitqu’elleparticipeàla

régulation du métabolisme des HDL et du cholestérol. Elle jouerait de plus un rôle

chimiotactiquepourlescellulesdel’inflammationenfacilitantl’adhérencedecescellules.

Son dosage se fait principalement par ELISA indirect chez les bovins 60. Lors de processus

inflammatoires,ils’agitdelamoléculeaveclasensibilitélaplusélevée,entre80et100%et

dontlaspécificitévarieentre80et90%.Cecipeutêtredûaufaitquelaseuleinfluencedel’IL-

6suffiraitàaugmenterlesconcentrationsdeSAA65,avecparfoisdesanimauxprésentantune

élévationdutauxdeSAAalorsqueceuxdel’haptoglobinerestentinchangés.Lesvaleurssont

élevéesmêmelorsd’inflammationmodéréeainsiquelorsdestressetautresphénomènes

non inflammatoires. Pour ces raisons, il est donc important de corréler les variations

observéesaveccellesdel’haptoglobineetlecontexteclinique.

47

a1- AGP L’a1-AGPestuneglycoprotéineconstituéed’unechainepolypeptidiquedontlacomposition

enacideaminésestconnuepourl’espècebovine.Safonctionestencoremaldéterminée;elle

joueunrôledansl’hémostaseetlarestaurationdestissusconjonctifsensedéposantsurla

surface des fibres élastiques néoformées, les protégeant ainsi des conditions lytiques du

milieuinflammatoire.Sonrôleprécisn’estpasentièrementcomprismaisellestimuleraitla

croissance des fibroblastes avec également une forte action immuno-modulatrice et anti-

inflammatoire.Cerôleestdémontréinvitro.

Deskitsdedosagepar immunodiffusionradialesontdisponiblesdans lemarché.Lepicde

concentration semble se produire tardivement lors de processus inflammatoire avec des

valeurspeumodifiéesendébutd’inflammation,cequiexpliquedesvaleursdesensibilitétrès

variablesenfonctiondesétudes.

1.4.3 Myélopéroxydase

Structure et localisation Lamyéloperoxydase (MPO) est une enzyme hémique présente en concentrations élevées

danslesgranulesprimairesdesneutrophiles,représentant5%delamasseprotéiquedela

cellule. Chez l’homme, la MPO est présente également mais dans des quantités bien

moindres,dansdespopulationsdemacrophagesrésidentstelleslescellulesdeKüppferdans

lefoieouencorelamicroglie.

C’estuneenzymequiagitensynergieaveclesautresenzymesdel’explosionrespiratoire,la

NADPH-oxydase, et la NOsynthase. Cette action conjointe permet d’éliminer les

microorganismesphagocytés qui sont résistants aux enzymesprotéolytiques. Il existe une

grandesimilitudeducomportementenzymatiquedelaMPOdanslesdifférentesespècesoù

elleaété identifiée,malgréune séquenced’acidesaminésqui varie. Lesdonnées lesplus

maîtriséesconcernentlesenzymeshumainesetéquines.

Lamyéloperoxydaseappartientà la familledesperoxydasesdesmammifères,présenteen

grande quantité dans les granules primaires des neutrophiles, et dans les monocytes en

quantité plus faible. Elle est indétectable avant les dernières étapes de maturation des

macrophages. La synthèse de MPO a lieu dans la moelle osseuse au sein des cellules

48

myéloïdes.LorsdelasynthèsedeMPOhumaine,unpassagedansleréticulumendoplasmique

de la séquence immature permet une N-glycosylation de celle-ci et incorpore le groupe

prosthétiquehémiqueàFe3+donnantnaissanceàlaproMPOde90kDadepoidsmoléculaire.

L’enzymematureestobtenuesuiteaupassagedansuncompartimentpré-granulaire.L’hème

est liéparsonatomeFe(III)àdeuxhistidinesde laprotéine, l’unepar liaisoncovalenteet

l’autreparunponthydrogène.Parailleursl’hèmeprésentetroisliaisonscovalentesavecla

protéine. La protéine étant glycosylée, son poids varie entre 120 et 150 kDa, avec un pic

d’absorptioncaractéristiqueà430nmà causede sa structurehémique. Suiteàdifférents

signaux(liaisondeTLR,GM-CSF,TNF-a…),laMPOpeutêtrelibéréepardégranulationoubien

parapoptoseounécrosecellulaire67,68.

Figure8:StructuredunoyauhémiquedelaMPOhumaine

69

Rôle biologique LaMPOestuneenzymeclédanslerôlededéfensedesneutrophilesdansl’immunité.La

MPOpossèdeuneactivitéperoxydaseetdechlorationlibérantdel’acidehypochloreuxHOCl

ou bien des acides hypo-halogénés à partir d’ions bromure ou iodure. Son activité de

chlorationcréedesagents intermédiaireshautementréactifsconduisantà la formationde

dérivéschlorés.Différemmentdesautresperoxydases,laMPOesttrèsréactivesoussaforme

naturelleMPO–FE(III)donnantunintermédiairelui-mêmehautementréactifCdIdecourte

duréedeviequiréagitavecCl-afindedonnerl’ionhypochloreuxetrestituerlaMPO-Fe(III).

49

• Activitédechloration

MPO-Fe(III)+H2O2<--->CdI+H2O��

CdI+Cl-+H+--->MPO-Fe(III)+HOCl�

CdIpeutparailleursréagiravecunsubstratréducteurDHpourformerCdIIpossédantune

structurehémiqueàFe(IV)etunproduitoxydéradicalaireprovenantdeDH.Enréagissant

avecunnouveauréducteur,CdIIrestituelaMPO-Fe(III)enformantundeuxièmeproduit

oxydéradicalaire.Lesproduitsoxydésradicalairespeuventdiffuseretconduireàla

formationdeproduitsactifsdelipoperoxydationàpartirdedifférentsréducteurstelsque

lesnitrites(NO2-),l'ascorbate,l'urate,lescatécholamines,lesœstrogènes,lasérotonineet

latyrosine.

• Activitéperoxydase

MPO-Fe(III)+H2O2--->CdI+H2O��

CdI+DH--->CdII+D•+H+��

CdII+DH--->MPO-Fe(III)+D•+H+�

DesconcentrationsmaximalesenH202etenCl-sontnécessairesafind’optimiserlaproduction

d’ionhypochloreuxetainsiéviterlaformationdeCdII(etd’ionsuperoxyde)àpartirdeCdIqui

réagitavecH202ainsiquelaformationdeCdIparréactiondelaMPOavecHOCl.

Deplus,laMPOpeutréagiravecdesréducteurs(dontO2-°)afindeformerCdIIIinactif.Cette

réactionrestetoutefoisréversibleetpeutseproduireendébutdephagocytoselorsquelepH

àl‘intérieurduphagosomeestalcalinoubienneutre,favorisantainsil’actiondelaNADPH-

oxydase avec une MPO quiescente. Lorsque le pH se rapproche du pH optimal de

fonctionnement de la MPO, c’est-à-dire pH=5,5, CdIII libère à nouveau de la MPO-Fe(II)

naturelle.

• FormationduCdIII

MPO-Fe(III)+substratréd.--->MPO-Fe(II)(CdIII)+substratoxydé

MPO-Fe(II)+O2--->MPO-Fe(II)-O2�

Toutefois,uneinactivationirréversibledelaMP–Fe(III)parHOClestpossible,cequilaisse

supposerunmécanismed’autorégulation.

50

Ainsi pH, productiondeO2-°avec formationdeH202, concentrationdeCl- dans le plasma,

concentrationsenréducteursetenmonoxyded’azotevontbalancerdefaçoncomplexeles

différentesréactionsdelaMPOauseinduphagosome.

Lamyéloperoxydasevadoncpermettredeformerdifférentesespècesoxydantes.Commecité

précédemment,l’acidehypochloreuxestleprincipalproduitdel’enzyme,ilagitcommeun

puissantbactéricideàl’intérieurduphagosomedanslequelilestformé,etvapermettrede

nombreuses réactions dans le milieu extracellulaire. La MPO sera ainsi responsable

directementdelaproductiondenombreusesmoléculesoxydantesparticipantàladéfensede

l’hôte. Il est intéressant de noter que ce sont ces espèces qui seront responsables de la

chimioluminescenceobservéelorsdelastimulationdesneutrophilesinvitro.

Figure9:ProduitsformésparactionoxydantedeHOCletréactionsd'HOClavecd'autresespècesactivéesdel'oxygèneetde

l'azote.67

L’activité principale de laMPOdécrite pour l’enzymehumaine est principalement un rôle

antimicrobien au sein des phago-lysosomes des neutrophiles. Les granules spécifiques

51

contenant la NADPH-oxydase sont les premiers à fusionner et à relarguer leur contenu

enzymatique.Lecontenudesgranulesazurophiles (dont laMPO)estdéverséaprès fusion

membranaire dans un deuxième temps, formant alors de nouvelles espèces activées.

L’activité de laMPO s’intensifie avec l’acidification dumilieu. LaMPO agit sur une large

gammedemicroorganismesparoxydationdedifférentsproduitsetdifférentsmécanismes.

La fixationsurdesstructurespolysaccharidiquesde lamembranebactériennepermetà la

MPOuneattaqueextracellulairedemicroorganismescommelesparasitesetleschampignons

trop volumineux pour être phagocytés, et qui sont souvent résistants aux enzymes

protéasiquesethydrolytiques.Enoxydantdifférentesstructuresenzymatiques,laMPOpeut

induirerapidementlamortcellulaire.

MalgréuneforteconcentrationdelaMPOaucontactdirectdesagentsinfectieuxauseindu

compartimentintracellulairequ’estlephagolysosome,unepetitequantitédel’enzymepeut

êtredéverséedanslemilieuextracellulaire,notammentlorsd’inflammationsévère.Eneffet

lorsquelesneutrophilesprocèdentàunedégranulationexacerbéeoulorsqu’ilsdeviennent

apoptotiques, une action toxique locale est prévisible. Malgré une inhibition des effets

délétèresdelaMPOparl’albumine,lacéruloplasmineouleslipoprotéinesdefaibledensité

quisontplussensiblesauxeffetsoxydantsdelaMPO,deslésionsdestissusendogènessont

fréquentes.Deplusils’agitd’uneinhibitionquiestréversible.LaMPOestcytotoxiquepour

leshématiesainsiquepourlescellulesendothélialeset lesfibroblastes;cesdeuxderniers

pouvantl’internaliserlorsdeladégranulationdesneutrophiles.ParailleurslaMPOpossède

lacapacitéd’oxyderlesneutrophilesdel’hôtemême.

LaMPOpeutégalementagirdirectementouindirectementdanslatransductiondessignaux

de l’inflammation en interférant dans la cascade des protéines kinases et au travers du

médiateurNF-kB.Ellepeutavoiruneffetbénéfiqueounéfasteselonl'endroitetlemoment

oùseproduitlaréactioninflammatoire.

Libérée au sein du site inflammatoire, la MPO est à l’origine de la formation d’espèces

oxydantesdiffusiblesquivontavoiruneactivitésurlesvoisinesalentour.EnsynergieavecCl-

et H202, la MPO perturbe les fonctions de prolifération, de production d’anticorps et de

cytolysedeslymphocytesT,BetNK(NaturalKiller)enfonctiondunombredeneutrophileset

dupotentielantioxydantdel’environnement.Parinteractionavecdesmacrophages,laMPO

peutégalementinduirelaproductiondecytokinespro-inflammatoirestellesqueTNF-aetIL-

52

1. Ces cellules ont également un potentiel oxydant accru vis-à-vis desmicroorganismes à

capsulespolysaccharidiquesrésistantesauxprotéases.

Parailleurs,laMPOpeutégalementavoiruneffetlimitantsurlaréactioninflammatoireen

diminuant le potentiel de phagocytose des neutrophiles par oxydation des récepteurs

membranaires.

Desdérégulationsdel’activitéoxydantedelaMPOsontliéesàdifférentesmaladiestellesque

lamaladied’Alzheimeroul’athérosclérosechezl’homme70.Desmutationsgénétiquesdans

l’espècehumainesontconnuescommeétantà l’originededéficitsenMPOsanstoutefois

provoquer des signes cliniques, car in vitro les neutrophiles présentent une explosion

respiratoireetuneactivitéphagocytaireaccrues.Cesaltérationsconduisentàunesensibilité

accrueauxinfectionsfongiques.

Onpeutdoncémettrel’hypothèsequelaquantificationdeMPOpermettraitd’estimer

l’intensitédurecrutementetdel’activationdesneutrophilesetdoncindirectement

l’importanceduprocessusinflammatoiredansletissuoùilapparaît.

Techniques de mesure et lien avec la quantité de neutrophiles

Plusieurstechniquespourquantifierlerecrutementetl’activationdesneutrophilesontété

décrites permettant de mesurer la concentration de MPO chez l’homme ou le cheval.

Cependant laconcentrationenzymatiquen’estpasproportionnelleà l’activité,car ilexiste

plusieurs inhibiteurs endogènes de son activité. Il serait donc plus intéressant de pouvoir

exprimerl’activitéafind’estimerlasévéritédelaréactioninflammatoire.Cependantiln’ya

pasdeconsensussurlaméthodelaplusfiablecomptetenudesdifférentssubstratsutilisés

(Tétraméthylbenzidine (TMB),dianisidine,guaiacol)quine sontpas spécifiquesde laMPO

maisdetouteactivitéperoxydasique.Ilestimportantdenoterquel’hémoglobineainsiquela

myoglobine possèdent une activité peroxydasique, ce qui peut directement influencer les

mesures71.L’activitéperoxydasiquedelaproductiondeH202etparchimioluminescence72.

D’aprèsPullietal.73différentestechniquessontutiliséesafindemesurersoitlaprésencede

MPOousonactivité souventdans l’objectifdequantifier laprésencedeneutrophiles. Les

sondes majoritairement utilisées pour mettre en évidence la présence de MPO sont la

53

dianisidine,leTMBsuividel’AdénosineDiphosphatehydrogénase(ADPH)etlataurine.Ace

jour,aucuneétudecomparantlesdifférentestechniquesentreelles.

Afindes’affranchirdesinterférencesavecd’autresmoléculesàactivitéperoxydasique,Pulli

etsonéquipeontproposéuneméthodededosageavecdesanticorpsanti-MPOquid’après

leursrésultats,estfidèleetreproductible,ainsiqued’unebonnesensibilité;elleestcapable

dedétecterlaproductiondeMPOàpartirde500neutrophiles.Parallèlement,lafixationde

la MPO par des anticorps augmenterait la spécificité des dosages. La corrélation entre

l’activitédelaMPOdanslescompartimentsintracellulairesetlaquantitédeneutrophilesa

étémontré.

54

2 Analysesystématiquedesmoléculesspécifiquesdesneutrophiles

2.1 Introduction

L’identificationetlaquantificationdescellulesinflammatoiresdanslesangpériphériqueainsi

quedans les tissussontétudiéesdepuisplusieurscentainesd’annéeset sontcorréléesau

conceptmêmede lathéoriecellulaire.L’analyseminutieusedecesprélèvementsapermis

toutd’abordd’identifierdifférentesfamillesainsiquedespatternsdeprésenceconsidérés

physiologiqueschezdespatientssains.Ledéveloppementdelacytologiecliniqueainsique

de l’hématologie cliniqueapermisdedétecterdevariationsanormalesdans les contenus

cellulairesetleurrépartition.Ceciaaboutiàunemeilleurecompréhensionmédicalesurles

processusphysiopathologiquesd’infiltrationcellulaire, leurévolutionaucoursdutempset

leursréponsesàdestraitements.

Historiquementdifférentestechniquesontserviàidentifieretàclasserlestypescellulaires,

que ce soit sur la basede leurs propriétés physico-chimiques, immunologiquesouencore

fonctionnelles.Deuxtraitscaractérisentlesgranulocytesneutrophiliques:leurcourtedurée

devie,avecunemoyennede5joursàpartirdumomentoùilsquittentlamoelle,ainsique

leurfaiblecapacitédesynthèseprotéiqueunefoisarrivésàmaturation.Depuislamaîtrisede

lafabricationd’anticorpsdirigéscontredesépitopesprécis,l’immunomarquageaétéutilisé

dans l’identificationdesneutrophilespour lesdistinguerdesautres leucocytes.Différentes

méthodes de séparation et d’identification des neutrophiles ont permis d’étudier leurs

caractéristiquesetleurparticipation,ainsiquelacinétiquederecrutement,lorsdelaréponse

inflammatoire.Traditionnellement,leprotocoledeséparationdesneutrophilesreposesurla

techniquedesédimentationafindelesisolerdurestedescellulescirculantesdanslesang.La

technique décrite par Ferrang et Thong repose sur une différenciation en couche des

différentstypescellulairesprésentsdanslesang,sicettetechniqueestutilepourpurifierles

cellulesàpartirdusang,elleestd’uneutilitémoindredanslaquantificationdesneutrophiles

présentsdanslesautrestissus.

55

2.2 MatérieletméthodesNousavonsprocédéàuneanalysesystématiquedespublicationsportantsurledifférentes

méthodespubliéesd’analysedesneutrophilesprésentsdanslestissus,endehorsdel’analyse

histologique.

Labasededonnéesestreprésentéeparlalittératureaccessibleenlignenotammentsurdes

sitesspécialiséstelPubmed,ScienceDirectetGoogleSchoolar.Lesarticlesrecenséssontdes

articles en langue anglaise publiés dans des revues spécialisées. Afin de concentrer nos

recherchessur les techniques lesplusrécentes,nousavonssélectionné lesarticlespubliés

entre 1990 et 2018. Les termes utilisés pour la sélection des articles ont été :neutrophil

quantification, polynuclear neutrophil biomarker, inflammation quantification, determining

neutrophilsintissue,neutrophilsELISAquantification,cytometryquantification.

Lesarticlesrépondantàcescritèresderechercheontététriésdansunpremiertempsàpartir

de la lecture du résumé afin de s’assurer qu’il s’agissait bien de descriptions techniques

portantsur lesneutrophileshumains,murinsoubovins,etqu’ils traitaientdirectementou

indirectement des méthodes de quantification des granulocytes neutrophiliques dans les

tissus au sens large, aussi bien les fluides biologiques (dans lesquels les cellules sont en

suspension)que les tissusorganisés, que lesneutrophilesont infiltré.Au final, les articles

remplissant ces critères ont été étudiés afin d’extraire les informations relatives aux

techniques d’identification des neutrophiles. Toutes les références supplémentaires

identifiéesaucoursde la lecturedesarticlesprécédemment sélectionnésontété incluses

dansl’étudeetanalyséesdefaçonanalogueàcequenousavonsprécédemmentdécrit,afin

derecueillirdesarticlesquiauraientéchappéàlarechercheavecdesmotsclés.

Parfois différents articles ont été retenus pour une même approche technique car les

méthodes étaient sensiblement différentes. Ce choix permettait généralement d’apporter

uneprécisionoudesinformationssupplémentairessurlatechniqueenquestion.

56

2.3 RésultatsNospremièresrecherchesaveclesmoyensdécritsnousontfaitaccéderàplusde600articles

parmi lesquelsnous avons toutd’abord sélectionné ceuxqui s’intéressaient à l’infiltration

neutrophilique spécifiquement dans l’inflammation. Beaucoup d’articles de recherche

cliniques’intéressentàlanétoseetàlamanièredelaquantifier,maisnousavonsexclusces

articlescarlatechniquenepermetpasdequantifierlescellules,etilsnerépondaientdonc

pasauxobjectifsdenotreétude.

Initialement,44articlesontétéséparéspourlecturedont28ontétéretenusetcomparés.

Les articles analysant des techniques décrites antérieurement et parfois adaptées afin de

prouverlacorrélationdemaladiesspécifiquesdanscertainsorganeschezl’homme,ontété

supprimés de notre étude. De même, toute étude de la réponse inflammatoire qui ne

s’intéressaitpasauxaspectscellulairesetlaréponseauxstimuliinflammatoiresaétéécartée.

Deplus, lesétudescorroborantdes résultatsdéjà rapportésparunautrearticleavecune

méthode identique n’ont pas été retenus à la faveur des études originales. En effet nous

n’avonspaslafinalitédedéterminerprécisémentlesvoiesmoléculairesdel’inflammationdes

organeslorsd’affectionsspécifiques;cependantlorsquetoutmarqueuroriginalaétéproposé

dansdetellesétudes,quenousavonsjugéexploitabledansladétectiondesneutrophiles,la

méthodeaétéanalyséeetinclusedansnotreétude.Aufinal,28articlesontétéretenuset

analysés.

2.3.1 Méthodesdécritespourlesespècesmurineethumaine:Chez les espèces étudiées, différents milieux ont servi de support à la recherche des

neutrophiles.Ainsienfonctiondumilieubiologique,lesméthodesvarient.Eneffetlorsque

lesneutrophilessontlibresdansunmilieuliquide,commelesang,lesexsudatsinflammatoires

ou bien le liquide articulaire qui peuvent être le site d’une infiltration neutrophilique, ou

encoredansdestissusorganisésinfiltrés.

Ainsidanslepremiercas,lescellulessontaisémentaccessibles.Parlareconnaissanced’un

marqueurdesurfacedescellulesilestpossibledelesidentifieretlesdénombrer.Ilsuffitpour

celadegénérerunligandspécifiqued’untelmarqueur,postérieurementdistinguable.

57

Cependant lors de l’analyse de tissus organisés et solides, il n’est pas possible d’aller

directementaucontactdescellulesinfiltréesauseind’uncompact.Pourcelailconvientde

défaire la structureorganisée.Encassant les tramesextracellulairesqui relient lescellules

entreellesainsiquelesliaisonsintercellulaires,ilyaatteintedesmembranescellulairesqui

sontalorsplusdifficilementanalysables.Cecirenddoncnécessaireuneméthodededétection

qui puisse relier les concentrations d’un biomarqueur contenu uniquement dans les

neutrophilesaunombredeneutrophilesprésents.Ainsil’analysed’uncomposantmoléculaire

d’unbroyatdetissupermettraituneanalyse indirectede lacompositioncellulaireetde la

proportiondeneutrophiles.

Automatisation avec coloration Giemsa

Le dénombrement microscopique se fait à l’aide des différences morphologiques qui

distinguentlesneutrophilesdesautrestypesdeleucocytes.Cecomptagesefaitàpartirdes

frottis de sang périphérique suite à une coloration. Le traitement est particulièrement

chronophage, dépendant de celui qui l’exécute, et dès est susceptible d’erreur non

négligeable. De plus, les différentes techniques de coloration et la variation du temps

d’expositionpourchaquetypedecolorationcauseunevariabilitémarquéedel’intensitéde

couleur de chaque compartiment subcellulaire et la possibilité de confusion entre types

cellulaires.C’estpourquoidesméthodesdedéterminationautomatiséesavecdesprotocoles

biendéfinissontrecherchées,telestlecasdesrecherchesdeAhmghalanetal(2009)74afin

de mesurer automatiquement les différents types cellulaires sur un frottis à l’aide d’un

algorithme.Enanalysantaumicroscopeélectroniquereliéàunecaméradigitale,deslames

ayantsubiunecolorationauGiemsa,ilsparviennentàdétecterlesnoyauxplurilobésdepar

leur coloration de plus forte intensité et de les séparer des autres lymphocytes par leur

proximité inférieure au diamètre d’un leucocyte. Ils parviennent ainsi à quantifier les

neutrophilesobservéssurlesfrottissanguinsavecuneprécisionrapportéede96%.

Les protéines membranaires de surface

Pourl’identificationdesneutrophilesselondifférentesméthodes,ilconvientdeconnaîtredes

protéinesmembranaires spécifiques des cellules neutrophiles, et ce afin de produire des

anticorpscapablesdelesreconnaitre.

58

Parmilestechniquesdequantification,l’immunohistooucyto-chimietellequelacytométrie

defluxsontutilisées.

Lacytométriedefluxmesurelafluorescenceetladiffusiondelalumièreàtraversdescellulesensuspension.Cetteméthodepermetd’analyserlespropriétésdescellulesenlesexposantàun faisceau laser après séparation dans un liquide de gaine. Des capteurs permettentd’analyser lespropriétésde la lumièrediffractéeetcelleémisepar lescellulesafind’enendéduire les propriétés physiques (taille et complexité cellulaire interne). De plus, lareconnaissance à l’aide d’anticorps spécifiques de protéinesmembranaires, couplés à desmarqueurs fluorescents, permet de discerner différentes populations de cellules. Ainsi,plusieursétudesontdécritladéterminationdesprotéinesspécifiquesdesneutrophiles75.

Figure10:Schémad'uncytomètredeflux75

DNA Content AnalysisThe measurement of cellular DNA content by flow cytom-etry uses fluorescent dyes, such as propidium iodide, thatintercalate into the DNA helical structure. The fluorescentsignal is directly proportional to the amount of DNA in thenucleus and can identify gross gains or losses in DNA.Abnormal DNA content, also known as “DNA contentaneuploidy”, can be determined in a tumor cell population.DNA aneuploidy generally is associated with malignancy;however, certain benign conditions may appear aneuploid(7–12). DNA aneuploidy correlates with a worse prognosisin many types of cancer but is associated with improved

survival in rhabdomyosarcoma, neuroblastoma, multiplemyeloma, and childhood acute lymphoblastic leukemia(ALL)1 (11, 13–16). In multiple myeloma, ALL, and myelo-dysplastic syndromes, hypodiploid tumors cells portend apoor prognosis. In contrast, hyperdiploid cells in ALL havea better prognosis (11, 13). For many hematologic malignan-cies, there are conflicting reports regarding the independentprognostic value of DNA content analysis. Although con-

1 Nonstandard abbreviations: ALL, acute lymphoblastic leukemia; PNH,paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; and RBC, red blood cell.

Table 1. Common clinical uses of flow cytometry.Field Clinical application Common characteristic measured

Immunology Histocompatibility cross-matching IgG, IgMTransplantation rejection CD3, circulating OKT3HLA-B27 detection HLA-B27Immunodeficiency studies CD4, CD8

Oncology DNA content and S phase of tumors DNAMeasurement of proliferation markers Ki-67, PCNAa

Hematology Leukemia and lymphoma phenotyping Leukocyte surface antigensIdentification of prognostically important subgroups TdT, MPO

Hematopoietic progenitor cell enumeration CD34Diagnosis of systemic mastocytosis CD25, CD69Reticulocyte enumeration RNAAutoimmune and alloimmune disorders

Anti-platelet antibodies IgG, IgMAnti-neutrophil antibodies IgGImmune complexes Complement, IgG

Feto-maternal hemorrhage quantification Hemoglobin F, rhesus DBlood banking Immunohematology Erythrocyte surface antigens

Assessment of leukocyte contamination of blood products Forward and side scatter, leukocytesurface antigens

Genetic disorders PNH CD55, CD59Leukocyte adhesion deficiency CD11/CD18 complex

a PCNA, proliferating cell nuclear antigen; TdT, terminal deoxynucleotidyltransferase; MPO, myeloperoxidase.

Fig. 1. Schematic of a flow cytometer.A single cell suspension is hydrodynamically focused withsheath fluid to intersect an argon-ion laser. Signals arecollected by a forward angle light scatter detector, a side-scatter detector (1), and multiple fluorescence emissiondetectors (2–4). The signals are amplified and converted todigital form for analysis and display on a computer screen.

1222 Brown and Wittwer: Flow Cytometry

59

Fungetal(2011)76ontpubliéunrécapitulatifdesantigènesconnusenfonctionpourl’

homme.

Tableau4:RécapitulatifdesAntigènesNeutrophiliqueshumainsetleurscaractéristiquesd'aprèsFungetal.(2011)76

Desmarqueursde la lignéemyéloïdeont étéproposéspar Lagasse et al. (1996)77 afin de

séparerneutrophilesetmonocytesdesautrestypesleucocytaires.Enutilisantdeuxanticorps

Gr-1etMac-1quireconnaissentdesépitopesmembranaires,spécifiquesdesneutrophileset

des monocytes, respectivement, la cytométrie de flux permet de distinguer les deux

populationsdont lesneutrophiles,etainside lesquantifieravecunmarquage fluorescent

préalable.Ceciaétéfaitdansdestissusmurinsnotammentlesang,lesponctionsdemoelle

osseuseetdesfractionsderatebroyée;cetteidentificationaétéconfirméeenmicroscopie

électronique. Cette étude a notamment permis de relever que l’expression de Gr-1

augmentaitàlasurfacedesneutrophilesaucoursdeleurmaturation,dansunpremiertemps

danslamoelleosseuseetensuitedanslacirculationsanguineetdanslarate.

[35]. In the German population, the HNA-3a antigen fre-quency is 97%, with gene frequencies of 0Æ792 and 0Æ207for HNA-3a and HNA-3b, respectively [35]. Antibodies toHNA-3a are implicated in immune neutropenia [36,37], butin the last two decades have gained notoriety for theirinvolvement in severe and often fatal TRALI events [38–41]. These antibodies are predominantly leucoagglutinat-ing, causing bulky cellular aggregates in vitro by bindingto neutrophils via their F(ab) ends [34]. This may echo theirin vivo behaviour and explain their association with themost severe TRALI reactions. Consequently, these antibod-ies are best detected using the granulocyte agglutinationtest (GAT) [42].

HNA-4a is located on the aM subunit (CD11b) of theC3bi receptor (CD11b ⁄CD18) and is expressed on granulo-cytes, monocytes and natural killer cells (Table 1) [43,44].HNA-5a is located on the aL (CD11a) subunits of the LFA-1complex, expressed on all leukocytes [44,45]. Antibodies toboth HNA-4a and HNA-5a were originally identified in serarespectively from a multiparous blood donor [43] and amulti-transfused male patient [45] indicating that the anti-gens are immunogenic. However, the clinical relevance ofantibodies to these antigens is still unclear in spite of thefunctional importance of their carrier glycoproteins. HNA-4a and HNA-5a antibodies have not yet been implicated intransfusion reactions, although ANN cases have been asso-ciated with each antigen [46,47].

InvestigationThe most widely used, accredited approach for detectingneutrophil-reactive antibodies is the combined use of thegranulocyte immunofluorescence test (GIFT) and GAT. Both

of these techniques have recently been described in detail[48]. In the GIFT, antibodies binding to neutrophils arelabelled with a conjugated anti-human globulin which canthen be visualized either by fluorescence microscopy ormore usually, using flow cytometry [3,49]. GAT reactionsrely upon a very different principle, because they dependon the ability of IgG antibody to sensitize and stimulateneutrophils, which results in migration to and agglutina-tion of adjacent neutrophils [50]. Thus, viable and func-tional neutrophils are critical to successful GAT results.Results from the International Granulocyte ImmunobiologyWorkshop have repeatedly demonstrated that the GAT isvital for the effective detection of antibodies to HNA-3a[42].

The fact that neutrophils live only for 6–8 h and arefragile, make it essential that fresh blood is used for neutro-phil isolation. The principle of neutrophil isolation is thatunwanted cell types are physically separated and removed,leaving behind a purified, functional pool of neutrophils[3,51,52]. In our laboratory, we centrifuge EDTA or citratedwhole blood (1000 g for 10 min) and remove platelet-richplasma. Dextran (5% solution) is mixed with the remainingleucocyte-rich mixture and this is incubated at 37!C for30 min at an angle to promote rapid red cell sedimentation.The leucocyte-rich plasma is then transferred into a freshconical tube, and underlayed with 1Æ077 and 1Æ114 densitygradient solutions. After centrifugation at 1600g for15 min, remaining red cells sediment at the bottom of thetube, granulocytes are retained at the lower gradient inter-face and mononuclear cells are retained at the top gradientinterface. Harvested granulocytes are washed with bufferprior to their use in the GIFT, GAT or monoclonal antibodyimmobilization of granulocyte antigen (MAIGA).

Table 1 HNA systems and their characteristics

Ag System HNA-1 (15-25) HNA-2 (26-33) HNA-3 (34-42) HNA-4 (43,44,46) HNA-5 (44,45,47)

Ag HNA-1a HNA-1b HNA-1c HNA-2a HNA-3a HNA-3b HNA-4a HNA-5a

Old nomenclature NA1 NA2 SH NB1 5b MART OND

Gylcoprotein(Cluster)

FccRIIIb (CD16b) gp 50-64 (CD177) CTL-2 (undefined) aM (CD11b) aL (CD11a)

Anchor ⁄ link glycosyl-phosphatidylinositollink (GPI)

GPI transmembrane transmembrane transmembrane

Expression Neutrophils Neutrophils(monocytes ofpregnant women)

Neutrophils, granulocytes,monocytes, lymphocytes,platelets, kidney, placentaltissue, spleen, lymph nodetissue, endothelial cells

Granulocytes,monocytes,T-lymphocytes

Granulocytes,monocytes,lymphocytes

Neutrophil antigen and antibody investigations 383

" 2011 The Author(s).ISBT Science Series " 2011 International Society of Blood Transfusion, ISBT Science Series (2011) 6, 381–386

60

Lacytométriedefluxestdevenueuneméthodeubiquiste,performanteetrapidedemesure

de la concentration des neutrophiles dans le sang. La maîtrise de différents marqueurs

membranairesapermisaussidedifférencierlesneutrophilesparmilesleucocytesainsique

desuivreleurdifférenciationaucoursdeleurdéveloppement.

Lesneutrophilesmurinspossèdentdegrandesquantitésdeprotéinesmembranairesde la

familledeLy6B,Ly6CetLy6G,commerapportéparP.Y.Leeetal(2013)78.Ils’agitdeprotéines

dontlerôlen’estpasencoreentièrementcomprismaisdontonestimequ’ellesparticipentà

lamigration. Ly6Bestplusparticulièrementexprimée sur les cellules au seinde lamoelle

osseuse et sur les neutrophiles circulants, mais également à la surface des monocytes

immatures.Ils’agitdoncd’unmarqueurutiledesneutrophilesencombinaisonavecF4/80;

CCR2,etCD11b,pourdifférencierlesneutrophilesdesmonocytes.

Ly6C est également présente sur les neutrophilesmais aussi sur différentes cellules de la

lignéeblanche;elleestprincipalementutiliséecommemarqueurdesmonocytes.Roseetal

(2014)ontproposéd’utiliser lemarquageavecLY6Get LY6Cpour identifierde façonplus

fiablelesneutrophiles79.

Ly6G ayant été démontrée comme une protéine exclusivement présente chez les

neutrophiles, elle a étéutiliséepar J.Daley et al. (2008) 80 pour enlever la productionde

neutrophileschezdessouris,confirmantainsilaspécificitévis-à-visdesneutrophiles.

Laquantificationdel’évolutiondel’expressiondeCD11baétéétudiéelorsdel’activationdes

neutrophiles et desmonocytes pendant l’inflammation. Il est difficile de séparer les deux

typescellulairesuniquementsurlabasedel’expressiondeCD11b;enoutre,sonexpression

nepermetpasdequantifieraveccertitudelaquantitédeneutrophilesactivés.AinsiNicholson

et al (2007) ont utilisé la cytométrie de flux pour analyser les neutrophiles dans le sang

périphérique afin de mesurer l’évolution de l’expression de CD11b lors d’activation par

chimiokineschezdespatientssainsetdepatientsatteintsdemaladiepulmonaireobstructive

chronique81.CD11betCD18sontdesmoléculesb2intégrines,quiparticipentàl’adhésion

auxprotéinesdesurfacedel’endothéliumvis-à-visdesquellesdesanticorpsspécifiquessont

disponibles.Demême, l’expressionde la L-sélectine (CD62L)à la surfacedesneutrophiles

permetdemesurerl’activationdesneutrophilesdefaçonindirectemaiségalementlacapacité

d’adhésionauxcellulesendothéliales,commemontréparMarshalletal(1997)82.

61

CependantBatemanetal(1993)ontdécritqueleniveaudebased’expressiondeCD11bet

CD18 ne permettait pas de définir avec précision l’activation des neutrophiles lors de

stimulationinflammatoirechezdesindividusmalades83.

Chezl’homme,plusieursanticorpsdirigéscontreCD35,CD16,CD64,etCD87,ontétéproposé

en association pour étudier la maturation des neutrophiles, en comparant la présence

séquentielle de ces molécules au cours du développement neutrophilique et permettant

mêmed’identifierdesanomaliesdelamaturationdesneutrophiles.Ilconvientdenoterque

lors de cette étude les auteurs se sont intéressés à la corrélation entre l’expression des

marqueursencytométriedefluxetledénombrementmanuelsurlameeffectuéenparallèle

pardesobservateurs.Ilsontdécritdescorrélationsstatistiquesentrelaproportiondesjeunes

neutrophiles«bandcells»avecl’expressiondesmarqueursdeCD16etCD35.Ladifférence

estplusgrandeencequiconcerne lesneutrophilessegmentés,mais ilyaégalementune

différencemarquéeentrelesdifférentsobservateurs84.

Les molécules intracellulaires Desmoléculesprésentesdanslesgranulesdesneutrophilesontétédoséesdansleplasma

afin d’établir si leurs concentrations étaient corrélées avec le nombre de neutrophiles

circulants. Lors de la dégranulation des neutrophiles, des contenus intracellulaires sont

déversés dans le milieu extérieur. Compte tenu du faible potentiel de synthèse des

neutrophiles,ilestpossibledelesdosersoitenstimulantlescellulesàladégranulation,soit

endéstructurantleurmembranecellulaire.

Sorensenetal(1997)85ontdéveloppéuntestELISAafindedoserlahCAP-18,unecathélicidine

présente dans les granules spécifiques des neutrophiles humains. Ils ont montré une

corrélationpositiveentre laquantitédeneutrophiles circulantset laquantitédehCAP-18

plasmatique,malgrélaprésenced’unequantitébasaledecetteprotéinedansleplasma,qui

estd’origineinconnuemaistrèsvraisemblablementd’originenonneutrophiliqueetmyéloïde.

Desétudesprécédentesavaientdéjàpermisdemontrerunerelationentrel’élastase

circulanteetlaquantitédeneutrophilesdansdesinfiltratscutanés.AinsiLammersetal

(1986)ontreliélaquantitéd’élastaselibéréeaunombredeneutrophilesinfiltrésdansdes

extraitsdepeaud’humainparimmunofluorescence86.

62

L’étudedelaquantitédelipocaline2associéeàlagélatinaseneutrophiliqueaégalementété

proposéecommeprotéineaigüedel’inflammation,carelleestsécrétéeparlesneutrophiles

humains.Laquantitésériqueaugmenteenfonctiondel’étatd’activationdesneutrophiles.Il

s’agitdoncd’unemoléculeintéressantedanslesétudesconcernantl’inflammationrénaleet

articulairechezl’homme.EllepeutêtredoséegrâceàuntestELISA87.

Deslipocalinesassociéesàlagélatinaseneutrophilique(NGAL),quisontdescollagénasesde

type IV libéréespar lesneutrophileshumains,ontétéétudiées chezdes sujets sains.Une

étudequantitativedelacollagénaseprésentedanslesgranulesazurophiliquesaétéréalisée

etuntestELISAaétéproposéparKjeldsenetal(1996)88.Lesauteursontconcluàl’absence

decorrélationentre lenombredeneutrophileset le tauxdegélatinasemesuréedansdes

échantillonsdesangchezlessujetssains.Cependant,unecorrélationétaitprésentechezdes

patientsatteintsde lymphomenon-Hodgkinien.Lagélatinaseserait liéedefaçonfidèleau

nombredeneutrophilescirculants,sansinterférencedel’activitémyéloïde88,89.

Parmi lesmoléculescandidatesprésentesdans lesvésiculesdesneutrophileson trouve la

myélopéroxydase,quiestégalementexpriméeparleséosinophilesalorsqu’elleestabsente

dans lesmacrophages.Brownetal (2001)90avaitmontrépar immunohistochimie,que les

cellulesdeKupferainsiquelesmacrophagesrésidentsdanslefoieexprimaientégalementla

MPO. Cependant, des études plus récentes ont investigué cette possibilité à l’aide de

différentestechniquescommel’immunohistochimie,leWesternBlotetlaRT-PCRdansdes

échantillonsdefoiemurinssainsouavecdeslésionsinduitesparunesurchargealcoolique,

ainsiquedansdeséchantillonsdefoieléséshumainsavecdeslésions.Lesauteursn’ontpas

conclusuruneoriginestrictementhépatiquedelaMPO91.

Dansdesessaisutilisantdesmodèlesanimaux, laMPOestunmarqueurdel’inflammation

trèssensibleetprécocecarilestprésent24heuresavantquelenombredeneutrophilessoit

augmentéetqu’ilspuissentêtredétectésenhistologie92.Onretrouvedanslalittératuretrois

techniquesdedosagedel’activitéperoxydasiquedontlaspécificitéetlasensibilitéontété

rapportées:

- La chimioluminescence dépendante du luminol à pH acide, spécifique de la

myéloperoxydase (MPO) des neutrophiles et dont l’activité a été corrélée à la

quantitédeneutrophilesdansdestumeurs93

- L’activité péroxydasique révélée avec de l’Adénosine Diphosphate Hydrogène

(ADPH)l’ADPH

63

- L’activitédechlorinationavecdel’acide2-[6-(4ʹ-hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-

on-9-yl]benzoïque(HPF)etdel’acide2-[6-(4ʹ-amino)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-

yl]benzoique(APF),) dont le différentiel de signal représenterait spécifiquement

l’activitédelaMPO94

L’équipedePullietal(2013)73ontpubliéunconséquenttravailsurlamyélopéroxydaseetla

déterminationd’unetechniquespécifiqueetstandardiséedemesuredesonactivitéausein

destissusetliquidesbiologiques.Lorsdel’analysedesméthodesprécédemmentcitéesilsont

concluàlaprésenced’uneinterférenceavecd’autresprotéineslorsdelamesuredel’activité

delaMPO.EnutilisantdesanticorpsmonoclonauxspécifiquesdelaMPO,ilsontdémontréla

spécificitéetlarépétabilitédesmesuresdel’activépéroxydasiquedansdeséchantillonsde

différentstissusmurinsbroyés.Ilsontainsipuétablirunerelationfidèleetrobusteentrela

quantitédeMPOetl’infiltrationneutrophiliquedestissus.

Une équipe canadienne a étudié une méthode semi-quantitative par immuno-

chromatographie(lateralflowtest)dedéterminationdel’activitéperoxydasiquedelaMPOà

partir de prélèvement d’expectoration chez des patients humains. Ils en concluent une

corrélationentrel’activitédelaMPOetlaquantitédeneutrophilesdanslesprélèvements,

dénombrésparuncomptagedanslesconditionsclassiques95.

RujuanDAietal (2017)ontutilisédes techniquesdeRT-PCR(RealTimePolyméraseChain

ReactionouPCRquantitative)pourquantifierl’expressiondel’élastaseneutrophiliqueetde

lamyéloperoxydasecirculantelorsl’administrationd’œstrogènechezlasouris.Ilsontconclu

à l’augmentation de ces molécules parallèlement à l’augmentation des neutrophiles

quantifiésparcytométriedefluxautraversdesmarqueursGr-1etCD11b.Ilsn’ontcependant

pas proposé de corrélation entre les deux facteurs 96.Uneméthode a été décrite afin de

mesurer les neutrophiles de façon quantitative sur des échantillons de prélèvements

nasopharyngés humains congelés en utilisant la RT-q sur les gènes codant CD16, CD18 et

CD26L, desmolécules considérées comme spécifiques des neutrophiles. Ils concluent que

cetteméthodepourraitêtreétendueàd’autresprélèvementsquelesexpectorationsnaso-

pharyngées97.

64

2.3.2 Chezlesbovins

Différentes études ont été menées chez les bovins afin de dénombrer les neutrophiles

présentsdanslelaitnotamment,lorsd’augmentationdelaconcentrationcellulairesignantla

présence d’une mammite. Différentes techniques ont été décrites afin de quantifier les

populationsdecellulesprésentesdanslelait.

Desméthodesdecytologie enmicroscopieoptiquepermettent l’identificationdirectedes

cellulesprésentesetleurclassificationsurlabasedescaractéristiquesmorphologiques98.

Demultiples techniquesde cytométriede fluxontétédécritesdans lebutdedéterminer

précisément les quantités de cellules dans des échantillons de lait. Lemarquage avec de

l’ioduredepropidiumetl’analyseparcytométrieenfluxestpossiblepourdétecterdesétats

inflammatoires avec des concentrations cellulaires basses, lors de mammites99.

L’augmentationdelaconcentrationdecellulesdanscecasprécisétantprincipalementdueà

unrecrutementdeneutrophiles.

Desanticorpsspécifiquesdesneutrophilesbovinsprésentsdanslelaitontétédéveloppéset

ontpermisl’essordetechniquesindirectesdedétectiondecescellulesdanslelaitavecdes

test ELISA notamment. Ainsi, à l’aide d’anticorps polyclonaux murins, la densité optique

mesuréeàl’aided’untestELISApermettaitunemesurefiableetbiencorréléeauxrésultats

ducomptagecellulairedansleséchantillonsdelait.Lasensibilitéétaitdel’ordrede95%etla

spécificité d’environ 97%. La fiabilité du test permettrait notamment la détection

systématiquedel’affluxneutrophiliquepourdesconcentrationsinférieursà100000cellules

parmillilitre100quiestconsidéréecommeleseuilau-dessusduquellaglandemammaireest

considéréecommeenflamméeàlasuited’uneinfection.

Par la suite, une technique reliant un marquage spécifique des neutrophiles à l’aide

d’anticorpspolyclonauxmarquésavecdel’isothiocyanatedefluorescéine(possédantunpic

d’excitationà470nm,fluorescenceverte)coupléàunmarquagedel’ADNavecdel’iodurede

propidium(excitationà530nm, fluorescence rouge),etuneanalyseenmicroscopieaété

proposée.Ainsi lorsde l’analysemicroscopique, ladétectiondesneutrophiless’estavérée

spécifiqueetsensible,avecunmarquagevertsurlesmembranesentourantunefluorescence

rouge. Cette technique est utile et fiable notamment lors de forte augmentation de la

65

cellularité du lait puisque les neutrophiles représentent dans ce cas, plus de 80% de la

populationdesleucocytesrecrutés101.

Coorayetal(1994)ontmontréunecorrélationentrelaconcentrationdeMPOdanslelaitet

laconcentrationcellulaire.DesanticorpsmurinsmonoclonauxspécifiquesdelaMPObovine

ontétéproduitsetutilisésafindemesurerlaMPOdansleséchantillonsdelaitavecuntest

ELISA.Parailleurs,l’absenced’interférencedesautresprotéinesdulaitoudel’inflammation

elle-mêmeaétédémontrée,ainsiquel’absencederéactioncroiséeavecla lactoferrine, la

lactoperoxydase,l’albuminesérique,lesproduitsdedégradationdeslymphocytesainsique

lesprotéinesdulaitnormal102.

Zerbe et al (2002) se sont intéressé aux écoulements utérins de vaches atteintes

d’endométrite causée par Escherichia coli ou Trueperella pyogenes et la population de

neutrophiles présentes. Malgré l’absence de quantification, ils ont montré un phénotype

altéréetuneproductionderéactifsoxygénésréduiteparlesneutrophilesprésentsdansles

sécrétions prélevées, rendant certaines techniques de détection inappropriées dans ce

cadre103.

66

2.4 DiscussionetpossiblesapplicationsIlexistedemultiplestechniquesdequantificationdesneutrophiles,ducomptagedirectàdes

méthodes de détection indirectes. Le comptage direct se base essentiellement sur des

lecturesde frottis sanguins,ouétalement sur lamedeprélèvements liquides.Ce sontdes

techniqueshistoriquesmaisquidemandentdutempsdanslapréparationetnesontpaslibres

d’erreurs.Eneffetenfonctiondutechnicienquisechargedelapréparationetdelalecture,

desvariationsnonseulementde l’intensitéde lacolorationainsiquedu recensementdes

types cellulaires sont fréquentes. De plus ces lectures sont largement dépendantes de

l’équipementdelaboratoiredisponible.

D’autrestechniquesdequantificationdespolynucléairesneutrophilesconnuesetmaitrisées

sontpossiblesàl’aided’équipementscouteux,dehautetechnicitéetdontlestempsd’analyse

ne sont pas négligeables. La détention et l’utilisation de ces équipements demande une

expertiseetuncertaindébitafind’optimiserleurutilisation.Lacytométriedefluxestdeplus

enplusrépandueetreprésenteaujourd’huiunedestechnologieslespluspuissantesutilisées

enroutineenhématologieetenimmunologie.Enmoinsde60ans,lesappareilsdemesure

sont passées d’un traitement de quatre couleurs de fluorescence à plus de 10 couleurs

mesuréesactuellement.Afind’identifierlesneutrophilescirculantsdanslesangpériphérique,

deux paramètres physiques analysés par réfraction de la lumière émise sont cependant

suffisants.Progressivement l’ajoutdemarqueurs fluorescentsdont le signalpeutêtre lua

permis d’affiner les techniques ainsi que d’identifier de nouveaux types cellulaires. Ces

marqueurs fluorescents sont conjugués à des anticorps spécifiques des types cellulaires à

déterminer104.Ainsil’étudedesmarqueursdesneutrophilesreprésenteunepartsignificative

destravauxutilisantlacytométriedeflux.

Il convient de relever que la grande diversité des études représente une difficulté dans

l’identificationd’unmarqueuruniverselquisurpasseraittouslesautres.Eneffetenfonction

de l’espèce cible, de la nature de l’échantillon biologique plusieurs techniques ont été

décrites.AinsiRoseetal(2014)79affirmentqu’unmarquagedirigécontreLy6C/Ly6Gpermet

une détection plus spécifique des neutrophiles spléniques par rapport à l’utilisation des

anticorps anti-Gr1. Cependant lemarquage le plus communémentutilisé cible la protéine

CD11b.Cependant,l’expressiondecesmarqueursquidiffèrentenfonctiondel’activitédes

67

neutrophilesetdontl’interactionpeutmêmeinduiredeschangementsdel’expression.On

retrouve cette même problématique lors de l’analyse des contenus des granules des

neutrophiles,oùdesdifférencespeuventapparaîtredifférenceparmilesneutrophilesciblés.

ParailleursCD11bestégalementprésentàlasurfacedeséosinophilesetdoitêtreconsidéré

avec précaution chez des individus avec une éosinophilie82. Ainsi, par accumulation des

données,desvariationsexistentauseinmêmede lapopulationdeneutrophilessanspour

autantenconnaîtrelacause,commelepassagepardifférentesétapesdematuration.Alors

que les neutrophiles sont considérés comme des cellules à faible pouvoir d’expression

protéique, ces différences sont difficiles à expliquer sauf à conclure à des différences

d’expressionmembranaireenfonctiondecertainsétats.AinsiChristofferssonetPhillipson

(2018)105ontrécemmentrecensélessous-typesrépertoriés:

Tableau5:Caractéristiquesetfonctionsdessous-typesdeneutrophiles(d'aprèsChristoffersonetPhillison105

)

On voit donc que non seulement la cytométrie de flux reste une technique couteuse et

requérantunecertainetechnicité,maislesprogrèstechniquesetdesconnaissancessurcette

populationcellulaireconduisentàs’interrogersurlapertinencedeteloutelmarqueurpour

l’identification de ces cellules et les différences au sein de la population ciblée. Est-ce

Table 1 The features and functions of neutrophil subtypes

Neutrophil subtype Defining features Function Model system Reference

N1 (antitumor) Hypersegmented nuclei, highTNFα, ICAM-1, FAS

Cytotoxic (through ROS) Mouse, subcutaneous andorthotopic tumors

Fridlender et al. 2009

N2 (protumor) Circular nuclei, high arginase,CCL2, CCL5

T cell inactivation, angiogenic factors, matrixdegradation

N1 (pro-inflammatory) Ly6G+, CD206− Promotes adverse ventricle wall remodeling Mouse, myocardial infarction Ma et al. 2016N2 (anti-inflammatory) Ly6G+, CD206+ Attenuates adverse ventricle wall remodeling

SiglecFhi (protumor) SiglecFhi, Cancer promotion; myeloid cell recruitment,angiogenesis, T cell suppression

Mouse, KP lung tumor,Human, non-small cell lung

cancer patients

Engblom et al. 2017

Pro-tumorigenic VEGF, MMP-9, CXCR4,IFNγ-responsive

Proangiogenic, matrix degradation Mouse, subcutaneous tumorsand metastases, Matrigel assay

Jablonska et al. 2010

Pro-angiogenic CD49d, CXCR4, VEGFR1, MMP-9 Accumulate at hypoxic sites and stimulateangiogenesis

Mouse, transplanted hypoxic tissue,hindlimb ischemia, recruitmentmodels

Christoffersson et al.2012,

Massena et al. 2015

Reverse-migrated Activated morphology Can re-mount responses to microbes and injuries Zebrafish wounding and infection Ellett et al. 2015

PMN-N BNormal^ neutrophils, round nuclei,CD49d−, CD11b−, TLR-2,-4,-9

No effect on macrophages Mouse, MRSA infection Tsuda et al. 2004

PMN-I Multilobular nuclei, CD49d+, CD11b−,IL-12, CCL3, TLR-2,-4,-5,-8

Activates M1 macrophages

PMN-II Ring-shaped nuclei, CD49d−, CD11b+,IL-10, CCL2, TLR-2,-4,-7,-9

Activates M2 macrophages

IL-17A-producingneutrophils

RORγt, IL-17 Clear infections Human blood, cystic fibrosis –pseudomonas aeruginosa-infected,mouse, fungal infection

Taylor et al. 2014,2016,

High density neutrophils Hypersegmented nuclei Anti-tumor Mouse, tumor models,Human cancer

Sagiv et al. 2015Low density neutrophils Banded/ring-shaped to hypersegmented

nucleiTumor-permissive

CD62Lbright/CD16bright Multilobular nuclei, Human; LPS administration tovolunteers

Pillay et al. 2010, 2012CD62Ldim/CD16bright Hypersegmented nuclei, CD11chi,

CD11bhi, CD54hiROS release to control T cell proliferation

CD62Lbright/CD16dim Banded nuclei, CD11clo, CD11blo,CD54lo

CellTissueRes

(2018)371:415–423419

68

raisonnabledeciblertoutelapopulationavecununiquemarqueurmembranaireouserait-ce

plusprécisde l’analyser au caspar casen fonctionde laquestionposéeoud’utiliserune

combinaisondemarqueurs?

Une autre approche très étudiée consiste à relier l’activité de laMPO contenue dans les

granulesdesneutrophilesàlaquantitédecellulesneutrophiliques.Uneétudemajeureaété

conduiteparPullietal(201373),montrantunerelativementbonnecorrélationaveclaquantité

deneutrophilesdansdifférentstissusavecunprotocolestandardisédontlesrésultatssont

répétables.Enquantifiantl’activitédelaMPOàpartirdebroyatstissulairesàl’aided’untest

ELISA,Pullietsonéquipeontpuquantifierlesneutrophilesinfiltrésdefaçonindirecte.Cetest

est à la fois simple et robuste, une fois les anticorps anti-MPO correctement identifiés et

l’ELISAmisaupoint. Les champsd’applicationpotentiels sontnombreux.Compte tenude

l’absenced’étudesavecuneméthodeaussidétailléepourlaquantificationdesneutrophiles

par ELISA, son développement pour une future enmédecine vétérinaire incluant l’espèce

bovine,estenvisageabledanslesuividecertainesaffectionstrèsrépandues.

Lediagnosticdenombreusesaffectionspourraitbénéficierdecetapporttechnique.Eneffet,

les infections de la sphère respiratoire, mammaire et génitale sont particulièrement

fréquenteschezlesbovins.Lesneutrophilesontunrôleparticulierdanslesinfectionscomme

lespneumoniesoulesmammitesd’originebactérienne.Mêmes’ilsparticipentàl’élimination

des infections, lesneutrophilesproduisent aussi desdommages tissulaires à la suitede la

libération de leur contenu intracellulaire, qui est un facteur important des atteintes des

parenchymes.Desétudesontmontréque larégulationdunombreetde ladiapédèsedes

neutrophiles permettait d’atténuer les signes cliniques des animaux atteints 106. Plusieurs

étudessesontintéressésàlacinétiquedel’infiltrationdesneutrophilessuiteàdesépisodes

destressouchezdesanimauxsoumisàdes infectionsviralestels leBVDou l’herpèsvirus

Bovinde type1107.Alorsque lepremier induituneneutropénie favorableàdes infections

pulmonaires d’origine bactérienne, le second induit une infiltration leucocytaire dont des

neutrophiles activés délétères au tissu pulmonaire. Comme relaté dans des études en

médecinehumaine,ilexisteunecorrélationentrel’activitédelaMPOdessécrétionsnasales

et la présence de neutrophiles95. Il faut cependant déterminer des seuils d’interprétation

69

permettantl’interprétationdesrésultatsdecesmesures.Ladéterminationdeseuilschezdes

veauxatteintspermettraituncriblagerapidedesanimauxatteints,permettantdumêmecoup

untraitementprécoce.

Parailleursenélevagelaitier,lesmammitesetendométritessonttrèsfréquentespendantle

peripartum.

Lasélectiongénétiquedesanimauxainsiquelesavancéesdanslanutritionetdanslagestion

del’élevageontpermisuneaugmentationdelaproductionlaitièreparanimal.Cependant,

parallèlementàcettehausseuneprédispositionauxmaladiesmétaboliquesetinfectieuses

estobservée.Ellesontlacaused’importantespertespourl’industrielaitière.Lapériodede

sensibilitémaximale s’étendde la3emesemaineprécédant laparturition jusqu’à la3eme

semainepost-partum,désignéepériodede transitionpendant laquelle les vaches laitières

hauteproductricessubissentdenombreuxchangements:qu’ilssoienthormonauxàlasuite

delaparturitionetledébutdelalactation,métaboliquesavecleschangementsnutritionnels

etl’exportationfortedegrandesquantitésd’énergieetdeprotéines,enplusdel’évolution

concurrente demaladies infectieuses. Ces changements sont fortement liés entre eux et

évoluentconcomitamment.Environ75%despathologiesrencontréeschezlavachelaitière

s’expriment pendant cette période de transition.Différentes études se sont penchées sur

l’activité des neutrophiles pendant cette étape de transition, et malgré les différentes

méthodesutiliséesdesrésultatscontradictoiresontétéobtenus.Ilenressortnéanmoinsque

l’activitépro-inflammatoiredesneutrophilesestaugmentée.108McDougallatal(2017)109ont

démontréquechezdesvachessainesuneneutrophiliepassagèrerelativeàlahaussedela

cortisolémiedueàlamisebasetuneréductiondescapacitédediapédèseétaientprésentes

enperipartum.Ladiminutiondunombredeneutrophilescirculantspeutêtreimputableàune

migrationdesneutrophilessuiteaudéveloppementd’infectionsauseindestissusutérinou

mammaire.

Lesendométritessontdéfiniescommeuneinflammationendométrialeprésenteau-delàde

21joursaprèslaparturitionenl’absencedesignescliniquessystémiques.Histologiquement,

on retrouve une interruption de la continuité de l’épithélium et la présence de cellules

inflammatoiresavecpourl’essentieldesneutrophiles.Lediagnosticcytologiquereposesur

l’identificationd’uneaugmentationdelaproportiondesneutrophilesdansleséchantillonsà

70

lasuiteduprélèvementutérinparcytobrosseousurdesprélèvementsdefaiblequantitéde

lavage utérin. Ces tests de référence sont capables de diagnostiquer des endométrites

cliniques et subcliniques sur la base du pourcentage de neutrophiles dénombrés. Un

pourcentage supérieur à 5% de neutrophiles serait le signe d’une inflammation et d’une

endométritepossiblementsubclinique.Cesendométritesnesontpastoujoursdétectéeset

sont la cause de nombreux échecs de reproduction, synonymes d’importantes pertes

économiquesdanslesélevagesbovins110.

Par ailleurs les mammites figurent parmi les causesmajeures de pertes économiques en

élevage laitier. Ces pertes sont la conséquence du retrait du lait dont la concentration

cellulaireest tropélevéeet lecoûtdestraitementsréaliséspourenrayer les infections.La

techniquediagnostiquedesmammites lapluscommunereposesur ledénombrementdes

cellulessomatiquedans le lait,quisontessentiellementdesneutrophilespourdesvaleurs

augmentéeslorsd’infection111.

Ainsi, pour les trois affectionsmajeuresde l’élevagebovin, il existeune augmentationdu

nombre de neutrophiles localement recrutés. La détection précoce de ces signes

inflammatoiresestessentiellepourlapriseenchargelamiseenœuvredutraitement,etainsi

minimiserlespertesdeproduction.Pourcela,ilconvientd’utiliserdesmoyensdiagnostiques

fiables,rapidesetpeuonéreux.Touttestdiagnostiqueapplicableauplusprèsdel’animalest

essentiel, notamment en médecine vétérinaire. Tout retard de diagnostic réduit

significativementlaprobabilitédeguérison.

Un biomarqueur est une caractéristiquemesurable et évaluée comme un indicateur d’un

processus normal, pathologique ou d’une réponse pharmacologique d’un essai

thérapeutique.Unbiomarqueurinformatifdoitréuniruncertainnombredequalités,comme

laspécificité, lasensibilité, lecaractèrerépétable.Enoutre,pourquecebiomarqueursoit

utilisableenroutineildoitêtrefacileàmettreenœuvreetpeuonéreux.

ilexistedoncunepossibilitédedévelopperuntestnoninvasifdedétectiondesneutrophiles

de façon indirecte, comme l’indique l’étude de Pulli, au travers de lamesure de l’activité

enzymatiquedelaMPO.Ilestpossiblequ’untestbasésurdesanticorpsmonoclonauxcontre

laMPObovine soitutilisabledans les trois situationsdécrites. Les anticorpsmonoclonaux

peuventaisémentêtreproduitsparlestechniquesusuelles,pargéniegénétiqueoupardes

71

protocoles conventionnels par immunisation de la souris Dans les expériences de Pulli, le

contenuintracellulaireestextraitafind’isolerlamyélopéroxydasecontenuedanslesgranules

neutrophiliquesàl’aided’acétone.Danschaquecas,desétudesontmontréquelamesurede

l’activitédelaMPOestpotentiellementexploitable.Eneffet,ledéveloppementdecetypede

testadéjàétéenvisagéafindedétecterlaprésenced’unemammitechezlavachelaitière;il

conviendrait d’établir le lien avec la concentration neutrophilique et le diagnostic de

mammitessubcliniques102.Demême,enmédecinehumaine,l’analysedel’activitédelaMPO

dans les sécrétions nasales est utilisée en tant quemarqueur de l’inflammationdes voies

respiratoires lors de bronchites chroniques (et dans le suivi des traitements de ces

affections)95. Il serait intéressant d’examiner des situations propres aux bovins. Pour cela,

outre le développement de tests performants, à la condition que les réactifs nécessaires

soient disponibles, il sera ensuite nécessaire d’établir la relation entre la quantité de

neutrophilesetl’activitépéroxydasique,afindefixerdesseuilsd’interprétation.Ilconviendra

égalementdedéterminer les concentrations idéalesdemesureafind’établir un intervalle

dans lequel on observe une relation linéaire entre l’activité MPO et la concentration

neutrophilique.

72

3 Conclusion

L’objectifdenotretravailétaitd’analyserlesdonnéespubliéesdisponiblesafindecomparer

les dernières techniques de mesure des neutrophiles et d’identifier une technique

performante, rapide, peu couteuse, et moins dépendante de ressources techniques

spécialisés, et éventuellement transposable à la pratique quotidienne des vétérinaires

praticiensenélevagebovin. L’utilisationd’unbiomarqueurdirectdesneutrophiles semble

l’approchelaplusadaptée.

Denombreusesétudesontanalysél’activitédelaMPOcontenuedanslesneutrophilesafin

de déterminer leur nombre de façon indirecte lors d’inflammation neutrophilique. les

techniquesontévoluéetdesprotocolessensiblesetrépétablesontétéproposés.Graceàune

testELISAilestpossiblederelierl’activitéperoxydasiqueàl’infiltrationneutrophilique,même

lorsquecelui-ciestenfaiblequantité.

Il seraitdonc intéressantdemettreenœuvredesexpériencesafind’étendre leprotocole

proposéàlamesuredel’activitédelaMPObovinedanslebutdeproposeruntestdiagnostic

précoce et non invasif utilisable pour trois maladies caractérisées par une infiltration

neutrophiliquedestissus.

73

Références:1. Espinosa,E.&Chillet,P.Immunologie.(2010).2. Shah,B.,Burg,N.&Pillinger,M.H.Neutrophils.KelleyandFirestein’sTextbookof

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{FormattingCitation}

80

DUPONTChristophe

TITRE:Lesgranulocytesneutrophiles:morphologie,fonctionsetméthodesdequantificationdansl’espèce

bovine.

Résumé:

Lesneutrophilessontlesplusgrandseffecteursdel’immunitéinnée.Ilsillustrentlapremièrelignededéfensecontrelesinfectionsbactériennes,viralesoufongiques.Laréponseinflammatoiremédiéeparlesneutrophilesestcomplexeetsedérouleenplusieursétapes.Lamyélopéroxydase(MPO)estuneprotéinehémiqueprésenteuniquementdanslesneutrophiles,notammentchezlesbovins.Parmilesdifférentesméthodesdequantificationdesneutrophilesanalysésuneméthodeproposéerécemmentamènedesopportunitésdedéveloppementd’untestrapidedequantificationdesneutrophilesautraversd’undosagedel’activitédelaMPOdansdestissusgrâceàunmarquageparELISA.Chezlesbovinsunbiomarqueurseraitutiledanstroispathologiesspécifiquesrencontréesenélevagebovinetàfortimpactéconomique.Eneffetledéveloppementd’untestrapidedel’inflammationrespiratoire,mammaireainsiqu’utérineseraitlargementbénéfiqueàlapratiquevétérinairerurale. Motsclés:neutrophiles,inflammation,myélopéroxydase,ELISA,bovin,quantificationAbstract:

Neutrophilsarethemaineffectorsofinnateimmunity.Theyillustratethefirstlineofdefenseagainstinfectionofbacteria,virusesorfungi.Theinflammatoryresponsemediatedbyneutrophilsiscomplexandhappensinseveralsteps.Themyeloperoxidaseisahemeproteinfoundonlyinneutrophils,includedinthebovinespecie.Amongdifferentquantificationmethodsofneutrophilsintissuesanewmethodhasbeenproposed.ItisanopportunityofdevelopmentofaquicktestforneutrophilsquantificationbasedonMPOactivityintissuesampleswithanELISAtest.Incowsanusefulbiomarkerofrespiratory,mammaloruterinediseasecouldbehelpfulconsideringtheeconomicimpactforfarmersofthosediseases.Suchtestcouldbeveryadvantageousinveterinarianpractice.

Keywords:neutrophils,inflammation,myeloperoxidase,ELISA,bovine,quantification

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Les granulocytes neutrophiles : morphologie, fonctions et ... · morphologie, fonctions et méthodes de quantification dans l’espèce bovine. Thèse d'exercice, Médecine vétérinaire,