LA DECISIONE 2015/495/EU (WATCH LIST):

DETERMINAZIONE DI MICROINQUINANTI EMERGENTI IN

ACQUE SUPERFICIALI MEDIANTE TECNICA

UHPLC-QQLIT-MS

Matteo Vitelli, Maddalena Busetto, Laura Clerici, Luisa Colzani, Maria

Giovanna Guiso, Simona Prosperini, Mauro Donzelli, Pierluisa Dellavedova

Michele Matiussi, Ivan Martinuzzi, Stefano De Martin

(ARPA Friuli Venezia Giulia)

Contaminanti emergenti: Contaminants of Emerging Concern (CECs)

La presenza di questa classe di sostanze nelle acque naturali a livelli compresi tra le frazioni

di ng/L e i µg/L nell’ambiente è stata riportata in letteratura, e comprende:

pesticidi, additivi in processi industriali, composti farmaceutici ed altri «personal care»

(PPCPs), metaboliti, estrogeni etc….

2

LA DECISIONE 2015/495/EU (WATCH LIST)

Sviluppo di Metodi Analitici

Monitoraggio

Ricerca delle sorgenti di contaminazione

Trasporto e Destino ambientale “Enviromental fate”

Effetti ecologici e sanitari

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CONTAMINANTI EMERGENTI

Standard di Qualità

Ambientale (SQA)

RISK

ASSESMENT

I cosiddetti «contaminanti emergenti» includono, ad esempio:

• interferenti endocrini (Endocrine disrupting compounds - EDCs): tra gli effetti

riscontrati sul biota acquatico vi è la capacità degli estrogeni di indurre

l’ermafroditismo o modifiche nelle capacità riproduttive e nel comportamento di

alcune specie di pesci già a livelli di concentrazione intorno a 1 ng/L.

4

CONTAMINANTI EMERGENTI: INTERFERENTI ENDOCRINI

• Antibiotici: gruppo di sostanze farmaceutiche utilizzate in grande quantità anche in

ambito veterinario (allevamenti). Sebbene biodegradabili, la continua immissione

nelle acque di tali sostanze ne provoca una «pseudo-persistenza». Tali sostanze sono

ritenute responsabili dello sviluppo di una resistenza degli agenti patogeni rispetto

all’azione degli antibiotici stessi.

5

CONTAMINANTI EMERGENTI: ANTIBIOTICI

Tra gli obiettivi attualmente più sfidanti per i laboratori ARPA vi è quello derivante

dall’introduzione, da parte della normativa europea, di nuove molecole da

monitorare nel settore della politica delle acque in attuazione della direttiva

2008/105/EC (modificata dalla Direttiva 2013/39/EU, quest’ultima recepita in

Italia con il D.Lgs.172/2015).

6

QUADRO NORMATIVO

All’elenco delle 45 sostanze/gruppi di sostanze da monitorare nelle acque

superficiali viene ad aggiungersi una «watch list» o lista di controllo di 10

sostanze/gruppi di sostanze con la recente Decisione 2015/495/EU.

7

QUADRO NORMATIVO

Decisione 2015/495/EU

8

SOSTANZE «WATCH LIST»

1. 17-Alpha-ethinylestradiol (EE2) (estrogeno sintetico contraccetivo)

2. 17-Beta-estradiol (E2), Estrone (E1) (ormoni naturali)

3. Diclofenac (antinfiammatorio, analgesico)

4. 2,6-diter-butil-4-metilfenolo (BHT - Butilidrossitoluene) (antiossidante)

5. 2-Etilhesil 4-metossicinnamato (EHMC) (filtro UV utilizzato in Cosmesi)

6. Antibiotici Macrolidi (Eritromicina, Claritromicina, Azitromicina)

7. Methiocarb (acaricida)

8. Neonicotinoidi (Imidacloprid, Thiacloprid, Thiamethoxam, Clothianidin, Acetamiprid)

(pesticidi)

9. Ossadiazone (pesticida)

10.Tri-allato (erbicida)

Le sostanze incluse in questo elenco sono

candidate ad entrare nell’elenco di priorità sulla

base di una valutazione del rischio e degli esiti

dei monitoraggi.

9

PROBLEMATICHE ANALITICHE

Notevole differenza tra i diversi composti delle concentrazioni richieste.

EVOLUZIONE DELLE TECNOLOGIE DISPONIBILI

10

In questo contesto normativo, è necessaria la disponibilità di metodi multiresiduo

molto sensibili, selettivi e accurati che permettano di determinare nel comparto

acque una grande varietà di sostanze, con caratteristiche chimico-fisiche tra loro

differenti e solitamente a livelli di concentrazione molto bassi.

Tra le varie metodologie, la tecnica strumentale per eccellenza oggi disponibile è la

cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa (LC-MS) nelle sue

forme più avanzate:

UHPLC – MS/MS oppure UHPLC – HRMS

UHPLC: Ultra High Liquid Performance Chromatography

(evoluzione dei materiali costituenti la fase stazionaria:

miglioramento della separazione dei picchi e rapidità della

corsa cromatografica (fino a 9 volte), oggi associata ad una

più rapida capacità di acquisizione e di processamento dei

segnali.

SPETTROMETRIA DI MASSA “TANDEM”

Q1

Q3

Q

2

823

502

226

226 502

200 1200

Selezione ione “precursore”

Frammentazionedello ione

“precursore”

Ioni “prodotto”

TRIPLO QUADRUPOLO – TRAPPOLA IONICA

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Q3Q2Q1

Trappola ionica

Triplo Quadrupolo

NUOVE TECNOLOGIE

13

Analizzatori ad

alta risoluzioneAnalizzatore ad alta risoluzione:

possibilità di effettuare esperimenti di

MSn in cicli molto rapidi e ad alta

risoluzione (R=60000-100000) fornendo

informazioni strutturali ad elevata

sensibilità.

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NUOVE TECNOLOGIE : SPETTROMETRIA DI MASSA AD ALTA RISOLUZIONE

Tempo di volo (Time Of Flight): strumenti caratterizzati da accuratezza di massa

(<3ppm), risoluzione (20.000 a masse elevate), velocità di scansione (fino a 20000

scansioni/sec).

Possibilità di riconoscimento di strutture incognite mediante determinazione della

massa esatta.

15

NUOVE TECNOLOGIE

SISTEMA IBRIDO: TRIPLO QUADRUPOLO/TRAPPOLA LINEARE

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PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE: Solid Phase Extraction (SPE)

E’ spesso indispensabile la

concentrazione e la purificazione

del campione, al fine di limitare gli

effetti matrice. Si parte da volumi

d’acqua dell’ordine di alcune

centinaia di mL.

17

SPE OFF-LINE

SVANTAGGI:

• Elevato volume di campione necessario

• Costi trasporto ????

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on-line SPE

E’ l’evoluzione della SPE off line: consiste nel prelievo diretto del campione d’acqua (es. 5

mL), arricchimento, purificazione e analisi HPLC-MS on-line.

(a) – Fase di caricamento del campione.

(b) - Fase di eluizione e separazione cromatografica.

SPE ON-LINE

19

METODO «A»: ORMONI

Parametro Intervallo di taratura

“Limite massimo ammissibile del

metodo di rilevazione (ng/L)” (Decisione

495/2015)

Ripetibilità in matrice

(RSD%)

Recupero in matrice (%)

17-alfa-

etinilestradiolo

0,035 – 1,12

ng/L0,035 10,54 97,1

17-beta-

estradiolo 0,07 – 2,24 ng/L 0,4 17,20 98,6

Estrone 0,07 -2,24 ng/L 0,4 17,43 105,7

� Stabilizzazione del campione a pH=2

� Concentrazione 1:500 con cartucce SPE, stirene/divinilbenzene

� Eluato (5mL) iniettati in SPE on-line + LC-MS/MS

Separazione cromatografica:

Loading Pump: 100% H2O milliQ. Lavaggio SPE: Acetone: 2-propanolo: Acetonitrile 1:1:1

Fase A: 0,02% v/v Ammoniaca (pH=8)

Fase B: Acetonitrile: Metanolo 70:30 + 0,02% Ammoniaca

20

METODO «A»: ORMONI

17 beta estradiolo

0.035 ng/L

17 alfa etinil estradiolo

0.1 ng/L

Estrone

0.1 ng/L

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METODO «B»: PESTICIDI MULTIRESIDUO

� Filtrazione con filtro 0,20µm

� Iniezione diretta

ParametroIntervallo di

taratura

“Limite massimo

ammissibile del metodo di

rilevazione (ng/L)”

(Decisione 495/2015)

Ripetibilità in matrice

(RSD%)

Recupero in matrice (%)

Diclofenac 5 – 500 ng/L 10 11,6 82,0

Metiocarb 5 – 500 ng/L 10 24,4 83,3

Imidacloprid 5 – 500 ng/L 9 12,3 100,8

Tiacloprid 5 – 500 ng/L 9 3,0 107,5

Tiametoxam 5 – 500 ng/L 9 9,3 72,1

Acetamiprid 5 – 500 ng/L 9 4,2 112,1

Clotianidin 5 – 500 ng/L 9 9,7 86,8

Ossadiazone 5 – 500 ng/L 88 11,4 101,1

Triallato 5 – 500 ng/L 670 4,1 90,5

4-metossicinnammato

di 2-etilesile(EHMC)5 – 500 ng/L 6000 10,9 90,6

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METODO «C»: ANTIBIOTICI

� Stabilizzazione del campione a pH=2

� Concentrazione 1:500 con cartucce SPE, stirene/divinilbenzene

� Eluato (5mL) iniettati in SPE on-line + LC-MS/MS

Separazione cromatografica:

Loading Pump: 100% H2O milliQ. Lavaggio SPE: Acetone: 2-propanolo: Acetonitrile 1:1:1

Fase A: 0,02% v/v Ammoniaca (pH=8)

Fase B: Acetonitrile: Metanolo 70:30 + 0,02% Ammoniaca

Parametro Intervallo di taratura

“Limite massimo ammissibile del

metodo di rilevazione (ng/L)”

(Decisione 495/2015)

Ripetibilità in matrice

(RSD%)

Recupero in

matrice (%)

Eritromicina 50 – 1000 ng/L 90 5,2% 127%

Claritromicina 50 – 1000 ng/L 90 5,3% 106%

Azitromicina 50 – 1000 ng/L 90 9,0% 90,1%

23

ARPA FVG - METODO «C»: ANTIBIOTICI

Concentrazione di 100 ng/L dei tre macrolidi

24

ARPA FVG - METODO «C»: ANTIBIOTICI

� Iniezione diretta di 40 uL di campione

� Colonna cromatografica «Bifenilica»

Separazione cromatografica:

Fase A: Tampone formiato 0.0033 M

Fase B: Acetonitrile

Parametro Intervallo di taratura

“Limite massimo ammissibile del

metodo di rilevazione (ng/L)”

(Decisione 495/2015)

Ripetibilità in matrice

(RSD%)

valutata a 0,1 µg/L

Recupero in

matrice (%)

Eritromicina 10 – 1000 µg/L 90 9,16% 103%

Claritromicina 10 – 1000 µg/L 90 2,38% 99%

Azitromicina 10 – 1000 µg/L 90 4,90% 104%

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CRITERI DI RICONOSCIMENTO

(SELETTIVITA’ DEL METODO)

Una Decisione della Commissione europea [1] definisce i criteri di

identificazione per l’analisi SRM (Selected Reaction Monitoring):

� Tempi di ritenzione entro il 2,5% del tempo di ritenzione dello standard di

riferimento

� Siano presenti lo ione precursore e due frammenti e che il rapporto

d’intensità dei frammenti rispetto allo ione molecolare sia all’interno del

50-20% rispetto allo standard di riferimento.

[2] European Commision (2002) Commission Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC

concerning performance of analytical methods and the interpretation of results. Off J Eur Commun L221/8.

26

RECUPERO DEL METODO

L’»effetto matrice» costituisce il principale inconveniente associato con l’ESI-

MS (Electro Spray Ionization-Mass Spectrometry), dovuto alla suscettibilità del

della sorgente ionica rispetto alla presenza di sostanze coeluenti, presenti

nella matrice. Tale effetto si manifesta come soppressione o esaltazione del

segnale relativo all’analita secondo i componenti presenti nella matrice.

[1] Journal of Chromatography A, 1418 (2015) 140-149

Impiego di standard isotopici (deuterati o C13), che seguono l’intero processo

analitico.

E’ dunque importante che le sostanze elencate nella «watch-list», come per le sostanze

classificate pericolose e pericolose-prioritarie ( EU - water framework directives) possano essere

determinate accuratamente ai livelli specificati nella Decisione.

E’ richiesto che ogni metodo :

• Sia validato secondo la ISO/IEC 17025:2005 (accreditamento)

• Abbia un limite di rilevabilità LOD < LOD tabellato

• Fornisca una incertezza di misura ≤ 50%

27

LE PRESTAZIONI DEI METODI

28

VALIDAZIONE

Tra le principali criticità incontrate nella messa a punto di questi metodi vi

sono:

- Assenza di Matrici Certificate di riferimento.

(Prove di recupero e ripetibilità su matrici fortificate «in house»)

- Assenza di circuiti interlaboratorio e di collaborative trial.

(manca una valutazione completa della riproducibilità per questi analiti)

- Assenza di Metodi Normati (es. norme ISO) per molte delle sostanze

ricercate.

Necessità di una completa validazione da parte del laboratorio.

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INCERTEZZA DI MISURA

• Documenti di riferimento:– Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental

Laboratories ( NORDTEST Technical Report TR 537)

– Norma ISO 11352:2012 – Water quality- estimation of measurement uncertainty based on validation and quality control data.

� � ��

�� ��

��Incertezza

composta

Bias e Ripetibilità intermedia

CONCLUSIONI

30

Quanto riportato in questa breve relazione, indica che allo stato attuale si possono

ancora incontrare alcune difficoltà tecnico-analitiche nel determinare le sostanze

individuate dalla watch list ai livelli di concentrazione richiesti.

L’obiettivo di determinare le sostanze elencate nella «watch list» ai livelli richiesti, pur

con i migliori standard tecnologici oggi disponibili, richiede quindi una complessa

attività di sviluppo e validazione dei metodi analitici che non può certamente

prescindere da una elevata qualificazione, dall’aggiornamento e da una forte

motivazione del personale coinvolto.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

31