La détection des mutations: pourquoi?

fins

diagnostics: - validation du diagnostic chez individu

symptomatique - Pathologie héréditaire (maladie génétique) ou

somatique (cancer)

Déterminer si un gène candidat est responsable de la

pathologie

Etudier les relations structure/fonction du

gène NB: Diagnostic génotypique pas forcément

nécessaire: - En France, dépistage néonatal systématique de 3 maladies

génétiques (phénylcétonurie, mucoviscidose, et

drépanocytose) par des approches biochimiques

LA DÉTECTION DES MUTATIONS: COMMENT?

Deux situations

différentes:

Mutations

connues:

criblages

(screening)

Mutations

inconnues:Balayage

(scanning) Un seul gène ou plusieurs

gènes

-Mutation unique (très rare)

-Mutations prédominantes

par effet fondateur

-Points chauds de mutations

-Spectre bien défini avec

fréquences allèliques dans la

population

Un gène ou plusieurs gènes

candidats

recherche sur la totalité du gène

Maladie Gène Mutation Remarque

Drépanocytose HBB Un seul codon (6), un seul faux-sens (Glu->Val), une seule mutation (GAG ->GTG)

Monoallélisme stricte

Achondroplasie FGFR3 Un seul codon (380), un seul faux-sens (Gly->Arg), deux mutations nt1138 (G->A; G->C)

Monoallélisme par récurrence en un point chaud

Mucoviscidose CFTR Del508>1300 autres

66% des allèles30% des allèles

Myopathie de Duchenne DMD Délétion de 1 ou plusieurs exonsDuplication de 1 ou plusieurs exonsMutation ponctuelle variable

65% des allèles10% des allèles25% des allèles

Neurofibromatose de type 1

NF1 >250 mutations différentes(74% petites mutations)

Taux de néomutations élevé (10-4)

LA DÉTECTION DES MUTATIONS: COMMENT? (SUITE)

LES AUTRES FACTEURS INFLUENÇANT LA

STRATÉGIE: - La nature attendue des mutations

- La taille et la structure du locus

exploré

- Le matériel disponible (ADN, ARNm)

- Le degré de sensibilité nécessaire

LA DÉTECTION DES MACROMUTATIONS

- 1) Cytogénétique classique et cytogénétique moléculaire-2) Southern blot

-3) PCR fluorescente

-4) RT-PCR

ADN

ARN

Grandes délétions, insertions, duplications, inversions et translocations

plusieurs centaines de pb voir des milliers

1) CYTOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

Principe: l’ADN est visualisé grâce à une sonde qui est soit un haptène ( ex: digoxigénine) révélé par un anticorps fluorescent ou directement par un fluorochrome

Cibles: uniques de l’ordre de quelques Kb mais aussi des cosmides, YAC.

Applications du FISH:- cartographie des marqueurs (Bac ou Yac) sur des chromosomes

métaphasiques (l’une des phases de la mitose) et en particulier les bac chimères- identification des chromosomes en particulier dans les hybrides

somatiques surtout après irradiation qui fragmente les chromosomes- identification de petits fragments chromosomiques remaniés- hybridation in situ en interphase permettant d’identifier sur de la

chromatine des séquences distantes de 100kB seulement ainsi que des chromosomes remaniés

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FISH ciblée

FISH locus spécifique

Sonde spécifique de gènes ou loci

Peinture chromosomique

Sonde de peinture d’un chromosome entier

Ex: Détection t(9;22) dans les LMC

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Ex: t(8;21) dans une LMA

Méthodes de FISH global

CGHComparative Genome

Hybridization)

M-FISH (multi-FISH)SKY (Spectral karyotyping)

24 sondes de peinture chromosomiques spécifique des 22 autosomes et X/Y. Utilisation d’un mélange de sondes dont la composition est spécifique d’un chromosome donné.

-ADN génomique testé et ADN génomique témoinMéthode permettant de quantifier et de localiser des microremaniements d’ADN- La résolution est maximale car elle ne dépend que de l’objet à analyser- Très utilisée pour les remaniements dans les cancers- Shéma expérimental (diapo suivante)

Ex: translocation (7p;12q)(Dupont JM, Cochin)

LA MÉTHODE DE CGH

CGH sur chromosomes

CGH sur microarray

Résolution 5-10Mb

Résolution dépend du matériel génomique utilisé. Permet de descendre à l’échelle de l’exon

Numérisation du signal -> lecture quantitative

2) LE SOUTHERN BLOT

-Permet de visualiser une portion du génome par hybridation d’une sonde marquée sur des fragments de restriction d’ADN séparés par électrophorèse.

-Limite supérieure de résolution: ≈ 20 kb.

-Pour l’analyse de plus grand fragment d’ADN génomique, electrophorèse en champs pulsés résolution max 1Mb)

Modifications de la carte de restriction si macromodification

Inconvénients:Difficultés de détection des anomalies quantitatives hétérozygotes: saturation du signal lors de la détection

3. Les dérivées de la PCR

=Amplification au cours d’une même PCR de plusieurs régions différentes

-taille de chaque amplicon différente-oligonucléotides de Tm proches

Analyse de l’ADN

La PCR multiplex

Mise au point assez complexe

ATG

TAATAGTGA AATAAA

Amplicon 1 Amplicon 2 Amplicon 3 Amplicon 4

3) LA PCR FLUORESCENTE

-Amorce ou dNTP marqués par un fluorochome et analyse du produit d’amplification sur un séquenceur

-Optimisation 1: PCR multiplex (amplification de plusieurs régions différentes)

-Optimisation 2: PCR semi-quantitative (faible nombre de cycles et analyse quantitative de la fluorescence)

Pertes ou gains d’amplicons entiers visualisés par absence de l’amplicon ou variation d’intensité (si hétérozygotie)

4) La RT-PCR

-Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin

Permet de détecter: - Perte ou gain de matériel visualisé par une anomalie de longueur de l’amplicon

-Transcrit ampliflié en un seul ADNc ou plusieurs fragments chevauchants

- des ARNm chimères avec des amorces spécifiques

-Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin

-Transcrit amplifié en un seul cDNA ou plusieurs fragments chevauchants

Permet de balayer la totalité de la séquence codante en un petit nombre de fragments chevauchants

Analyse de l’ARN

1. La RT-PCR

OMGP EVI2A

ADNc NF1

250 bp

Exons EVI2B27b 492 28

17

2 6 84

2 7 13 19a 23-1 28 31 36 43 49

1 3 5 7 9

Exemple de l’amplification de l’ADNc NF1 en 9 fragments chevauchants couvrant les 9000pb de séquence condante

Cas particulier: LES AMPLIFICATIONS DE TRIPLETS

- Catégorie de maladies dues à des amplifications de triplets CAG, GCG,CTG

- dans un exon codant: CAG (maladie de Huntington)- dans la région 3’UTR: CTG (maladie de Steinert)- dans la région promotice: CGG (Syndrome du x fragile)- dans un intron: FAA (maladie de Freidrich)

-Analyse par Southern blot

- Analyse génotypique par PCR

-Problèmes méthodologiques si expansion trop importante

DETECTION DES SUBSTITUTIONS

Inconnues (Scanning)

-Clivage spécifique (chimique, enzymatique)

-SSCP (Single strand Conformational Polymorphism)

-DGGE (Denaturing gradient Gel Electrophoresis)

-PTT (Protein Truncation Test): détection spécifique des codons STOP

Connues (Screening)

+ séquençage

-Southern ou PCR-hydrolyse pour mutations modifiant un site de restriction

-Séquençage

-PCR-ASO (Allele Specific Oligoprobe)

-PCR-OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)

-PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

-PCR suivie d’hybridation sur puces

MÉTHODE SSCP

Principe:

La perturbation de séquence induit un changement de conformation du DNA simple brin

-Sensiblité: 60-80% de mutations détectées

Mise en évidence

Conformation des brins

électrophorèse en gel d’acrylamide non dénaturant

Méthode DGGE (Denaturated Gradient Gel Electrophoresis)

- La perturbation de séquence induit un modification de la température de fusion

-Bonne sensiblité

-Mis en évidence par electrophorèse en gel d’acrylamide en gradient dénaturant

-Choix des amplicons doit tenir compte des domaines de fusion de la séquence

-Amplicons de 100-300 pb

LE PROTEIN TRUNCATION TEST (PTT)

-Mise en évidence d’une protéine tronquée due à la présence d’un codon STOP prématuré

-Promoteur T7 ajouté à l’amorce 5’

Système de transcription/traduction in vitro

Analyse des polypeptides sur SDS-PAGE

Méthode de PCR-ASO

- Mésappariements dans un court fragment diminuent la température de fusion de l’ hybride

- Synthèse de 2 oligosondes:Séquence normaleSéquence mutée

- Hybridation avec produit PCR de la région à étudier: conditions ne permettant que les appariements parfaits

- Visualisation par dot-blot

Nécessité d’étudier des témoins en parallèle

Techniques basées sur une extension différentielle d’amorce

MALDI-TOF:

Miniséquençage:

Allèle normal Allèle muté

T

A

C

G

Extension d’amorce(Taq Pol) + F1-ddTTP

+F2-ddCTP

TA

CG

Elimination des ddNTP et analyse du produit d’extension

+ ddNTP

Miniséquençage: analyse de fluorescence sur séquenceur d’ADN

MALDI-TOF: analyse de masse moléculaire de l’oligo