Jolanta F. Kukowska-Latallo et al- Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers

8/3/2019 Jolanta F. Kukowska-Latallo et al- Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyam

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 3 , p p . 4 8 9 7 - 4 9 0 2 , May 1 9 9 6G e n e t i c s

E f f i c i e n t t r a n s f e r o f g e n e t i c m a t e r i a l i n t o mammalian c e l l s u s i n gS t a r b u r s t p o l y a m i d o a m i n e d e n d r i m e r s( t r a n s f e c t i o n / p o l y m e r s / c a t i o n i c l i p i d s / c D N A )

J O L A N T A F . K U K O W S K A - L A T A L L O * , ANNA U . B I E L I N S K A * , J E N N I F E R J O H N S O N * , RALPH S P I N D L E R t ,DONALD A . T O M A L I A t , A ND J A M E S R . B A K E R , J R . * t* D e p a r t m e n t o f I n t e r n a l M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f M i c h i g a n M e d i c a l S c h o o l , Ann A r b o r , MI 4 8 1 0 9 - 0 6 6 6 ; a n d t M i c h i g a n M o l e c u l a r I n s t i t u t e , M i d l a n d , MI 4 8 6 0 4C o m m u n i c a t e d b y J . L . O n c l e y , T h e U n i v e r s i t y o f M i c h i g a n , Ann A r b o r , M I , D e c e m b e r 2 1 , 1 9 9 5 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w S e p t e m b e r 7 , 1 9 9 5 )ABSTRACT S t a r b u r s t p o l y a m i d o a m i n e d e n d r i m e r s a r e an e w c l a s s o f s y n t h e t i c p o l y m e r s w i t h u n i q u e s t r u c t u r a l a n dp h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . T h e s e p o l y m e r s w e r e i n v e s t i g a t e d f o rt h e a b i l i t y t o b i n d DNA a n d e n h a n c e DNA t r a n s f e r a n de x p r e s s i o n i n a v a r i e t y o f mammalian c e l l l i n e s . T w e n t yd i f f e r e n t t y p e s o f p o l y a m i d o a m i n e d e n d r i m e r s w e r e s y n t h e -s i z e d , a n d t h e p o l y m e r s t r u c t u r e w a s c o n f i r m e d u s i n g w e l l -d e f i n e d a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s . T h e e f f i c i e n c y o f p l a s m i d D NAt r a n s f e c t i o n u s i n g d e n d r i m e r s w a s e x a m i n e d u s i n g t w o r e -p o r t e r g e n e s y s t e m s : f i r e f l y l u c i f e r a s e a n d b a c t e r i a l 1 B - g a l a c -t o s i d a s e . T h e t r a n s f e c t i o n s w e r e p e r f o r m e d u s i n g v a r i o u sd e n d r i m e r s , a n d l e v e l s o f e x p re s si o n o f t h e r e p o r t e r p r o t e i nw e r e d e t e r m i n e d . H i g h l y e f f i c i e n t t r a n s f e c t i o n o f a b r o a dr a n g e o f e u k a r y o t i c c e l l s a n d c e l l l i n e s w a s a c h i e v e d w i t hm i n i m a l c y t o t o x i c i t y u s i n g t h e D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s .H o w e v e r , t h e a b i l i t y t o t r a n s f e c t c e l l s w a s r e s t r i c t e d t o c e r t a i nt y p e s o f d e n d r i m e r s a n d i n s o m e s i t u a t i o n s r e q u i r e d t h ep r e s e n c e o f , a d d i t i o n a l c o m p o u n d s , s u c h a s D E A E - d e x t r a n ,t h a t a p p e a r e d t o a l t e r t h e n a t u r e o f t h e c o m p l e x . A f e w c e l ll i n e s d e m o n s t r a t e d e n h a n c e d t r a n s f e c t i o n w i t h t h e a d d i t i o n o fc h l o r o q u i n e , i n d i c a t i n g e n d o s o m a l l o c a l i z a t i o n o f t h e c o m -p l e x e s . T h e c a p a b i l i t y o f a d e n d r i m e r t o t r a n s f e c t c e l l s a p -p e a r e d t o d e p e n d o n t h e s i z e , s h a p e , a n d number o f p r i m a r ya m i n o g r o u p s o n t h e s u r f a c e o f t h e p o l y m e r . H o w e v e r , t h es p e c i f i c d e n d r i m e r m o s t e f f i c i e n t i n a c h i e v i n g t r a n s f e c t i o nv a r i e d b e t w e e n d i f f e r e n t t y p e s o f c e l l s . T h e s e s t u d i e s d e m o n -s t r a t e t h a t S t a r b u r s t d e n d r i m e r s c a n t r a n s f e c t a w i d e v a r i e t yo f c e l l t y p e s i n v i t r o a n d o f f e r a n e f f i c i e n t m e t h o d f o r p r o d u c i n gp e r m a n e n t l y t r a n s f e c t e d c e l l l i n e s .T h e i n t r o d u c t i o n o f g e n e t i c m a t e r i a l i n t o e u k a r y o t i c c e l l s h a sb e e n a m a j o r t e c h n i q u e t o i n v e s t i g a t e g e n e f u n c t i o n a n d t h er e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n ( 1 , 2 ) . I n a d d i t i o n , r e c e n ta d v a n c e s i n d e t e c t i n g i n h e r i t e d o r a c q u i r e d g e n e t i c d i s o r d e r sh a v e p r o v i d e d t h e p o s s i b i l i t y o f t r a n s f e r r i n g r e c o m b i n a n tg e n e s i n t o s o m a t i c c e l l s t o c o r r e c t m i s s i n g o r d e f e c t i v e g e n ep r o d u c t s ( 3 ) . A v a r i e t y o f m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d t oa c c o m p l i s h g e n e t r a n s f e r i n t o e u k a r y o t i c c e l l s . T h e s e t e c h -n i q u e s i n v o l v e t h e d i r e c t p h y s i c a l - i n t r o d u c t i o n o f g e n e t i cm a t e r i a l i n t o c e l l s ( 4 ) , t h e d i s r u p t i o n o f c e l l m e m b r a n e s t oa l l o w t h e t r a n s f e r o f DNA ( 5 , 6 ) , t h e u s e o f g e n e t i c a l l ym o d i f i e d v i r u s e s t o d e l i v e r g e n e t i c m a t e r i a l ( 7 , 8 ) , a n d t h ef o r m a t i o n o f DNA c o m p l e x e s w i t h e i t h e r i n o r g a n i c s a l t s ,p o l y c a t i o n s , o r l i p i d s t o t r a n s f e r t h e DNA a c r o s s c e l l mem-b r a n e s ( 9 , 1 0 , 1 1 ) . T h e r e i s g r e a t u t i l i t y f o r t h e s e t e c h n i q u e s ,b u t t h e r e a r e l i m i t a t i o n s i n t a r g e t c e l l t y p e a n d i n t h e a b i l i t y t ot r a n s f e r d i f f e r e n t t y p e s o f g e n e t i c m a t e r i a l ( 1 0 , 1 1 , 1 2 ) .S t a r b u r s t p o l y a m i d o a m i n e (PAMAM) d e n d r i m e r s a r e anew c l a s s o f h i g h l y b r a n c h e d s p h e r i c a l p o l y m e r s t h a t a r e h i g h l ys o l u b l e i n a q u e o u s s o l u t i o n a n d h a v e a u n i q u e s u r f a c e o f

p r i m a r y a m i n o g r o u p s ( 1 3 , 1 4 , 1 5 ) . Compared w i t h many o t h e rt y p e s o f d e n d r i t i c m a c r o m o l e c u l e s t h a t h a v e r e c e n t l y b e e ns y n t h e s i z e d , PAMAM d e n d r i m e r s a r e t h e o n l y c l a s s o f m a c -r o m o l e c u l e s t h a t a r e u n i d i s p e r s e d a n d s h o w h i g h c h a r g ed e n s i t i e s r e s t r i c t e d t o t h e s u r f a c e o f t h e m o l e c u l e ( 1 3 , 1 6 , 1 7 ) .D e n d r i m e r s h a v e b e e n r e l i a b l y p r o d u c e d i n l a r g e q u a n t i t i e sa n d c a n b e p r e c i s e l y s y n t h e s i z e d o v e r a r a n g e o f m o l e c u l a rw e i g h t s s i m i l a r t o t h a t o f p r o t e i n s . T h e m a j o r s t r u c t u r a ld i f f e r e n c e s i n PAMAM d e n d r i m e r s r e l a t e t o t h e c o r e m o l e -c u l e , e i t h e r ammonia ( N H 3 ) a s t r i v a l e n t i n i t i a t o r c o r e o re t h y l e n e d i a m i n e ( E D A ) a s a t e t r a v a l e n t i n i t i a t o r c o r e ( 1 4 ) ,t h a t s t a r t s t h e s t e p w i s e p o l y m e r i z a t i o n p r o c e s s a n d d i c t a t e ss e v e r a l s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e m o l e c u l e , i n c l u d i n g t h eo v e r a l l s h a p e , d e n s i t y , a n d s u r f a c e c h a r g e . W i t h e a c h ne w l a y e ro r g e n e r a t i o n , t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e d e n d r i m e r moret h a n d o u b l e s , a n d t h e n u m b e r o f s u r f a c e a m i n e g r o u p s e x a c t l yd o u b l e s . T h e d e f i n e d s t r u c t u r e a n d l a r g e n u m b e r o f s u r f a c ea m i n o g r o u p s o f PAMAM d e n d r i m e r s h a v e l e d t o t h e s ep o l y m e r s b e i n g e m p l o y e d a s a s u b s t r a t e f o r t h e a t t a c h m e n t o fa n t i b o d i e s , c o n t r a s t a g e n t s , a n d r a d i o p h a r m a c e u t i c a l s f o r a p -p l i c a t i o n s i n a n u m b e r o f d i f f e r e n t a r e a s o f b i o l o g y a n dm e d i c i n e ( 1 5 , 1 8 , 1 9 ) . S t u d i e s u s i n g . a n t i b o d y / d e n d r i m e r c o n -j u g a t e s i n v i t r o a n d i n v i v o i n e x p e r i m e n t a l a n i ma l s h a v ed o c u m e n t e d t h e s e c o n j u g a t e s t o b e n o n t o x i c a n d a b l e t o t a r g e tb i o l o g i c a g e n t s t o s p e c i f i c c e l l s ( 1 5 , 1 8 , 1 9 ) .

G i v e n t h a t PAMAM d e n d r i m e r s c o n t a i n d e f i n e d n u m b e r so f a m i n o g r o u p s o n t h e s u r f a c e o f t h e p o l y m e r t h a t a r ep o s i t i v e l y c h a r g e d a t p h y s i o l o g i c p H , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a tt h e s e m o l e c u l e s c o u l d i n t e r a c t w i t h b i o l o g i c a l l y r e l e v a n t p o l y -a n i o n s , i n c l u d i n g n u c l e i c a c i d s . I t w a s f u r t h e r p o s t u l a t e d t h a tD N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s m i g h t b e a b l e t o t r a n s f e c t c e l l s i na manner s i m i l a r t o D N A / p o l y l y s i n e c o m p l e x e s ( 1 1 ) , b u t w i t hb e t t e r e f f i c i e n c y , g i v e n t h e h i g h s o l u b i l i t y a n d d e f i n e d a r c h i -t e c t u r e o f t h e d e n d r i m e r . T h i s r e p o r t d e t a i l s t h a t h i g h l ye f f i c i e n t t r a n s f e c t i o n c a n b e a c h i e v e d w i t h D N A / d e n d r i m e rc o m p l e x e s f o r m e d w i t h c e r t a i n t y p e s o f d e n d r i m e r s .

M ATER I A L S AND METHODSD e n d r i m e r S y n t h e s i s . T e n g e n e r a t i o n s o f t w o d i f f e r e n t

t y p e s o f PAMAM d e n d r i m e r s ( N H 3 a n d EDA c o r e ) w e r es y n t h e s i z e d i n a s t e p w i s e p r o c e s s a s d e s c r i b e d i n d e t a i l ( 1 4 ) .E a c h f i n a l d e n d r i m e r p r e p a r a t i o n w a s p u r i f i e d u s i n g u l t r a f i l -t r a t i o n a n d s t r u c t u r a l l y c h a r a c t e r i z e d u s i n g a n u m b e r o f t e c h -n i q u e s , i n c l u d i n g e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o s c o p y ,1 3 C a n d I H n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y , s i z ee x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y , c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s , H P L C ,a n d g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 4 , 2 0 , 2 1 ) . S t a r b u r s t PAMAM d e n -d r i m e r s a r e i d e n t i f i e d u s i n g a s t a n d a r d n o m e n c l a t u r e ; f o re x a m p l e , G 10 ( E D A ) i s t h e 1 0 t h - g e n e r a t i o n EDA c o r e d e n -d r i m e r .A b b r e v i a t i o n s : P A M A M , p o l y a m i d o a m i n e ; EDA, e t h y l e n e d i a m i n e .t T o w h o m r e p r i n t requests s h o u l d b e a d d r e s s e d .

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T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a ge c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t " i na c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


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4 8 9 8 G e n e t i c s : K u k o w s k a - L a t a l l o e t a l .P r e p a r a t i o n o f DNA/Dendrimer C o m p l e x e s . P l a s m i d DNA

was a m p l i f i e d i n b a c t e r i a a n d t h e n i s o l a t e d b y two c y c l e s o fc e s i u m c h l o r i d e g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n ( 2 2 ) . D e n d r i m e r s w e r ed i l u t e d t o an a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n i n b u ff e r c o n t a i n i n g 2 0mM H e p e s (p H 7 . 9 ) , 1 0 0 mM K C l , 0 . 2 mM EDTA, 0 . 5 mMDTT, a n d 20 % g l y c e r o l , w i t h a l l s o l u t i o n s s t o r e d a t 4 C .D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s w e r e f o r m e d b y i n c u b a t i n g t h etwo components t o g e t h e r i n a b u f f e r c o n ta i n i n g 1 0 0 mM N a C l ,1 0 mM T r i s (p H 7 . 5 ) , 5 mM DTT, 4 % g l y c e r o l , a n d 1 mMEDTA f o r a minimum o f 5 m i n a t room t e m p e r a t u r e . R a t i o so f n u c l e i c a c i d t o d e n d r i m e r were b a s e d on t h e e l e c t r o s t a t i cc h a r g e p r e s e n t on e a c h component: t h e number o f p h o s p h a t eg r o u p s i n t h e n u c l e i c a c i d c o m p a r e d w i t h t h e n u m b e r o ft e r m i n a l NH2 g r o u p s on a d e n d r i m e r . F o r e x a m p l e , g i v e n t h a tt h e n u m b e r o f b a s e s i n 1 . 0 j i g o f DNA i s 1 . 7 1 x 1015, 1 . 7 1x 1 0 1 5 n e g a t i v e c h a r g e s ar e p r e s e n t per 1 . 0 j i g o f DNA,w h e r e a s a G 7 ( N H 3 ) d e n d r i m e r h a s - 2 . 6 5 x 1 0 1 5 c h a r g e s p e r, t g . T h e r e f o r e , t o o b t a i n a 1 : 1 c h a r g e r a t i o , 1 . 0 , u g o f DNA w a sm i x e d w i t h 0 . 6 5 , t g o f d e n d r i me r . DNA/dendrimer c o m p l e x e swere a n a l y z e d b y e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y - s h i f t assays i n 1 %agarose g e l i n t h e s t a n d a r d T r i s - b o r a t e EDTA ( T B E ) b u f f e r( p H 8 . 3 ) , w h e r e DNAwas i d e n t i f i e d b y s t a i n i n g w i t h 0 . 1 , u g o fe t h i d i u m b r o m i d e p e r m l .

C e l l s a n d M e d i a . The c e l l l i n e s u s e d i n t h e s e s t u d i e s ar el i s t e d i n T a b l e 1 . A l l c e l l s were m a i n t a i n e d i n s t a n d a r d c u l t u r em e d i a ( e i t h e r R P M I 1 6 4 0 , L e i b o v i t z L - 1 5 , o r DMEM; L i f eT e c h n o l o g i e s , G a i t h e r s b u r g , M D) w i t h 5-10% f e t a l c a l f seruma n d 1 % p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n a t 3 7 C i n 5 % C O 2 .T r a n s f e c t i o n M e t h o d s . T r a n s f e c t i o n s w i t h d e n d r i m e r s w e r ep e r f o r m e d a n d a n a l y z e d u s in g e x p re s s i o n p l a s m i d s p R S V L u c ,pCMVLuc, p R S V f B g a l , a n d p C M V f 3 g a l c o n t a i n i n g e i t h e r t h ef i r e f l y l u c i f e r a s e gen e o r t h e b a c t e r i a l f 3 - g a l a c t o s i d a s e gen eu n d e r t h e c o n t r o l o f e i t h e r t h e Rous s a r c o m a v i r u s o r c y t o -m e g a l o v i r u s l o n g t e r m i n a l r e p e a t e n h a n c e r / p r o m o t e r s ( 2 3 , 2 4 ,2 5 ) . One t o 1 0 , u g o f p u r i f i e d p l a s m i d DNA ( p e r w e l l o ft r a n s f e c t e d c e l l s ) was m i x e d w i t h d e n d r i m e r s a t a v a r i e t y o fc h a r g e r a t i o s , f r o m 2 : 1 t o 1 : 5 0 0 . The DNA/dendrimer com-p l e x e s w e r e t h e n a l l o w e d t o f o r m f o r 5 m i n a t room t e m p e r -a t u r e . S i x - w e l l p l a t e s , s e e d e d 2 4 h b e f o r e t h e t r a n s f e c t i o n w i t h- 2 0 0 , 0 0 0 c e l l s p e r w e l l , w e r e w a s h e d w i t h s e r um - f r e e m e d i u m ,a n d 5 0 , u l o f t h e c o m p l e x c o n t a i n i n g 1 - 1 0 , u g o f DNA wasa d d e d t o e a c h v w e l l o f c e l l s i n 1 m l o f s e r u m - f r e e m edi um a n di n c u b a t e d f o r 3 h a t 3 7 C . The medium c o n t a i n i n g t h e com-p l e x e s w a s t h e n r e p l a c e d w it h s t a n d a r d g r o w t h m e d i u m . Thec e l l s r e m a i n e d i n c u l t u r e f o r 2 4 - 7 2 h b e f o r e b e i n g h a r v e s t e df o r a n a l y s i s o f e x p r e s s i o n o f t h e t r a n s f e c t e d p l a s m i d DNA.

T r a n s f e c t i o n s w e r e a l s o p e r f o r m e d w i t h d i f f e r e n t e n h a n c i n ga g e n t s b y a d d i n g t h e DNA/dendrimer c o m p l e x e s t o mediumt h a t c o n t a i n e d t h e a d d i t i o n a l c o m p o u n d ( s ) . Compounds u s e di n t h i s manner i n c l u d e d : 0 . 2 5 - 1 . 0 , u M D E A E - d e x t r a n c h l o r i d e( a v e r a g e M r , 5 0 0 , 0 0 0 ; S i g m a ) , 2 5 - 1 0 0 , u M c h l o r o q u i n e d i p h o s -p h a t e ( S i g m a ) , a n d 2-10% g l y c e r o l ( S i g m a ) . When s t a b l ec l o n e s w e r e g e n e r a t e d , t r a n s f e c t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h G 7( N H 3 ) d e n d r i m e r ( w i t h o u t d e x t r a n ) a n d p R S V , 3 g a l - N e oa n d / o r pRSVLuc-Neo p l a s m i d DNA. C l o n e s w e r e s e l e c t e d b yi n c u b a t i o n i n n e o m y c i n ( G 4 1 8 , G e n e t i c i n ; L i f e T e c h n o l o g i e s )a t 3 0 0 , u g / m l f o r 3 w e e k s . C o n t r o l t r a n s f e c t i o n s were p e r-f o r m e d w i t h t h r e e c a t i o n i c l i p i d p r e p a r a t i o n s [TFX 5 0 ( P r o -m e g a ) , L i p o f e c t a m i n e , a n d L i p o f e c t i n ( L i f e T e c h n o l o g i e s ) ]a c c o r d i n g t o t h e v e n d o r ' s p r o t o c o l s .A n a l y s i s o f t h e C e l l u l a r U p t a k e o f DNA/Dendrimer Com-p l e x e s . L i n e a r i z e d a n d d e p h o s p h o r y l a t e d DNA f r o m a 2 . 9 - k bp l a s m i d was r a d i o l a b e l e d w i t h [ _ y - 3 2 P ] A T P u s i n g T4 p o l y n u -c l e o t i d e k i n a s e . A f t e r p u r i f i c a t i o n , 2 . 0 ng o f r a d i o l a b e l e d DNA( 5 . 2 x 1 0 7 c p m / , g ) m i x e d w i t h a n a p p r o p r i a t e amount o fn o n l a be l e d p l a s m i d DNA was c o m p l e x e d w i t h G 7 (EDA)d e n d r i m e r t o a c h i e v e a 1 : 1 0 D N A - t o - d e n d r i m e r c h a r g e r a t i o .R a t 2 c e l l s w e r e p l a t e d a t 2 . 0 x 1 0 5 c e l l s p e r w e l l i n s i x - w e l lp l a t e s a n d w a s h e d w i t h s e r u m - f r e e m e d i u m . DNA/dendrimerc o m p l e x e s w e r e t h e n a d d e d a n d i n c u b a t e d w i t h t h e c e l l s f o r 6h , a n d s a m p l e d a t s p e c i f i c t i m e p o i n t s . The c e l l s w e r e w a s h e d ,p r o c e s s e d i n t o e x t r a c t s , a n d s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d mem-b r a n e f r a c t i o n s ( 2 6 ) . R a d i o a c t i v i t y i n w h o l e c e l l e x t r a c t a n d i ne a c h f r a c t i o n was t h e n q u a n t i f i e d , a n d t h e t o t a l c o u n t s w e r ea d j u s t e d f o r t h e n u m b e r o f c e l l s i n t h e s a m p l e .E x p r e s s i o n A s s a ys . L uc i f e ra s e e x p r e s s i o n was q u a n t i f i e d a t2 4 , 4 8 , a n d 7 2 h a f t e r t r a n s f e c t i o n b y m e a s u r i n g t h e l i g h te m i s s i o n r e s u l t i n g f r o m 1 - 1 0 , u l Q f c e l l l y s a t e i n c u b a t e d w i t h2 . 3 5 x 10-2 , u m o l o f l u c i f e r i n s u b s t r a t e ( P r o m e g a ; t e c h . b u l l .1 0 1 ) . L i g h t i n t e n s i t y w a s m e a s u r e d i n a c h e m i l u m i n o m e t e r( L B 9 6 P ; EG & G / B e r t h o l d , G a i t h e r s b u r g , MD) a n d a d j u s t e df o r t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e s a m p l e . The p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n i n t h e c e l l l y s a t e was m e a s u r e d i n a s t a n d a r dassay (D C p r o t e i n a s s a y ; B i o - R a d ) . C e l l s t r a n s f e c t e d w i t h t h ee x p r e s s i o n p l a s m i d c o n t a i n i n g t h e j - g a l a c t o s i d a s e r e p o r t e rgen e w e r e f i x e d i n 1 . 2 5 % g l u t a r a l d e h y d e f o r 5 m i n a t 2 4 - 7 2 ha f t e r t r a n s f e c t i o n . H i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g f o r B 3 - g a l a c t o s i d a s ee x p r e s s i o n was p e r f o r m e d u s i n g 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y lf 3 - D - g a l a c t o s i d e ( X - G a l ) s u b s t r a t e ( L i f e T e c h n o l o g i e s ) i n 5 . 0mM p o t a s s i u m f e r r o c y a n i d e / p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e a n d 2 . 0mM M g C l 2 . The number a n d p e r c e n t a g e o f s t a i n e d c e l l s w e r ed e t e r m i n e d b y l i g h t m i c r o s c o p y .

T a b l e 1 . O p t i m a l g e n e r a t i o n o f PAMAM d e n d r i m e r i n t r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n a s s a y o f d i f f e r e n t c e l lt y p e s a n d f r e q u e n c i e s f o r g e n e r a t i n g s t a b l e c e l l l i n e sC e l l l i n e C e l l t y p e D e n d r i m e r S t a b l e c l o n e f r e q u e n c y

R a t 2 R a t e m b r y o n a l f i b r o b l a s t G10 1 . 3 x 1 0 - 3C l o n e 9 R a t l i v e r e p i t h e l i u m G7-G10 NDN I H / 3 T 3 Mouse e m b r y o n a l G7-G10 NDEL 4 Mouse l y m p h o m a G 7 NDD5 Mouse m e l a n o m a G 7 1 . 6 x 1 0 - 3C O S - 1 M o n k e y k i d n e y f i b r o b l a s t G5-G9 NDCOS-7 M o n k e y k i d n e y f i b r o b l a s t G5-G9 NDCHO C h i n e s e h a m s t e r o v a r y G 1 0 NDQS Human s y n o v i o c y t e G 1 0 NDH e p G2 Human l i v e r h e p a t o b l a s t o m a G10 NDJ u r k a t Human a c u t e T - c e l l l e u k e m i a G7-G10 NDSW480 Human c o l o n a d e n o c a r c i n o m a G 1 0 NDCOLO 3 2 0 D Human c o l o n a d e n o c a r c i n o m a G 1 0 NDSW837 Human r e c t u m a d e n o c a r c i n o m a G I O NDU - 9 3 7 Human h i s t i o c y t i c l y m p h o m a G7-G9 NDHF1 P r i m a r y human f i b r o b l a s t G 1 0 0 . 9 x 1 0 - 4R M 1 R a t m e s o t h e l i a l G5 2 . 5 x 1 0 - 5Y B 2 / 0 R a t m y e l o m a G 7 ND

ND, n o t d e t e r m i n e d .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 )


3/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 ) 4 8 9 9E l e c t r o n M i c r o s c o p e A n a l y s i s o f DNA/Dendrimer Com-p l e x e s . D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s w e r e a n a l y z e d b y e l e c t r o nm i c r o s c o p y u s i n g s t a n d a r d t u n g s t e n s t a i n i n g a n d r o t a r y ( 4 5 0 )s h a d o w i n g p r o c e d u r e s o n a c a r b o n g r i d . DNA ( 0 . 5 j i g / m l ) w a sc o m p l e x e d w i t h e i t h e r G1 0 (EDA) o r G 4 (EDA) d e n d r i m e r sa t a D N A - t o - d e n d r i m e r c h a r g e r a t i o o f 1 : 1 0 i n 1 mM T r i s ( p H7 . 8 ) a n d t h e n p l ac e d i n t o m e d i a i n e i t h e r t h e p r e s e n c e o ra b s e n c e o f D E A E - d e x t r a n ( 0 . 5 , u M ) .S t a t i s t i c a l A n a l y s i s . S t a t i s t i c a l a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d

u s i n g S Y S T A T 5 . 2 s o f t w a r e f o r M a c i n t o s h . E r r o r s w e r e c a l c u -l a t e d a s s t a n d a r d d e v i a t i o n s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n s a m p l e sw e r e a n a l yz e d b y a n a l y s i s o f v a r i a n c e .RES U LTS

T h e F o r m a t i o n o f D N A / S t a r b u r s t D e n d r i m e r C o m p l e x e s .When DNA i s m i x e d w i t h PAMAM d e n d r i m e r s a t roomt e m p e r a t u r e , e v e n f o r a p e r i o d a s s h o r t a s 5 m i n , a c h a r g e -b a s e d c o m p l e x f o r m s . A n a l y s i s o f t h e f o r m a t i o n a n d s t a b i l i t yo f t h i s D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x w a s p e r f o r m e d b y e x a m i n i n gc h a r g e n e u t r a l i z a t i o n o f t h e c o m p l e x a s i t r e t a r d s t h e m i g r a t i o no f t h e p l a s m i d DNA d u r i n g a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . I t w a sf o u n d t h a t G 7 PAMAM d e n d r i m e r s o f b o t h c o r e t y p e s w e r ea b l e t o f u l l y r e t a r d DNA m o b i l i t y i n g e l s ; h o w e v e r , r e t a r d a t i o nw a s c o m p l e t e o n l y w h e n a n e q u i v a l e n c e o r a n e x c e s s o fd e n d r i m e r a m i n e g r o u p s ( a s c o m p a r e d w i t h p h o s p h a t e g r o u p so n t h e DNA) w a s p r e s e n t ( F i g . L A ) . A t c h a r g e r a t i o s w h e r e t h ed e n d r i m e r w a s i n g r e a t e r t h a n a 5 - f o l d e x c e s s , t h e c o m p l e xa p p e a r e d t o h a v e a n e t p o s i t i v e c h a r g e a s t h e DNA m i g r a t e dt o w a r d t h e c a t h o d e . D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s f o r m e dr e a d i l y i n N a C l c o n c e n t r a t i o n s f r o m 5 0 mM t o 1 . 5 M ( F i g . 1 B )a n d i n p H f r o m 5 . 0 t o 9 . 8 ( F i g . 1 C ) . D i s r u p t i o n o f t h e c o m p l e xr e q u i r e d s t r o n g i o n i c d e t e r g e n t s , s u c h a s S D S , a n d w a s n o to b s e r v e d u n d e r a n y p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n . R e t a r d a t i o n o f

AC h a r g e

r a t i o

BN a C I

DNA m i g r a t i o n w a s n o t o b s e r v e d w i t h d e n d r i m e r s G 3 a n db e l o w ( a t a n y c h a r g e r a t i o ) , s u g g e s t i n g t h a t e f f e c t i v e c o m p l e xf o r m a t i o n d i d n o t o c c u r w i t h t h e s e p o l y m e r s , b u t w a s s e e n w i t ha l l o t h e r g e n e ra t i o n s o f b o t h c o r e t y p e s o f PAMAM d e n d r i m -e r s ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e A b i l i t y o f D N A / D e n d r i m e r C o m p l e x e s t o T r a n s f e c tC e l l s . B a s e d o n r e p o r t s d e s c r i b i n g t h e t r a n s f e c t i o n o f c e l l su s i n g D N A / p o l y l y s i n e c o m p l e x e s f o r m e d a t p o s i t i v e c h a r g ee x c e s s , i n i t i a l t r a n s f e c t i o n s t u d i e s u s i n g D N A / d e n d r i m e r c o m -p l e x e s w e r e p e r f o r m e d w i t h c h a r g e r a t i o s f r o m 1 : 1 t o 1 : 5 0 .G4-G10 S t a r b u r s t d e n d r i m e r s o f b o t h c o r e t y p e s w e r e e m -p l o y e d , b e c a u s e t h e s e d e n d r i m e r s d e m o n s t r a t e d t h e a b i l i t y t oc o m p l e x DNA. I n e x p e r i m e n t s u s i n g R a t 2 c e l l l i n e , a d e f i n i t i v er e l a t i o n s h i p b e t w e e n d e n d r i m e r g e n e r a t i o n a n d t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y w a s o b s e r v e d w h e r e i n a n e x p o n e n t i a l i n c r e a s e i nt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y w a s s e e n w i t h i n c r e a s i n g g e n e r a t i o nf r o m G 5 t o G 1 0 , w i t h a p l a t e a u i n a c t i v i t y a f t e r G 8 ( F i g . 2 4 ) .T h i s p a r a l l e l e d t h e i n c r e a s e i n s u r f a c e c h a r g e o n t h e d e n -d r i m e r . O t h e r s t u d i e s u s i n g d e n d r i m e r s o f a s p e c i f i c g e n e r a -t i o n , m o d i f i e d t o h a v e e i t h e r d e c r e a s e d o r i n c r e a s e d s u r f a c ec h a r g e , d e m o n s t r a t e d d e c r e a s e d a n d i n c r e a s e d t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y , r e s p e c t i v e l y , d u e t o t h e s e m o d i f i c a t i o n s ( d a t a n o ts h o w n ) . I t w a s f o r t u i t o u s l y o b s e r v e d d u r i n g t h e s e s t u d i e s t h a tD E A E - d e x t r a n p l a c e d i n t o b u f f e r c o n t a i n i n g t h e DNA/d e n d r i m e r c o m p l e x e s e n h a n c e d t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y ( F i g .2 B ) .To e v a l u a t e t h e r e l a t i v e e f f i c i e n c y o f d e n d r i m e r - m e d i a t e dt r a n s f e c t i o n , c e l l s w e r e a l s o t r a n s f e c t e d w i t h p l a s m i d DNAu s i n g t h r e e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e c a t i o n i c l i p i d p r e p a r a t i o n s .T r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y u s i n g G 9 d e n d r i m e r i n t h e p r e s e n c e o fD E A E - d e x t r a n w a s 2 0 , 0 0 0 - t o 4 0 , 0 0 0 - f o l d more e f f i c i e n t t h a nt h a t a c h i e v e d w i t h D E A E - d e x t r a n ( F i g . 2 A ) a n d 1 0 - t o 1 0 0 -f o l d g r e a t e r t h a n t h e t r a n s f e c t i o n a c h i e v e d w i t h c o m m e r c i a l l ya v a i l a b l e c a t i o n i c l i p i d p r e p a r a t i o n s i n s i x o f e i g h t c e l l l i n e s

k 1 \+ k o , \ . , \ " , , \,0g \ Q \ . < 0 Q . z 1 < 0 zr p . r vO c p 0 I Z ) 3 . \. 1 " . 1 . 1 . jj . .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2

Z~~~ 4z )


4/6

4 9 0 0 G e n e t i c s : K u k o w s k a - L a t a l l o e t a l .

4 5 0 0 0 -C 4 0 0 0 0 -00 3 5 0 0 0 -c nC Z 3 0 0 0 0 -. E 2 5 0 0 0 -C D )t 2 0 0 0 0 -

c ic : 1 5 0 0 0 -C D l o o o o -00 - 5 0 0 0 -

2 3 4 5 6 7 8D e n d r i m e r G e n e r a t i o nB G 5 ED A

9 1 0

G10 ED A

1 : 1 0 1 : 2 0 1 : 5 0 1 : 1 0 1 : 2 0 1 : 5 0C O S - 1 C e l l s

CL i p o f e c t a m i n e 1 0 p . s -i n f p r f t q m i n p r R ) A i n I rG 9 N H 3 / D E A E D e x t r a j nL i p o f e c t a m i n e 1 0 u . t - ; D 5L i p o f e c t a m i n e 6 f L aG 9 N H 3 / D E A E D e x t r a r _L i p o f e c t a m i n e 2 0 , U J u r k a tL i p o f e c t a m i n e 1 0lpG 7 E D A / D E A E D e x t r a nL i p o f e c t a m i n e 2 0 . t , S C O S - 7L i o f e c t a m i n e 2 / ,G 7 E D N D E A E D e x t r a n

T F X 5 0 O 2 0 p . R a t 2T F X 5 0 2G 7 E D A / D E A E D e x t r a nL i p o f e c t i n 2 0 p . N I H / 3 T 3L i p o f e c t i n 2 p . gG 7 E D A N D E A E D e x t r a nL i p o f e c t i n 2 0 p . ' - - / C l o n e 9L i p o f e c t i n 2 p . g /G 7 E D A J D E A E D e x t r a nL i p o f e c t i n 2 0 p .gL i o f e c t i n 2 j gG 7 EDNDEAE D e x t r a n -

1 o o o o 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 o o r o o o 1 0 0 0 6 0 0 0 0 o o o o ' o o o o oL i g h t U n i t s / 4 g c e l l p r o t e i n

e x a m i n e d ( F i g . 2 C ) . 5 - B r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l , B - D - g a l a c -t o s i d e s t a i n i n g o f , B - g a l a c t o s i d a s e - t r a n s f e c t e d c e l l s r e v e a l e dt h a t i n d i f f e r e n t c e l l l i n e s , 5-80% o f c e l l s e x p r e s s e d t h ee n z y m e , a n d t h e r e w a s a n o v e r a l l c o r r e l a t i o n w i t h l u c i f e r a s ee x p r e s s i o n f o r e a c h c e l l l i n e ( d a t a n o t s h o w n ) . To d e t e r m i n et h e o p t i m a l c h a r g e r a t i o o f D N A / d e n d r i m e r a n d t h e o p t i m a lc o n c e n t r a t i o n o f D E A E - d e x t r a n n e c e s s a r y t o e n h a n c e t r a n s -f e c t i o n , t r a n s f e c t i o n s w e r e c o n d uc t e d w i t h G 9 (EDA) d e n -d r i m e r s c o m p l e x e d t o DNA i n a v a r i e t y o f D N A / d e n d r i m e rc h a r g e r a t i o s a n d t r a n s f e c t e d i n a r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n s o fD E A E - d e x t r a n . T h e o p t i ma l c h a rg e r a t i o o f D N A / d e n d r i m e ra p p e a r e d t o b e b e t w e e n 1 : 5 a n d 1 : 5 0 , a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o fD E A E - d e x t r a n r e q u i r e d f o r e n h a n c e m e n t o f t r a n s f e c t i o n a p -p e a r e d t o b e b e t w e e n 0 . 2 5 a n d 1 . 0 , t M . G l y c e r o l a l s o e n h a n c e dt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y , w h e r e a s n o n s u b s t i t u t e d d e x t r a n , w h i c hl a c k s a p o s i t i v e c h a r g e , h a d n o e f f e c t ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e a b i l i t y o f d i f f e r e n t g e n e r a t i o n s o f d e n d r i m e r s t o t r a n s -f e c t c o m p l e x e d DNA i n a w i d e v a r i e t y o f c e l l s w a s e v a l u a t e d( F i g . 2C a n d T a b l e 1 ) . H i g h - e f f i c i e n c y t r a n s f e c t i o n c a n b ea c h i e v e d i n m a n y c e l l l i n e s , i n c l u d i n g n o n a d h e r e n t c e l l s ( J u r -k a t ) a n d p r i m a r y h u m a n f i b r o b l a s t s , t h a t a r e d i f f i c u l t t ot r a n s f e c t u s i n g o t h e r t e c h n i q u e s ( F i g . 2 C ) . W h e r e a s t h e m a -j o r i t y o f c e l l l i n e s w e r e m o s t e f f i c i e n t l y t r a n s f e c t e d u s i n gp r o t o c o l s i n v o l v i n g DNA c o m p l e x e d t o G 9 o r G1 0 d e n d r i m e r sp l a c e d i n D E A E - d e x t r a n ( s i m i l a r t o t h o s e d e v e l o p e d f o r t h eR a t 2 c e l l l i n e ) , C O S - 1 c e l l s a p p e a r e d t o b e e f f i c i e n t l y t r a n s -f e c t e d u s i n g c o m p l e x e s m a d e w i t h G5 ( E D A ) d e n d r i m e r s i nt h e p r e s e n c e o f c h l o r o q u i n e ( F i g . 2 B ) .T h e c o n c e n t r a t i o n s o f D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s u s e d i nt h e a f o r e m e n t i o n e d s t u d i e s d i d n o t a p p e a r t o b e c y t o t o x i c , a n dm o s t c e l l l i n e s c o u l d b e i n c u ba t e d w i t h t h e c o m p l e x e s f o r2 4 - 4 8 h w i t h o u t e v i d e n c e o f a c c e l e r a t e d c e l l d e a t h . DEAE-d e x t r a n i n c r e a s e d t h e n u m b e r o f d e a d c e l l s i n c u l t u r e a f t e r 2 4h o f i n c u b a t i o n - 2 - f o l d , t o 5 - 8 % , b u t n o a d d i t i o n a l t o x i c i t yw a s n o t e d f r o m t h e c o m b i n a t i o n o f D N A / d e n d r i m e r c o m -p l e x e s a n d D E A E - d e x t r a n . T r a n s f e c t i o n w i t h o u t DEAE-d e x t r a n , p o s s i b l y d u e t o l o w c y t o t o x i c i t y , w a s v e r y e f f e c t i v e a tp r o d u c i n g p e r m a n e n t l y t r a n s f e c t e d c e l l l i n e s , y i e l d i n g e f f i c i e n -c i e s e s t i m a t e d t o b e u p t o 1 i n 1 0 0 0 t r a n s f e c t e d c e l l s ( T a b l e 1 ) . 1

C e l l u l a r U p t a k e o f D NA T r a n s f e c t e d w i t h D N A / D e n d r i m e rC o m p l e x e s . T h e u p t a k e a n d c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f DNA/d e n d r i m e r c o m p l e x e s w e r e a n a l y z e d i n R a t 2 c e l l s . As c o m -p a r e d w i t h DNA a l o n e , d e n d r i m e r s i n c r e a s e d a n d p r o l o n g e dDNA u p t a k e i n t o w h o l e c e l l s ( F i g . 3 A ) a n d n u c l e a r f r a c t i o n so f c e l l s ( F i g . 3 B ) . C o m p l e x e s a p p e a r t o b e i n t e r n a l i z e d t o t h ec e l l t h r o u g h e n e r g y - d e p e n d e n t e n d o c y t o s i s , b e c a u s e t h e p r e -i n c u b a t i o n o f c e l l s w i t h i n h i b i t o r s o f c e l l u l a r m e t a b o l i s m ( 5 . 0F I G . 2 . ( A ) E x p r e s s i o n o f a l u c i f e r a s e e x p r e s s i o n p l a s m i d i n R a t 2c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h d i f f e r e n t g e n e r a t i o n s o f NH 3 a n d EDA c o r ed e n d r i m e r s . R o u s s a r c o m a v i r u s - l u c i f e r a s e p l a s m i d DNA was com-p l e x e d w i t h e a c h d e n d r i m e r a t a 1 : 1 0 c h a r g e r a t i o i n t h e p r e s e n c e o f0 . 5 , u M D E A E - d e x t r a n f o r t r a n s f e c t i o n . R e s u l t s ar e e x p r e s s e d as t h e

p e r c e n t i n c r e a s e i n t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y ( a s d e t e r m i n e d b y r e l a t i v el i g h t u n i t s p e r , u g o f c e l l l y s a t e p r o t e i n ) o v e r a c o n t r o l t r a n s f e c t i o nu s i n g D E A E - d e x t r a n a l o n e . ( B ) C o m p a r i s o n o f t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n -c i e s o f two t y p e s o f d e n d r i m e r s i n COS-1 c e l l l i n e s . C e l l s weret r a n s f e c t e d w i t h p C M V L U C p l a s m i d u s i n g e i t h e r G 5 (EDA) o r G10(EDA) d e n d r i m e r s a t D N A - t o - d e n d r i m e r c h a r g e r a t i o s o f 1 : 1 0 , 1 : 2 0 ,a n d 1 : 5 0 i n medium a l o n e ( b l a c k b a r s ) , w i t h 0 . 5 , u M D E A E - d e x t r a n( g r e y b a r s ) , o r w i t h 5 0 , u M c h l o r o q ui n e ( h at c h e d b a r s ) . S i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s i n t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y b e t w e e n t h e G 5 a n d G10 d e n -d r i m e r s f o r e a c h a g e n t ar e i d e n t i f i e d b y an a s t e r i s k ( P c 0 . 0 5 ; a n a l y s i so f v a r i a n c e ) . ( C ) T ra n sf e c t io n o f e i g h t d i f f e r e n t c e l l l i n e s u s i n gd e n d r i m e r s a n d c a t i o n i c l i p i d s . The o p t i m a l d e n d r i m e r f o r t r a n s f e c t i o n( b l a c k b a r s ) i s c o m p a r e d w i t h t h e b e s t p e r f o r m i n g l i p i d a t t h e t w o m os te f f i c i e n t c o n c e n t r a t i o n s ( h a t c h e d b a r s ) f o r e a c h p a r t i c u l a r c e l l l i n e . I ns i x o f t h e e i g h t l i n e s , d e n d ri m e rs d e m o n s t r a t e d h i g h e r t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c i e s b y 1 0 - t o 1 0 0 - f o l d . I n t h e o t h e r two c e l l l i n e s ( D 5 a n dC O S - 7 ) , t r a n s f e c t i o n was very e f f i c i e n t w i t h d e n d r i m e r s b u t n o ts i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e b e s t p e r f o r m i n g l i p i d .

A

H F 1

Y B 2 f O



5/6

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 ) 4 9 0 1

C D 1 2 0 0o( D 7 0 -

o100 ~ ~ ~ ~ ~ H o r

o ~~~~~~~~~40- 6 0 -' - 8 0 - 5 0 -U) 3 0 -0. 60- 4 0 -. 4 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 0 3 0 -C 4 0 -

o ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 0 -O 2 0 1 0 1 00 0 . 0 *

0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6H o u r sF I G . 3 . T h e u p t a k e a n d c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f 3 2 P - l a b e l e d p l a s m i d DNA t r a n s f e c t e d i n t o R a t 2 c e l l s u s i n g G 7 ( N H 3 ) d e n d r i m e r c o m p l e x e d a t1 : 1 0 D N A - t o - d e n d r i m e r c h a r g e r a t i o . T h e u p t a k e a n d d i s t r i b u t i o n o f p l a s m i d DNA c o m p l e x e d w i t h d e n d r i m e r ( - ) was c o m p a r e d w i t h t h e u p t a k eo f p l a s m i d DNA a l o n e ( U ) a n d p l a s m i d DNA c o m p l e x e d w i t h d e n d r i m e r , b u t i n c ub a te d w i th t h e c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f 5 mM N a N 3 ( A ) . U p t a k ew a s d e t e r m i n e d i n w h o l e c e l l s ( A ) , c e l l n u c l e a r p r e p a r a t i o n s ( B ) , o r c e l l m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s ( C ) . E n h a n c e d u p t a k e i s o b s e r v e d w i t h t h eD N A / d e n d r i m e r c o m p l e x i n t h e w h o l e c e l l a n d n u c l e a r f r a c t i o n s a t t h e 3 - a n d 6 - h t i m e p o i n t s a n d i s a b s e n t a f t e r t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h N a N 3 .

mM s o d i u m a z i d e , F i g . 3 A - C ) o r s p e c i f i c i n h i b i t o r s o fe n d o c y t o s i s ( d e o x y g l u c o s e a n d c y t o c h o l a s i n B ; d a t a n o ts h o w n ) i n h i b i t s t h e e n h a n c e d u p t a k e o f D N A / d e n d r i m e rc o m p l e x e s . U 9 3 7 c e l l s d e m o n s t r a t e d i d e n t i c a l u p t a k e k i n e t i c sw i t h D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s ( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n gt h i s a c t i v i t y w a s n o t p a r t i c u l a r t o a s p e c i f i c c e l l t y p e .A n a l y s i s o f D E A E - D e x t r a n E n h a n c e m e n t o f D N A / D e n -d r i m e r T r a n s f e c t i o n . G i v e n t h a t p o s i t i v e l y c h a r g e d d e x t r a ne n h a n c e d t r a n s f e c t i o n i n c e r t a i n c e l l l i n e s a n d t h a t c e l l s t r e a t e dw i t h d i m e t h y l s u l f o x i d e t o p e r m e a b i l i z e t h e i r m e m b r a n e s d i dn o t d e m o n s t r a t e e n h a n c e d t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y w i t h DNA/d e n d r i m e r c o m p l e x e s ( d a t a n o t s h o w n ) , i t a p p e a r e d t h a te n h a n c e m e n t o f t r a n s f e c t i o n w i t h D E A E - d e x t r a n m i g h t b ed u e t o a n a l t e r a t i o n o f t h e D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x r a t h e rt h a n t h e c e l l m e m b r a n e . To d i r e c t l y a s s e s s t h e e f f e c t o fD E A E - d e x t r a n o n D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s , c o m p l e x e sw e r e e x a m i n e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . T h i s a n a l y s i s r e v e a l e dt h a t p l a s m i d DNA c o m p l e x e d t o a h i g h - g e n e r a t i o n d e n d r i m e r( G 1 0 ) f o r m s l a r g e a g g r e g a t e s h u n d r e d s o f a n g s t r o m s i n d i a m -e t e r ( F i g . 4 A ) t h a t a r e n o t o b s e r v e d i n e i t h e r G 1 0 ( E D A )d e n d r i m e r p r e p a r a t i o n s w i t h o u t DNA ( d a t a n o t s h o w n ) o rD N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s f o r m e d w i t h a l o w e r - g e n e r a t i o n( G 4 ) d e n d r i m e r ( F i g . 4 C ) . T h e l a r g e a g g r e g a t e s t h a t f o r m e dw i t h G1 0 ( E D A ) d e n d r i m e r / D N A c o m p l e x e s w e r e n o t o b -s e r v e d w h e n t h e s e c o m p l e x e s w e r e p l a c e d i n a n a p p r o p r i a t e

c o n c e n t r a t i o n o f D E A E - d e x t r a n ( F i g . 4 B ) , s u g g e s t i n g t h a t t h ed e x t r a n a l t e r s t h e n a t u r e o f t h e c o m p l e x e s .DISCUSSIONO u r s t u d i e s i n d i c a t e t h a t S t a r b u r s t d e n d r i m e r s c a n b e u s e d t om e d i a t e h i g h l y e f f i c i e n t , n o n s p e c i f i c i n v i t r o t r a n s f e r o f g e n e t i cm a t e r i a l i n t o e u k a r y o t i c c e l l s . G3-G10 S t a r b u r s t PAMAMd e n d r i m e r s w i t h e i t h e r EDA o r NH 3 c o r e s f o r m s t a b l e com-p l e x e s w i t h DNA u n d e r m o s t p h y s i o l o g i c c o n d i t i o n s , a n dG5-G10 d e n d r i m e r s a r e c a p a b l e o f m e d i a t i n g t r a n s f e c t i o n .T h e r e s t r i c t i o n o f t r a n s f e c t i o n c a p a b i l i t y t o t h e s e g e n e r a t i o n si s p r o b a b l y d u e t o t h e h i g h e r n u m b e r o f s u r f a c e a m i n o g r o u p sa n d t h e s p h e r i c a l s h a p e o f G5-G10 d e n d r i m e r s . T h e s e c h a r -a c t e r i s t i c s may a l l o w f o r s i m u l t a n e o u s i n t e r a c t i o n w i t h b o t hn e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d s o n c e l l m e m b r a n e s a n dDNA. E f f i c i e n t t r a n s f e c t i o n o f DNA c o m p l e x e d w i t h l i p i d s h a sb e e n a s s o c i a t e d w i t h l a r g e c a t i o n i c s u b s t i t u t i o n s , s u g g e s t i n g a

s i m i l a r p h e n o m e n o n ( 1 1 ) . H o w e v e r , t h e h i g h e r - g e n e r a t i o nd e n d r i m e r s w i t h t h e g r e a t e s t s u r f a c e c h a r g e d e n s i t y f o r m l a r g ea g g r e g a t e s w i t h DNA t h a t a p p e a r t o b e l e s s e f f i c i e n t a tm e d i a t i n g t r a n s f e c t i o n i n c e r t a i n c e l l t y p e s . T h i s may h a p p e nb e c a u s e t h e l a r g e s i z e o f t h e s e c o m p l e x e s e i t h e r p r e v e n t su p t a k e b y t h e c e l l , p r e v e n t s DNA t r a n s p o r t t o t h e n u c l e u s o n c ei n s i d e t h e c e l l , o r i n h i b i t s t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e DNA.; 0 . 4 M 5 . C

+ 1 q _ 5 * ; , * X ; ,,,

DEAE-dextran~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~I ,1m.~F I G . 4 . E l e c r o m i c o g a p h o D N / d n d r m e c o p l x e s . A m a g n f i c t i o o f X 4 0 a s d t x m n h o p e e b r 2 0 n )

P l a s m i d DNA ( 2 . 9 k b ) w a s c o m p l e x e d a t 1 : 1 0 c h a r g e r a t i o w i t h G ( E D A ) d e n d r m e r ( A ) G ( E D A ) d e n d r i m e r i n t h e*sjE ^ s ab g _ || l* ll ll. i S v * * l 2 s x Ft 8t e _ i B i e s l 5 - 1

F I G . 4 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s . A m a g n i f i c a t i o n o f X 4 5 , 0 0 0 was u s e d t o e x a m i n e t h e c o m p l e x e s ( b a r =220 n m ) .P l a s m i d DNA ( 2 . 9 k b ) was c o m p l e x e d a t 1 : 1 0 c h a r g e r a t i o w i t h G 1 0 ( E D A ) d e n d r i m e r ( A ) , G 1 0 ( E D A ) d e n d r i m e r i n t h e p r e s e n c e o f O . S , u MD E A E - d e x t r a n ( B ) , o r G 4 ( E D A ) d e n d r i m e r ( C ) .

G e n e t i c s : K u k o w s k a - L a t a l l o e t a l .


6/6

4 9 0 2 G e n e t i c s : K u k o w s k a - L a t a l l o e t a l .H i g h - e f f i c i e n c y t r a n s f e c t i o n i s o b t a i n e d when t h e s e DNA/d e n d r i m e r a g g r e g a t e s a r e c h a n g e d i n t o c o n d e n s e d , t o r o i dDNA p a r t i c l e s t h a t a p p e a r t o m a i n t a i n a n i n t e r a c t i o n w i t h t h ed e n d r i m e r s . T h i s may b e t h e r e s u l t o f d i s p e r s i o n o f t h ea g g r e g a t e s i n t h e p r e s e n c e o f d e f i n e d q u a n t i t i e s o f a m o l e c u l ew i t h l o we r ( p o s i t i v e ) c h a r g e d e n s i t y , s u c h a s D E A E - d e x t r a n .H o w e v e r , f u r t h e r s t u d i e s a r e n e c e s s a r y t o d e f i n e t h e e x a c tn a t u r e o f t h i s i n t e r a c t i o n .D e n d r i m e r s o f f e r many a d v a n t a g e s f o r t h e i n v i t r o t r a n s f e c -t i o n o f c e l l s . T h e D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s a r e v e r y s o l u b l ei n m o s t a q u e o u s s o l u t i o n s , a l l o w i n g u p t o 1 . 0 mg o f DNA p e rm l c o m p l e x e d t o 6 5 mg o f d e n d r i m e r p e r m l t o r e m a i n i ns o l u t i o n . D N A / d e n d r i m e r c o m p l e x e s a r e s t a b l e f o r manyw e e k s i n s o l u t i o n a n d a p p e a r c a p a b l e o f m e d i a t i n g h i g h -e f f i c i e n c y t r a n s f e c t i o n i n a w i d e v a r i e t y o f c e l l l i n e s , i n c l u d i n gp r i m a r y c e l l s a n d n o n a d h e r e n t c e l l l i n e s . T h e r e i s m i n i m a lc y t o t o x i c i t y w h e n t r a n s f e c t i o n s a r e p e r f o r m e d w i t h DNA/d e n d r i m e r c o m p l e x e s a n d t h i s a p p e a r s t o f a c i l i t a t e t h e d e v e l -o p m e n t o f c e l l s t h a t s t a b l y i n c o r p o r a t e t r a n s f e c t e d DNA i n t ot h e i r c h r o m o s o m e s .A n i n t e r e s t i n g f i n d i n g f r o m o u r w o r k i s t h a t s e v e r a l o f t h ec e l l l i n e s e v a l u a t e d i n o u r s t u d i e s a p p e a r e d t o h a v e d i f f e r e n tr a t e - l i m i t i n g s t e p s i n t r a n s f e c t i o n . D i f f e r e n c e s i n t h e a b i l i t y t ot r a n s f e c t c e l l s h a d b e e n n o t e d w i t h c a t i o n i c l i p i d p r e p a r a t i o n s( 1 1 , 1 2 ) , b u t t h e b a s i s f o r t h e s e d i f f e r e n c e s w a s n o t c l e a r . T h ep r e c i s e s t r u c t u r e o f t h e d e n d r i m e r s a l l o w s t h e e x a m i n a t i o n o ft h i s p h e n o m e n o n b y c o m p a r i n g t r a n s f e c t i o n u s i n g v a r i o u sd e n d r i m e r s i n t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t e n h a n c i n g a g e n t s . I nm o s t c e l l s , t r a n s f e c t i o n s e e m e d t o b e l i m i t e d b y t h e e n t r y o f t h eDNA c o m p l e x i n t o t h e c e l l , a n d e f f i c i e n t t r a n s f e c t i o n t h e r e f o r er e q u i r e d t h e u s e o f d e n d r i m e r s w i t h h i g h s u r f a c e c h a r g ed e n s i t y , p o s s i b l y t o t r i g g e r e n d o c y t o s i s . T r a n s f e c t i o n i n t o s o m eo t h e r c e l l l i n e s , C O S - 1 b e i n g a n e x a m p l e , w a s n o t l i m i t e d b y t h eg e n e r a t i o n o f t h e d e n d r i m e r u s e d ( o v e r G 5 ) . H o w e v e r , t h e s ec e l l s r e q u i r e d t h e a d d i t i o n o f a l y s o s o m o t r o p i c a g e n t , s u c h a sc h l o r o q u i n e , t o a c h i e v e t h e m o s t e f f i c i e n t t r a n s f e c t i o n , i n d i -c a t i n g t h a t e n d o s o m a l l o c a l i z a t i o n i s a r a t e - l i m i t i n g s t e p i nt r a n s f e c t i o n . T h i s s u g g e s t s t h a t d i f f e r e n t t y p e s o f c e l l s m i g h t b es p e c i f i c a l l y t r a n s f e c t e d w i t h d i f f e r e n t t y p e s o f d e n d r i m e r sb a s e d o n t h e c e l l u l a r m e t a b o l i s m o f t h e D N A / d e n d r i m e rc o m p l e x .O n e o t h e r t e c h n i q u e f o r g e n e t r a n s f e r e m p l o y i n g d e n d r i m -e r s h a s b e e n d e s c r i b e d ( 2 7 ) . T h i s t e c h n i q u e n o t e d m a x i m a lt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y u s i n g a G 6 ( N H 3 ) S t a r b u r s t d e n d r i m e ra n d i n d i c a t e d t h a t t r a n s f e c t i o n g r e a t l y d i m i n i s h e d w h e n h i g h e rg e n e r a t i o n s o f d e n d r i m e r s w e r e u s e d . T r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c yw a s o n l y 2 - t o 4 - f o l d g r e a t e r t h a n t h a t o b s e r v e d w i t h p o l y l y s i n e ,a n d t h u s a p p e a r e d t o b e 1 0 0 0 - t o 2 0 , 0 0 0 - f o l d l o w e r t h a n w h a tw a s a c hi e v e d u s i n g t h e c u r r e n t l y d e s c r i b e d m e t h o d s . I t w a s a l s oa s s o c i a t e d w i t h s i g n i f i c a n t c y t o t o x i c i t y , a n d n o b e n e f i t f r o mt h e a d d i t i o n o f c h l o r o q u i n e w a s o b s e r v e d e v e n i n c e l l s t h a ts h o w e d i n c r e a s e d t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y i n t h e p r e s e n c e o f t h i sc o m p o u n d i n o u r s t u d i e s . T h e d i f f e r e n c e s i n t h e r e s u l t sb e t w e e n t h e t w o t e c h n i q u e s a r e d i f f i c u l t t o e x p l a i n . H o w e v e r ,t h e o t h e r s t u d y e m p l o y e d c o m m e r c i a l d e n d r i m e r p r e p a r a t i o n s ,a n d o u r a n a l y s i s o f t h e s e p r e p a r a t i o n s h a s r e v e a l e d t h a t a l m o s tn o i n t a c t d e n d r i m e r s w e r e p r e s e n t . I t i s t h e r e f o r e p o s s i b l e t h a tt h e o t h e r r e p o r t w a s a c t u a l l y d e m o n s t r a t i n g t r a n s f e c t i o n m e -d i a t e d b y a r a n d o m m i x o f p o l y m e r f r a g m e n t s a n d / o r f u s o -g e n i c p e p t i d e s .I n c o n c l u s i o n , o u r s t u d i e s o u t l i n e t h e a b i l i t y o f S t a r b u r s td e n d r i m e r s t o m e d i a t e h i g h - e f f i c i e n c y t r a n s f e c t i o n i n a w i d e

v a r i e t y o f c e l l l i n e s i n v i t r o . T h e l a c k o f t o x i c i t y , h i g h t r a n s -f e c t i o n e f f i c i e n c y , s t a b i l i t y o f DNA/dendrimer c o m p l e x e s , a n dt h e p o t e n t i a l t o p r o d u c e t h i s m a t e r i a l u n d e r G o o d M a n u f a c -t u r i n g P r a c t i c e s c o n d i t i o n s s ug ge s t t h a t t h i s t r a n s f e c t i o nm e t h o d may h a v e u t i l i t y i n i n v i v o a p p l i c a t i o n s . B e c a u s ed e n d r i m e r - a n t i b o d y c o n j u g a t e s h a v e a l r e a d y b e e n u s e d e x -p e r i m e n t a l l y i n d i a g n o s t i c a p p l i c a t i o n s , i n r a d i o i m m u n o -t h e r a p y a n d i n t h e i m a g i n g o f t u m o r s ( 1 5 , 1 8 , 1 9 ) , i t i s p o s s i b l et h a t s i m i l a r f o r m s o f a n t i b o d y - c o n j u g a t e d d e n d r i m e r s may b eu s e f u l i n t a r g e t e d g e n e d e l i v e r y i n v i v o . T h i s c o u l d e n a b l e s o m et h e r a p e u t i c u s e s o f g e n e t r a n s f e r .

F u n d i n g f o r t h i s w o r k w a s p r o v i d e d b y R43 CA 6 8 8 2 0 a n d t h eD e n d r i t e c h C o r p o r a t i o n . J . R . B . , R . S . , a n d D . A . T . a r e s t o c k h o l d e r s i nD e n d r i t e c h .1 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 9 ) i n M o l e c u l a rC l o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b . P r e s s ,P l a i n v i e w , N Y ) , 2 n d E d . , p p . 1 6 3 0 - 1 6 5 5 .2 . A u s u b e l , F . M . , B r e n t , R . , K i n g s t o n , R . E . , M o o r e , D . D . ,S e i d m a n , J . G . , S m i t h , J . A . & S t r u h l , K . ( 1 9 9 4 ) i n C u r r e n tP r o t o c o l s i n M o l e c u l a r B i o l o g y ( W i l e y , Ne w Y o r k ) , p p . 9 1 1 - 9 4 3 .3 . C h o w d h u r y , J . R . , G r o s s m a n , M . , G u p t a , S . , C h o w d h u r y , N . R . ,B a k e r , J . R . & W i l s o n , J . M . ( 1 9 9 1 ) S c i e n c e 2 5 4 , 1 8 0 2 - 1 8 0 5 .4 . W o l f f , J . A . , M a l o n e , R . W . , W i l l i a m s , P . , C h o n g , W . , A c s a d i , G . ,J a n i , A . & F e l g n e r , P . L . ( 1 9 9 0 ) S c ie n ce 2 4 7, 1 4 6 5 - 1 4 6 8 .5 . A n d r e a s o n , G . L . & E v a n s G . A . ( 1 9 8 8 ) B i o T e c h n i q u e s 6 ,

6 5 0 - 6 6 0 .6 . Y a n g , N . S . , B u r k h o l d e r , J . , R o b e r t s , ; B . , M a r t i n e l l , B . & M c C a b e ,D . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 7 , 9 5 6 8 - 9 5 7 2 .7 . A k l i , S . , C a i l l a u d , C . , V i g n e , E . , S t r a t f o r d - P e r r i c a u d e t , L . D . ,P o e n a r u , L . , P e r r i c a u d e t , M . , K a h n , A . & P e s c h a n s k i , M . R .( 1 9 9 3 ) N a t . G e n e t . 3 , 2 2 4 - 2 2 8 .8 . L e h n , P . ( 1 9 9 3 ) P a t h o l . B i o l . 4 1 , 6 5 8 - 6 6 2 .9 . G r a h a m , F . L . & v a n d e r E b , A . J . ( 1 9 7 3 ) V i r o l o g y 5 2 , 4 5 6 - 4 6 7 .1 0 . L o p a t a , M . A . , C l e v e l a n d , D . W. & S o l l n e r - W e b b , B . ( 1 9 8 4 )N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 , 5 7 0 7 - 5 7 1 7 .1 1 . B e h r , J . P . ( 1 9 9 3 ) A c c . C h e m . R e s . 2 6 , 2 7 4 - 2 7 8 .1 2 . J o h n s o n , L . G . ( 1 9 9 5 ) C h e s t 1 0 7 , 7 7 S - 8 3 S .1 3 . T o m a l i a , D . A . & D u r s t , H . D . ( 1 9 9 3 ) i n T e c h n i q u e s i n C u r r e n tC h e m i s t r y , e d . W e b e r , E . ( S p r i n g e r , B e r l i n ) , p p . 1 9 3 - 2 4 5 .1 4 . T o m a l i a , D . A . , N a y l o r , A . M . & G o d d a r d , W. A . , I I I ( 1 9 9 0 )A n g e w . C h e m . , I n t . E d . E n g l . 2 9 , 1 3 8 - 1 7 5 .1 5 . Wu , C . , B r e c h b i e l , M. W . , K o z a k , R . W. & G a n s o w , 0 . A . ( 1 9 9 4 )B i o o r g . M e d . C h e m . L e t t . 4 , 4 4 9 - 4 5 4 .1 6 . F r e c h e t , J . M . J . ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 3 , 1 7 1 0 - 1 7 1 5 .1 7 . M o o r e , J . S . ( 1 9 9 3 ) P o l y m e r N e w s 1 8 , 5 - 1 0 .1 8 . B a r t h , R . F . , A d a m s , D . M . , S o l o wa y, A . H . , A l a m , F . & D a r b y ,M . V . ( 1 9 9 4 ) B i o c o n j u g a t e C h e m . 5 , 5 8 - 6 6 .1 9 . S i n g h P . , M o l l , F . , I I I , L i n , S . H . , F e r z l i , C . , Y u , K . S . , K o s k i , R .K . , S a u l , R . G . & C r o n i n , P . ( 1 9 9 4 ) C l i n . C h e m . 4 0 , 1 8 4 5 - 1 8 4 9 .2 0 . K a l l o s , G . J . , T o m a l i a , D . A . , H e d s t r a n d , D . M . , L e w i s , S . &Z h o u , J . ( 1 9 9 1 ) R a p i d C o m m u n . M a s s S p e c t r o m . 5 , 3 8 3 - 3 8 6 .2 1 . S m i t h , P . B . , M a r t i n , S . J . , H a l l , M . J . & T o m a l i a , D . A . ( 1 9 8 7 )i n A p p l i e d P o l y m e r A n a l y s i s a n d C h a r a c t e r i z a t i o n , e d . M i t c h e l l , J .( H a n s e r , M u n i c h ) , p p . 3 5 7 - 3 8 4 .2 2 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 9 ) i n M o l e c u l a rC l o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b . P r e s s ) ,2 n d E d . , p p . 1 4 2 - 1 4 3 .2 3 . G o r m a n , C . M . , M e r l i n o , G . T . , W i l l i n g h a m , M . C . , P a s t a n , I . &H o w a r d , B . H . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 9 , 6 7 7 7 - 6 7 8 1 .

2 4 . M a c G r e g o r , G . R . & C a s k e y , C . T . ( 1 9 8 9 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 7 ,2 3 6 5 .2 5 . A l a m , J . & C o o k , J . L . ( 1 9 9 0 ) A n a l . B i o c h e m . 1 8 8 , 2 4 5 - 2 5 4 .2 6 . D i g n a m , J . D . , L e b o v i t z , R . M . & R o e d e r , R . G . ( 1 9 8 3 ) N u c l e i cA c i d s R e s . 1 1 , 1 4 7 5 - 1 4 8 9 .2 7 . H a e n s l e r , J . & S z o k a , F . C . , J r . ( 1 9 9 3 ) B i o c o n j u g a t e C h e m . 4 ,3 7 2 - 3 7 9 .


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Jolanta F. Kukowska-Latallo et al- Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers