La trascrizione: da DNA ad RNA

An organism may contain many types of somatic cells, each with distinct shape and

function. However, they all have the same genome. The genes in a genome do not have any

effect on cellular functions until they are "expressed". Different types of cells express

different sets of genes, thereby exhibiting various shapes and functions.

Gene expression" means the production of a protein or a functional

RNA from its gene. Several steps are required:

Transcription: A DNA strand is used as the template to synthesize a

RNA strand, which is called the primary transcript.

RNA processing: This step involves modifications of the primary

transcript to generate a mature mRNA (for protein genes) or a

functional tRNA or rRNA.

For RNA genes (tRNA and rRNA), the expression is complete after a

functional tRNA or rRNA is generated. However, protein genes

require additional steps:

Nuclear transport: mRNA has to be transported from the nucleus to

the cytoplasm for protein synthesis.

Protein synthesis: In the cytoplasm, mRNA binds to ribosomes,

which can synthesize a polypeptide based on the sequence of mRNA.

The central dogma

According to the above process, the flow of genetic information is in

the following direction:

DNA > RNA > Protein.

This rule was dubbed the "central dogma", because it was thought

that the same principle would apply to all organisms. However, we

now know that for RNA viruses, the flow of genetic information starts

from RNA.

Schematic illustration of transcription. (a) DNA before transcription. (b)

During transcription, the DNA should unwind so that one of its strand can

be used as template to synthesize a complementary RNA.

Growth of a nucleic acid strand is always in the 5' to 3' direction. This is true not only

for the synthesis of RNA during transcription, but also for the synthesis of DNA during

replication. The enzymes, called polymerases, are used to catalyze the synthesis of nucleic

acid strands. RNA strands are synthesized by RNA polymerases. DNA strands are

synthesized by DNA polymerases.

The entire transcription process should involve the following essential steps:

(i) Binding of polymerases to the initiation site. The DNA sequence which signals the

initiation of transcription is called the promoter. Prokaryotic polymerases can recognize

the promoter and bind to it directly, but eukaryotic polymerases have to rely on other

proteins called transcription factors.

(ii) Unwinding (melting) of the DNA double helix. The enzyme which can unwind the

double helix is called helicase. Prokaryotic polymerases have the helicase activity, but

eukaryotic polymerases do not. Unwinding of eukaryotic DNA is carried out by a specific

transcription factor.

(iii) Synthesis of RNA based on the sequence of the DNA template strand. RNA

polymerases use nucleoside triphosphates (NTPs) to construct a RNA strand.

(iv) Termination of synthesis. Prokaryotes and eukaryotes use different signals to terminate

transcription. [Note: the "stop" codon in the genetic code is a signal for the end of peptide

synthesis, not the end of transcription.]

Transcription in eukaryotes is much more complicated than in prokaryotes, partly because

eukaryotic DNA is associated with histones, which could hinder the access of polymerases

to the promotor.

Transcription is a process in which one DNA strand is used as template to

synthesize a complementary RNA. The following is an example:

Note that uracil (U) of RNA is paired with adenine (A) of DNA. There are a few

different names for these nucleic acid strands. The DNA strand which serves as

the template may be called "template strand", "minus strand", or "antisense

strand". The other DNA strand may be termed "non-template strand", "coding

strand", "plus strand", or "sense strand". Since both DNA coding strand and RNA

strand are complementary to the template strand, they have the same sequences

except that T in the DNA coding strand is replaced by U in the RNA strand.

The function of RNA polymerases

Both RNA and DNA polymerases can add nucleotides to an existing strand, extending its

length. However, there is a major difference between the two classes of enzymes: RNA

polymerases can initiate a new strand but DNA polymerases cannot. Therefore, during DNA

replication, an oligonucleotide (called primer) should first be synthesized by a different

enzyme.

The chemical reaction catalyzed by RNA polymerases is shown. The nucleotides used to

extend a growing RNA chain are ribonucleoside triphosphates (NTPs). Two phosphate groups

are released as pyrophosphate (PPi) during the reaction. Strand growth is always in the 5' to 3'

direction. The first nucleotide at the 5' end retains its triphosphate group.

Simplified presentation for the

chain elongation. The vertical

line represents the pentose and

the slanting line denotes the

phosphodiester bond. Bases

are designated as N1, N2, etc.

The chemical reaction catalyzed

by RNA polymerases.

Classes of RNA polymerases

E. coli

An E. coli RNA polymerase is composed of five subunits: two subunits, and one for each

, ', and subunit. (151 kD) and ' (156 kD) are significantly larger than (37

kD). Several different forms of subunits have been identified, with molecular weights

ranging from 28 kD to 70 98ik98ik4kD. The subunit is also known as the factor. It

plays an important role in recognizing the transcriptional initiation site, and also possesses

the helicase activity to unwind the DNA double helix. Nucleotide synthesis is carried out

by other four subunits, which together are called the core polymerase. The term

"holoenzyme" refers to a complete and fully functional enzyme. In this case, the

holoenzyme includes the core polymerase and the factor.

Eukaryotes

There are three classes of eukaryotic RNA polymerases: I, II and III, each comprising two

large subunits and 12-15 smaller subunits. The two large subunits are homologous to the E.

coli and ' subunits. Two smaller subunits are similar to the E. coli subunit. However,

the eukaryotic RNA polymerase does not contain any subunit similar to the E. coli

factor. Therefore, in eukaryotes, transcriptional initiation should be mediated by other

proteins.

RNA polymerase II is involved in the transcription of all protein genes and most snRNA

genes. It is undoubtedly the most important among the three classes of RNA

polymerases. The other two classes transcribe only RNA genes. RNA polymerase I is

located in the nucleolus, transcribing rRNA genes except 5S rRNA. RNA polymerase III is

located outside the nucleolus, transcribing 5S rRNA, tRNA, U6 snRNA and some small

RNA genes.

Transcription Mechanisms in Prokaryotes

In prokaryotes, binding of the polymerase's s factor to promoter can catalyze unwinding of

the DNA double helix. The most important s factor is Sigma 70, whose structure has been

determined by x-ray crystallography, but its complex with DNA has not been solved.

(a) (b)

The structure of Sigma 70 and its DNA binding site. (a) Structure of Sigma 70, residues 114 to

448. PDB ID = 1SIG. (b) A model for the binding between Sigma 70 and the promoter, based on

biochemical studies. Residues Y425, Y430, W433 and W434 are directly involved in the unwinding

(melting) of the double helix.

The promoter is rich in A and T. The AT pair involves two hydrogen bonds whereas the

CG pair involves three hydrogen bonds. Therefore, AT pairs are easier to separate. The

DNA replication origin is also rich in A and T.

After the DNA strands have been separated at the promoter region, the core polymerase

(') can then start to synthesize RNA based on the sequence of the DNA template

strand. Since the role of the factor is mainly to initiate transcription, it will be released

after about 10 ribonucleotides have been polymerized.

Elongation of the RNA strand continues until the core polymerase reaches the termination

site.

Tipi di RNA polimerasi DNA-dipendenti

Polimerasi Geni trascritti

Batteri

RNA polimerasi Tutti i geni batterici

Nuclei eucariotici

RNA polimerasi I Geni dell’RNA ribosomiale (rRNA)

RNA polimerasi II mRNA, snoRNA, alcuni snRNA,

miRNA

RNA polimerasi III tRNA, 5S rRNA, alcuni snRNA

RNA polimerasi IV (soltanto nei

vegetali?)

siRNA coinvolti nella formazione di

eterocromatina

Organelli eucariotici

RNA polimerasi mitocondriale Geni mitocondriali

RNA polimerasi del cloroplasto

(multiple; codificate sia nel

cloroplasto che nel nucleo)

Geni del cloroplasto

I promotori batterici hanno due sequenza consenso distinte

Struttura del fattore batterico e dell’oloenzima della RNA polimerasi

Cambiamenti

conformazionali

durante i passaggi di

inizio della trascrizione

Terminazione della

trascrizione

Transcriptional Termination in Prokaryotes

In prokaryotes, the transcription is terminated by two major mechanisms: Rho-independent

(intrinsic) and Rho-dependent.

The Rho-independent termination signal is a stretch of 30-40 bp sequence, consisting of

many GC residues followed by a series of T ( "U" in the transcribed RNA). The resulting

RNA transcript will form a stem-loop structure to terminate transcription.

The stem-loop structure of the RNA transcript as a termination signal for the

transcription of the trp operon.

Rho-dependent mechanism

Rho is a ~ 50 kD protein, involved in bout half of E. coli transcriptional terminations. It

has been well established that six Rho proteins form a hexamer to terminate

transcription, but the precise mechanism is not clear. Experiments suggest that two

components are essential: (i) the upstream Rho loading site and (ii) the downstream

termination site. The Rho hexamer first binds to the RNA transcript at the upstream site

which is 70-80 nucleotides long and rich in C residues. Upon binding, the Rho hexamer

moves along the RNA in the 3' direction. If movement of the polymerase is slow, the

Rho hexamer will catch up and terminate the transcription at the downstream termination

site. Rho has ATPase activity which can induce release of the polymerase from DNA.

Correzione delle bozze da parte della RNA polimerasi

Regolazione della trascrizione

nei procarioti e negli eucarioti

Gene's Regulatory Elements

Transcriptional regulation is mediated by the interaction between transcription factors and

their DNA binding sites which are the cis-acting elements, whereas the sequences encoding

transcription factors are trans-acting elements. The cis-acting elements may be divided

into the following four types:

Promoters

Enhancers

Silencers

Response elements

Gene organization. The

transcription region consists

of exons and introns. The

regulatory elements include

promoter, response element,

enhancer and silencer (not

shown). Downstream

refers to the direction of

transcription and upstream

is opposite to the

transcription direction. The

numbering of base pairs in

the promoter region is as

follows. The number

increases along the direction

of transcription, with "+1"

assigned for the initiation

site. There is no "0"

position. The base pair just

upstream of +1 is numbered

"-1", not "0".

Promoter is the DNA region where the transcription initiation takes place. In prokaryotes,

the sequence of a promoter is recognized by the Sigma (s) factor of the RNA

polymerase. In eukaryotes, it is recognized by specific transcription factors.

E. Coli

E. coli has five sigma factors:

Sigma 70: Regulate expression of most genes.

Sigma 32: Regulate expression of heat shock proteins.

Sigma 28: Regulate expression of flagellar operon (involved in cell motion).

Sigma 38: Regulate gene expression against external stresses.

Sigma 54: Regulate gene expression for nitrogen metabolism.

E. coli factors and the consensus sequences

of their recognition sites (promoters).

Table shows the consensus sequences of the promoters recognized by E. coli factors

(except for Sigma 38 which is not clear). The consensus sequence is an ideal sequence for

the interaction with its regulatory protein. A promoter should contain an element which is

identical to or very close to the consensus sequence.

Direzione della

trascrizione

intorno al genoma

circolare di E. coli

Modello dell’operone di Jacob e Monod

The lac Operon Promoter

The lac operon of E. coli was used by Francois Jacob, Andre Lwoff and Jacques Monod to

investigate the transcription mechanism in 1960s, providing the first molecular details. Its

promoter sequence is shown in the following figure.

(a)

(b)

The lac operon promoter (

which regulates the

transcription of lacZ, not

lacI). (a) Presented so that

the genome sequence

numbers increase from left

to right. Its 5' to 3'

sequence is the same as in

the database (ACCESSION

AE000141). (b) Presented

so that the promoter

sequence numbers increase

from left to right. Its 5' to

3' sequence is comparable

to the consensus sequence.

(a)

(b)

E. coli operons. An operon consists of several genes which are transcribed together.

(a) The lac operon comprises lacA, lacY and lacZ. The lacI gene is not part of the operon,

but encodes a protein which could repress transcription of the lac operon.

(b) The trp operon consists of trpA, trpB, trpC, trpD, and trpE.

(Numbers represent the genome sequence

The DNA's two strands are complementary to each other. Only one strand's sequence is

sufficient to represent both strands' information. By convention, the sequence of the 5' to 3'

strand (from left to right) is used. From the above figure, the promoter sequence of the lac

operon is TATGTT at the -10 region, and TTTACA at the -35 region. The consensus

sequence of s70 which regulates the lac operon is TATAAT at the -10 region, and

TTGACA at the -35 region. They differ at three positions (two at the -10 region and one

at the -35 region). Experimentally, it has been found that binding of the RNA polymerase

to the lac promoter is relatively weak. Transcription of the lac operon often requires an

activation such as catabolite activator protein (CAP).

Transcriptional activation by CAP

In the absence of any transcriptional activator, binding of the polymerase to the promoter

of the lac operon is weak. The binding site of the catabolite activator protein (CAP) is

located just upstream of the promoter. In such case, the activator can enhance transcription

by direct contact with the polymerase, making it bind more efficiently to the promoter.

Transcriptional inhibition by lac repressor

The silencer (also known as operator) of the lac operon is located at the transcriptional

start site. When the lac repressor binds to this region, it will block the movement of the

polymerase, thereby inhibiting transcription.

Dimostrazione

sperimentale

del legame del

repressore lac

all’operatore

Regulation of lac Operon Transcription

Regulation of the lac operon transcription. (a) by CAP. (b) by lac repressor

Structure of the lac repressor/operator complex. The repressor is a homodimer. Each

subunit is represented by a different color. PDB ID = 1LBG.

Regolazione dell’operone lac

da parte di glucosio e lattosio

Complesso

CAP-DNA

Dimostrazione sperimentale della

formazione di un’ansa di DNA

L’operone del Triptofano (trp)

• La regolazione dell’operone del trp nei batteri è un classico esempio di attenuazione trascrizionale.

• Due meccanismi di attenuazione:

• Controllo post-trascrizionale mediante ripiegamento differenziale dell’mRNA.

• Controllo dell’inizio della trascrizione dell’operone trp mediante il legame di un repressore, attivato dal legame con il triptofano, a siti operatori, con conseguente blocco dell’accesso della RNA polimerasi al promotore trp.

Attenuazione

trascrizionale del

operone trp di E. coli

Meccanismi d’azione dei regolatori trascrizionali

• Legame cooperativo delle proteine al DNA: importante sia nei procarioti che negli eucarioti; es. della proteina CAP che ha un dominio di legame al DNA ed un dominio detto “regione di attivazione” che entra in contatto con la RNA polimerasi che si lega al promotore.

• Modificazioni allosteriche e legame al DNA: ci sono due esempi, 1) il legame del cAMP alla proteine CAP che induce un cambiamento allosterico in quest’ultima per cui si lega più saldamente al DNA; 2) il legame dell’allolattosio o dell’IPTG alla proteina repressore dell’operone lac che induce un cambiamento allosterico nel repressore che fa diminuire la sua capacità di legarsi al DNA.

• Formazione di anse da parte del DNA: la formazione di anse di DNA permette a proteine, anche distanti, legate sul DNA di interagire con la DNA polimerasi legata al promotore.

La trascrizione negli eucarioti e sua

regolazione

Transcription Mechanisms in Eukaryotes

In eukaryotes, there are three classes of RNA polymerases: I, II and III. This section will

focus on the RNA polymerase II (Pol II), which is involved in the transcription of all

protein genes.

Structure of the human TBP core domain complexed with DNA as determined by x-ray

crystallography. The DNA includes the TATA element. PDB ID = 1CDW.

Formazione del complesso

di preinizio ed inizio della

trascrizione

Assembly of the Pre-Initiation Complex (PIC)

TBP first binds to the promoter and then

recruits TFIIB to join TFIID (and TFIIA if

present). Before entering PIC, RNA Pol II and

TFIIF are bound together, which are recruited

by TFIIB. Finally, RNA Pol II recruits TFIIE,

which further recruits TFIIH to complete the

PIC assembly.

Struttura della

RNA Pol II

General transcription factors associated with RNA Pol II in human cells.

Fosforilazione della RNA pol II

Attività elicasica di TFIIH

Una regione contenente la TATA

box promuove l’inizio specifico

della trascrizione in vitro

Eukaryotes

In eukaryotes, there is a significant difference between the transcription of protein

genes and RNA genes.

The most common promoter element in eukaryotic protein genes is the TATA box,

located at -35 to -20. Its consensus sequence, TATAAA, is quite similar to the -10

region of the Sigma 70 recognition site. Another promoter element is called the

initiator (Inr). It has the consensus sequence PyPyAN(T/A)PyPy, where Py

denotes pyrimidine (C or T), N = any, and (T/A) means T or A. The base A at the

third position is located at +1 (the transcriptional start site).

TATA box and initiator are the core promoter elements. There are other elements

often located within 200 bp of the transcriptional start site, such as CAAT box and

GC box which may be referred to as promoter-proximal elements.

Eukaryotic promoter elements.

The protein which interacts with the initiator and TATA box is known as the TATA-box

binding protein (TBP), because the TATA box was discovered earlier than the

initiator. TBP recognizes not only the core promoter of protein genes, but also RNA

promoter. It is a subunit of the general transcription factor TFIID. In eukaryotes,

transcription requires several different general transcription factors and, in most cases, the

regulatory transcription factors.

Confronto fra un’unità trascrizionale semplice ed una complessa della RNA pol II

I motivi del nucleo del promotore della RNA pol II

Promotore Posizione Fattore di trascizione Sequenza consenso

Elementi a monte del nucleo del promotore

BRE

TATA Box

Iniziatore

-37 a -32

-31 a -26

-2 a +4

TFHB

TBP

TAF1 e TAF2

(G/C)(G/C)(G/A)CGCC

TATA(A/T)AA(G/A)

PyPyA+1N(T/A)PyPy

Elementi a valle del nucleo del promotore

MTE

DPE

+18 a + 27

+28 a + 32

TFIID

TAF9 e TAF6

C(G/A)A(A/G)C(G/C)

(C/A/G)AACG(G/C)

(A/G)G(A/T)(C/T)(G/A/

C)

Elementi prossimali del promotore

CAAT box

GC box

-200 a -70

-200 a -70

CBF, NF1, C/EBP

Sp1

CCAAT

GGGCGG

CBF: fattore che lega CAAT; C/EBP: proteina che lega CAAT/enhancer.

Initiation

RNA Pol II does not contain a subunit similar to the prokaryotic factor, which can

recognize the promoter and unwind the DNA double helix. In eukaryotes, these two

functions are carried out by a set of proteins called general transcription factors. The

RNA Pol II is associated with six general transcription factors, designated as TFIIA,

TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH, where "TF" stands for "transcription factor" and

"II" for the RNA Pol II.

TFIID consists of TBP (TATA-box binding protein) and TAFs (TBP associated

factors). The role of TBP is to bind the core promoter. TAFs may assist TBP in this

process. In human cells, TAFs are formed by 12 subunits. One of them, TAF250 (with

molecular weight 250 kD), has the histone acetyltransferase activity, which can relieve the

binding between DNA and histones in the nucleosome.

The transcription factor which catalyzes DNA melting is TFIIH. However, before TFIIH

can unwind DNA, the RNA Pol II and at least five general transcription factors (TFIIA is

not absolutely necessary) have to form a pre-initiation complex (PIC).

Regolazione della trascrizione negli eucarioti

• Concetto di elementi cis-agenti and trans-agenti del

DNA e fattori trans-agenti.

• Fattori che intervengono nella regolazione della

trascrizione negli eucarioti:

• Interazioni DNA-proteina;

• Interazioni proteina-proteina;

• Struttura della cromatina;

• Architettura del nucleo;

• Compartimentazione cellulare.

Il controllo dell’espressione genica negli eucarioti può

essere

esercitato a molti livelli oltre che a livello trascrizionale.

Regolazione della trascrizione negli eucarioti

• La RNA polimerasi II è responsabile della trascrizione della

grande maggioranza dei geni eucariotici:

• Geni codificanti per mRNA;

• Geni codificanti per snoRNA;

• Geni codificanti per alcuni snRNA;

• Geni codificanti per microRNA.

• Negli eucarioti esistono altre due RNA polimerasi: RNA

polimerasi I localizzata nel nucleolo responsabile della sintesi

dell’rRNA grande; RNA polimerasi III si trova nel

nucleoplasma ed è responsabile della sintesi dell’tRNA,

dell’rRNA 5S e di alcuni snRNA.

Elementi regolatori dei geni codificanti proteine

• Fattori di trascrizione (attivatori o repressori)

CREB, CTCF, FOG-1, GATA-1, NF-E2, NF-B, Sp1.

• Macchinario generale della trascrizione RNA pol

II, TFIIB, TFIID (TBP + TAF), TFIIE, TFIIF, TFIIH,

Mediatore.

• Coattivatori e corepressori complessi di

modificazione della cromatina (HAT, HDAC, CBP,

HMT, LSD1), complessi di rimodellamento della

cromatina (SWI/SNF, ISWI, SWR1).

• Fattori di allungamento FACT, allungatore, TFIIS.

Elementi regolatori a lungo raggio

Questi elementi degli eucarioti multicellulari comprendo:

• Enhancer;

• Silenziatori;

• Isolatori;

• Regioni di controllo del locus (LCR);

• Regioni di attacco alla matrice (MAR).

Alcuni enhancer che sono negli introni contribuiscono

all’espressione tessuto-specifica enhancer nel secondo

introne del gene dell’apolipoproteina B (apoB delle LDL).

Enhancer e silenziatori

• Questi elementi sono di solito a 700 – 1000 o più bp

di distanza dal sito di inizio della trascrizione.

• Gli enhancer si possono trovare sia a monte che a

valle del gene, o dentro un introne, e possono

funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto al

promotore.

• Un enhancer è lungo 500 bp e contiene 10 siti di

legame per fattori di trascrizione diversi.

• I silenziatori sono elementi simili agli enhancer, ma

reprimono l’espressione del gene.

Tre caratteristiche cruciali di

un elemento enhancer

Enhancer e silenziatori:

A distanza di 700-1000

o più bp dal sito di inizio

Della trascrizione.

Histone Acetylation

Acetylation of the lysine residues at the N terminus of histone proteins removes positive

charges, thereby reducing the affinity between histones and DNA. This makes RNA

polymerase and transcription factors easier to access the promoter region. Therefore, in

most cases, histone acetylation enhances transcription while histone deacetylation

represses transcription.

Acetylation and deacetylation

of the lysine residue.

Histone acetylation is catalyzed

by histone acetyltransferases

(HATs) and histone

deacetylation is catalyzed by

histone deacetylases (denoted

by HDs or HDACs). Several

different forms of HATs and

HDs have been

identified. Among them,

CBP/p300 is probably the most

important, since it can interact

with numerous transcription

regulators.

Isolatori

Un isolatore è una sequenza di DNA, di solito lunga

300 – 2000 bp, che ha la funzione di:

• Marcatore di un confine di cromatina, tra regioni di

eucromatina ed eterocromatina;

• Attività di blocco di un enhancer o di un silenziatore.

Contiene un gruppo di siti di legame per proteine che

legano sequenze specifiche di DNA.

Gli isolatori funzionano come marcatori dei confini della cromatina e hanno attività di

blocco degli enhancer

Isolatore HS4: sito ipersensibile alla digesione da DNAasi I.

Gli elementi isolatori sono riconosciuti da almeno tre proteine

diverse che legano il DNA: fattore che lega CCCTC (CTCF), fattori

Di stimolazione a monte (USF) 1 e 1.

Regioni di controllo del locus (LCR)

• Le LCR sono sequenze di DNA che organizzano e

mantengono un dominio funzionale di cromatina attiva e fanno

aumentare la trascrizione dei geni a valle.

• Siti ipersensibili (HS) alla DNasi a monte del gruppo dei geni

della -globina.

• Le LCR sono presenti in altri loci genici fra cui: i gruppi di

geni che codificano le -globine, i pigmenti visivi, le proteine

del complesso maggiore di istocompatibilità, gli ormoni della

crescita umani, le serpine, le citochine delle cellule T helper di

tipo 2.

Regione di controllo del locus (LCR): prototipo di LCR è stato caratterizzato

come un gruppo di siti ipersensibili alla Dnasi I a monte del gruppo dei geni

della β-globina.

LCR per altri loci:

• Gruppi di geni codificanti le α-globine;

• Gruppi di geni codificanti i pigmenti visivi;

• Gruppi di geni codificanti le proteine del complesso maggiore di

istocompatibilità;

• Gruppi di geni codificanti gli ormoni della crescita umani;

• Gruppi di geni codificanti le serpine;

• Gruppi di geni codificanti le citochine delle cellule T helper di tipo 2.

Regioni di controllo del locus (LCR)

L’intero locus dei geni della -globina occupa 200

kb.

La LCR è necessaria per la trascrizione ad alto livello

di tutti i geni della famiglia della -globina.

La regolazione della formazione di “anse” di

cromatina è il meccanismo che controlla l’espressione

durante lo sviluppo dei geni della -globina.

La LCR interagisce con un solo promotore genico

alla volta, così da garantire l’espressione differenziale

dei diversi geni durante lo sviluppo.

Regioni di attacco alla matrice (MAR)

L’organizzazione tridimensionale della cromatina ha anche un

ruolo centrale nel controllo della trascrizione negli eucarioti.

Organizzazione in anse indipendenti della cromatina. La

formazione di queste anse dipende da elementi specifici di

sequenza del DNA che sono sparsi in tutto il genoma ad

intervalli di 5 – 200 kb.

Queste sequenze di DNA sono chiamate regioni di attacco alla

matrice (MAR).

Le MAR organizzano il genoma in 60000 anse di cromatina

con una dimensione media di 70 kb.

Regioni di attacco alla matrice (MAR)

I geni attivi tendono a far parte di domini ad ansa piccoli,

mentre quelli inattivi sono associati a domini più grandi.

Più del 70% delle MAR sono ricche di sequenze AT

Le MAR si trovano vicino agli enhancers. Conferiscono

specificità tissutale e controllo durante lo sviluppo

dell’espressione genica reclutando fattori di trascrizione e

richiamando gli enzimi di rimodellamento della cromatina.

MAR strutturali servono come ancore; MAR funzionali sono

dinamiche e aiutano a portare i geni sulla matrice nucleare.

Modello della regolazione trascrizionale da parte delle regioni di attacco alla matrice

(MAR)

I fattori di trascrizione

La regolazione dell’attività trascrizionale dei

geni avviene mediante cambiamenti della

quantità o dell’attività dei fattori di trascrizione.

Questi fattori influenzano la velocità di

trascrizione dei geni “target” positivamente o

negativamente tramite interazioni specifiche con

gli elementi regolatori del DNA e tramite

interazioni con altre proteine.

Meccanismi di regolazione della quantità e dell’attività dei

fattori di trascrizione

Meccanismi con cui agiscono fattori di trascrizione

attivatori per aumentare l’attività trascrizionale

1) Stimolazione del reclutamento e del legame dei

fattori generali di trascrizione e della RNA pol II sul

nucleo del promotore per formare un complesso di

preinizio.

2) Induzione di un cambiamento conformazionale od di

una modificazione post-traduzionale che stimola l’attività

enzimatica del macchinario generale di trascrizione.

3)Interazione con i complessi di rimodellamento e di

modificazione della cromatina per permettere una

migliore accessibilità dei fattori generali di trascrizione o

di attivatori specifici al DNA.

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il

DNA

Motivo elica-giro-elica (HTH) (es. repressore del trp, proteina

CAP, repressore lac, ecc.) l’omeodominio (60

amminoacidi) è una variante del motivo HTH classico che è

presente in molti fattori di trascrizione che regolano lo

sviluppo (anche nei mammiferi).

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il

DNA

• L’omeodominio: un -elica contatta il solco maggiore del DNA

riconoscendo una sequenza di 6 pb (come nel HTH), mentre un braccio

flessibile interagisce specificamente con il solco minore del DNA.

Motivo a dita di Zn Dominio a dito di Zn del recettore

dei glucocorticoidi (GR)

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che

lega il DNA

Motivo a dita di zinco: deriva il nome dallo schema della sua

struttura un atomo di Zn coordina dei residui di cisteine e di

istidine, formando un ansa che ricorda la forma di un dito.

Struttura diffusa in molte famiglie di attivatori trascrizionali

(es. fattore Sp1, recettori degli ormoni steroidei).

Domini a cerniera di leucina

Questo motivo è stato descritto per la prima volta nella

proteina C/EBP che lega CAAT box presente in molti

enhancer.

Appartiene a questo gruppo di attivatori la proteina AP-1, un

eterodimero formato dall’unione di due protooncogeni c-Jun e

c-Fos, che regola l’espressione genica in risposta a vari

stimoli, quali, stress, infezioni virali e batteriche, e

l’attivazione da parte delle citochine.

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che

lega il DNA

Domini a cerniera lampo (leucine zipper): due lunghe strutture ad -elica

che contengono, contemporaneamente, il dominio di dimerizzazione ed il

dominio di legame al DNA. Queste strutture possono formare sia

omodimeri che eterodimeri.

Domini elica-ansa-elica basico (BHLH)

E’ una struttura caratterizzata da due -eliche connesse da un ansa. I fattori

con questo motivo sono in genere eterodimeri, formati da un’elica più

lunga che lega il DNA attraverso amminoacidi basici.

Appartengono a questa famiglia molti attivatori che hanno un ruolo nello

sviluppo, come Myo-D che svolge una funzione fondamentale nel

differenziamento delle cellule muscolari. Un altro esempio è la proteina c-

Myc, che è coinvolta nella trasformazione tumorale (linfoma di Burkitt).

Controllo combinatoriale della trascrizione

Gli attivatori e gli inibitori sono coinvolti nella regolazione di

numerosi geni.

E’ la combinazione tra diversi attivatori ed inibitori che rende

molto specifico il meccanismo di regolazione.

Sequenze di importazione ed esportazione nucleare

Il traffico fra nucleo e citoplasma avviene attraverso i complessi dei posi nucleari (NPC).

I fattori di trascrizione, sintetizzati nel citoplasma, devono attraversare questi pori per giungere nel nucleo.

Le proteine sono indirizzate al nucleo da una sequenza amminoacidica specifica chiamata sequenza di localizzazione nucleare (NLS); ne esistono diverse, ma le più studiate sono le sequenze ricche di a.a basici (Arg e Lys).

Per l’uscita dal nucleo, le proteine devono anche avere una sequenza di esportazione nucleare (NES); le meglio caratterizzate sono le piccole sequenze idrofobiche ricche di Leu.

Per il passaggio attraverso i pori le proteine con sequenze di localizzazione e/o esportazione, si avvalgono di una famiglia di recettori solubili, importine od esportine (carioferine).

Importazione nucleare

regolata

I recettori degli ormoni

steroidei

Importazione nucleare regolata di NF-B

Risposta al cAMP e fattore CREB

P-CREB si lega a siti sul DNA chiamati

CRE (cAMP Response Element).

CREB è strettamente correlato, sia per

struttura che per funzione, a CREM

(cAMP Response Element Modulator)

ed a ATF-1 (Activating Transcription

Factor-1).

DNA Methylation

Methylation on the DNA's cytosine base is commonly used to repress transcription

Transcription of RNA Genes

The products of RNA genes include

rRNA, tRNA and small RNA

molecules. In the mammalian genome,

the three rRNA genes, 28S, 18S, and

5.8S, are clustered as a pre-rRNA gene.

which is transcribed by RNA

polymerase I. tRNA, 5S rRNA and the

U6 snRNA genes are transcribed by

RNA polymerase III. Most snRNA

genes are transcribed by RNA

polymerase II using the same

mechanism as transcribing protein

genes.

Transcription by RNA Polymerase I

RNA polymerase I is devoted to the

synthesis of pre-rRNA. Like RNA

polymerase II, a pre-initiation complex

(PIC) has to be formed before RNA

polymerase I can exert its function.

The PIC assembly for RNA polymerase I. The regulatory region of pre-rRNA gene contains a core element and an

upstream control element (UCE). Binding of two upstream binding factors (UBF) to both elements may induce DNA

looping, and subsequently recruiting TATA-binding protein (TBP) and TBP-associated factors (TAFI). Finally, RNA

polymerase I joins the complex and completes the assembly process.

Transcription by RNA

Polymerase III

Transcription of tRNA

gene

The regulatory region of

tRNA gene contains A box

and B box located inside the

transcription unit. The PIC

assembly begins with the

binding of TFIIIC to both

elements

The PIC assembly for the transcription of tRNA gene.

Duplicated Genes

Most proteins do not need duplicated genes, because the mRNA molecule transcribed from

one gene can be translated into many copies of its protein product. However, rRNA and

tRNA are the final gene products. In order to accelerate the production process, all species

contain an array of tandemly repeated RNA genes. The number of repeats ranges from tens

to 24,000.

Number of RNA genes.

*The X chromosome of fruit fly contains 250 copies of Pre-rRNAs, Y chromosome

contains 150 copies.

Most proteins do not need duplicated genes, There are four types of rRNA in mammalian

cells: 28S, 5.8S, 5S and 18S. In the human genome, 28S, 5.8S and 18S are clustered

together. They form a single transcription unit which will be separated by specific enzymes

after transcription. " Pre-rRNA" refers to their precursor. In humans, a repeat unit for the

pre-rRNA has about 40 kb in length, including a 13-kb transcription unit and a 27-kb

untranscribed spacer region. The transcription unit contains three spacers: ETS, ITS1 and

ITS2. They will be removed during RNA processing.