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기관고유연구사업 최종보고서

편집순서 1 : 겉표지 (앞면)

(과제번호 : 1010270 )

연구과제명 (국문)

제브라피쉬를 이용한 발암유전자 기능연구와 암모델동물

개발을 위한 연구 II

연구과제명 (영문)

Research for the functional study of oncogenes and the

development of cancer models using zebrafishII

과제책임자 : 배영기

국 립 암 센 터

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편집순서 1 : 겉표지 (측면, 뒷면)

(뒷면) ( 측 면 )

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5cm

↓

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피

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암

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국

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암

센

터

↑

3cm

↓

1. 이 보고서는 국립암센터 기관고유연구

사업 최종보고서입니다.

2. 이 보고서 내용을 인용할 때에는 반드시

국립암센터 연구사업 결과임을 밝혀야

합니다.

(14 pont, 고딕체)

↑

6cm↓

- 4 -

편집순서 2 : 제출문

제 출 문

국립암센터 원장 귀하

이 보고서를 기관고유연구사업 “제브라피쉬를 이용한 발암유전자 기능연구

와 암모델동물 개발을 위한 연구 II ” 과제의 최종보고서로 제출합니다.

2012. 11. 07

국 립 암 센 터

과 제 책 임 자 : 배영기

연 구 원 : 안상중

〃 : 박문학

- 5 -

편집순서 3 : 목차

목 차

< 요 약 문 > 1

(한글) 제브라피쉬를 이용한 발암유전자 기능연구와 암모델동물 개발

을 위한 연구 II

(영문) Research for the functional study of oncogenes and the

development of cancer models using zebrafishII

1. 연구의 최종목표 5

2. 연구의 내용 및 결과 6

3. 연구결과 고찰 및 결론 27

4. 연구성과 및 목표달성도 35

5. 연구결과의 활용계획 45

6. 참고문헌 47

7. 첨부서류 50

※ 여러개의 세부과제로 과제가 구성된 경우 위 목차와 동일하게 세부과제별로 작성함

(I. 총괄과제, II. 제1세부과제, III. 제2세부과제...........................)

- 1 -

편집순서 4 : 요약문 (한글)

< 요 약 문 >

연구분야(코드) 암실험동물 개발(S2) 과제번호 1010270

과 제 명 제브라피쉬를 이용한 발암유전자 기능연구와 암모델동물 개발을 위한 연구 II

연구기간/연구비(천원)

합계 2010년 1월 1일 ～ 2012년12월31일 380,000

1차년도 2010년 1월 1일 ～ 2010년12월31일 140,000

2차년도 2011년 1월 1일 ～ 2011년12월31일 130,000

3차년도 2012년 1월 1일 ～ 2012년12월31일 110,000

과제책임자성 명 배영기

소 속 국립암센터 연구소 기초실용화연구부 비교생명의학연구과

색인단어국문 제브라피쉬, 뇌암, 전이, 암모델동물, 유전자적중

영문 Zebrafish (Danio rerio), Brain tumor, Metastasis, Animal Cancer Model. Knockout

◆ 연구목표<최종목표> 암발생 및 전이의 분자기전 및 저해방법 연구를 위한 제브라피쉬 암모델동물의 개발

<당해년도 목표>

뇌전이암 및 뇌암 의 분자기전 및 저해방법 연구를 위한 제브라피쉬 암모델동물의 개발

- 제브라피쉬를 이용한 유전자 조작 뇌암 동물모델 구축

- Zinc finger nuclease 유전자 가위를 이용한 면역부전 제브라피쉬의 개발

◆ 연구내용 및 방법

1. 제브라피쉬를 이용한 유전자 조작 뇌암 동물모델 구축

-조직 특이적으로 발암유전자를 다중 발현하는 형질전환 제브라피쉬 (F1 heterozygous transgenic

zebrafish)의 제작 : 총 6종 제작

-Glioma models: Tg(zGFAP :: △PH Akt X KRas G12V X EGFR vIII), Tg(zHer4 ::

△PH Akt X KRas G12V X EGFR vIII)

-Medulloblastoma models: Tg(zNdr1 :: △PH Akt X Nmyc X SmaA1), Tg(Ndr2 :: △

PH Akt X Nmyc X SmaA1), Tg(zNdr1 :: △PH Akt X Nmyc), Tg(Ndr2 :: △PH Akt

X Nmyc)

-다중 교배에 의해 제작된 뇌암모델동물에서 암발생 여부 및 발생한 암조직의 조직학적, 분자 세포학

적 특성 분석

-Tg(zHer4 :: △PH Akt X KRas G12V X EGFR vIII)모델에서 눈, 뇌에서 hyperplasia

현상 확인

-Tg(zNdr1 :: △PH Akt X Nmyc X SmaA1)모델에서 Thyroid hyperplasia확인 및 전이

되는 현상 확인, 조직학적으로 관찰

- 2 -

2. 인간 암세포의 intravasation 및 extravasation 연구를 위한 제브라피쉬 이종이식 암모델 (zebrafish

xenograft cancer model)의 개발

- 암세포 extravasation 관찰을 위한 면역부전 제브라피쉬 (Transparent nude zebrafish)를 개

발

a. FoxN1 유전자 특이적 ZFN (zinc finger nuclease)를 이용한 제브라피쉬 foxn1

heterozygous 돌연변이체 제작

b. 제브라피쉬 에서 DNA-PK 유전자 특이적 ZFN (zinc finger nuclease)를 이용한 ZFN 를 이

용한 DNA-PK knockout 제브라피쉬 돌연변이체 screening

- 제브라피쉬 foxn1 heterozygous 돌연변이체 상호 교배에 의한 homozygous 제브라피쉬에서

의 배아 및 성체에서의 장기 형성 및 면역체계 이상 등의 일차 표현형 해석

a. 제브라피쉬 thymus 특이적 분자적 markerfh 분석한 결과 배아 및 치어 상태에서의 thymus 형성에

이상을 발견함.

b. Thymus 특이적으로 GFP를 발현하는 형질전환체와 교배한 foxn1 homozygous 제브라피쉬에서

흉선 특이적인 GFP의 발현의 감소로 보아 면역세포 생산에 중요한 흉선 이상에 의한 면역부전 제브

라피쉬 개발에 성공한 것으로 보임.

◆ 연구성과

-정량적 성과

구분 달성치/목표치1) 달성도(%)

SCI 논문 편수 8/6 130

IF 합 32/24 130

기타 성과

1) 총연구기간내 목표 연구성과로 기 제출한 값

-정성적 성과

․발암유전자 조합의 조직특이적인 double activation 형질전환체 제작에 의한 제브라피쉬

hyperlasia 모델 개발

․암세포 intravasation/extravasation 관찰을 위한 제브라피쉬 배아 이종이식 모델의 확립과

검증

․ZFN 유전자 가위법에 의한 제브라피쉬 유전자 knockout법 확립

․ZFN 유전자 가위법에 의한 foxN1 유전자 knockout 면역부전 제브라피쉬의 개발

◆ 참여연구원

(최종연도 참여인원)성 명

배영기, 안상중, 박문학, 박종배

※ 요약문의 총분량은 2page 이내로 제한함

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편집순서 5 : 요약문 (영문)

Project Summary

Title of ProjectResearch for the functional study of oncogenes and the

development of cancer models using zebrafishII

Key WordsZebrafish (Danio rerio), Brain tumor, Metastasis, AnimalCancer Model. Knockout

Project Leader Young-Ki Bae

Associated Company

The zebrafish (Daniorerio) has proven to beause useful vertebrate model system

for cancer research and high through-put drug discovery, because they have

several advantages, including transparency of embryos and feasibility for forward

and reverse genetic analyses.

1. In order to develop the genetic engineered brain tumor models in zebrafish, we

have adopted Gal4-UAS binary transgenic system in which neural progenitor

specific promoters driven Gal4 protein can induce and amplify the expression of

UAS controlled oncogenes. To generate the neural specific Gal4VP16 expressing

transgenic zebrafish, we used the promoter of zebrafish Her4 and GFAP genes, and

that of NeuroD1 and NeuroD2. We have generated 4 transgenic lines of Gal4

expressing F1 zebrafish, in addition to 14 transgenic lines of UAS-oncogenes

expressing F1 zebrafish. After multiple mating of tissue specific-GAL4 lines and

UAS driven oncogenes expressing lines, the single or double oncogenes expressing

transgenic zebrafish were generated. But we found that transgenic zebrafish

harboring Gal4-UAS transgene could not produce tumor bearing zebrafish because

of the methylation mediated silencing transgenes in zebrafish. Hence we

reconstructed 2A mediated transgenic system for multiple expression of oncogene

directed by neural stem cell promoters, and obtained thyroid hyperplasia

zebrafish(zNdr1 :: △PH Akt X Nmyc X SmaA1) and eyes and brain hyperplasia

zebrafish (zHer4 :: △PH Akt X KRas G12V X EGFR vIII).

2. To test the usefulness of zebrafish for the preclinical trials, we also performed

tumor xenograft experiment in zebrafish by injection of various cancer cell lines

into the perivitelline space of zebrafish embryos.

- 4 -

Human lung cancer H1299::mRFP cells and human stomach cancer cell

AGS::GFP/mRFP cells, which were injected into the perivitelline space of zebrafish

embryos at 24 hpf, could survive and migrate into distal organs such as eyes and

tail vein. In contrast, human glioma U87MG::mRFP and murine melanoma

B16F10::mRFP cells did not migrate in zebrafish embryos, but they could

proliferate and form the tumor mass like structure. We also found that B16F10

melanoma grafts induce a neovascular response originating from the developing

subintestinal vessels within 24–48h.

3. Transplantation of human tumors into immuno-deficient animal model such as

nude, scid mouse have been used as a pivotal experimental model for cancer

research during the past five decades. Recently, zebrafish (Danio rerio) entered the

stage as a promising xenograft model for human cancers on the help of their

transparency and immuno-free state in embryo stage. However, the

immuno-deficient zebrafish models for xenograft of cancer cells were still

required, because the adult zebrafish in which have fully equipped with immune

system could not accessible for the transplantation of various types of cancer

cells. Here we showed that the targeted disruption of Forkhead box N1 (FoxN1,

nude), DNA-PK (scid) and cdkn2 gene were performed with Zinc Finger

Nucleases (ZFNs) knockout method in zebrafish. Using the ZFNs, we successfully

obtained two different mutated FoxN1 alleles in heterozygous F1 generation (1bp

deletion & 6bp substitution in FoxN1 exon 3). We found that lack of FoxN1

caused a deteriorated thymus, which have a crucial role in the regulation of

T-cell development. Interestingly, the adult zebrafish with homozygous mutation

of FoxN1 could be still alive. In addition, we could induce targeted insertions or

deletions in DNA-PK (scid) gene using ZFNs with high efficiency in the transient

in vivo test.

In summary, our study showed that ZFNs/TALENs-mediated gene knockout

methods could efficiently produce target specific mutations in the genome of

zebrafish, and be useful new strategy for the development of cancer models in

zebrafish.

※ 연구목표, 연구방법, 연구성과를 영문으로 요약하여 2쪽이내의 분량으로 작성

- 5 -

구분 목표 내용 및 범위

1차년도(2010)

뇌전이암 및 뇌암 의 분자기전 및

저해방법 연구를 위한 제브라피쉬

암모델동물 연구기반 구축

♦ 제브라피쉬를 이용한 뇌전이암 및 뇌암의

분자기전 및 저해방법 연구를 위한 유전자 조작

동물모델의 연구기반 구축

♦ 암세포의 intravasation 및 extravasation 연구를

위한 제브라피쉬 이종이식 암모델 (zebrafish

xenograft cancer model)의 탐색

2차년도(2011)

제브라피쉬을 모델로 한 유전자조작

암모델동물의 개발과 이종이식모델

을 이용한 암세포 intravasation 및

extravasation 연구

♦ 제브라피쉬 유전자 조작 뇌암 모델동물 개발을

위한 발암유전자 발현형 형질전환 제브라피쉬의

개발

♦ Flk1-GFP 제브라피쉬 배아 모델에서의

암세포 intravasation 및 extravasation 연구

3차년도(2012)

뇌전이암 및 뇌암 의 분자기전 및

저해방법 연구를 위한 제브라피쉬

암모델동물의 개발 및 응용

♦ 확립된 제브라피쉬 유전자조작 제브라피쉬

뇌암모델동물 개발 및 발암성 연구

♦ 암세포 intravasation 및 extravasation 연구를

위한 면역부전 제브라피쉬 모델의 개발

편집순서 6 : 연구결과

1. 연구의 최종목표

1-1. 최종목표

제브라피쉬를 이용하여 암 발생 및 전이의 분자기전 및 저해방법 연구를 위한 암모델동물 개발

1-2. 연구사업의 목표 및 범위

- 6 -

그림 2. 제브라피쉬 발암억제유전자 돌연변이체의 확보

그림 1. 제브라피쉬 사육시설 보강

2. 연구의 내용 및 결과

2-1. 제브라피쉬를 이용한 뇌전이암 및 뇌암의 분자기전 및 저해방법 연구를 위한 유전자 조작 동물

모델의 연구기반 구축

◯ 제브라피쉬 사육 시설 보강: 본연구과제인 유전자 조작 제브라피쉬의 유지 및 다중교배를 위해서는

현재 연구소 4층에 있는 제브라피쉬 시설 내의 시설 규모가 절대적으로 부족하여 기존 장비에 추가로

제브라피쉬를 키울 수 있는 수조 및 유지 장치의 보강을 함 (그림 1)

- 7 -

그림 3. Genotyping of homozygous p53-/- and patched2-/- zebrafish using specific genetic

markers.

표 1. Neural stem cell and/or progenitor cell specific gal4 driving transgenic zebrafish

Gal4 lines Enhancer

Generation of

transgenic

zebrafish

Glioma

inducing zebrafish lines

GFAP::Gal4 7.5 kb around ATG F2

Her4::Gal4 3.4 kb upstream of ATG F2

Nestin::Gal4 160 kb of bac plasmid F2

Medulloblastoma

inducing zebrafish lines

Atoh1a::Gal4 210 kb of bac plasmid F2

NeuroD1::Gal4 5.1 kb upstream of ATG F2

NeuroD2::Gal4 4.9 kb upstream of ATG F2

◯ 그림 2에서 보는 바와 같이 기존의 p53 및 patched2 제브라피쉬 발암억제유전자 돌연변이체 외

에 pten-a, pten-b, apc 등 3종류의 돌연변이체를 확보하였음.

◯ p53 및 patched2 제브라피쉬 발암억제유전자 돌연변이체의 in cross에 의한 homozygous 돌연

변이체의 성체 제브라피쉬를 동정하였음.(그림 3).

◯ 뇌암 동물모델 개발을 위한 신경줄기세포 (neural stem cell) 특이적 유전자의 발현조절영역

(Promoter/enhancer)을 genomic DNA, BAC plasimd에서 동정하고, GFP/RFP의 발현을 유도

하는 reporter 유전자를 제작하여, 제브라피쉬 배아에 transient 또는 stable하게 발현시켜 그

활성을 확인한 후, glioma 유도 GAL4-lines과 medulloblastoma GAL4-lines를 제작하여

founder 제브라피쉬를 제작 (표1, 그림 4)

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그림 4. Identification of neural stem/ neural progenitor cell specific promoter for brain

tumor modeling in zebrafish

A.

◯ 먼저 GAL4-driver 형질전환 제브라피쉬의 신경 줄기세포 특이적 발현을 확인하기 위하여

UAS-EGFP 형질전환 제브라피쉬와 교배하여 EGFP의 발현을 확인함. 그 결과 신경교종 모델용

GFAP/Her4::GAL4를 발현하는 F2세대의 제브라피쉬와 수모세포종 모델용 NeuroD1/D2::GAL4

를 발현하는 F2세대의 제브라피쉬는 각각의 유전자의 발현을 조직 특이적으로 유도하는

- 9 -

B.

그림 5. GAL4-driver 형질전환 제브라피쉬에 의한 UAS-EGFP 형질전환 제브라피쉬의 배아의

신경줄기세포 특이적인 EGFP 발현

A. GFAP/Her4::GAL4 X UAS-EGFP, B. NeuroD1/D2::GAL4 X UAS-EGFP

promoter/enhancer 영역을 가지고 있고 UAS-형질전환 제브라피쉬의 교배에 의해 EGFP의 발

현을 신경줄기세포 특이적으로 유도하는 것을 확인함 (그림 5).

◯ 발암유전자 발현 형질전환 제브라피쉬의 경우 founder 제브라피쉬의 in cross를 통하여 각각

F2 및 F3 세대까지 homozygous transgenic 제브라피쉬를 제작함. (표 2)

◯ GAL4 및 UAS-oncogenes 형질전환 제브라피쉬의 교배한 후(표 3), trans-induction 확인하

기위하여 교배에 의한 생산된 배아의 oncogene 특이적인 RNA probe를 제작하여 in-situ

hybridization법을 이용하여 oncogene이 조직 특이적으로 유도되는 현상을 확인함(그림 6).

◯ 표 3에서와 같이 각기 하나의 발암유전자를 유도한 형질전환 제브라피쉬에서 뇌암 및 수모

세포종의 형성을 관찰한 결과 유도 발현 후 약 6개월이 지난 제브라피쉬에서 대조군과 비교

하여 이상증식 및 종양의 형성이 관찰되지 않았음. 이는 발암유전자 하나만의 유도 발현으로

는 종양형성에 충분치 못하고, 제브라피쉬에서 암발생을 위해서는 둘 이상의 발암유전자의

발현 유도 또는 발암억제 유전자에 기능이상이 있는 유전적 돌연변이가 필요하다는 것을 의

미함.

- 10 -

그림 6. Trans-activation of oncogenes using GAL4-UAS induction system.

표 3. Trans-activation of single oncogenes using GAL4-UAS induction system.

Glioma models

Gal4 X UAS lineszGFAP X KRas G12V

zGFAP X △PH Akt

zGFAP X EGFR vIII

zGFAP X EGFR L858R

zHer4 X KRas G12V

zHer4 X △PH Akt

zHer4 X EGFR vIII

zHer4 X EGFR L858R

Medulloblastoma models

zNeuroD1 X △PH Akt

zNeuroD1 X NMyc T50A

zNeuroD1 X zSmoA1 W514L

zNeuroD2 X △PH Akt

zNeuroD2 X NMyc T50A

zNeuroD2 X zSmoA1 W514L

◯ 한편 제브라피쉬 Her4 positive neural stem cell에 발암유전자 KrasG12V를 발현 유도한 형질

전환 제브라피쉬에서는 눈의 수정체가 퇴화되는 현상을 발견함. 이는 발암유전자가 이상증식

과 같은 암발생 과정을 수행하기에 시간적 조직적인 특성이 맞지 않아 일어나는 현상으로

특정 시간대에 조직 특이적인 유전자 발현의 조절이 암 발생에 필요하다는 것을 의미함 (그

림 7).

- 11 -

표 2. Oncogenes expressing 10XUAS transgenic zebrafish

그림 7. Trans-activation of KrasG12V under control of zHer4 promoter using GAL4-UAS

induction system.

◯ 발암유전자 하나만의 유도 발현으로 충분하지 않은 형질전환 제브라피쉬 모델에서 암발생

과정을 인위적으로 유도하기 위해 하나의 promoter에 의한 여러 발암유전자의 동시 다중 유도

를 위해 Promoter-Gal4 형질전환체와 UAS-oncogenes (EGFRs, Ras, N-myc, Akt, etc) 형질

전환체 사이의 다중교배 (Multiple cross) 실시함 (표 4).

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표 4. Trans-activation of double oncogenes using GAL4-UAS induction system.

Glioma models

zGFAP X △PH Akt X KRas G12V

zGFAP X △PH Akt X EGFR vIII

zHer4 X △PH Akt X KRas G12V

zHer4 X △PH Akt X EGFR vIII

Medulloblastoma models

zNeuroD1 X △PH Akt X zSmoA1 W514L

zNeuroD1 X △PH Akt X NMyc T50A

zNeuroD2 X △PH Akt X zSmoA1 W514L

zNeuroD2 X △PH Akt X NMyc T50A

2-2. 제브라피쉬를 이용한 유전자 조작 동물모델 제작 및 해석

그림 8. Double activation of ΔPH Akt and other oncogenes using GAL4-UAS induction

system.

◯ 표적 발암 유전자의 고효율 발현을 위해서 강력한 전사 활성 인자인 GAL4의 transcriptional

- 13 -

activator domain에 형광단백질을 융합한 GAL4-UAS system을 적용하고, 형질전환체의 다중

교배에 의해 제작된 모델의 이상증식 및 세포 사멸 등을 해석하였음 (그림 8, 9).

그림 9. Cell death effects of double activated ΔPH Akt and other oncogenes were

relieved by p53 knock-down

◯ 조직 특이적 GAL4 발현 형질전환체와 ΔPH Akt 유도발현 형질전환체의 교배에 의해 태어

난 개체를 별도의 oncogene 유도 형질전환체와 재교배하여 태어나는 double oncogene 발현

제브라피쉬를 각각 제작하였음.

◯ 그림 8에서 보는 바와 같이 발암유전자 조합의 조직 특이적인 double activation은 배아 상태

에서 세포사멸 및 비특이적 세포증식에 대하여 아무런 영향을 발견할 수 없었으나, ΔPH Akt

와 불특정 발암유전자 조합의 동시 발현 배아에서는 세포증식은 감소하고, 조직 특이적 세포

사멸이 증가되어 최종적으로 수정 후 3일 이내에 배아발생이 중지되고 죽음에 이르는 것을

확인하였음.

◯ 발암유전자 조합의 조직 특이적인 double activation을 유도한 개체 중 성체로 성장한 유전자

조합의 형질전환체에서는 3개월 및 6개월 후의 조직 관찰을 통하여 암조직 발생 여부를 확인

한 결과, 암조직은 발견되지 않았음. 이는 본 연구에서 검토한 발암유전자 조합이 암발생을

유도함에 있어 충분하지 않음을 시사하는 것으로 사료됨.

◯ 한편, ΔPH Akt와 불특정 발암유전자 조합의 형질전환체에서 관찰되는 초기 발생단계에서의

세포사멸을 극복하여 성체로의 발생을 지속시킴으로써 성체에서의 발암 여부를 확인하기 위

하여 ΔPH Akt와 불특정 발암유전자 조합의 형질전환체에 p53 antisense morpholino

oligonucleotide를 미세주입하여 발생 초기에 일시적으로 p53 발현을 억제한 배아를 제작하여

관찰하였음 (그림 9).

- 14 -

◯ ΔPH Akt와 불특정 발암유전자 double activation 형질전환체 배아에서의 세포사멸이 일시적

인 p53 knock-down에 의하여 완화되어 young adult 단계까지 성장을 계속하였으나 9개월에

걸쳐 확인한 결과 상기 개체들에서의 발암여부가 관찰되지 않았음.

◯ 한편, GAL4-UAS binary induction system에 의한 발암유전자 발현 형질전환체 제작에 의해

발암모델의 개발이 어려워져, 상기 방법 이외의 두 개 이상의 발암유전자의 동시 발현을 가능

하게 하기 위하여 2A Peptide system을 사용한 transgenic 제브라피쉬 개발을 시도하였음.

◯ 2A peptide는 viral 유전자의 발현현상 연구 과정에서 발견된 것으로 두 개 이상의 cistron이

하나의 polypeptide로 translation 된 후 2A peptide의 self-cleavage에 의해 각각의 기능을 가

진 독립된 단백질을 생성하는 system임. 제브라피쉬 brain tumor model을 제작하기 위하여

2A peptide system을 이용하여 그림 10에서 제시한 바와 같은 double-triple oncogene 발현

construct를 제작하였음.

그림 10. 2A peptides system for simultaneous expression of multiple cistron.

◯ 2A peptide system을 이용하여 제작한 double-triple oncogene 발현 construct를 제브라피쉬

수정란에 미세주입하여 각각의 oncogene 및 marker인 GFP의 발현 여부를 확인한 결과, 조직

특이적인 promotor의 유도에 의해 그 발현이 특정 조직에서 발현됨을 확인할 수 있었음 (그

림 11).

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그림 11. Transient expression of double-triple oncogenes using 2A peptide system.

◯ 그림 11에서의 제브라피쉬 배아를 성체까지 키워 본 결과 Ndr1::Nmyc-2A-△PH-Akt의 형

질전환체에서 갑상선에 hyperplasia의 형상이 발견되었고, 이와 같은 종양은 제브라피쉬의 턱

과 같은 기관으로 이동하여 다시 증식하는 것을 확인함. (그림 12)

그림 12. Thyroid hyperplasia with ectopic dislocation in Tg(Ndr1::Nmyc-2A-△PH-Akt)zebrafish.

◯ 또한 신경줄기세포에서 발현을 유도하는 제브라피쉬 her4의 promoter의 유도에 의해

EGFRvlll-2A-KrasG12V-IRES-△PH Akt의 형질전환 유전자를 transient하게 발현을 시킨

founder 제브라피쉬에서는 각기 눈과 머리 부위에서 ectopic hyperplasia가 발견되었음. 이와

같은 ectopic hyperplasia는 생후 약 2개월 이후부터 관찰되었음.

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그림 14. Proliferation model using xengraft of U87MG::RFP into Flk::GFP zebrafish

embryos.

그림 13. Transient expression of Her4:: EGFRvlll-2A-KrasG12V-IRES-△PH Akt induced

neoplasia in eyes and brain of zebrafish

2-2. 제브라피쉬 이종이식 뇌암 동물모델을 이용한 항암제 탐색

- 17 -

그림 15. In-vivo live imaging of U87MG cells in zebrafish embryos at 30 hpf.

◯ 선행연구를 통하여 확립된 제브라피쉬를 이용한 이종이식 암세포의 이상증식모델인

U87MG(human glioma cell line)::RFP/Flk::gfp 제브라피쉬 모델을 이용하여 항암제 탐색 및 in

vivo validation을 하고자 함 (그림 14).

◯ U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피쉬 모델을 이용하여 개체가 살아있는 상태에서 실시간으로

U87MG::RFP 세포의 증식 과정을 관찰한 결과, 이식 12 시간 후부터 급격한 이상증식 현상을

확인하였음 (그림 15).

◯ 이 모델을 이용하여 항암 후보제의 탐색 동정이 가능한 지 알아보기 위하여 U87MG::RFP 세포를

Flk::gfp 제브라피쉬 모델에 이식 후 2시간부터 각종 항암제를 배양액에 처리하여 이식된 암세

포의 증식 사멸 여부를 관찰 함. 선행과제 연구 결과로부터 일반적인 cytotoxic 항암제인

paclitaxel 및 doxorubicin 등은 개체에 독성이 없는 농도에서 암세포 증식 억제 아무런 영향이

없어서 임상에서 뇌암 치료제로 쓰이는 temozolomide와 특정 단백질 억제제인 AMPK

inhibitor, gleevec (imatinib) 등을 처리하여 제브라피쉬로 이종이식된 암세포의 증식 억제 등을

관찰하였음. 그림 16에서 보는 바와 같이 AMPK inhibitor와 gleevec의 경우 암세포의 이상 증

식을 억제하는 것을 관찰하였음.

◯ U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피쉬 모델에서 각종 항암제와 gamma-irradiation 처리의

synergic 효과를 비교 검토하기 위해서, 제브라피쉬 배아의 gamma-irradiation 처리 시 배아

자체의 독성을 극복하기 위하여 p53 레벨을 antisense morpholino oligonucleotide 미세주입을

통하여 억제한 제브라피쉬 배아를 사용하여 항암제의 in-vivo validation을 개체 내에서 검토한

결과 gamma-irradiation과 gleevec를 동시에 처리했을 때 U87MG 세포의 이상증식 억제뿐만

아니라 cancer cell mass의 크기가 매우 줄어드는 것을 관찰할 수 있었음 (그림 17)

- 18 -

그림 16. In-vivo validation of temozolomide, AMPK inhibitor, and gleevec in living

U87MG::RFP/Flk::gfp zebrafish model.

그림 17. Combinational treatment of γ-irradiation and Gleevec on U87MG::RFP/Flk::gfp

zebrafish model.

- 19 -

그림 18. Pilot scale screening of pharmacologically active compounds using

U87MG::RFP/Flk::gfp zebrafish.

그림 19. Combinational treatment of γ-irradiation and Etoposide on U87MG::RFP/Flk::gfp

zebrafish model.

◯ U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피쉬 모델이 개체를 이용한 항암 후보물질 동정에 이용될 수 있

는지 확인하기 위하여, Sigma 사에서 시판하는 총 1280여개의 phamacologically active

compound (LOPAC) 에 대해 in-vivo pilot scale screening 실시하였음.

◯ 먼저 U87MG::RFP 세포에 대한 phamacologically active compound의 항암성을 96 well

plate상에서 1차 screening (in vitro validation) 한 후 , p53 knock down 제브라피쉬의 배아를

사용하여 항암제의 in-vivo validation을 실시 그 효능 검토이였음었음.인 을 이용하여 개체가

살아있는 상태에서 실시하여 64 개의 후보물질을 선별하였고, U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피

쉬 모델을 이용하여 2개의 물질을 선별한 후, gamma-irradiation과 etoposide의 synergic 효과

를 U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피쉬 모델에서 확인하였음 (그림 18, 그림 19).

- 20 -

그림 20. Human or mouse cancer cells expressing fluorescent protein

그림 21. Cancer cell migration depends on the integrity of vessel. SU5416 (selective

inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1/KDR))

2-3. 암세포의 intravasation 및 extravasation 연구를 위한 제브라피쉬 이종이식 암모델

(zebrafish xenograft cancer model)의 개발

◯ in vivo 실시간 관찰을 위해서 선행 연구에서 확보한 3 종의 형광단백질 발현 stable cell lines

과 별도로 제브라피쉬 생체 내에서 주입된 암세포의 stemness, intravasation 및 extravasation 연구를

위해 metastatic 능력이 탁월한 암세포주를 추가로 mRFP 형광단백질을 발현하는 암세포주를 확립하

였음 (그림 20).

- 인간 전립선암 세포주: PC3M::mRFP의 제작

- 인간 유방암 세포주: MDA-MB231::mRFP의 제작

◯ 암세포가 가지고 있는 특히, 전이과정에서의 cancer cell migration은 혈관 형성에 의존하는

것을 알 수 있었음(그림 21)

- 21 -

복강 이식 yolk transplantation) 혈관 이식 vessel transplantation)

그림 23. Fluorescent labeled cancer cell in the yolk or vessel of zebrafish embryo

그림 22. Cancer cell migration depends on the integrity of vessel. SU5416 (selective

inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1/KDR))

◯ 암세포가 가지고 있는 특히, 전이과정에서의 intravasation 및 extravasation를 형질전환 제브

라피쉬 (Flk1-GFP transgenic zebrafish)을 이용한 tumor xenograft 실시 및 형광현미경을 사

용하여 암세포의 생장, 이동의 실시간 관찰하였음 ( 그림 22).

◯ 암세포 이종 이식의 최적조건 확립을 위해 제브라피쉬 배아의 복강 (yolk transplantation) 이

식, 혈관 (vessel transplantation) 이식을 실시하여 그 효용성을 검토한 결과, intravasation 연

구를 위해서는 복강 (yolk transplantation) 이식, extravasation를 위해서는 혈관 (vessel

transplantation) 이식이 유리함을 알 수 있었음 (그림 23)

◯ 한편, 제브라피쉬 성체를 이용한 이종이식실험에서 이식한 암세포의 생장을 통한 tumor cell

mass의 형성을 보기 위하여 U87MG:RFP cell을 제브라피쉬 성체의 꼬리 부근 근육층에

1X105개 주입하여 형광현미경을 이용하여 관찰하였음 (그림 24). 이식한 부위에서의 암세포

는 이식 후 3일까지 그 생장의 변화가 없이 유지되었으나 약 10일 이후 점차적으로 감소하여

15일 경에는 거의 관찰되지 않았음. 한편 일부 암세포를 미세 주입한 성체에서는 이식 부위에

- 22 -

서의 tumor 형성은 관찰되지 않았으나 이식된 암세포가 뇌영역으로 이동하여 증식하는 현상

을 확인할 수 있었으나 그 빈도는 매우 낮았음 (그림 25). 이와 같은 현상은 면역체계가 완전

히 확립되지 않은 배아상태에서는 tumor cell mass 형성이 가능했음에 반하여 성체에서는 암

세포가 host 동물의 완벽히 작동하는 면역체계에 의해서 더 이상 유지되지 않은 것으로 판단

됨. 이상의 결과에서 extravasation 현상을 연구하기 위한 제브라피쉬 모델은 cancer stem

cell이 충분히 포함된 population을 주입하기 위하여 성체를 이용하여야 하고, 이종이식 후 암

세포의 생존이 성체의 면역체계에 의해 공격되지 않도록 하기 위하여 mouse 이종이식 모델

에서와 같이 Nude 및 SCID와 같은 면역부전 동물의 이용 필요성이 제기됨.

그림 24. Transplantation of U87MG:RFP cells into wt and transparent adult zebrafish : 10

Day after microinjection of 1X104cells.

그림 25.. Transplantation of metastatic cancer cells in tail of transparent zebrafish Cancer

cell::RFP(or GFP)/Flk::gfp Models: Growth and Migration

- 23 -

2-4. 암세포 extravasation 관찰을 위한 zinc finger nuclease(ZFN) 유전자 가위를 이용한

면역부전 제브라피쉬의 개발

◯ 위의 결과에서 제브라피쉬 성체에서의 이종이식 후의 암세포의 생장 및 전이를 관찰하기 위

해서는 Nude 및 SCID와 같은 면역부전 동물의 이용 필요성이 제기되었음. Nude 마우스의 경

우 그 원인유전자가 FoxN1의 기능이상에 기인함이 알려져 있어, 제브라피쉬에서의 동종 유전

자를 검색하여 이상을 유도한 면역부전 제브라피쉬 개발을 시도하였음.

◯ 제브라피쉬에서 활용 가능한 target specific 유전자 적중 돌연변이체 제작 기법은 아직 일반

화되지는 않았으나, 최근 zinc finger nuclease 유전자 가위를 사용한 돌연변이체의 제작이 가

능하게 되었음. zinc finger nuclease 유전자가위의 작용 기전은 각기 3개의 염기를 인식하는

zinc finger array 3-4개에 endonuclease인 Fok1 domain를 유전자 조합하여 만든 것으로

genome 내의 target region의 double strand breakage를 유도한 후, non-homologous end

joining (NHEJ) 기전에 의해 insertion 또는 deletion mutation을 일으킴 (그림 26).

그림 26. Zinc-finger nucleases (ZFN)-induced insertion or deletion mutations.

그림 27. 제브라피쉬 FoxN1 유전자

- 24 -

◯ 면역부전 제브라피쉬를 개발하기 위하여 Nude 면역부전 마우스의 원인 유전자인 제브라피쉬

FoxN1의 염기 배열을 Sanger center의 [ensemble MultiBlastView engine] 프로그램으로 검

색한 후, 상동한 유전자의 일부분을 PCR로 클로닝 하고 이어서 full length cDNA를 확보함

(그림 27). 포유류와 제브라피쉬의 FoxN1의 구조 및 아미노산 배열을 비교하고, 구조적으로

보존되어 있으면서 중요한 역할을 하는 motif를 zinc finger nuclease의 target으로 선정하였음

(그림 28).

그림 28. Modular assembly법을 이용한 FoxN1 유전자 targeting용 zinc finger module 선정

◯ FoxN1 유전자 exon 2 및 3에서 spacer가 5 bp 또는 6 bp를 인식하는 zinc finger module을

각각 5개씩 제작하여 Fok1 nuclease가 들어있는 expression vector에 재조합한 targeting

construct를 제작하였음. 상기 targeting vector로부터 in vitro transcription 법을 사용하여

capped mRNA를 만든 후 one cell stage의 수정란에 미세주입하여 target genome 내의

double strand breakage를 유도한 다음, non-homologous end joining (NHEJ) 기전에 의한

- 25 -

insertion 또는 deletion mutation (in/del mutation)이 일어났는지를 관찰함 (그림 29).

◯ Target genome 내의 돌연변이 유도 여부는 heteroduplex DNA 특이적 endonuclease인 T7

endonuclease sensitivity 법 또는 target specific restrition enzyme (Mnl 1)에 의해 DNA 절

단 여부에 의해 판단하였음 (그림 29).

그림 29. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases

◯ 상기 10종의 module 중 FoxN1 유전자의 exon 3을 target으로 하는 spacer 5 bp를 인식하는

zinc finger nuclease (zfn 5-4)의 활성을 확인한 후, 미세주입에 의한 founder 제브라피쉬를

제작한 후 germ line transmission된 F1 세대의 heterozygotic mutant를 스크리닝하였음 (그

림 30).

그림 30. FoxN1 (nude) gene: Modular assembly methods, Toolgen ZFN

- 26 -

그림 31. FoxN1 (nude) gene: Modular assembly methods, Toolgen ZFN

◯ FoxN1 유전자 heterozygotic 돌연변이체의 genomic DNA에서 FoxN1 유전자의 knockout 타

겟 부위를 DNA sequencing으로 확인한 결과, N-terminal 192개의 아미노산만으로 구성된 돌

연변이 단백질이 생산됨. 이 돌연변이 단백질은 FoxN1 단백질에서 중요한 역할을 할 것으로

추정되는 Forkhead domain을 포함하지 못하여 정상적으로 기능을 하지 못할 것으로 추정됨.

◯ 한편 FoxN1 유전자 돌연변이체에서 스크리닝한 F1 세대의 heterozygotic mutant를 동종 교

배하여 homozygous 돌연변이체를 얻어 thymus 특이적인 유전자 rag1으로 in situ

hybridization을 실시하여 mRNA의 발현을 알아 본 결과, 배아 초기의 흉선 발달에 문제가 있

는 것으로 판단됨. 흉선 발달에 문제가 있는 FoxN1 돌연변이체는 T cell를 포함하는 면역세

포 생성에 문제가 생기고 이에 따라 면역 시스템의 부전이 일어나 제브라피쉬가 개발됨. (그

림 31)

- 27 -

3. 연구결과 고찰 및 결론

3-1. 암모델동물로서의 제브라피쉬의 유용성

◯ 제브라피쉬 (Zebrafish, Danio rerio)는 최근 세계적으로 척추동물의 발생 연구 및 사람의 질

환연구에 탁월한 장점을 가지고 있는 중요한 모델 동물로 특히 조직특이적으로 형광을 발현

하는 transgenic fish를 이용하면 특정 세포의 이동이나 증식 사멸 분화 과정을 생체 내에서

살아있는 상태에서 관찰할 수 있음. 또한 제브라피쉬는 25개의 염색체를 가지고 있으므로, 인

체의 유전자와 크기와 수가 비슷하며 유전자 및 단백질간의 상동성이 매우 높고, 또한 신경계

뿐 아니라 각종 기관형성 과정이 사람과 매우 유사하기에 제브라피쉬의 연구를 통하여 얻어

진 결과들은 바로 인간의 건강과 질병 연구에 중요한 자료로 활용될 수 있음.

그림 32. Zebrafish (Danio rerio) as a Cancer Model

◯ 특히 제브라피쉬는 인체의 질병모델 뿐 아니라 밑의 그림에서 보는바와 같이 암이 유발되는

경로 및 암의 조직학적 구조가 사람과 유사하며(그림 32), 각종 암 유발 관련 유전자들의 발

암 기전이 사람과 거의 동일한 것으로 확인되어 최근 많은 연구자들에 의하여 암동물모델로

서 암 연구에 활용되고 있음(표 5). 또한 제브라피쉬는 각종 carcinogen에 대한 반응성이 일반

적인 암세포주와 비슷하며, 특히 발생후 약 5-7일째까지는 96 well plate에서 배양이 가능하므

로 질환모델로 확립한 제브라피쉬를 사용하여 대단위 신약 탐색이 가능함.

- 28 -

표 5. 대표적인 제브라피쉬 발암 모델 동물

Myc-induced T cell leukemia in

transgenic zebrafish

(Langenau et. al. Science 299: 887-890, 2003)

제브라피쉬에서 thymus 특이적 promoter에 의한

발암유전자 발현을 통한 T cell leukemia 발생,

형광단백질의 동시 발현에 의해 살아 있는 개체 내에서

암 형성 및 전이를 쉽게 관찰

Adenomatous polyposis coli

-deficient zebrafish as

cololectal cancer model

(Haramis et. al. EMBO Rep 7: 444-449, 2006)

Fish model for melanoma (Patton et. al. Curr Biol 15: 249-254, 2005)

p53 유전자에 돌연변이가 일어난 제브라피쉬에 human

BRAF 유전자를 이상 발현시킨 형질전환 모델

Transplantable tumor lines in

clonal zebrafish(Mizgireuv et. al. Cancer res 66: 3120-3125, 2006)

표 6. 뇌종양 유발 관련 대표적인 표지 인자

발암 유전자

(Oncogene)

발암 억제 유전자

(Tumor suppressor gene)

신경교종

(Glioblastoma)

EGF receptor: EGFRvIII (Wong

et. al. PNAS 89: 2965-2969,

1992)

PTEN

(Li DM, Sun H. PNAS 95:

15406-15411, 1998)

Kras

(Holland et. al. Nature

Genetics 25: 55-57, 2000)

p16INK4a/CDKN2A

(Arap et. al. Oncogene 14:

603-609, 1997)

Akt

(Holland et. al. Nature

Genetics 25: 55-57, 2000)

p53

(van Meyel et. al. JNCI 86:

1011-1017, 1994)

수모세포종

(Medulloblastoma)

SmoA1 (Shh signaling)

(Hallahan et. al. Cancer Res 64:

7794-7800, 2004)

Patched

(Vorechovsky et. al. Oncogene

15: 361-366, 1997)

N-Myc

(Browd et. al. Cancer Res 66:

2666-2672, 2006)

SuFu (Shh signaling)

(Taylor et. al. Nature Genetics

31: 306-310, 2002)

Kras

(Thomas et. al. Nature

Genetics 39: 347-351, 2007)

Axin1 (Wnt signaling)

(Dahmen et. al. Cancer Res 61:

7039-7043, 2001)

3-2. 유전자조작 제브라피쉬 뇌암모델

◯ 최근 많은 연구자들에 의해서 뇌종양 조직 및 확립된 암세포주로부터 종양 유발 관련 유전자

들의 돌연변이에 의한 종양유전자의 활성화, 세포 신호전달체계의 이상 등에 의한 분자 종양

학적 기전이 각각의 종양 종류에 따라 특이적인 것이 밝혀지고 있음.(표 6)

- 29 -

표 7. 대표적인 뇌종양 관련 동물모델 (Genes Dev. 2007 21: 2683-2710)

◯ 현재까지 뇌암 및 뇌전이암 동물 모델에 관한 연구는 전 세계적으로 매우 활발하게 진행되고

있고, 그 대부분은 생쥐모델로 제브라피쉬에서의 뇌암모델 개발은 아직 시작 단계임 (표 7)

◯ 제브라피쉬 뇌암 동물모델 개발 방법은 유전적으로 발암유전자를 신경줄기세포에 과잉발현

시킨 형질전환체를 제작하여 시도하였으나, 한 개의 발암유전자로서는 개체에서 암 발생이 되

지 않는 것을 확인하였고, 이를 극복하기 위해 발암유전자 조합의 조직 특이적인 double

activation을 유도한 형질전환 성체에서도 기대하였던 암조직은 발견되지 않아, 그 원인을 파

악하기 위해 형질전환 제브라피쉬에서 실재 각 발암유전자가 발현하는지 여부를 검토함. 그

결과 2세대 이상 경과한 형질전환 제브라피쉬의 genome 내에 도입한 유전자가 지속적으로

integration된 상태로 유지되고 있었으나, 각 발암유전자의 발현은 세대가 경과함에 따라 발현

이 억제되고 있음을 확인하였음 (그림 33). 이러한 형질전환 유전자의 발현 억제는 본 연구

에서 사용한 UAS 영역에서의 DNA methylation에 의해 발생하는 것으로 사료됨.

- 30 -

그림 33. Transcriptional silencing and DNA methylation in GAL4-UAS transgenic

zebrafish

◯ M. Halpern group이 발표한 최근 논문에 따르면 이들 또한 UAS-transgenic 제브라피쉬에서

의 유도 유전자 발현이 억제되는 현상을 발견하였고, 그 해결책으로서 DNA

methyltransferase-1 (dnmt1) 돌연변이체를 제작하여 교배함으로써 유전자 발현을 정상화함에

성공하였음. 이에 본 연구에서 제작한 UAS-oncogene 형질전환 제브라피쉬의 경우에도

dnmt1 돌연변이체를 적용함으로써 oncogene 조합의 발현을 유지할 수 있을 것으로 기대됨.

◯ 또한 조직 특이적 GAL4 발현 형질전환체와 UAS 조절 발암유전자 발현 형질전환체의 교배에

의한 발암 모델 개발 전략을 제브라피쉬 조직 특이적 endogeneous promotor에 발암유전자를

직접적으로 연결한 construct를 사용한 형질전환체의 제작을 통하여 DNA methylation에 둔감

한 형질전환 모델을 개발하여 극복하고자 하여 2A peptides system을 도입하여 해결하고자

하였음.

그림 34. 2A peptide system for simultaneous expression of multiple cistron.

- 31 -

표 5. 제브라피쉬 이종이식 암모델 현황

이종이식 암모델 참고문헌

Tumorigenic FGF2-overexpressiong MAE (murine

aortic endothelial) modelCancer Research 67: 2927-2931(2007)

Human metastatic melanoma (WM-266-4) model Angiogenesis 9: 139-151 (2006)

Transplantable Tumor Lines Generated in ClonalZebrafish

Cancer Research 66: 3120-3125(2006)

1. Human endometrial adenocarcinoma Tet-FGF2 cells

2. Murine melanoma B16-BL16 cells

Nature Protocols 2: 2918 - 2923(2007)

Human glioma (U251-RFP) model Cancer Res 68: 3396-3404 (2008)

Human adonocarcinoma (MDA-MB-435) model PNAS 104(44) 17406-17411 (2007)

3-3. 암세포의 intravasation 및 extravasation 연구를 위한 제브라피쉬 이종이식 암모델

(zebrafish xenograft cancer model)의 개발 및 응용

◯ 최근 많은 연구자들에 의해서 제브라피쉬를 이용하여 암세포 이종이식을 시도, 전임상모델로

서의 가능성을 연구하고 있음 (표 8)

◯ 제브라피쉬 배아 이종이식 모델을 활용한 암세포의 intravasation 및 extravasation을 관찰하

기 위한 실험 디자인을 기존의 배아 복강의 perivitelline space에 미세주입 방법에서 배아의

심장에 직접 암세포주를 미세주입하는 방식으로 변경하였음. 주입한 세포주는 약 100여개로,

수정 후 48시간이 지난 Flk::GFP 형질전환 배아의 심장에 직접 미세주입하여 24시간 후 혈관

밖으로 이동하는 RFP 표식 암세포를 형광현미경으로 추적하였음 (그림 35). 그 결과, 개체당

약 0～2개의 암세포가 혈관에서 탈출하는 것을 확인하였음 (그림 36). 그러나 이와 같은 적은

숫자의 extravasation 된 암세포는 전이 후 tumor mass 형성을 기대하기에 충분한 cancer

stem cell을 포함하지 않으므로, 미세주입하는 암세포의 절대 수량를 증가시킬 필요성을 시사

함.

◯ 암세포의 전이과정 연구에서 intravasation 및 extravasation을 제브라피쉬를 사용하여 실시간

으로 관찰하기 위해서는 사용하는 암세포주의 전이 능력 외에도 이종이식하는 암세포 중

cancer stem cell의 population이 어느 정도인가에 따라 모델의 성공 여부가 나누어진다고 알

려져 있음. 기존의 기술에서 제브라피쉬 배아에 이종이식할 수 있는 암세포 수는 약 200여개

로 제한되어 있어 이 중 cancer stem cell은 극히 일부분 존재하거나 포함되어 있지 않을 가

능성이 매우 높음. 그러므로 성체를 사용한 이종이식 기술을 확보함으로써 개체당 이종이식할

- 32 -

수 있는 암세포수를 늘일 수 있으며, 이를 통하여 개체당 이식되는 cancer stem cell을 충분히

확보할 수 있을 것으로 기대됨.

그림 35. Transplantation of cancer cells into the heart of zebrafish

그림 36. AGS::RFP cell extravasation from vessels of Flk1::GFP 제브라피쉬 모델

◯ 암세포 extravasation 관찰을 위한 면역부전 제브라피쉬 (Nude zebrafish)를 개발을 위해 제브

라피쉬의 nude gene인 foxn1 유전자에 대하여 특이적인 double strand breakage를 유도하는

zinc finger nuclease를 이용한 Knockout을 시도하였음. (그림 37, 38).

그림 37. Zinc finger nucleaseAGS::RFP cell extravasation from vessels of Flk1::GFP 제브

라피쉬 모델

- 33 -

그림 37. In vivo targeted mutagenesis using customized zinc finger nuclease in zebrafish

◯ 제브라피쉬 배아(zebrafish embryos)을 사용한 이종 이식 모델은 면역 억제된 상태가 아니므

로 한꺼번에 많은 수의 동물에 다양한 실험 조건에서 이종 이식이 가능한 반면, host 동물이

매우 작음으로 인해 발생하는 이식할 수 있는 암세포 수의 제한으로 인해 여러 가지 문제점

을 가지고 있다. 본 연구에서 밝혀진 바와 같이 시도된 암세포의 약 40%만이 생존 가능하다

는 것은 이식된 암세포의 수가 너무 적거나, 제브라피쉬에서는 아직 잘 알려져 있지 않은 내

재 면역 체계(innate immune system)에 의한 non specific prevention에 의한 가능성이 있음.

◯ 이를 극복하기 위해서는 기존의 생쥐모델에서 주로 이용되는 면역부전 마우스와 같이 제브

라피쉬의 면역체계를 억제한 면역부전 제브라피쉬의 모델을 개발하여 배아가 아닌 성체에서

각종 암세포의 이종이식을 실시할 필요가 있음.

◯ 포유동물 유전학의 발전으로부터 1962년 발견된 Nude 마우스 및 1983년에 개발된 중증복합

면역부전증(SCID: Severe Combined Immuno-Deficiency) 마우스의 원인 유전자가 각각

FoxN1과 DNA dependent protein kinase(DNA-PK)라는 것이 알려져, 본 연구자들에 의하면

제브라피쉬에서도 각각의 유전자 보존되어있고 그 구조 및 아미노산 배열이 포유류의 그 것

과 매우 유사함. 한편, 제브라피쉬를 이용한 면역부전동물은 아직까지 전혀 보고된 바 없어,

본 연구 과제를 통해 얻은 Nude 제브라피쉬는 암세포의 이종 이식 모델뿐만 아니라 각종 질

- 34 -

표 6. List of ZFNs used for targeted genome editing in higher eukaryotic cells and

organisms

Genome editing with modularly assembled zinc-finger nucleases(Kim, J.-S.et. al. Nature methods 7(2): 91, 2010)

환모델동물로 쓰이는 제브라피쉬의 면역체계의 연구에도 유용하게 이용되리라 기대됨.

◯ 최근까지 제브라피쉬의 돌연변이체의 제작은 ENU에 의한 화학적 돌연변이법, retroviral

insertion 돌연변이법, TILLING(Targeting Induced Local Lesions in Genomes) 등의 random

mutagenesis 이외에는 없었으나, zinc finge nuclease 유전자가위를 이용하여 특정한 유전자

부위를 gene targeting하는 방법이 개발되어 제브라피쉬의 특정 유전자 돌연변이체의 제작이

가능하게 되었음.

- 35 -

논문명저자

(저자구분1))

저널명(I.F.)Year;

Vol(No):Page구분

2)지원과제번호

3)

An in vivo C. elegans model systemfor screening EGFR-inhibitinganti-cancer drugs

배영기(제1)

PLos One(4.09)

2012;

7(9):e42441국외SCI

0810070

Galectin-3 Facilitates Cell Motility inGastric Cancer by Up-Regulating

Protease-Activated Receptor-1(PAR-1)and MatrixMetalloproteinase-1(MMP-1)

배영기(공동)

PLoS ONE

(4.351)

2011;

(6)9:e25103국외SCI

0810061

MicroRNA let-7a suppresses breastcancer cell migration and invasionthrough downregulation of C-Cchemokine receptor type 7.

배영기(공동)

Breast cancerresearch(5.245)

2012;

14(1) r14국외SCI 0910150

Her4-positive population in thetectum opticum is proliferating neuralprecursors in the adult zebrafishbrain

배영기(공동)

Mol Cells

(2.023)

2012;

33

:627-632

국내SCI 없음

Zinc finger genes Fezf1 and Fezf2

control neuronal differentiation by

repressing Hes5 expression in the

forebrain.

배영기(공동)

Developme

nt

(6.812)

2010;

137(11)

:1875-85

국외SCI 없음

Proneural gene-linked neurogenesis

in zebrafish cerebellum.배영기(공동)

Developmental

Biology

(4.416)

2010;

343(1-2)

:1-17

국외SCI 1010270

Proliferating neural progenitors in

the developing CNS of zebrafish

require Jagged2 and Jagged1b

배영기(제1)

Mol Cells

(2.023)

2010;

30(2)

:115-119

국내SCI

없음

Gicerin/Cd146 is involved in

zebrafish cardiovascular development

and tumor angiogenesis

배영기(공동)

Genes to

Cells

(3.137)

2010;

1 5 :1099-1110

국외SCI

없음

4. 연구성과 및 목표달성도

(1) 연구성과

가. 국내 및 국제 전문학술지 논문 게재 및 신청

1) 저자구분 : 교신, 제1, 공동

2) 구분 : 국내, 국내 SCI, 국내 SCIE, 국외, 국외SCI, 국외SCIE 등

3) 지원과제번호(Acknowledgement)

- 과제번호를 연차 표시(-1, -2, -3 등)를 생략하고 7자리로 기재하고, 과제와 관련성은 있으나

불가피하게 Acknowledgement가 누락된 경우에는 ‘없음’으로 기재

- 36 -

논문명 저자 학술대회명 지역1)지원과제번호

Development of tumor models using

zebrafish: genetic modified brain tumor

models and xenograft models for

preclinical trials

배영기

한국분자세포생물학회

제7회 한국제브라피쉬

연구회국내

1010270

Development of tumor models using

zebrafish

배영기 한국실험동물학회

2011 국제학술대회

국내 1010270

구분1) 특허명 출원인 출원국 출원번호

저서명 저자 발행기관(발행국, 도시) 쪽수 Chapter 제목, 쪽수(공저일 경우)

보고서명 정부정책 기여내용

나. 국내 및 국제 학술대회 논문 발표

1) 지역 : 국내, 국외

다. 산업재산권

1) 구분 : 발명특허, 실용신안, 의장등록 등

라. 저 서

마. 연구성과의 정부정책 기여

바. 기타연구성과

- 37 -

최종목표 연차별목표 달성내용달성도(%)연차 최종

암발생 및 전이의

분자기전 및 저

해방법 연구를

위한 제브라피쉬

암모델동물의 개

발

1차년도

제브라피쉬를 이용한

뇌전이암 및 뇌암의

분자기전 및 저해방법

연구를 위한 유전자

조작 동물모델의

연구기반 구축

◯ 제브라피쉬 시설 내의 기존 장비

에 추가로 제브라피쉬를 키울 수

있는 수조 및 유지 장치의 보강

◯ 기존의 p53 및 patched2 제브라

피쉬 발암억제유전자 돌연변이

체 외에 pten-a, pten-b, apc

등 3종류의 돌연변이체를 확보

◯ 뇌암 동물모델 개발을 위한 신

경줄기세포 (neural stem cell)

특이적 유전자의 발현조절영역

을 genomic DNA, BAC

plasimd에서 동정하고, 제브라

피쉬 배아에 transient 또는

stable하게 발현시켜 그 활성을

확인한 후, glioma 유도

GAL4-lines과 medulloblastoma

GAL4-lines를 제작하여

founder 제브라피쉬를 제작

◯ 발암유전자 발현 형질전환 제브

라피쉬의 in cross를 통하여 각

각 F2 및 F3 세대까지

homozygous transgenic 제브라

피쉬를 제작

◯ 발암유전자 하나만의 유도 발현

으로 충분하지 않은 형질전환

제브라피쉬 모델에서 암발생

과정을 인위적으로 유도하기

위해 하나의 promoter에 의한

여러 발암유전자의 동시 다중

유도를 위해 Promoter-Gal4 형

질전환체와 UAS-oncogenes

(EGFRs, Ras, N-myc, Akt,

etc) 형질전환체 사이의 다중교

배 (Multiple cross) 실시

10040

/100

(2) 목표달성도

가. 연구목표의 달성도

- 38 -

암세포의

intravasation 및

extravasation 연구를

위한 제브라피쉬

이종이식 암모델

(zebrafish xenograft

cancer model)의 탐색

◯ U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피

쉬 모델을 이용하여 개체가 살

아있는 상태에서 실시간으로

U87MG::RFP 세포의 증식 과

정을 관찰하여 12 시간 후부터

급격한 이상증식 현상을 확인

◯ 제브라피쉬 모델을 이용하여 항

암 후보 물질의 탐색하고

gamma-irradiation 처리의

synergic 효과를 비교 검토 동

정

◯ U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피

쉬 모델을 이용하여 Sigma 사

에서 시판하는 1280여개의

phamacologically active

compound에 대해 in-vivo pilot

scale screening 실시하여

etoposide 등의 활성 확인

◯ 2 종류의 형광단백질을 발현하

는 전이성 암세포주의 확립

( P C 3 M : : G F P ,

MDA-MB231::mRFP)

◯ 제브라피쉬에서의 암세포 이종

이식의 최적조건 확립하여

tumor xenograft 실시하고, 이

식된 암세포의 생장, 이동 등의

관찰

◯ 암세포의 전이과정에서의

cancer cell migration은 혈관

형성에 의존하는 것으로 판명

◯ 암세포의 intravasation 및

extravasation를 형질전환 제브

라피쉬 (Flk1-GFP transgenic

zebrafish)을 이용한 tumor

xenograft 실시 및 형광현미경

을 사용하여 암세포의 생장, 이

동의 실시간 관찰

2차년도

제브라피쉬 유전자

조작 뇌암 모델동물

개발을 위한

발암유전자 발현형

◯ 발암유전자 조합의 조직 특이적

인 double activation은 배아 상

태에서 세포사멸 및 비특이적

10070

/100

- 39 -

형질전환

제브라피쉬의 개발

세포증식에 대하여 아무런 영향

을 발견할 수 없었고, 성체로 성

장한 발암유전자 double

activation 형질전환체에서도 암

발생 유도는 충분하지 않음을

확인함

◯ ΔPH Akt와 불특정 발암유전자

조합의 동시 발현 배아의 경우

세포증식은 감소하고, 조직 특

이적 세포 사멸이 증가되어 최

종적으로 수정 후 3일 이내에

배아발생이 중지되고 죽음에

이르는 것을 확인함

◯ ΔPH Akt와 불특정 발암유전자

조합의 동시발현 형질전환체의

초기발생 중지를 극복하기 위하

여 상기 배아에 antisense

morpholino oligonucleotide를

미세 주입하여 p53의 발현을 일

시적으로 억제함으로써 성체로

의 성장 가능함을 확인함

◯ 다중 유전자 발현을 위한

2A-peptide system 벡터의 제

작 및 double-triple oncogene

발현 construct의 활성 검증을

제브라피쉬 수정란에 미세주입하

여 각각의 oncogene 발현 여부

를 확인한 후, germ line

transmission을 생산할 수 있는

founder 제브라피쉬 스크리닝 수

행함

Flk1-GFP

제브라피쉬 배아

모델에서의 암세포

intravasation 및

extravasation 연구

◯ 제브라피쉬 배아 이종이식 모델

을 활용한 암세포의

extravasation을 관찰하기 위해

배아의 심장에 직접 암세포주

를 미세주입하는 방식으로 변

경함

◯ 성체 제브라피쉬에서도 내부장기

및 혈관이 보이는 투명한 돌연

변이체 casper 및 fantom을

확보하여, 성체에서 암세포의

- 40 -

이종이식을 실시한 후, wild

type 제브라피쉬에서의 결과와

비교 검토함

◯ 일부 이종이식한 성체에서 이식

된 암세포가 뇌영역으로 이동

하여 증식함을 확인하였으나

그 빈도가 매우 낮았고, 기존의

면역체계가 정상적인 성체에서

충분한 수량의 암세포를 사용한

이종이식실험에서도 tumor cell

mass 형성에 충분하지 않음을

확인함

3차년도

확립된 제브라피쉬

유전자조작

제브라피쉬

뇌암모델동물 개발 및

발암성 연구

◯ 조직 특이적으로 발암유전자를 다

중발현하는 형질전환 제브라피쉬

(F1 heterozygous transgenic

zebrafish)의 제작함

◯ 발암 억제 유전자 기능 이상 돌연

변이체와 발암유전자 발현형 형질전

환 제브라피쉬의 교배에 의한 암모

델 개발함

◯ 다중 교배에 의해 제작된 뇌암모

델동물에서 암발생 여부 및 발생한

암조직의 조직학적, 분자 세포학적

특성 분석.

100100/

100

암세포 intravasation

및 extravasation

연구를 위한 면역부전

제브라피쉬 모델의

개발

◯ 제브라피쉬의 target specific 유전

자 적중 돌연변이체 제작을 위한

zinc finger nuclease 유전자 가위

법 도입: modular assembly 법

◯ 암세포 extravasation 관찰을 위한

면역부전 제브라피쉬를 개발하기

위하여 Nude 면역부전 마우스의

원인 유전자인 제브라피쉬 FoxN1

유전자를 동정하고, 그 기능에 중

요한 역할을 하는 motif를 zinc

finger nuclease의 target으로 선

정하였음.

◯ 암세포 extravasation 관찰을

위한 면역부전 제브라피쉬를 개

발하기 위해 제브라피쉬 Nude

gene (FoxN1)에 대한 zinc finger

- 41 -

module의 제작하고, 그 활성을

zinc finger nuclease의 mRNA를

제브라피쉬 수정란에 미세주입하

여 확인함. heterozygotic mutant

를 스크리닝을 수행함

◯ 활성이 확인된 FoxN1 유전자

targeting zinc finger nuclease의

발현에 의한 founder 제브라피쉬

를 제작하고, germ line

transmission된 F1 세대의

heterozygotic mutant를 스크리닝

함.

◯ FoxN1 유전자결손의 Knockout

제브라피쉬를 제작하고, F1 세대

의 heterozygotic mutant의 상호

교배에 의한 homozygous 돌연변

이체에서의 흉선 이상을 관찰함..

- 42 -

평가의 착안점 자 체 평 가

제브라피쉬를 이용한 뇌전이암 및 뇌

암의 분자기전 및 저해방법 연구를

위한 동물모델의 연구기반 구축

- 형질전환 제브라피쉬 제조의 진

행 정도. [F2 hetero

/homozygous 의 제작 수 (A(≧4),

B(=3), C(<3))]

- 형질전환 및 유전자 조작 벡터의

제작 및 founder 제브라피쉬의 개발

및 확보 정도. [ (A(≧3), B(=2),

C(<2))]

- 동물모델의 연구기반구축: 제브라피쉬 시설 내의 기존

장비에 추가로 제브라피쉬를 키울 수 있는 수조 및 유지 장

치의 보강하고, 기존의 p53 및 patched2 제브라피쉬 발암

억제유전자 돌연변이체 외에 pten-a, pten-b, apc 등 3

종류의 돌연변이체를 확보하여 기존 목표를 충분히 달

성.

- 뇌암 동물모델 개발을 위한 glioma 유도 GAL4-lines

3종과 medulloblastoma GAL4-lines 3종, 그리고

UAS::oncogene 13종의 F2 세대 homozyous transgenic

제브라피쉬 제작: 기존 목표 보다 4배 이상 확보.

- 여러 발암유전자의 동시 다중 유도를 위한 형질전환체

사이의 다중교배 (Multiple cross)에 실시: 총 8 종의 교

배 후 성체를 확보하여 기존 목표 보다 4배 이상 달성.

확립된 제브라피쉬 이종이식 뇌암 동

물모델을 이용한 항암제 탐색

- 제브라피쉬 암모델에 대한 항암

제 in vivo validation 건수 [(A(≧

3), B(=2), C(<2))]

- U87MG::RFP/Flk::gfp 제브라피

쉬 모델을 이용한

phamacologically active

compound에 대해 in-vivo

screening 실시 및 발굴 여부

- U87MG::RFP/Flk::GFP 이종이식 제브라피쉬 암모델에

대행 총 5종의 항암제 in vivo validation 실시하여 기존

목표를 넘어 달성

- 이종이식 제브라피쉬 암모델을 이용하여 Sigma 사의

1280여개의 phamacologically active compound에 대해

in-vivo pilot scale screening 실시하여 etoposide 등 2종

의 compound에 대한 활성 확인: 기존 목표를 충분히 달

성.

암세포의 intravasation 및

extravasation 연구를 위한 제브라피

쉬 이종이식 암모델 (zebrafish

xenograft cancer model)의 개발

- 형광단백질 발현 암세포의 확립

[(A(≧3), B(=2), C(<2))]

- 암세포 이종이식 실시 및 제브

라피쉬 내에서 암세포 생장, 이동,

전이 등의 관찰 [(A(≧3), B(=2),

C(<2))]

- H1299::RFP 및 AGS::RFP 외 2 종류의 형광단백질을

발현하는 전이성 암세포주 (PC3M::GFP,

MDA-MB231::mRFP)를 확립하여 제브라피쉬에서의

tumor xenograft 실시하고, 이식된 암세포의 생장, 이동

등의 관찰함: 기존 목표를 충분히 달성.

- 암세포의 intravasation 및 extravasation를 형질전환

제브라피쉬 (Flk1-GFP transgenic zebrafish)을 이용한

tumor xenograft 실시 및 형광현미경을 사용하여 암세

포의 생장, 이동의 실시간 관찰: 기존 목표를 충분히 달

성.

제브라피쉬를 이용한 뇌전이암 및 뇌

암의 분자기전 및 저해방법 연구를

위한 동물모델 개발

- 뇌암 동물모델 개발을 위하여 여러 발암유전자의 동시

다중 유도를 위한 형질전환체 사이의 다중교배

(Multiple cross)에 실시: 총 8개 조합의 교배 후 성체

나. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가

- 43 -

- 형질전환 제브라피쉬의 다중교

배에 의한 발암유전자 double

activation 실시 건수 [A(≧4),

B(=3), C(<3)]

- 발암유전자 다중 발현을 위한

2A peptide construct 제작 건

수 및 founder fish 제작 건수

[A(≧3), B(=2), C(<2)]

를 확보하여 그 발암여부를 검토함 (A).

- 특히, ΔPH Akt와 불특정 발암유전자 조합의 형질전환체

에서 관찰되는 초기 발생단계에서의 세포사멸을 극복하

기 위하여, 상기 다중교배 형질전환체에 p53 antisense

morpholino oligonucleotide의 미세 주입에 의한 초기

발생 독성 억제 방법을 개발하였음.

- 2A peptide system을 이용하여 제작한 double-triple

oncogene 발현 construct를 제브라피쉬 수정란에 미세주

입하여 각각의 oncogene 및 marker인 GFP의 발현 여부

를 확인하고, germ line transmission을 생산할 수 있는

founder 제브라피쉬 6종을 스크리닝함 (A).

암세포의 intravasation 및

extravasation 연구를 위한 제브라피

쉬 이종이식 암모델 (zebrafish

xenograft cancer model)의 개발

- extravasation 연구를 위한 제브라

피쉬 이종이식 암모델 개선 시도

여부 [A(≧2), B(=1), C(<1)]

- 개선 시도한 제브라피쉬 이종이

식 암모델 검증 및 유효성 평가

건수 [A(≧2), B(=1), C(<1)]

- 암세포의 extravasation을 관찰하기 위한 제브라피쉬 암모

델의 개선을 위해서 암세포수의 증가를 위한 성체 제브라

피쉬 에서의 이종이식 모델을 시도하여 그 유효성을 검토

하였음.

- 또한 일반 야생형 제브라피쉬와 casper 및 fantom 등의 투

명 제브라피쉬 성체를 이용한 이종이식 실험법을 비교하여,

암세포의 extravasation을 관찰하기 위해서는 면역 부전 투

명 제브라피쉬 모델의 필요성을 제시하였음 (A).

유전자 조작 제브라피쉬 뇌암모

델동물 개발

- 조직 특이적으로 발암유전자를 다

중발현하는 형질전환 제브라피쉬

(F1 heterozygous transgenic

zebrafish)의 제작

- 발암 억제 유전자 기능 이상 돌연

변이체와 발암유전자 발현형 형질

전환 제브라피쉬의 교배에 의한

암모델 개발

- 다중 교배에 의해 제작된 뇌암모

델동물에서 암발생 여부 및 발생

한 암조직의 조직학적, 분자 세포

학적 특성 분석.

- 조직 특이적으로 발암유전자를 다중발현하는 형질전환 제브

라피쉬 (F1 heterozygous transgenic zebrafish)의 제작:

6종 line 제작

- 발암 억제 유전자 기능 이상 돌연변이체와 발암유전자 발

현형 형질전환 제브라피쉬의 교배에 의한 암모델 개발: 2종

개발

-다중 교배에 의해 제작된 뇌암모델동물에서 암발생 여부 및

발생한 암조직의 조직학적, 분자 세포학적 특성 분석: H

&E 염색 및 광학적 관찰 수행

암세포 extravasation 관찰을 위

한 zinc finger nuclease(ZFN) 유

전자 가위 이용 면역부전 제브라

피쉬의 개발

- FoxN1 유전자 내의 target을

인식하는 zinc finger nuclease 제

- 면역 부전 제브라피쉬의 개발을 위하여 FoxN1 유전자

의 exon 2 및 3 내에 target을 인식하는 zinc finger

nuclease를 10종 제작하였고 각각의 활성을 제브라피쉬

배아에서 검증하였음 (A).

- 활성이 확인된 FoxN1 유전자 targeting zinc finger

nuclease의 mRNA를 제브라피쉬 수정란에 미세주입하

- 44 -

작 및 활성 검증 건수 [A(≧3),

B(=2), C(<2)]

- FoxN1 유전자 targeting zinc

finger nuclease의 발현에 의한

founder 제브라피쉬 스크리닝 건

수 [A(≧2), B(=1), C(<1)]

- F1 세대의 heterozygotic mutant

의 상호교배에 의한 homozygous 돌

연변이체에서의 흉선 이상을 관찰

함..

여 3～4 개월 동안 사육한 후 germ line transmission

된 F1 세대의 heterozygotic mutant를 생산할 수 있는

2종의 founder 제브라피쉬를 스크리닝 하였음 (A).

- F1 세대의 heterozygotic mutant의 상호교배에 의한

homozygous 돌연변이체의 분자적 조직학 해석 여부 (O)

- 45 -

표 7. 세계 최초의 면역부전 제브라피쉬 실험 모델을 이용한 활용분야 및 활용방안

과학 연구계

1. 기존의 Nude 마우스 및 SCID 마우스를 이용한 대부분의 연구를

보다 경제적이고 많은 실험 개체를 사용해서 연구가 가능해 짐.

2. 본 연구개발을 통하여 얻게 될 zinc finger nuclease 유전자가위를

이용한 유전자적중 등의 각종 연구방법 및 기술 등은 향후 표적 인

5. 연구결과의 활용계획

(1) 연구종료 2년후 예상 연구성과

구 분 건 수 비 고

학술지 논문 게재 총 4건

PNAS(9.643), Cancer Research(7.656),

Developmental Biology(4.714), Journal of

Biological Chemistry(5.808)

산업재산권 등록

한국, 미국,

[사람 암세포의 이종이식이 가능한 면역부전

제브라피쉬]

기 타

(2) 연구성과의 활용계획

◯ 본 연구개발을 통하여 만들어질 제브라피쉬 뇌암 및 뇌전이암 모델에서 규명되리라 기대되는

전이 과정중 intravasation, extravasation 등의 분자조절기전 연구결과는 cancer progression,

metastasis의 저해하는 새로운 표적 인자 발굴에 유용한 정보를 제공함.

◯ 본 연구개발을 통하여 얻게 될 각종 연구방법 및 기술 등을 향후 표적 인자만 바꾸어 활용하

면 다양한 다른 종류의 암연구에도 응용이 가능하리라 기대됨.

◯ 특히 비교적 적은 비용으로 단시간 내에 표적 치료제를 탐색할 수 있는 개체 수준의 발암 동

물 모델은 현재 세계적으로도 거의 전무한 실정으로 국제적으로 통용될 수 있는 원천 기술의

확보가 가능하리라 기대됨.

◯ 본 연구개발을 통하여 만들어질 발암 동물 모델은 향후 표적 발암 유전자를 대상으로 한 항

암 치료제 개발에 있어 항암제 탐색 및 그 독성조사를 일시에 할 수 있는 개발 사업를 위한

획기적인 재료로 활용될 것임

◯ 또한 본 연구개발을 통하여 확립된 발암 동물 모델에서 발암 유전자에 대한 세포 증식 사멸

및 분화 조절에 관한 분자 종양학적 기전과 전이 과정의 intravasation, migration,

extravasation등의 기전이 규명되면 얻어진 연구결과들을 바로 고등동물인 생쥐 동물 모델 및

사람의 종양세포 등에서 그 결과들을 검증함으로서 전임상연구에 있어서도 중요한 자료로서

활용될 것임.

- 46 -

자만 바꾸어 활용하면 다른 종류의 질환모델개발에도 응용이 가능함.

3. 면역부전 투명 제브라피쉬를 이용한 암 발생 및 전이 현상을

in-vivo에서 실시간으로 미세 환경(micro-environment) 수준에서 관

찰하여 얻는 정보는 이제까지 볼 수 없었던 암발생 및 전이의 새로

운 개념 및 기전 등을 발견할 기회를 제공함.

4. 또한 본 연구개발을 통하여 확립되는 암동물모델에서 발암 유전자

에 대한 세포 증식 사멸 및 분화 조절에 관한 분자 종양학적 기전과

전이 과정의 intravasation, migration, extravasation등의 기전이 규

명되면 얻어진 연구결과들을 바로 고등동물인 생쥐 동물 모델 및 사

람의 종양세포 등에서 그 결과들을 검증함으로서 전임상연구에 있어

서도 중요한 자료로서 활용될 것임.

의료 제약 산업계

1. 제브라피쉬 질환모델이 가진 대단위 검색(high through-put)에의

응용 등의 장점을 이용해 신약개발 단계에서 신약검색 및 독성검사

와 같은 본격적인 비포유류 전임상모델로서의 활용이 가능함.

2. 한편 zinc finger nuclease를 이용한 동물모델 개발의 성공으로,

제브라피쉬 뿐만 아니라, 기존의 ES cell이 없어 유전자 적중이 불가

능하였던 소, 돼지와 같은 동물에서도 knock out를 통한 유용 유전

자조작 동물모델의 개발이 기대됨.

- 47 -

6. 참고문헌

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