ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE TERMOFILIK

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SIPOHOLON

TAPANULI UTARA SUMATERA UTARA

TESIS

Oleh

ROSLIANA PAKPAHAN 067030019/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2009

S

EK O L A

H

PASCASAR J

ANA

id76981874 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com

Rosliana Pakpahan : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Protease Termofilik Dari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara, 2009.

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SIPOHOLON

TAPANULI UTARA SUMATERA UTARA

TESIS

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister Sains dalam Program Studi Biologi pada Sekolah

Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh

ROSLIANA PAKPAHAN 067030019/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2009


Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE TERMOFILIK DARI SUMBER AIR PANAS SIPOHOLON TAPANULI UTARA SUMATERA UTARA

Nama Mahasiswa : Rosliana Pakpahan Nomor Pokok : 067030019 Program Studi : Biologi

Menyetujui Komisi Pembimbing

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc) Ketua Anggota

Ketua Program Studi Direktur

(Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc)

Tanggal lulus : 08 April 2009


Telah diuji pada

Tanggal : 08 April 2009

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc

Anggota : 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc

2. Dr. Ir. Herla Rusmarilin

3. Dr. Delvian, SP, MP


ABSTRAK

Isolasi dan uji aktivitas enzim protease termofilik dari sumber air panas Sipoholon Tapanuli Utara telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA USU Medan dari bulan Februari sampai Agustus 2008. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh karakterisasi bakteri termofil proteolitik serta mengetahui aktivitas protease. Enam belas isolat menunjukkan aktivitas protease dalam agar skim milk. Tiga isolat dipilih untuk diuji berdasarkan diameter zona jernih. SP2 menunjukkan aktivitas hidrolitik relatif tinggi sebesar 5.96 mm, yang diikuti oleh SP1 sebesar 5.81 mm dan SP3 sebesar 5.22 mm. Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Lowry. Aktivitas protease kasar tertinggi diperoleh pada SP3 sebesar 11.16 Unit, suhu optimum 65°C. Aktivitas protease kasar SP2 sebesar 9.93 Unit, suhu optimum 65°C. Aktivitas protease kasar terendah pada SP1 sebesar 9.50 Unit, suhu optimum 60°C. Protease kasar yang diperoleh dipresipitasi dengan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 70%. Hasil presipitasi menunjukkan Aktivitas protease tertinggi pada SP3 sebesar 12.34 Unit, yang diikuti oleh SP2 sebesar 10.92 Unit dan SP1 sebesar 10.59 Unit.

Kata Kunci : Protease, sumber air panas, bakteri termofilik


ABSTRACT

A study on isolation and activity assay of termophilic protease from hot spring of Sipoholon, of North Tapanuli has been done in Laboratory of Microbiology Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to August 2008. This study was aimed to characterize the proteolytic thermophilic bacteria and to know their protease activity. Sixteen isolates showed protease activity in skim milk agars. Three isolates were choosen for further study based on their clearing zone diameter. SP2 showed relatively high hydrolytic activity by 5.96 mm followed by SP1 and SP3 by 5.81 mm and 5.22 mm, respectively. Examination of protease activity was done using Lowry method. The highest crude protease activity was showed by SP3 by 11.6 Unit, with optimum temperature of 65°C. SP2 showed crude protease activity by 9.93 Unit, with optimum temperature of 65°C. The lowest crude protease activity showed by SP1 by 9.50 Unit, with temperature of 60°C. The crude protease was further precipitated with ammonium sulphate at level of 70% saturation. The highest protease activity was showed by SP3 by 12.34 Unit, followed by SP2 and SP1 by 10.92 Unit and 10.59 Unit, respectively.

Key Word : Protease, hot spring, thermophilic bacteria


KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala karuniaNya

yang berlimpah sehingga tesis yang berjudul �Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Protease

Termofilik� ini dapat diselesaikan. Tesis ini ditulis untuk memenuhi syarat memperoleh gelar

Magister Sains dalam Program Studi Biologi pada Sekolah Pascasarjana Universitas

Sumatera Utara Medan.

Dalam penulisan tesis ini penulis banyak mendapat bantuan moril maupun materil

yang tak ternilai harganya. Untuk itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih

yang sebesar-besarnya kepada:

1. Pemerintah Provinsi Sumatera Utara lewat BAPPEDA Provinsi Sumatera Utara yang

telah memberikan beasiswa dan Dinas Pendidikan Kota Medan yang telah memberikan

izin untuk mengikuti Program Magister Biologi di Sekolah Pascasarjana Universitas

Sumatera Utara Medan..

2. Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, SP. A(K) selaku Rektor Universitas Sumatera

Utara dan Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc. selaku Direktur Sekolah Pascasarjana

Sumatera Utara yang telah memberi kesempatan kepada Penulis untuk mengikuti

Program Studi Magister Biologi di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Medan.

3. Prof. Dr. Dwi Suryanto, M.Sc., selaku Ketua Program Studi Biologi Sekolah Pasca-

sarjana Universitas Sumatera Utara dan dosen pembimbing I atas kesabaran Beliau


mengarahkan, membimbing dan memberikan masukan, saran serta semangat dalam

menyelesaikan tesis ini.

4. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc., selaku Dosen Pembimbing II yang telah banyak

meluangkan waktu untuk membimbing, dan memberikan saran-saran dalam penyusunan

tesis ini.

4. Dr. Ir. Herla Rusmarilin dan Dr. Delvian, SP, MP., selaku dosen pembanding yang telah

membimbing untuk menyempurnakan tesis ini.

5. Keluarga besar Pakpahan, khususnya Ibunda tercinta Nelly Butar-Butar yang selalu

mendoakan, memberi bantuan moril maupun materil yang tak ternilai bagi penulis.

6. Seluruh dosen dan staf di Program Studi Magister Biologi pada Sekolah Pascasarjana

Universitas Sumatera Utara.

7. Ibu Nurhasni selaku Laboran Mikrobiologi dan Teman-teman S2 Mikrobiologi (Bunga,

Sri, Iche, Dewi, Nurhalijah, Dessy, Yusuf, Parasian).

Kiranya Tuhan memberkati kita semua dan berkenan membalas segala kebaikan dan

kemurahan segenap pihak yang telah membantu penulis menyelesaikan tesis ini.

Medan, 8 April 2009

Penulis,

ROSLIANA PAKPAHAN


RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Dolok Ilir pada tanggal 01 N0vember 1969. Anak dari alm P. Pakpahan dan Nelly Butar-Butar. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1983 dari SDN Dolok Ilir, tahun 1986 tamat dari SMP Negeri Kp.Pon Deli Serdang dan tahun 1989 tamat dari SMA Negeri Sei Rampah. Pada tahun 1990 kuliah di IKIP Negeri Medan dan gelar Sarjana Pendidikan diperoleh dari Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Biologi tahun 1995. Tahun 1997 sampai tahun 1999 menjadi guru di SMP Negeri 6 Barus, tahun 1999 sampai dengan sekarang 2009 menjadi guru di SMA Negeri 12 Medan. Tahun 2006-2008 kuliah di Sekolah Pasca Sarjana USU pada Program Studi Biologi-Mikrobiologi.


DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ..................................................................................................................... i

ABSTRACT .................................................................................................................... ii

KATA PENGANTAR .................................................................................................. iii

RIWAYAT HIDUP ....................................................................................................... v

DAFTAR ISI.................................................................................................................. vi

DAFTAR TABEL ......................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR..................................................................................................... ix

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. x

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1. Latar Belakang................................................................................... 1 1.2. Perumusan Masalah........................................................................... 3 1.3. Tujuan................................................................................................ 4 1.4. Hipotesis ............................................................................................ 4 1.5. Manfaat.............................................................................................. 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 5

2.1. Bakteri Termofilik ............................................................................. 5 2.2. Protease.............................................................................................. 7 2.3. Klasifikasi Protease ........................................................................... 10

2.3.1. Eksopeptidase ....................................................................... 10 2.3.2. Endopeptidase....................................................................... 12

2.4. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim........................ 13

2.5. Protease termofilik............................................................................. 15 2.6. Aplikasi Mikroorganisme Termofilik............................................... 17


BAB III METODE PENELITIAN ......................................................................... 19

3.1. Waktu dan Tempat............................................................................. 19 3.2. Alat dan Bahan .................................................................................. 19 3.3. Sumber Isolat..................................................................................... 19 3.4. Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik Termofilik............................. 20 3.5. Uji Kemampuan Aktivitas Proteolitik Isolat ..................................... 20 3.6. Karakterisasi Sifat Morfologi dan Biokimia Isolat Terpilih.............. 21 3.7. Produksi Protease .............................................................................. 21 3.8. Pemekatan Enzim Dengan 70% Amonium Sulfat............................. 22 3.9. Penentuan Kadar Protein Enzim Proteolitik ...................................... 22 3.10. Pengujian Aktivitas Protease ............................................................. 23 3.11. Analisis Data...................................................................................... 24

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 26

4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik Termofilik ............................. 26

4.2. Kemampuan Aktivitas Kuantitatif Proteolitik Isolat ......................... 27

4.3. Karakter Isolat Terpilih Bakteri Proteolitik Termofilik..................... 29

4.4. Hasil Pengujian Aktivitas Protease Kasar Dari Tiga Isolat Termofilik Terpilih.......................................................... 32

4.5. Hasil Pengujian Aktivitas Protease Pemekatan Dengan 70%

Amonium Sulfat dari Tiga Isolat Termofilik Terpilih ....................... 37

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................ 45

5.1. Kesimpulan........................................................................................ 45

5.2. Saran .................................................................................................. 46

DAFTAR PUSTAKA................................................................................................... 47


DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1. Klasifikasi Protease (Rao et al., 1998).................................................................. 11

2. Kemampuan Aktivitas Proteolitik Bakteri Termofilik Secara Kualitatif ............. 28

3. Karakteristik Morfologi Bakteri Proteolitik Termofilik Tiga Isolat Terbaik .................................................................................................................. 29

4. Uji Biokimia Sederhana Tiga Isolat Bakteri Yang Menunjukkan Aktivitas Proteolitik Terbaik................................................................................. 31

5. Aktivitas Protease Kasar Pada Tiga Isolat Terpilih Secara Kuantitatif................. 32

6. Aktivitas Protease Pemekatan Dengan 70% Ammonium Sulfat Pada Pada Tiga Isolat Terpilih Secara kuantitatif .......................................................... 38


DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1. Mekanisme umum hidrolisis enzimatik substrat peptida. ..................................... 9

2. Gambaran skematik kompleks substrat-proteinase dengan enam lokasi Ikatan. Pembelahan terjadi antara residu-residu asam amino PI-PI�..................... 12

3. Zona jernih sebagai indikator aktivitas hidrolisis dari tiga isolat Terbaik yang diseleksi untuk uji lanjutan yaitu SP1, SP2 dan SP3 ....................... 28

4. Sel isolat SP1, SP2. dan SP3 hasil pewarnaan gram diamati dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 40 x 100........................................................ 30

5. Aktivitas protease kasar isolat SP1, SP2 dan SP3 pada suhu inkubasi yang berbeda............................................................................................ 35

6. Aktivitas protease pemekatan dengan 70% ammonium sulfat isolat SP1, SP2 dan SP3 pada suhu inkubasi yang berbeda................................. 41


DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Komposisi pereaksi C metode Lowry, komposisi media agar susu skim dan Media Produksi............................................................................................... 52

2. Alur kerja isolasi dan seleksi bakteri proteolitik termofilik .................................. 53

3. Alur kerja uji kemampuan aktivitas kuantitatif proteolitik isolat.......................... 54

4. Alur kerja karakterisasi sifat morfologi dan biokimia isolat ................................. 55

5. Alur kerja produksi protease ................................................................................. 56

6. Alur kerja pemekatan enzim protease 70%........................................................... 57

7. Alur kerja penentuan kadar protein enzim proteolitik........................................... 58

8. Alur kerja penentuan panjang gelombang maksimum.......................................... 59

9. Alur kerja pembuatan kurva standar BSA............................................................. 60

10. Alur kerja pengujian aktivitas Protease................................................................. 61

11. Penentuan kurva standar bovine serum albumin (BSA) dengan menggunakan Spektrofotometer ë=760 nm .......................................................... 62 12. Penentuan persamaan garis regresi larutan standar protein BSA untuk berbagai konsentrasi dengan menggunakan spektrofotometer ë=760 nm ............ 63 13. Gambar grafik kurva standar BSA yang diperoleh ............................................... 65 14. Contoh perhitungan kadar protein enzim dan substrat terhidrolisis..................... 66 15. Daftar sidik ragam & uji Duncan tiga isolat terbaik bakteri proteolitik termofilik Sipoholon ............................................................................................ 68

16. Gambar pengambilan sampel dari sumber air panas Sipoholon .......................... 71

17. Gambar Uji Biokimia Tiga Isolat Terpilih............................................................ 72


BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Mikroorganisme termofil dapat dengan mudah ditemukan pada daerah dengan

aktivitas geotermal, seperti daerah pegunungan berapi, sumber air panas, dan juga tempat

cadangan minyak bumi atau batubara (van den Burg, 2003). Mikroorganisme ini sangat

menarik untuk dikaji baik dari sudut pandang ilmu dasar maupun terapan. Bidang penelitian

dasar yang berhubungan yaitu biologi molekuler, genetika, biokimia, evolusi, taksonomi,

ekologi dan asal usul kehidupan. Dari sudut pandang terapan atau bioteknologi, termofil

merupakan sumber enzim-enzim yang unik dengan sifat luar biasa, khususnya yang tahan

suhu tinggi (Brock, 1986).

Kemajuan-kemajuan dalam teknologi fermentasi, rekayasa genetika dan teknologi

aplikasi enzim itu sendiri menyebabkan penggunaan enzim dalam industri semakin meluas

saja. Kunci kemajuan teknologi enzim ini sebenarnya adalah karena enzim diketahui sebagai

biokatalis yang sangat efisien dengan akurasi (presisi) yang tinggi, versatil dan ekonomis

(Darwis & Sukara, 1990). Saat ini industri enzim telah berkembang dengan pesat dan

menempati posisi penting dalam bidang industri. Kesadaran masyarakat terhadap masalah

lingkungan yang semakin tinggi serta adanya tekanan dari para ahli dan pencinta lingkungan

menjadikan teknologi enzim sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan berbagai

proses kimiawi dalam bidang industri (Akhdiya, 2003).


Protease merupakan enzim penting yang digunakan secara luas pada aplikasi industri

melalui reaksi sintesis dan reaksi hidrolisis, hampir mencapai 65% dari total penjualan enzim

di dunia (Huang, 2006). Protease digunakan pada beberapa aplikasi industri seperti detergen,

farmasi, produk-produk kulit, pengempukan daging, hidrolisat protein, produk-produk

makanan, dan proses pengolahan limbah industri (Nascimento & Martin, 2006).

Enzim-enzim termostabil saat ini sedang mendapat perhatian besar, karena enzim-

enzim ini sangat cocok untuk proses-proses industri yang memerlukan suhu tinggi (Rakshit,

2003). Penggunaan protease termostabil pada beberapa aplikasi sangat efektif dan

menguntungkan misalnya pada proses-proses yang menggunakan suhu tinggi, peningkatan

kecepatan reaksi, meningkatkan kelarutan reaktan dan produk-produk non-volatil serta

mengurangi kontaminasi mikroba-mikroba mesofilik (Martins et al., 2007).

Kemajuan dalam bidang bioteknologi memungkinkan semakin meluasnya

penggunaan enzim termostabil sehingga menarik untuk dilakukan penelitian yang intensif,

khususnya protease termostabil dalam berbagai produk komersil dan industri di Indonesia

(Naiola & Widhyastuti, 2002). Namun, kebutuhan terhadap protease termostabil hampir

100% masih bergantung pada produk impor (Fuad et al., 2004).

Pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa keuntungan bila

dibandingkan yang diisolasi dari tanaman ataupun hewan. Antara lain adalah sel mikroba

relatif lebih mudah ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi

sel lebih mudah ditingkatkan bila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya

relatif rendah, kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan

waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Meyrath & Volvasek, 1975).


Selama ini sebagian besar enzim yang stabil pada suhu tinggi diisolasi dari bakteri

termofil. Salah satu bakteri yang diduga banyak sebagai penghasil enzim proteolitik adalah

Bacillus (Gupta et al., 2002).

Adanya mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting penting

dalam usaha produksi enzim. Oleh karena itu penggalian mikroorganisme indigenous

penghasil protease perlu dilakukan di Indonesia. Keragaman hayati yang tinggi dan

banyaknya aktivitas geotermal di Indonesia memberi peluang yang besar untuk mendapatkan

mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai penghasil enzim.

2.1. Perumusan Masalah

Enzim-enzim hidrolitik banyak dipergunakan dalam bidang industri. Umumnya

proses pengolahan dilakukan pada suhu tinggi (45-100°C) sehingga kebutuhan akan enzim-

enzim termostabil sangat tinggi. Untuk itu perlu dilakukan isolasi dan seleksi bakteri

proteolitik termofil indigenous untuk mengetahui: Apakah ada bakteri termofil indigenous

yang berpotensi untuk menghasilkan protease di sumber air panas Sipoholon dan apakah

terdapat perbedaan kemampuan proteolitik antar bakteri termofilik indigenous di sumber air

panas Sipoholon.

1.3. Tujuan

1. Untuk memperoleh isolat bakteri proteolitik termofil indigenous yang berpotensi

menghasilkan protease dari sumber air panas Sipoholon, Tarutung Sumatera Utara.


2. Untuk mengetahui karakter bakteri termofilik yang bersifat proteolitik.

3. Untuk mengetahui potensi aktifitas protease kasar dan protease pemekatan dengan

70% ammonium sulfat bakteri termofilik indigenous.

1.4. Hipotesis

1. Terdapat keragaman karakteristik bakteri proteolitik termofil indigenous yang

berpotensi menghasilkan protease.

2. Terdapat perbedaan kemampuan aktivitas protease kasar dan protease pemekatan

dengan 70% ammonium sulfat bakteri termofilik indigenous.

1.5. Manfaat

1. Untuk mendapatkan data tentang isolat bakteri termofil, potensi enzim protease kasar

dan protease pemekatan dengan 70% ammonium sulfat dari bakteri termofilik di

kolam sumber air panas Sipoholon, Tarutung, Sumatera Utara.

2. Sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut terhadap usaha eksplorasi

bakteri protease termostabil.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Bakteri Termofilik

Indonesia merupakan negara dengan biodiversitas tinggi serta memiliki banyak

aktivitas geotermal. Keanekaragaman mikroba ternyata jauh lebih luas dari keanekaragaman

hewan dan tanaman, namun kurang mendapat perhatian (Gunarto et al., 2002).

Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang paling banyak digunakan dibanding tanaman

dan hewan karena memiliki beberapa keuntungan (Akhdiya, 2003).

Ekstremofil merupakan organisma, yang pada umumnya mikroorganisme, dapat

hidup dan bereproduksi pada kondisi-kondisi ekstrim seperti suhu, pH, tekanan, konsentrasi

garam, tekanan, radiasi dan senyawa toksik (Eichler, 2001). Dalam banyak kasus

mikroorganisme ekstremofil tidak hanya beradaptasi terhadap kondisi ekstrim tetapi juga

membutuhkan kondisi ini untuk bereproduksi (Madigan & Marrs, 1997). Beberapa

mikroorganisme ekstremofil telah dikenal selama 40 tahun, namun dalam dekade terakhir

pencarian mikroorganisme ekstrim telah diintensifkan untuk dua alasan, pertama cakupan

kondisi hidup yang ada saat ini jauh lebih luas dari yang dipikirkan sebelumnya, dan ini

menyebabkan eksplorasi dari banyak habitat yang tidak diselidiki sebelumnya. Kedua,

sekarang diketahui bahwa organisme yang beradaptasi dengan lingkungan ekstrim memiliki

potensi yang dapat dimanfaatkan secara luas untuk tujuan industri (Sciraldi et al., 2002).

Termofil dan hipertermofil adalah kelompok ekstremofil yang paling banyak

dipelajari. Termofil adalah mikroorganisme yang menyukai suhu antara 45-80°C, sedangkan


hipertermofil menyukai suhu di atas 80°C. Pada saat ini batas yang dikenal untuk suhu

hipertermofil adalah adalah 113°C (Adams, 1999). Termofil yang hidup pada suhu 60°C telah

diketahu sejak lama, tetapi yang benar-benar termofil yaitu yang dapat hidup pada suhu yang

lebih tinggi, pertama kali ditemukan sekitar 30 tahun lalu. Pada tahun 1964 Thomas D. Brock

berhasil mengisolasi bakteri termofil pertama, Thermus aquaticus dari sumber air panas yang

mampu tumbuh pada suhu di atas 70ºC (Vieille & Zeikus, 2001). Penemuan terhadap T.

aquaticus memberikan terobosan teknologi untuk menggunakan enzim Tag DNA polymerase

yang tahan pada proses Polymerase Chain Reaction (Lestari, 2000).

Molekul dasar penyusun membran termostabil belum jelas, mungkin berhubungan

dengan lemak dan protein penyusun membran. Kalau temperatur lingkungan naik, ternyata

organisme yang mempunyai membran termostabil seperti T. aguaticus akan memproduksi

lemak yang memiliki titik cair yang lebih tinggi. Lemak membran plasma ini memiliki

struktur tetraeter dengan dua unit gliserol yang berikatan atau cross link dengan dua unit

isoprenoid. Isopreonid (tersusun atas 40 atom C) merupakan jembatan jenuh rantai panjang

yang mencair hanya pada suhu tinggi. Digliserol tetraeter akan membatasi pergerakan lateral

dari lipid membran, yang tidak tergantung satu terhadap yang lain pada kedua permukaannya.

Keadaan ini membuat membran menjadi stabil pada keadaan asam atau panas (Sundaram

dalam Brock, 1986).

Sampai saat ini lebih dari 50 spesies termofilik telah berhasil diisolasi (Madigan &

Marrs, 1997), 20 genera mikroba diketahui mampu tumbuh secara optimum pada suhu 80ºC

atau lebih. Pyrolobus fumarii adalah mikroba yang paling tahan panas tumbuh pada sumur

hidrotermal dasar laut atau biasa disebut smoker. Mikroba ini tumbuh baik pada lingkungan

suhu 100ºC berkembang biak pada suhu sampai 113ºC, tetapi berhenti tumbuh pada suhu di


bawah 90ºC. Dari 20 genera dua diantaranya dikenali sebagai bakteri yaitu Thermotoga dan

Aquifex, sedang yang lain adalah archaea (Madigan & Marrs, 1997).

Beberapa bakteri termofilik berhasil diisolasi dari berbagai sumber air panas di

Indonesia. Geobacillus thermoleovorans, dengan kisaran suhu pertumbuhan 43ºC sampai

75ºC (Indrajaya et al., 2003) dari sumber air panas kawah Wayang, Pangelangan.

Geobacillus thermoleovorans, dengan kisaran suhu pertumbuhan 42ºC sampai 70ºC

(Dirnawan et al., 2000) dari sumber air panas Gunung Pancar, Bogor.

Bakteri termofilik merupakan contoh mikroba yang prospektif dalam aplikasi bidang

pangan dan industri. Salah satu penerapan yang telah dilakukan adalah sebagai agen aktif

dalam fermentasi bersuhu tinggi, proses pengolahan limbah, dan proses pelarutan mineral

(Lestari, 2000).

2.2. Protease

Enzim merupakan katalisator protein yang mempercepat reaksi kimia dalam

makhluk hidup atau dalam sistem biologik. Sebagai protein, enzim memiliki sifat-sifat umum

protein, seperti enzim terdenaturasi pada suhu tinggi atau kondisi ekstrim lainnya. Beberapa

oksidator, keadaan polaritas larutan, tekanan osmotik yang abnormal juga dapat menghambat

kerja enzim (Suhartono, 1989). Enzim memiliki kelebihan terhadap katalisator non-biologis

pada kecepatan reaksi serta spesifikasi terhadap substrat yang tinggi. Enzim Orotidin 5�-

fosfat (OMP) dekarboksilase dapat mempercepat reaksi sampai 1017 dengan waktu paruh 78

juta tahun, enzim lain rata-rata masih di bawah 1014 kali (Radzicka & Wolfenden, 1995).


Protease merupakan kelompok enzim-enzim yang sangat kompleks yang menduduki

posisi sentral dalam aplikasinya pada bidang fisiologis dan produk-produk komersil. Protease

ekstraseluler sebagian besar berperan dalam hidrolisis substrat polipeptida besar. Enzim

proteolitik intraseluler memainkan peran penting dalam metabolisme dan proses regulasi

pada sel hewan, tumbuhan dan mikroorganisma. Seperti mengganti protein, memelihara

keseimbangan antara degradasi dan sintesis protein. Protease intraseluler berperan dalam

fungsi fisiologis lainnya, seperti pencernaan, maturasi hormon, perakitan virus, respon imun,

imflamantasi, fertilisasi, koagulasi darah, fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi,

germinasi dan patogenesis (Rao et al., 1998). Protease juga diimplikasikan dalam peran

regulasi ekspresi gen, perbaikan DNA, dan sintesis DNA (Kalisz, 1998).

Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida dalam

peptida, polipeptida dan protein dengan menggunakan reaksi hidrolisis menjadi molekul-

molekul yang lebih sederhana seperti peptida rantai pendek dan asam amino (Naiola &

Widyastuti, 2002). Banyak protease mengkatalisasi dengan reaksi yang sama dengan reaksi

kimia umum, reaksi hidrolisis yang serupa ditunjukkan pada Gambar 1 (Moran et al., 1994).


Gambar 1. Mekanisne umum hidrolisis enzimatik substrat peptida (Moran et al., 1994)

Hidrolisis ikatan peptida adalah reaksi penambahan-penghilangan, dimana protease

bertindak sebagai nukleofili atau bereaksi dengan membentuk satu molekul air (Bauer et al,

1996). Secara umum nukleofili membentuk intermediat tetrahedral dengan atom karbon

karbonil pada ikatan peptida. Satu gugus amina dilepaskan dan dikeluarkan dari sisi aktif,

Nucleo-phile

Acid Catalyst

X HB

C

R1 N R2

H

O

Peptide

Enz Acid

Catalyst

X H B

C

R1

N R2

H

First Tetrahedral intermediate

Enz

O

Nucleo-phile

Acid Catalyst

X HB

C

R1 O + H

O

Carboxy- late product

Enz

N

H

R2

H

Amine Product

Base Catalyst

X B:

C

R1

Acyl-enzyne adduct

Enz

O

:O

H

H

Water

Acid Catalyst

X HB

C

R1

O

Second Tetrahedral

Enz

O

H

. .

. .


yang digantikan secara bersamaan dengan satu molekul air. Pada protease tertentu, adisi

enzim-asil dapat dibentuk, seperti pada Gambar 1. Intermediat tetrahedral kedua akhirnya

dibentuk dan menghasilkan produk karboksilat, proton dan enzim bebas yang diregenerasi

(Moran et al., 1994).

2.3. Klasifikasi Protease

Enzim yang bekerja sebagai katalis dalam reaksi pemecahan molekul protein dengan

cara hidrolisis disebut proteolitik atau peptidase (Poedjiadi & Supriyanti, 1994). Berdasarkan

sistem klasifikasi IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology), enzim-enzim proteolitik mikroba dapat dibedakan atas

endopeptidase dan eksopeptidase. Protease diklasifikasikan berdasarkan tiga kriteria utama,

yaitu tipe reaksi yang dikatalisisnya, struktur kimia alami yang ada pada sisi katalitiknya, dan

strukturnya yang berhubungan dengan evolusi (Rao et al., 1998).

2.3.1. Eksopeptidase

Masing-masing jenis protease lebih spesifik pada satu atau lebih ikatan peptida.

Tergantung pada residu-residu asam amino yang berdekatan. Eksopeptidase memotong ikatan

peptida dimulai dari terminal atau karboksi bebas pada ikatan peptida substrat dan dibagi

dalam beberapa subklas, bergantung pada bagian yang di potong pada substrat polipeptida

dan pada terimal mana enzim bekerja (Tabel 1). Subsklas ini dibagi atas 6 kelompok berbeda:


memotong pada terminal amino atau karboksil, dan selanjutnya, memotong satu, dua atau tiga

residu terminal terakhir target yang dipilih (Barret, 1994).

Tabel 1. Klasifikasi protease (Rao et al., 1998)

Ket : a menunjukkan pembukaan cincin residu asam amino pada rantai polipeptida. Cincin yang padat mengindikasikan terminal asam amino, tanda bintang menandakan penghambatan terminal asam amino. Tanda panah menunjukkan sisi aktif enzim

2.3.2. Endopeptidase

Endopeptidase memotong protein pada tempat-tempat tertentu dalam molekul

protein (Tabel 1). Biasanya tidak dipengaruhi oleh gugus yang terletak di ujung molekul

(Poedjiadi & Supriyanti, 1994). Gambar 2. menunjukkan representasi dari sisi aktif

endopeptidase pada substrat polipeptida dimana substrat hampir selalu terlihat dengan amino


terminal pada sisi kiri. Pembelahan substrat terjadi pada rantai antara kedua residu yang

diberi label P1 dan P1´. Residu asam amino dalam seluruh posisi yang berikatan (P3-P3´)

dapat memiliki efek pada kecepatan hidrolisis yang didasarkan pada dua sifat utama:

rintangan ruang dan stabilitas interaksi antar substrat dan enzim (Hicks, 1998).

Gambar 2. Gambaran skematik komplek substrat-proteinase dengan enam lokasi ikatan. Pembelahan terjadi antara residu-residu asam amino P1-P1´ (Hicks,1998)

Menurut tata nama enzim, endopeptidase yang didasarkan pada geometri sisi aktif

dan mekanisme enzimatik, dibagi dalam lima kelompok (Tabel I) yaitu: protease serin,

sistein, aspartik, metallo- dan protein yang belum di ketahui mekanisme katalitiknya (Barret,

1994).

2.4. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Aktifitas Enzim

Semua enzim adalah protein, dan aktifitas katalitiknya bergantung kepada integritas

strukturnya sebagai protein. Enzim seperti protein lain, mempunyai berat molekul berkisar

dari kira-kira 12.000 sampai 1 juta. Oleh karena itu enzim berukuran amat besar

dibandingkan dengan substrat atau gugus fungsional targetnya.


Penataan tertentu pada rantai samping asam amino suatu enzim di sisi aktifnya

menentukan tipe molekul yang dapat terikat dan bereaksi di situ. Biasanya ada sekitar lima

rantai samping seperti itu dalam enzim apapun. Selain itu, banyak enzim yang molekul-

molekul nonprotein kecil yang terhubung dengan sisi aktif atau di dekatnya. Molekul-

molekul ini disebut kofaktor atau koenzim (Ngili, 2009). Beberapa enzim memerlukan

kofaktor atau koenzim untuk aktifitas katalitiknya, dan enzim lain mungkin membutuhkan

koenzim maupun satu atau lebih ion logam untuk aktivitas katalitiknya. Bagian holoenzim

(koenzim dan ion) bersifat stabil sewaktu pemanasan, sedangkan bagian apoenzim (protein)

terdenaturasi oleh pemanasan (Poedjiadi & Supriyanti, 1994).

Pengaruh suhu sangat menentukan aktivitas enzim pada waktu mengkatalisa suatu

reaksi. Seluruh enzim memerlukan jumlah panas tertentu untuk dapat aktif. Sejalan dengan

meningkatnya suhu, makin meningkat pula aktivitas enzim. Secara umum, setiap peningkatan

sebesar 10ºC di atas suhu minimum, aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali lipat.

Aktivitas enzim meningkat pada kecepatan ini hingga mencapai kondisi optimum.

Peningkatan suhu yang melebihi suhu optimumnya menyebabkan lemahnya ikatan di dalam

enzim secara struktural (Pratiwi, 2008). Pada suhu maksimum enzim akan terdenaturasi

karena struktur protein terbuka dan dan gugus non polar yang berada di dalam molekul

menjadi terbuka keluar, kelarutan protein di dalam air yang polar menjadi turun, sehingga

aktivitas enzim juga akan turun (Lehninger, 1997).

Aktivitas enzim dipengaruhi pula oleh konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat

rendah, enzim tidak mencapai konversi maksimum akibat sulitnya enzim menemukan

substrat yang akan direaksikan. Seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat, kecepatan

reaksi juga akan meningkat akibat makin cepatnya substrat terikat pada enzim. Peningkatan


konsentrasi substrat pada titik jenuh tidak lagi dapat meningkatkan kecepatan laju reaksi

(Pratiwi, 2008). Facilitation of proximity, atau kemudahan berdekatan, yang disebut sebagai

efek keakraban, yang berarti bahwa laju reaksi antara dua molekul ditingkatkan bila dalam

larutan encer keduanya dijaga dalam jarak dekat dalam sisi aktif enzim, sehingga menaikkan

konsentrasi efektif reaktan (Ngili, 2009).

pH lingkungan juga berpengaruh terhadap kecepatan aktivitas enzim dalam

mengkatalisis suatu reaksi. Hal ini disebabkan konsentrasi ion hidrogen mempengaruhi

struktur tiga dimensi enzim dan aktivitasnya. Setiap enzim memiliki pH optimum di mana

pada pH tersebut stukur tiga dimensinya paling kondusif untuk mengikat substrat. Bila

konsentrasi ion hidrogen berubah dari konsentrasi optimal, aktivitas enzim secara progesif

hilang sampai pada akhirnya enzim menjadi tidak fungsional (Lehninger, 1997).

Selain suhu, pH dan konsentrasi substrat, aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh ada

tidaknya inhibitor. Jika terdapat pengurangan laju reaksi oleh suatu senyawa, senyawa

tersebut dinamakan inhibitor. Inhihitor dapat bersaing dengan substrat dalam berikatan

dengan enzim, sehingga menghalangi substrat terikat pada tapak aktif enzim (Poedjiadi &

Supriyanti, 1994). Peningkatan laju reaksi yang disebabkan oleh aktivator adalah kebalikan

dari efek inhibitor.

2.5. Protease Termofilik

Kebanyakan protease stabil pada suhu normal (mesofilik), namun enzim mesofilik

sering tidak secara optimal beradaptasi dengan kondisi-kondisi dimana enzim diharapkan

dapat diterapkan. Karena alasan ini beberapa strategi digunakan untuk meningkatkan

karakteristik dari biokatalisator seperti, stabilitas, aktifitas, spesifitas, dan pH optimum.


Isolasi enzim dari organisme yang mampu bertahan di bawah kondisi-kondisi ekstrim, dapat

menjadi sumber penting untuk biokatalis baru (Fujiwara et al., 1993). Akhir-akhir ini,

protease dari mikroorganisma termofil menjadi pusat perhatian terutama pada enzim-

enzimnya. Selama evolusinya mikroorganisma ini beradaptasi untuk tumbuh dalam cakupan

luas pada suhu, pH dan tekanan (Setter, 1996). Jenis yang ditemukan di atas suhu yang lebih

tinggi (105-113°C) hanya dari archaea (Setter, 1996).

Protease bakteri termostabil menjadi pusat perhatian karena stabilitasnya pada suhu

yang lebih tinggi. Enzim termofilik secara optimal aktif jauh di bawah kondisi terdenaturasi

(Gupta et al., 2002). Hasil elusidasi struktur dari kristal enzim ini menunjukkan strukturnya

lebih kaku dari enzim mesofil karena struktur bagian dalam dari enzim termofil mempunyai

jaringan pasangan ion yang sangat luas dibanding enzim mesofil (Yuwono, 2005). Síntesis

protein pada suhu tinggi tidak hanya membutuhkan enzim termostabil, tetapi juga

membutuhkan asam inti yang termostabil, yaitu mRNA. tRNA dan rRNA. Perubahan kimia

walaupun sedikit, tetapi akan berakibat terhadap perubahan fisik dari tRNA yang sifatnya

menjadi lebih stabil. Organisme termofil memiliki kecenderungan mempunyai kandungan

G+C yang tinggi. Semakin tinggi nilai G+C maka semakin sukar molekul untai DNA

dipisahkan. Adanya mg2+ ion yang melindungi denaturasi akibat panas dan terjadinya tiolasi

dari ribotimidin menjadi 5-metil-2-tiouridin menyebabkan enzim stabil pada suhu tinggi

(Sundaram dalam Brock, 1986).

Mekanisne dasar stabilitasnya adalah modifikasi sekuen seperti penggantian

konformasi glisin dengan residu-residu kaku, penambahan jembatan garam, peningkatan

interaksi hidropobik, ikatan hidrogen dan pasangan ion tambahan, meminimalkan akses luas


permukaan hidrofobik, stabilitas heliks, dan perakitan subunit. Formasi oligomer dan faktor

lingkungan lain juga dapat menstabilkan enzim (Vieille & Zeikus, 2001).

Pada strategi ini, variasi berbeda yang digunakan untuk protein termofilik yang

berbeda, tidak hanya memberikan stabilitas termal untuk protein tetapi juga meningkatkan

kekakuan dan resistensi pada denaturasi kimia dan serangan proteolitik. Stabilitas yang tinggi

membuat enzim termofilik atraktif untuk beberapa proses industri.

2.6. Aplikasi Mikroorganisme Termofilik

Teknologi enzim dipandang sebagai teknologi yang diduga akan menjadi teknologi

yang paling ideal untuk masa yang akan datang sebab enzim hanyalah berupa protein dan

tidak bersifat toksik dan dapat mengalami denaturasi secara alami sehingga tidak

menimbulkan bahaya apapun terhadap lingkungan. Sebagai tambahan bahwa enzim mampu

mengkatalisis suatu reaksi biokimia secara efektif, efisien dan spesifik dan bahkan dengan

kemajuan teknik imobilisasi, enzim dapat dipergunakan secara berulang kali tanpa

mengurangi laju reaksi biokimia yang dikatalisisnya (Darwis & Sukara, 1990). Pada saat ini

teknologi enzim banyak dilibatkan dalam berbagai industri termasuk pembuatan alkohol,

pembuatan roti, bir, detergen, kulit, anggur dan sari buah, industri pati, tekstil, industri

protein, industri farmasi serta industri-industri lain termasuk industri kopi, kertas, gula,

minyak nabati dan modifikasi lemak, bio-stoning jeans, makanan ternak, bioremediasi

lingkungan (Gomes & Steiner, 2004)

Termofil saat ini menjadi tujuan sumber-sumber enzim termostabil yang relevan

dengan industri yang beroperasi pada suhu tinggi. Aktivitas mikroorganisme ini serta enzim

yang dihasilkan dapat dimanfaat untuk konversi biomassa ke produk target (Karlson et al.,


2007). Kebanyakan protein-protein industri yang ditemukan bersumber dari mikroba,

khususnya protease mikroba mencapai 40% dari total jumlah enzim yang di jual di seluruh

dunia (Gupta et al., 2002). Enzim�enzim mikroba ini harus aman yaitu tidak toksik dan tidak

patogenik dan secara umum tidak menghasilkan antibiotik (Rao et al., 1998).

Banyak industri menggunakan protease dalam deterjen, peragian, pengembang,

penyamakan kulit dan pengempukan daging berasal dari Bacillus, Aspergillus oryzae dan

streptomyces spp. Tipe protease ini umumnya dihasilkan selama proses fermentasi dan

dikeluarkan ke dalam media produksi (Headon & Walsh, 1994).

Protease bakteri secara ekstensif digunakan dalam industri deterjen, yang jumlahnya

mencapai 25% dari total enzim yang dijual di dunia. Dimulai tahun 1993, protease dari

ekstrak kasar protease ditambahkan pada deterjen laundry untuk mencapai hasil yang lebih

baik dalam memindahkan noda proteinaceous. Akhir tahun 50-an, protease bakteri pertama

kali digunakan dalam deterjen komersil. Saat ini protease paling populer untuk digunakan

dalam deterjen yang semuanya tergolong protease serin dari Bacillus amyloliquefaciens, B.

lichenformis, Bacillus alkali kuat seperti B. lentus (Rao et al., 1998).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Tahap isolasi sampai dengan tahap pengujian aktifitas protease dilakukan di

Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas MIPA USU dan Laboratorium

Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi USU dari bulan Maret sampai Agustus 2008.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, Shaker Water Bath

(Gallenkamp), Inkubator, Water Bath, oven neraca analitik, kamera digital, termometer,

indikator universal, Mikroskop dan alat gelas.

Bahan yang digunakan adalah sampel air, medium nutrient, medium Luria Agar,

hidrogen peroksida 3%, susu skim, pereaksi A, pereaksi B, pereaksi C, pereaksi D, Mc

Farland, Nutrien Broth, kristal violet, alkohol, aquadest, kapas, aluminium foil, kertas tissue,

wipol

3.3. Sumber Isolat

Sampel diperoleh dari sumber air panas yang terletak secara geografis antara 98° 54´

00��- 99° 01´ BT dan 1° 56° 00�� sampai 2° 06� 00�� LU, Desa Sipoholon, Kecamatan Toba

Samosir, Kabupaten Tarutung, Sumatera Utara. Sampel diambil pada bagian dasar dan

permukaan aliran air panas dengan cara memasukkan ke dalam botol winkler steril. Suhu dan


pH pada sumber air panas diukur sebagai data pendukung. Sampel segera dibawa ke

Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU untuk diisolasi.

3.4. Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik Termofilik

Sebanyak 0,1 ml sampel air dan lumpur dimasukkan ke dalam media selektif

(Lampiran 1), yaitu agar susu skim (pH 6,5) (Widhyastuti & Dewi, 2001). Sampel

disebarkan ke seluruh bagian media dengan metode cawan sebar, lalu diiunkubasi pada suhu

65°C selama ± 48 jam.

Koloni isolat yang memiliki zona proteolitik diamati warna, tepi, elevasi dan bentuk

koloni. Isolat yang memiliki nilai aktivitas hidrolisis kemudian dibuat biakan murni pada

media agar susu skim (Lampiran 2).

3.5. Uji Kemampuan Aktivitas Proteolitik Isolat

Masing-masing isolat bakteri yang memiliki aktivitas proteolitik ditumbuhkan pada

media selektif agar susu skim (pH 6,5). Isolat diinkubasi pada suhu 65°C selama ± 48 jam.

Zona hidrolisis protein diukur dengan membandingkan diameter zona bening dengan

diameter koloni bakteri.

Hasil bagi zona bening dan zona pertumbuhan dinilai sebagai kekuatan enzim secara

nisbi (Widhyastuti & Dewi, 2001). Isolat yang memiliki nilai aktivitas proteolitik yang tinggi

dikarakterisasi dan diperbanyak untuk proses selanjutnya (Lampiran 3).


3.6. Karakterisasi Sifat Morfologi dan Biokimia Isolat Terpilih

Beberapa isolat yang memiliki nilai aktivitas hidrolisis yang tinggi dikarakterisasi

sifat morfologi dan biokimianya (Lampiran 4). Karakterisasi sifat morfologi mencakup

bentuk sel, motilitas, dan sifat Gram.

Motilitas diamati dengan menggunakan medium semi padat Sulfide Indole Motily

(SIM). Pewarnaan Gram menggunakan pewarna kristal violet dan safranin untuk menentukan

sifat Gram. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji sitrat dengan media Simons Citrat

Agar (SCA), uji gelatin dengan media nutrien gelatin, dan uji katalase dengan menggunakan

larutan 3% H2O2 (Cappuccino & Sherman, 1983). Uji sitrat, uji motilitas dan uji gelatin

dilakukan pada suhu 65°C.

3.7. Produksi Protease

Sebanyak 1 ml (108 sel/ml) isolat bakteri proteolitik yang dipilih dari uji kemampuan

aktifitas proteolitik, diinokulasikan ke dalam 20 ml medium cair (Fitri et al., 2005) yang

dimodifikasi, pH 6,5 dan diinkubasi pada suhu 65°C selama ± 48 jam dengan pengocokan

setiap 12 jam.

Enzim kasar diperoleh dengan mensentrifugasi medium kultivasi dengan kecepatan

6000 rpm selama 20 menit pada suhu ruang. Supernatan yang diperoleh merupakan protease

kasar (Apriyantono et al., 1989) (Lampiran 5).

3.8. Pemekatan Enzim Dengan 70% Amonium sulfat

Enzim kasar hasil sentrifugasi dipresipitasi menggunakan ammonium sulfat dengan

konsentrasi kejenuhan 70% (Widowati et al., 2005). Penambahan ammonium sulfat


dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk pada 5°C sampai larutan jenuh. Sebaiknya

ditambahkan 1-2 ml EDTA 0.5 mM dan didiamkan selama 1 jam. Kemudian disentrifugasi

dengan kecepatan 6000 rpm selama ± 15 30 menit. Supernatan yang diperoleh disimpan

dalam kulkas sedangkan endapan dicampur dengan buffer fosfat 50 mM pH 6,5 sebanyak 2-3

ml kemudian dimasukkan ke dalam membran dialisis.

Dialisis dilakukan untuk memisahkan protein yang diinginkan dari senyawa-senyawa

lain seperti ammonium sulfat. Cairan dialisis yang digunakan adalah buffer posfat 50 mM pH

6,5. Penggantian buffer dilakukan setelah 30 menit satu jam pertama, setelah 30 menit satu

jam berikutnya dan setelah satu malam. Dialisis dilakukan pada suhu 5°C. Setelah itu hasil

dialisis digunakan untuk pengujian enzim (Lampiran 6).

3.9. Penentuan Kadar Protein Enzim Proteolitik

Sebanyak 1 ml enzim protease yang telah dipekatkan ditambahkan dengan 5 ml

pereaksi C, dikocok dengan segera dan dibiarkan pada suhu kamar selama 10 menit.

Kemudian ditambahkan 0,5 ml pereaksi D, dikocok dengan segera dibiarkan pada suhu

kamar selama 30 menit.

Absorbansi diukur dengan spektofometer pada panjang gelombang maksimum yang

telah diperoleh. Kadar proteinnya ditentukan dengan membandingkan absorbansi dengan

kurva standar BSA yang diperoleh (Lubis, 2003) (Lampiran 7). Alur kerja penentuan

panjang gelombang maksimum dapat dilihat pada Lampiran 8. Alur kerja pembuatan kurva

standar BSA dapat dlilihat pada Lampiran 9.


3.10. Pengujian Aktivitas Protease

Sebanyak 0,5 ml substrat (BSA 300 µg/ml) ditambahkan pada campuran 0,5 ml

buffer fosfat (pH 6,5) dan 0,5 ml larutan enzim yang telah dipreinkubasikan pada suhu ruang

selama 5 menit. Campuran tersebut diinkubasikan selama 10 menit pada suhu yang berbeda

yaitu 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C dan 80°C. Reaksi enzimatis dihentikan dengan

mendinginkan larutan pada suhu 5°C di dalam lemari pendingin (Widhyastuti & Dewi,

2001).

Kadar protein akhir reaksi (enzim protease dan substrat) diukur dengan metode

Lowry. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi C, dikocok dengan segera dan dibiarkan pada

suhu kamar selama 10 menit, ditambahkan 0,5 mL pereaksi D, dikocok dengan segera dan

dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit (Lubis, 2003). Absorbansi diukur dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh (Lampiran 10).

Untuk mengetahui aktivitas protease bakteri pada substrat terlebih dahulu harus

diketahui kadar protein terhidrolisis yang dibebaskan dari substrat. Untuk mengetahui kadar

protein dalam ekstrak dilakukan analisa menurut metode Lowry. Dalam hal ini dipakai

standar protein dari BSA (300µg/ml) dengan hasil ditunjukkan pada Lampiran 11. Penentuan

kadar protein dapat dihitung berdasarkan persamaan regresi dengan rumus Y= a + bX

(Lampiran 12).Grafik kurva standar yang diperoleh dapat dilihat pada Lampiran 13.

Untuk mendapatkan kadar protein substrat yang tersisa dilakukan pengurangan kadar

protein akhir reaksi dengan kadar protein enzim protease sehingga diperoleh kadar protein

yang terhidrolisis yaitu dengan mengurangkan kadar protein substrat awal dengan kadar

protein sisa substrat (Lampiran 14). Pengukuran aktivitas enzim (v) protease dilakukan


menurut Sadikin (2002), yaitu dengan membagi Ä[S] dengan Ät yang dapat ditulis dengan

rumus:

t

SV

Satu unit aktivitas enzim protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang

menghidrolisis 1 µg substrat per menit (Fitri et al., 2005).

3.11. Analisis Data

Data berupa hasil pengamatan morfologi dan biokimia dipaparkan secara deskriftif,

sedangkan hasil berupa data kuantitatif pengaruh terhadap suhu dilakukan analisis varian

dilanjutkan dengan uji Duncan (Sudjana, 1986). Mengingat semua media dan kondisi

lingkungan serta perlakuan terhadap protease dikondisikan sama kecuali perlakuan suhu

aktivitas enzim, rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap non faktorial.

Perlakuan suhu terhadap protease adalah rentang suhu termofil antara 50-80ºC, sebanyak 3

kali ulangan. Parameter yang diukur adalah konsentrasi protein (ug/ml) terhadap berbagai

variasi suhu untuk mengetahui aktivitas enzim protease.

Data hasil penelitian dihitung dalam struktur tabel sidik ragam (Lampiran 15).

Pengujian hipotesis dilanjutkan bila nilai Fhitung > Ftabel maka hipotesis nol ditolak, yang

berimplikasi bahwa perlakuan suhu memberikan pengaruh nyata terhadap konsentrasi protein

(ìg/ml). Dengan demikian dilakukan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) untuk melihat

jarak antar perlakuan suhu dan pH.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Proteolitik Termofilik

Dari hasil isolasi yang telah dilakukan, diperoleh 16 isolat bakteri proteolitik termofil

dari sumber air panas Sipoholon, Tarutung, Sumatera Utara. Masing- masing dari kolam I

(suhu 66ºC, pH 6,5-7), kolam II (suhu 65ºC, pH 6,5-7) dan kolam III (suhu 59ºC, pH 6,5-7).

Seluruh tahap inkubasi pada proses isolasi dan seleksi dilakukan pada suhu 65ºC. Suhu tinggi

(65ºC) dimaksudkan agar bakteri proteolitik yang terseleksi merupakan bakteri proteolitik

yang memiliki aktivitas optimum dan stabilitas tinggi pada suhu tinggi.

Media isolasi dan seleksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah susu skim

(Lampiran 1). Susu adalah merupakan media yang sesuai untuk pertumbuhan mikroba karena

kaya akan nutrien. Kasein merupakan protein susu yang terdiri dari fosfoprotein yang

berikatan dengan kalsium membentuk garam kalsium yang disebut kalsium kalseinat.

Molekul ini sangat besar dan tidak larut dalam air serta membentuk koloid. Suspensi ini

berwarna putih dan dapat diamati secara langsung pada saat disuspensikan ke dalam kultur

media padat.

Dengan adanya enzim proteolitik ekstraseluler bakteri, kasein ini akan terhidrolisis

menjadi peptida-peptida dan asam-asam amino yang larut. Hilangnya pertikel kasein di dalam

media susu skim ditandai dengan adanya zona lisis (zona jernih) di sekitar koloni bakteri,

merupakan indikator bahwa 16 isolat bakteri-bakteri ini mampu merombak kasein dalam

media susu skim.


4.2. Kemampuan Aktivitas Kualitatif Proteolitik Isolat

Aktivitas hidrolisis secara kualitatif merupakan gambaran dari kemampuan isolat

bakteri proteolitik merombak protein dengan membandingkan besarnya zona jernih di sekitar

koloni dengan besarnya diameter koloni (Widhyastuti & Dewi, 2001).

Dari hasil uji aktivitas proteolitik secara kuantitatif diperoleh tiga isolat yang

menunjukkan zona jernih terbesar, yaitu SP1 dengan nilai aktifitas kualitatif 5.81 mm yang

diperoleh dari kolam III (suhu 59ºC, pH 6,5-7), SP2 dengan nilai aktivitas kualitatif 5.96 mm

yang diperoleh dari kolam II (suhu 65ºC, pH 6,5-7) dan SP3 dengan nilai aktivitas kualitatif

5.22 mm yang diperoleh dari kolam I ( suhu 66ºC, pH 6,5-7). Ketiga isolat terbaik ini dipilih

untuk uji lanjutan.

Perbedaan luas zona jernih yang ditemukan pada tiap isolat diduga disebabkan

perbedaan suhu dan pH baik pada kondisi alami dengan perlakuan di laboratorium selama

penelitian berlangsung. Menurut Lehninger (1998), bahwa aktivitas suatu enzim dipengaruhi

oleh beberapa faktor, yaitu pH, konsentrasi substrat dan enzim, suhu dan adanya aktivator

atau inhibitor. Metode ini tidak selalu menjadi dasar yang baik untuk melihat aktifitas enzim-

enzim proteolitiknya, sehingga perlu dilakukan uji lanjutan terhadap aktivitas proteasenya

(Ward, 1985). Hasil hidrolisis tiga isolat terbaik terhadap protein dalam media skim dapat

dilihat pada Tabel 2.


Tabel 2. Kemampuan Aktivitas Proteolitik Bakteri Termofilik Secara Kualitatif

No Kode Isolat

Diameter zona lisis (mm)

Diamemeter koloni (mm)

Aktivitas hidrolisis (mm)

1. SP1 9.6 1.65 5.81

2. SP2 21.61 3.65 5.96

3. SP3 19.60 3.75 5.22

Besar aktivitas enzim proteolitik ditunjukkan dengan semakin lebarnya zona jernih

tetapi besarnya aktivitas enzim proteolitik yang berperan merombak protein dalam medium

padat tidak dapat diketahui dan diukur secara kuantitatif. Hasil perombakan polimer protein

hanya ditunjukkan dengan adanya zona jernih yang menandakan protein telah dirombak

menjadi senyawa peptida dan asam amino yang sifatnya terlarut dalam medium. Hasil uji

aktivitas secara kualitatif tiga isolat terbaik dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Zona jernih sebagai indikator aktivitas hidrolisis dari tiga isolat terbaik yang diseleksi untuk uji lanjutan yaitu SP1, SP2 dan SP3


4.3. Karakter Isolat Terpilih Bakteri Proteolitik Termofilik

Masing-masing isolat terbaik ini telah dilakukan pewarnaan gram dan uji biokimia

sederhana. Menurut Lay (1994), koloni yang tumbuh di atas agar lempengan perlu

diperhatikan bentuk, warna tepi elevasi dan sifat tembus cahaya untuk memperoleh ciri

morfologinya. Hasil pengamatan morfologi koloni dan morfologi bakteri disajikan pada

Tabel 3. berikut:

Tabel 3. Karakteristik Morfologi Bakteri Proteolitik Termofilik Tiga Isolat Terbaik

Isolat Morfologi Koloni Morfologi Bakteri

Warna Bentuk Tepi Elevasi Bentuk Penataan Warna Gram

SP1 putih bulat rata cem-bung

basil mono,

diplo

merah -

SP2 putih bulat rata cem-bung

Pseu-dobasil

mono, diplo

ungu +

SP3 krem bulat rata cem-bung

basil mono, diplo,

strepto

merah -

Hasil pengamatan morfologi koloni menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki

bentuk bulat, tepi rata dan elevasi cembung. Perbedaan ditemukan pada warna koloni, warna

koloni SP1 dan SP2 putih dan SP3 berwarna krem. Hasil pengamatan morfologi setelah

pewarnaan menunjukkan SP1 mono basil dan diplo basil. SP3 berbentuk mono basil, diplo


dan strepto basil sedang SP2 berbentuk mono dan diplo pseudobasil. Pewarnaan gram

menunjukkan umumnya bersifat gram negatif kecuali SP2 bersifat gram positif.

Perbedaan warna gram menunjukkan perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Umumnya bakteri gram negatif memiliki dinding sel dengan kandungan lipida yang tinggi.

Lipida larut oleh aseton alkohol sehingga kompleks zat warna kristal violet pada dinding sel

tidak dapat dipertahankan dan mengikat zat warna merah safranin pada waktu pewarnaan.

Warna merah yang tetap dipertahankan mengindikasikan bakteri gram negatif. Pada bakteri

gram positif dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan yang tidak larut oleh aseton alkohol

sehingga warna biru kompleks zat warna kristal violet tetap dipertahankan pada waktu

pewarnaan (Lay, 1994). Gambar hasil pewarnaan gram bakteri dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar hasil pengamatan uji biokimia sederhana yang telah dilakukan pada isolat bakteri

terbaik ini dapat dilihat pada Lampiran 16.

Gambar 4. Sel isolat SP1, SP2 dan SP3 hasil pewarnaan gram diamati dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 40 x 100


Berdasarkan hasil pengamatan uji biokimia sederhana diperoleh hasil seperti pada

Tabel 4 berikut:

Tabel 4. Uji Biokimia Sederhana Tiga Isolat Bakteri Yang Menunjukkan Aktivitas Proteolitik Terbaik

Isolat SA SIM Gelatin SCA Katalase

SP1 + + + - +

SP2 + + + - +

SP3 + + + - +

Hasil uji SIM terhadap ketiga isolat menunjukkan bahwa SP1, SP2 dan SP3 bersifat

motil yang ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri di dalam medium. Hasil uji

gelatin juga menunjukkan ketiga isolat mampu menghidrolisis gelatin. Uji positif gelatin

ditandai dengan medium gelatin yang tetap bersifat cair setelah dimasukkan ke dalam lemari

pendingin selama 30 menit (Lay, 1994). Gambar uji biokimia sederhana dapat dilihat pada

Lampiran 16.

Dari uji SCA diketahui ketiga isolat tidak mampu menggunakan sitrat sebagai

sumber karbon. Hal ini ditandai dengan tidak berubahnya warna hijau menjadi biru pada

media. Keadaan positif apabila terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru akibat

penghilangan asam dan peningkatan pH pada media (Cappucino & Sherman, 1983). Hasil uji

katalase dengan penambahan larutan 3% H2O2 mengindikasikan bahwa ketiga isolat memiliki

enzim katalase, ditandai dengan terbentuknya gelembung udara yaitu O2 di sekitar koloni. Uji


katalase membuktikan adanya enzim katalase pada isolat yang berfungsi mendegradasi H2O2

menjadi O2 (Lay, 1994).

4.4. Hasil pengujian Aktivitas Protease Kasar dari Tiga Isolat Termofilik Terpilih

Hasil pengujian aktivitas protease kasar dari tiga isolat terpilih menunjukkan ketiga

isolat memiliki aktivitas protease secara kuantitatif yang berbeda (Tabel 5).


Tabel 5. Aktivitas Protease Kasar pada Tiga Isolat Terpilih Secara Kuantitatif

Ket: Notasi berdasarkan hasil uji Duncan, angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama untuk masing-masing isolat artinya tidak berbeda nyata

Dari hasil pengujian aktivitas protease kasar menunjukkan isolat SP3 (dari kolam I suhu

66ºC, pH 6,5-7), memiliki aktivitas protease secara kuantitatif yang tertinggi sebesar 11.6

Unit, sedang aktivitas protease terendah dihasilkan oleh isolat SP1 (dari kolam III suhu 59ºC,

pH 6,5-7) sebesar 9.50 Unit. Isolat SP2 (dari kolam II suhu 65ºC, pH 6,5-7) dengan hidrolisis

tertinggi secara kualitatif sebesar 5.96 mm hanya menghasilkan aktivitas enzim secara

Isolat Suhu

Kadar protein (µg/ml)

Substrat terhidrolisis

(µg/ml)

Aktivitas (Unit)

Aktivitas spesifik (U/mg protein) Notasi

0.05

SP1 50 ºC 595.551 58.060 5.80 9.89 c

55 ºC 574.905 78.707 7.87 13.87 b 60 ºC 558.593 95.019 9.50 17.31 a 65 ºC 570.970 82.642 8.26 14.47 b 70 ºC 602.852 50.760 5.07 8.90 c 75 ºC 627.091 26.520 2.65 4.39 d 80 ºC 648.137 5.475 0.54 0.88 d

SP2 50 ºC 667.928 43.574 4.37 6.52 d 55 ºC 650.532 60.969 6.09 9.37 c 60 ºC 637.700 77.224 7.72 11.57 b 65 ºC 618.992 99.353 9.93 14.94 a 70 ºC 641.350 75.855 7.58 10.93 b 75 ºC 653.669 56.691 5.66 8.84 c 80 ºC 683.042 26.178 2.84 4.16 d



kuantitatif sebesar 9.93 Unit, sedang SP3 dengan aktivitas hidrolisis secara kualitatif terendah

sebesar 5.22 mm, memperlihatkan aktivitas yang lebih tinggi dari SP2.

Adanya perbedaan nilai aktivitas protease secara kualitatif dan aktivitas kuantitatif

kemungkinan karena perbedaan kondisi suhu alami pertumbuhan bakteri dengan perlakuan di

laboratorium sehingga aktivitas bakteri tidak optimum. Pertumbuhan suatu mikroorganisme

sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti faktor fisika-kimia (suhu, pH, aerasi,

agitasi) dan komposisi media tumbuh (Stanbury & Whitaker, 1985). Ward (1985)

mengindikasikan bahwa tidak selalu terdapat korelasi yang baik antara zona jernih protein di

sekitar koloni pada media padat dengan kemampuan organisme tersebut. Beberapa faktor

yang diduga menjadi penyebab tidak terkorelasinya nilai aktivitas hidrolisis secara kualitatif

dengan nilai enzim secara kuantitatif adalah perbedaan jenis mikroorganisme, kecepatan

pertumbuhan setiap isolat pada medium padat dan cair, jumlah inokulum yang diberikan pada

kedua medium, dan tipe enzim yang dihasilkan.

Hasil pengujian aktivitas proteolitik kasar secara kuantitatif dari Tabel 5.

menunjukkan aktivitas protease SP1, SP2 dan SP3 dipengaruhi sangat nyata oleh perbedaan

suhu (á ≤ 0.05) (Lampiran 15). Aktivitas protease terlihat meningkat seiring dengan

peningkatan suhu inkubasi, dan setelah suhu optimum aktivitas menurun.

Penurunan aktivitas protease dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya pH,

suhu dan waktu inkubasi (Naiola & Widhyastuti, 2007). Dalam suatu reaksi enzimatik,

setelah suhu optimal tercapai laju reaksi akan turun (Tortora et al., 2000). Penurunan aktivitas

protease terjadi karena perubahan struktur enzim yang akan menyebabkan penurunan laju


katalitik. Akibat perubahan struktur enzim, sisi aktif enzim mengalami perubahan bentuk

sehingga tidak dapat digunakan secara baik dalam mengikat substrat (Sofro, 1990).

Hasil uji isolat menunjukkan suhu berpengaruh sangat nyata (á ≤ 0.05) terhadap

isolat SP1, SP2 dan SP3. Pada perlakuan suhu 60ºC, aktivitas protease SP1 berbeda sangat

nyata dengan perlakuan suhu 50ºC, 55ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC dan 80ºC. Sedangkan perlakuan

suhu 50ºC, aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 70ºC. Perlakuan

suhu 55ºC aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan suhu 65ºC dan suhu 75ºC aktivitas

protease tidak berbeda nyata dengan suhu 80ºC.

Pada perlakuan suhu 65ºC aktivitas protease SP2 berbeda sangat nyata dengan

perlakuan suhu 50ºC, 55ºC, 60ºC, 70ºC, 75ºC dan 80ºC. Sedangkan perlakuan suhu 50ºC

aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 80ºC, aktivitas protease pada

perlakuan suhu 55ºC tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 75ºC, dan perlakuan suhu

60ºC aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 70ºC.

Aktivitas protease isolat SP3 pada perlakuan suhu 65ºC berbeda sangat nyata dengan

perlakuan suhu 50ºC, 55ºC, 60ºC, 70ºC, 75ºC dan 80ºC. Sedangkan aktivitas protease pada

perlakuan suhu 50ºC tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 80ºC, aktivitas protease

pada perlakuan suhu 55ºC tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 75ºC dan perlakuan

suhu 60ºC aktivitas proteasenya, tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 70ºC. Aktivitas

protease kasar untuk tiap isolat pada perlakuan suhu berbeda ditunjukkan pada Gambar 5.


0

2

4

6

8

10

12

50 55 60 65 70 75 80

Suhu Inkubasi (oC)

Akt

ivit

as P

rote

ase

(Uni

t)

SP1 SP2 SP3

Gambar 5. Aktivitas protease kasar isolat SP1, SP2 dan SP3 pada suhu inkubasi yang berbeda

Pada SP1 terlihat aktivitas protease kasar optimum pada suhu 60ºC. Aktivitas

protease menurun pada suhu 65ºC dan hampir kehilangan aktivitas protease pada suhu 80ºC.

Hal ini menunjukkan pada perlakuan suhu 60ºC, enzim bekerja paling aktif, karena suhu

alami pertumbuhan bakteri adalah 59ºC. Penurunan aktivitas enzim proteolitik setelah suhu

optimum, karena denaturasi termal dari substrat ataupun enzimnya. Denaturasi akibat suhu

tinggi biasanya irreversible karena ikatan-ikatan lemah penting pada protein enzim rusak

sehingga mempengaruhi konformasi tiga dimensinya yang akan menyebabkan penurunan

aktivitas enzim (Purnomo & Purwanto, 2003). Karena suhu alami SP1 adalah 59ºC dan suhu

optimum pada perlakuan adalah 60ºC, diduga pada suhu 59ºC sesuai dengan suhu alaminya

aktivitas protease SP1 dapat lebih tinggi dari suhu optimum (60ºC ) pada perlakuan.


Aktivitas protease kasar optimum pada SP2 pada perlakuan berada pada suhu 65ºC.

Hal ini sesuai dengan suhu pertumbuhan alami bakteri yaitu 65ºC dan menunjukkan enzim

paling aktif bekerja pada suhu 65ºC. Aktivitasnya menurun pada perlakuan suhu 70ºC.

Pada SP3 aktivitas protease kasar optimum berada pada perlakuan suhu 65ºC, yang

menunjukkan pada suhu 65ºC enzim paling aktif bekerja. Hal ini karena suhu pertumbuhan

alami bakteri adalah 66ºC, meskipun ada kemungkinan pada suhu 66ºC aktivitas protease

dapat lebih tinggi dari suhu optimum (65ºC) pada perlakuan. Aktivitasnya menurun pada

suhu 70ºC, yang menunjukkan perlakuan suhu 70ºC menyebabkan terjadinya denaturasi

termal pada substrat dan enzim (Purnomo & Purwanto, 2003).

Perlakuan suhu 80ºC menunjukkan aktivitas protease kasar terendah pada SP2 dan

SP3, tidak dapat ditetapkan sebagai aktvitas protease minimum. Hal ini karena masih

terdapatnya aktivitas protease pada suhu tersebut.

4.5. Hasil pengujian Aktivitas Protease Pemekatan Dengan 70% Amonium Sulfat dari Tiga Isolat Termofilik Terpilih

Untuk mendapatkan enzim protease yang bebas dari molekul lainnya, dilakukan

pengendapan protein dengan menggunakan amonium sulfat 70%. Pengendapan (pemekatan)

protein dengan amonium sulfat adalah metode yang sering digunakan karena memiliki daya

larut yang tinggi di dalam air, relatif murah, dan kestabilan protein di dalam amonium sulfat

(2M-3M) tahan bertahun-tahun. Supernatan yang mengandung protease dapat dipekatkan

dengan dialisis pada suhu dingin (4ºC) untuk meningkatkan konsentrasi enzim dan

menghilangkan senyawa lain (molekul kecil) yang terkandung dalam media atau produk

metabolit lainnya (Naiola & Widhyastuti, 2007). Pada tahap dialisis, garam yang berlebih di


dalam sampel dapat dihilangkan dengan cara menempatkan sampel di dalam kantung

(membran) dialisis semipermeabel yang direndam dalam larutan buffer. Molekul yang

berukuran kecil akan keluar melalui membran sedangkan molekul yang besar akan tertahan di

dalam membran dialisis (Harris, 1989).

Hasil pengujian aktivitas protease pemekatan dengan 70% amonium sulfat SP1, SP2

dan SP3 dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Aktivitas Protease Pemekatan Dengan 70% Amonium Sulfat pada Tiga Isolat Terpilih Secara Kuantitatif


Ket: Notasi berdasarkan hasil uji Duncan, angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama untuk masing-masing isolat artinya tidak berbeda nyata

Hasil uji statistik sidik ragam yang digunakan untuk semua isolat (Lampiran 15)

menunjukkan suhu berpengaruh sangat nyata (á ≤ 0.05) terhadap SP1, SP2 dan SP3.

Aktivitas protease terlihat meningkat seiring dengan peningkatan suhu inkubasi, dan setelah

suhu optimum aktivitas menurun.

Isolat Suhu

Kadar protein (µg/ml)

Substrat terhidrolisis

(µg/ml)

Aktivitas (Unit)

Aktivitas spesifik (Unit/

mg protein) Notasi 0.05

SP1 50 ºC 308.669 69.496 6.94 22.30 c

55 ºC 289.620 88.536 8.85 29.91 b 60 ºC 272.224 105.941 10.59 40.14 a 65 ºC 282.631 94.534 9.45 31.85 b 70 ºC 317.510 60.655 6.06 19.10 c 75º C 341.122 37.043 3.70 11.23 d 80 ºC 363.365 14.803 1.48 4.29 d




Pada SP1 perlakuan suhu 60ºC menunjukkan aktivitas protease berbeda sangat nyata

dengan perlakuan suhu 50ºC, 55ºC, 65ºC, 70ºC, 75ºC dan 80ºC. Hal ini karena suhu alami

pertumbuhan bakteri adalah 59ºC, sehingga perlakuan suhu 60ºC memperlihatkan aktivitas

protease optimal pada percobaan. Kemungkinan pada suhu 59ºC enzim dapat bekerja lebih

aktif karena sesuai dengan suhu pertumbuhan alami bakteri. Perlakuan suhu 50ºC aktivitas

proteasenya tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 70ºC, perlakuan suhu 55ºC aktivitas

proteasenya tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 65ºC dan perlakuan suhu 75ºC

aktivitas proteasenya tidak berbeda nyata dengan suhu 80ºC. Hal ini karena perlakuan suhu

dibawah suhu aktivitas protease optimum, suhu optimasi yang dibutuhkan enzim untuk

bekerja secara optimal, tidak mencukupi sehingga enzim dapat bekerja optimal. Sedangkan

suhu di atas aktivitas protease optimum, kemungkinan protease maupun substrat mengalami

denaturasi termal sehingga aktivitas protease menurun (Poedjiadi, 1994)

Perlakuan suhu 65ºC aktivitas protease berbeda sangat nyata dengan perlakuan suhu

50ºC, 55ºC, 60ºC, 70ºC, 75ºC dan 80ºC terhadap isolat SP2. Hal ini karena pertumbuhan

alami bakteri pada suhu 65ºC, sehingga pada perlakuan suhu 65ºC protease bekeja paling

aktif. Perlakuan suhu 50ºC aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan suhu 80ºC,

perlakuan suhu 55ºC aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 75ºC dan

perlakuan suhu 60ºC aktivitas protease tidak berbeda nyata dengan perlakuan suhu 70ºC.

Perlakuan suhu 65ºC aktivitas protease SP3 berbeda sangat nyata dengan perlakuan

suhu 50ºC, 55ºC, 60ºC, 70ºC, 75ºC dan 80ºC. Hal ini karena suhu pertumbuhan alami bakteri

adalah 66ºC sehingga pada perlakuan suhu 65ºC aktivitas protease optimum. Meskipun ada

kemungkinan pada suhu 66ºC aktivitas protease lebih tinggi dari aktivitas protease optimum

(65ºC) perlakuan. Sedangkan perlakuan suhu 50ºC aktivitas protease tidak berbeda nyata


dengan suhu 80ºC, aktivitas protease pada perlakuan suhu 55ºC tidak berbeda nyata dengan

suhu 75ºC dan aktivitas protease pada perlakuan suhu 60ºC tidak berbeda nyata dengan

perlakuan suhu 70ºC.

Aktivitas enzim bergantung pada struktur dan konformasi molekul protein yang

tepat. Terjadinya perubahan struktur dan konformasi misalnya oleh perubahan suhu, pH dan

ion-ion logam, menyebabkan aktivitas biokimia protease akan berkurang atau terdenaturasi.

Tiap enzim mempunyai mempunyai suhu dan pH tertentu yang menyebabkan aktivitasnya

mencapai keadaan optimum (Poedjadi & Supriyanti,1994). Masih terdapatnya aktivitas

protease setelah suhu optimum kemungkinan protein mengalami koagulasi atau terkonjugasi

dengan molekul lain sehingga aktivitas enzim berkurang.

Aktivitas protease pemekatan dengan 70% ammonium sulfat untuk tiap isolat pada

perlakuan suhu berbeda ditunjukkan pada Gambar 6.


0

2

4

6

8

10

12

14

50 55 60 65 70 75 80

Suhu Inkubasi (oC)

Akt

ivit

as P

rote

ase

(Uni

t)

SP1 SP2 SP3

Gambar 6. Aktivitas protease pemekatan dengan 70% amonium sulfat isolat SP1, SP2 dan SP3 pada suhu inkubasi yang berbeda

Dari Gambar 6 dapat dilihat aktivitas optimum protease pemekatan dengan 70%

ammonium sulfat pada SP1 berada pada perlakuan suhu 60ºC sebesar 10.59 Unit. Aktivitas

protease menurun pada perlakuan suhu 70ºC dan hampir kehilangan aktivitas protease pada

suhu 80ºC dengan nilai aktivitas protease sebesar 1.84 Unit. Aktivitas protease pemekatan

dengan 70% amonium sulfat optimum pada SP2 dan SP3 berada pada perlakuan suhu 65ºC.

Nilai aktivitas optimum protease pemekatan dengan 70% amonium sulfat pada SP2 sebesar

10.92 Unit, dan nilai aktivitas protease pemekatan dengan 70% amonium sulfat SP3 sebesar

12.34 Unit. Pada suhu 80ºC aktivitas protease SP2 sebesar 4.77 Unit dan aktivitas protease

SP3 sebesar 6.01 Unit. Aktivitas protease terendah pada SP2 dan SP3 terjadi pada suhu 80°C

dalam variasi suhu yang diujikan, namun tidak dapat ditetapkan sebagai aktvitas protease

minimum karena masih terdapatnya aktivitas protease pada suhu tersebut.


Dari data pada Tabel 5. dan Tabel 6. terlihat adanya peningkatan aktifitas protease

pemekatan dengan 70% amonium sulfat diikuti dengan peningkatan aktivitas spesifik dari

protease kasar pada masing masing isolat. Pada isolat SP1 aktivitas protease kasar optimum

sebesar 9.50 unit, aktifitas spesifiknya sebesar 17.31 U/mg protein dan aktivitas optimum

protease dengan pemekatan 70% sebesar 10.59 unit, aktifitas spesifiknya sebesar 40.14 U/mg

protein. Terdapat peningkatan aktifitas protease setelah pemekatan sebesar 1.09 unit.

Pada suhu optimum aktivitas protease kasar isolat SP2 sebesar 9.93 unit, aktifitas

spesifiknya sebesar 14.94 U/mg protein dan aktivitas optimum protease pemekatan dengan

70% ammonium sulfat sebesar 10.92 unit, aktifitas spesifiknya sebesar 55.07 U/mg protein.

Terdapat peningkatan aktifitas protease setelah pemekatan sebesar 0.99 unit.

Pada isolat SP3 aktivitas protease kasar optimum sebesar 11.16 unit, aktifitas

spesifiknya sebesar 25.25 U/mg protein dan aktivitas optimum protease dengan pemekatan

70% sebesar 12.34 unit, aktifitas spesifiknya sebesar 99.47 U/mg protein. Terdapat

peningkatan aktifitas protease setelah pemekatan dengan 70% amonium sulfat sebesar 1.19

unit.

Pada proses purifikasi parsial dengan amonium sulfat sebagian besar protease pada

SP1, SP2 dan SP3 terendapkan dengan 70% amonium sulfat saturasi. Data dari Tabel 5.

menunjukkan kadar protein enzim setelah dialisis menurun dibandingkan kadar protein enzim

kasar (Tabel 4). Hasil pengujian mengindikasikan peningkatan nilai aktivitas spesifik

protease SP1, SP2 dan SP3 hasil dialisis (Tabel 6) dari aktivitas protease enzim kasar (Tabel

5). Hal ini menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa�senyawa pengotor dan protein-

protein lain (protein non fungsional) sudah dipisahkan. Peningkatan aktivitas protease setelah


pengendapan relatif rendah rata-rata sebesar 1 unit. Hal ini karena proses pemekatan dengan

amonium suftat hanyalah tahap awal pemurnian enzim, kemungkinan masih terdapat sisa

kontaminan enzim yang menyebabkan enzim tidak dapat bekerja maksimal. Menurut Fuad et

al (2004) masalah ini mungkin terjadi karena proses pengendapan yang kurang sempurna

seperti waktu yang kurang lama dan kualitas amonium sulfat yang digunakan (kualitas

teknis). Pemurnian enzim protease yang dilakukan secara pengendapan dengan menggunakan

amonium sulfat dan alkohol, merupakan cara pemurnian paling sederhana dan harganya

relatif sangat murah dibandingkan cara pemurnian lainnya, meskipun tingkat kemurnian

enzim yang diperoleh sangat rendah (Naiola & Widhyastuti, 2007).

Kemungkinan lain diduga adalah pH yang kurang optimal terhadap aktivitas enzim.

Kestabilan enzim terhadap suhu dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti struktur tiga

dimensi, komposisi asam amino, jembatan disulfida, pH, dan senyawa penstabil lain sepeti

ion logam (Daniel, 1996). Nilai aktivitas protease bervariasi dengan adanya perubahan pH

disebabkan pengaruh perubahan ionisasi enzim, substrat atau kompleks substrat (Fuad et al,

2004). Suhu optimum dan pH optimum aktivitas protease termostabil dari Bacillus yang

pernah diteliti antara lain 60°C dan pH 11 pada sp.NG312 ( Jasvir et al, 1999), 60-70°C dan

pH 10 pada Bacillus sp. (Gupta et al, 1999), 80°C dengan penambahan ion Ca2+ pH 8-10

Pada Bacillus sp. PS719 (Towatana et al, 1999), 70°C dan pH 10 dari galur mutan M-3-20

berasal dari Bacillus sp. No 58 (Fuad, 2002) dan 80°C pH 9 dari B. thermoglucosidasius AF-

01 (Fuad et al, 2004).


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap isolasi dan uji aktivitas protease termofil

kasar dan protease termofil pemekatan dengan 70% amonium sulfat, dapat disimpulkan

sebagai berikut :

a Diperoleh 3 isolat dengan zona bening terbesar yaitu SP1 dengan nilai aktifitas

kualitatif 5.81 mm, SP2 dengan nilai aktivitas kualitatif 5.96 mm dan SP3 dengan

nilai aktivitas kualitatif 5.22 mm yang berpotensi menghasilkan enzim proteolitik

termofil.

b. Hasil pengujian aktivitas protease kasar menunjukkan bahwa isolat SP3 (dari kolam I

suhu 66ºC, pH 6,5-7), memiliki aktivitas protease tertinggi secara kuantitatif dengan

nilai aktivitas protease optimum sebesar 11.6 Unit. Aktivitas optimum protease kasar

isolat SP2 (dari kolam II suhu 65ºC, pH 6,5-7) sebesar 14.94 Unit. Aktivitas protease

terendah dihasilkan oleh isolat SP1 (dari kolam III suhu 59ºC, pH 6,5-7) dengan nilai

aktivitas protease optimum sebesar 9.50 Unit.

c. Hasil pengujian aktivitas protease pemekatan dengan 70% amonium sulfat isolat SP1

sebesar 10.59 Unit dengan suhu optimum 60ºC. Suhu optimum SP2 dan SP3 berada

pada suhu 65ºC dengan nilai aktivitas optimum protease SP2 sebesar 10.92 Unit, dan

SP3 sebesar 12.34 Unit.


d. Hasil karakterisasi ketiga isolat menunjukkan hasil yang bervariasi secara biokimia

dan morfologi koloni.

e. Hasil pengukuran aktivitas protease pemekatan dengan 70% amonium sulfat

menunjukkan peningkatan aktivitas protease rata-rata sebesar 1 Unit pada tiap isolat

terpilih.

5.2. Saran

Berdasarkan hasil penelitian terhadap bakteri proteolitik termofil dari Sipoholon maka perlu

dilakukan penelitian lanjutan untuk perlakuan pH di atas 6,5, sehingga dapat ditetapkan pH

optimum dan faktor fisiko-kimia lain yang memungkinkan kondisi pertumbuhan optimal

bakteri, produksi protease optimal dan aktivitas optimal protease termofil.


DAFTAR PUSTAKA

Adams MWW. 1999. The biochemical diversity of life near and above 100 degrees C in marine environments. Appl. Microbiol. 85: 108S-117S.

Akhdiya A. 2003. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Bogor.

Apriyantono A, Fardiaz D, Sedarnawati NLP &.Budiyanto. S 1989. Analisis Pangan. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. IPB.

Barrett A J. 1994. Classification of Peptides. In Proteolytic Enzymes: Serine and Cysteine Peptidases. Academic Press, Inc. San Diego, CA.

Bauer MW, Halio SB & Kelly RM. 1996. Proteases and Glycosyl Hydrolases from Hyperthermophilic Microorganisms. Adv Protein Chem. 48: 271-310.

Brock T D. 1986. Thermophiles: General, Molecular, and Applied Microbiology. Departement of Bacteriology 1550 Linden Drive University of Winconsin-Madison, Winconsin 53705 USA. Publ. John Willey & Son.

Cappuccino JG & Sherman N. 1983. Microbiology a Laboratory Manual. 4th ed. Menlo park: Addison-Wesley Publ. Company, Inc.

Daniel RM 1996. The upper limits of enzyme thermal stability. Enzyme Microbial Tech. 19: 74-79

Darwis A.A & Sukara E. 1990. Teknologi Mikrobial. Depdikbud Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Pusat antar Universitas Bioteknologi. IPB.

Eichler J. 2001. Biotechnological uses of archaeal extremozymes. Research Review Paper. Departement Of Life Sciences, Ben Gurion University, P.O.box 653, Beersheva 84105, Israel.

Enggel J, Meryandini A & Natalia L. 2004. Karakterisasi protease ekstraseleler Clostridium bifermentans R14-1-b. Mikrobiol. Indonesia. 9-12.

Fitri, Siti GS, Mubarik NR & Taruni SP. 2005. Produksi dan karakterisasi protease ekstraseluler Bacillus sp. galur BKU-10 yang diisolasi dari saluran pencernaan Epinephelus tauvina. Mikrobiol. Indonesia. 10: 9-13


Fuad AM. 2002. Protease Alkali Ekstrasellular dari Isolat Bacillus sp No. 58: Perbaikan Galur untuk Peningkatan Produksi Protease Melalui Mutagenesis. Abstrak Seminar Bioteknologi dan Kongres II Konsorsium Bioteknologi Indonesia Bandung, 10-11 Okt 2002.

Fuad AM, Rahmawati R & Natalia. L. 2004. Produksi dan Karakterisasi Parsial Alkalitermostabil Bacillus thermoglucosidasius AF-1. Mikrobiol. Indonesia.

Fujiwara N, Masui A & Imanaka T. 1993. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. Journal of Biotechnology. 30: 245-256.

Jasvir S, Navdeep G, Gina D & Debendra KS. 1999. Studies on alkalin protease produced by Bacillus sp. NG312. Appl. Biochem. Biotechnol 76: 57-63.

Glover T & Mitchel K. 2002. An introduction to biostastic: McGraw-Hill Companies, Inc. New York.

Gomes J & Steiner W. 2004. The biocatalytic potential of extremophiles. Food. Technol. Biotechnol. 42: 223-235.

Gunarto L, Susilowati, Rosmimik ND, Saraswati R & Simanungkalit RDM. 2002. Koleksi, karakterisasi dan preservasi mikroba penyubur tanah dan perombak bahan organik. Hayati. 9: 84-95.

Gupta R, Gupta K, Saxena RK & Khan S. 1999. Bleach-satble alkalin protease from Bacillus sp. J. Biotechnol Letters. 1: 135-138.

Gupta R., Beg QK & Lorenz P. 2002. Bacterial alkalin proteases: Molecular approach and industrial application. Mini review. Springer-Verlag 2002. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 15-32.

Headon DR & Walsh G. 1994. The Introduction of Enzymes. Biotechnol Adv. 12: 635-646.

Hicks PM. 1998. Genetic, biochemical, and biophysical characteristics of intracellular proteases from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. PhD dissertation, North Carolina State University.

Huang G, Ying T, Huo P & Jiang J. 2006. Purification and characterization of a protease from thermophilic Bacillus strain HS08. African. Biotechnol. 5: 2433-2438.

Kalisz HK. 1988. Microbial Proteinases. Advances in Biochemical Engineering & Biotechnology. 36: 1-65.


Karlson EN, Mamo G & Turner P. 2007. Potential and utilization of thermophiles and thermostable enzymes in biorefining. Review. Microbial Cell Factory.10: 1475-2859.

Lay BW. 1994. Analisa Mikroba di Laboratorium. PT. Grafindo Persada. Jakarta.

Lehninger AL. 1998. Biochemistry. Academic Press. New York.

Lestari P. 2000. Ulasan: Eksplorasi enzim termostabil dari mikrob termofil. Hayati. 7: 0854-8587.

Lubis R. 2003. Penentuan aktivitas enzim protease dari ekstrak jeroan ikan mas (Cyprinus carpio L) terhadap hidrolisa bovin serum albumin (Skripsi). Departemen Kimia FMIPA USU.

Madigan MT & Marrs BL. 1997. Extremophiles. Sci Am. vol. 276.

Malikhah I. 1995. Karakterisasi protease Bacillus pumilus Y3 yang diisolasi dari limbah cair tahu. (Skripsi). Bogor. IPB.

Martins MLL & Nascimento WCA. 2006. Studies on stability of protease from Bacillus sp. and its compatibility with commercial detergent. Brazilia. Microbiol. 37: 307-311.

Martins MLL, Delatorre ABS & Camila R. 2007. Effect of culture conditions on the production of extracellular protease by thermophilic Bacillus sp. and some properties of the enzymatic activity. Brazilia. Microbiol. 38: 253-258.

Meyrath J & Volavsek U.1975. Production of Microbioal Enzyme. In Food Processing edited by Reed G. Academic Press. New York.

Moran LA, Scrimgeour KG, Horton HR, Ochs RS. & Rawn JD.1994. Biochemistry. Second edit, Prentice Hall, Inc. Upper Saddle River.

Naiola E & Widhyastuti N. 2002. Isolasi, seleksi dan optimasi produksi protease dari beberapa isolat bakteri. Hayati. 6: 467-473.

Naiola E & Widhyastuti N. 2007. Semi purifikasi dan karakterisasi enzim protease Bacillis. Sp. Berk. Penel. Hayati. 13: 51-56.

Ngili Y. 2009. Biokimia: Struktur & Fungsi Biomolekul. Graha Ilmu. Yogyakarta.

Pratiwi ST. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.

Pudjiadi A & Supriyanti FM.1994. Dasar-Dasar Biokimia. UI.


Radzicka A & Wolfenden R. 1995. A Proficient Enzyme. Science. 267: 90-93.

Rakshit SK & Haki GD. 2003. Development in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioproces Technology Program, Asian Institute of Technology (AIT), P.O.Box 4, Klong Luang, Pathumthani 12120, Thailand.

Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS & Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Rev. Sci Am. 62 : 597-635.

Sadikin M. 2002. Biokimia. Widya Medika. Jakarta.

Sciraldi C, Giuliano M & Rosa DM. 2002. Persvectives on biotechnological application of archaea. Departement of experimental Medicine, Section of Biotechnology and molecular Biology, Faculty of medicine, II University of Naples,Via Costantinopoli 16, 80138 Naples, Italy.

Setter KO. 1996. Exstremophiles and their adaptation to hot environments. Minireview. FEBS Letters. 425: 22-23.

Shahib MN. 1992. Pemahaman seluk beluk biokimia dan penerapan enzim. Citra Aditya Bakti. Bandung.

Sofro ASM. 1990. Biokimia. Pusat antar universitas pangan dan gizi. UGM. Yogyakarta.

Stanbury PF & Whitaker A. 1985. Principles of fermentation technology. Pergamon Press. New York.

Sudjana MA. 1986. Metoda Statistik. 4 ed. Tarsito. Bandung.

Suhartono MT. 1989. Enzim dan bioteknologi. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.

Sundaram TK. 1986. Physiology and Growth of Thermophilic Bacteria. In Brock TD (ed). Thermophiles: General, Molecular, and Applied Microbiology. Departement of Bacteriology 1550 Linden Drive University of Winconsin-Madison, Winconsin 53705 USA. Publ. John Willey & Son.

Tortora JG, Funkle BR & Case CL. 2001. Microbiology an introduction 7th edition. Addison Wesley Longman inc.

Towatana NH, Poinupong A & Suntinalaret P. 1999. Purification an charactyerization of extracellular protease from alkaliphilic an thermophillic Bacillus sp. PS719. Biosci Bioeng 87: 581-587.


Van der burg B. 2003. Extremophiles as a source for novel enzymes. Curr Opinion in Microbiol. 6: 213-318.

Vieille C & Zeikus JG. 1998. Thermozymes: Biotechnology and structure-function relationships. Extremophiles. 2: 179-183.

Ward OP. 1985. Proteinase. In Fogarty WM (ed). Microbial and enzyme biotechnology. New York: Appl. Science Publ. 251-290.

Widhyastuti N & Dewi RM. 2001. Isolasi bakteri proteolitik dan optimasi produksi protease. Laporan Teknik Proyek Inventarisasi dan Karakterisasi Sumberdaya Hayati. Pusat penelitian Biologi. LIPI.

Witarto AB. 2001. Protein Engineering : Perannya dalam bioindustri dan prospeknya di Indonesia. Seminar on-Air. Sinergy Forum � PPI Tokyo Institute of Technology.

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 : Komposisi Pereaksi C metode Lowry, Komposisi Media Agar Susu

Skim dan Media Produksi

a. Komposisi Pereaksi C menurut Lubis (2003) : Pereaksi A (2 gr Na2CO3 dilarutkan

dalam NaOH 0,1N hingga batas 100 ml dalam labu takar), Pereaksi B (0,5 gr

CuSO4.5H2O dilarutkan dalam Natrium Kalium Tartrat 1 % hingga batas 100 ml

dalam labu takar) dan Pereaksi C (50 ml Pereaksi A ditambah 1 ml Pereaksi B dan

dihomogenkan).

b. Komposisi media agar susu skim Widhyastuti & Dewi (2001) yang dimodifikasi,

yaitu media agar susu skim (PH 6,5) mengandung 20 gr susu skim dan 24 agar per

liter. 20 gr susu skim dilarutkan dalam 400 ml aquadest kemudian dipasteurisasi

(700C selama 1 jam ). 24 agar ditambah 600 ml aquadest, disterilkan dan dicampur

dengan larutan susu waktu masih panas.

c. Komposisi media produksi menurut Fitri et al., (2005) yang dimodifikasi, yaitu

Nutrien Broth ( peptone dari daging 0,5% dan ekstrak daging 0,3%, 0,8% tripton

1%, glukosa 0,5% dan CaCl2 0,1 %).

d. Pembuatan Mc Farland

Untuk pembuatan Mc Farland bahan yang digunakan: BaCl2 (1,175% 10/v.

BaCl2.2H2O) dan H2SO4 (1% v/v). Prosedur kerja yang dilakukan ádalah sebagai

berikut ; ditambahkan 0,05 ml dari 0,048 M BaCl2 (1,175% 10/v. BaCl2.2H2O) pada

99,5 ml dari 0,35 N H2SO4 (1% v/v). (Lorian,Victor N.D. 1980)


Lampiran 2. Alur kerja isolasi dan seleksi bakteri proteolitik termofilik

Dimasukkan ke dalam botol Winkler

steril diambil 0,1 ml

Disebarkan ke dalam media selektif agar susu

skim

Diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 48 jam

Diamati zona proteolitik

Diamati warna, tepi, elevasi dan bentuk koloni

Dibuat biakan murni pada media agar susu

skim

Sampel air panas

Isolat proteolitik

Biakan Murni


Lampiran 3. Alur kerja uji kemampuan aktivitas kualitatif proteolitik isolat

Ditumbuhkan pada media agar selektif

Diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 48 jam

Diukur diameter zona bening dengan diameter

koloni bakteri

Nilai aktivitas proteolitik secara nisbi

Biakan Murni


Lampiran 4: Alur Kerja Karakterisasi Sifat Morfologi dan Biokimia Isofat

Karakterisasi

Morfologi

Pewarnaan

Uji Biokimia Sederhana

Isolat Terpilih

Uji Motilitas Uji Sitrat Uji Gelatin Uji Katalase

Bentuk Sel


Lampiran 5 : Alur Kerja Produksi Protease

Diinokulasikan sebanyak 1ml ke dalam 20

ml medium cair modifikasi cair pH 6,5

Diinkubasi di atas shaker pada suhu 65 ºC

selama 72 jam dengan kecepatan 150 rpm

Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm

selama 20 menit pada suhu ruang

supernatan

Residu

Starter

Hasil Pengamatan

Isolat bakteri

(10 8 sel/ml)



Lampiran 6 : Alur Kerja Pemekatan Enzim Protease 70%

Dimasukkan ke dalam beaker glass

Ditambahkan ammonium sulfat sedikit demi

sedikit sambil diaduk pada suhu 5 ºC

Ditambahkan 2-3 ml EDTA 0.5 mM dan

didiamkan selama 1 jam.

Disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm

selama ±15 menit pada suhu ruang

Ditambahkan 2-3 ml buffer fosfat 50 mM pH

6,5.

Dimasukkan dalam membrane dialysis.

Dimasukkan dalam beaker glass yang berisi

buffer fosfat50 mM pH 6,5.sambil diaduk

pada suhu 5 ºC

Diganti buffer fosfat 50 mM pH 6,5 pada 30

menit 1 jam pertama dan 30 menit 1 jam

berikutnya.

Protease Kasar

Protease Kasar

supernatan

Residu


Didialisis selama 24 jam pada suhu 5ºC

Dialisat


Lampiran 7 : Alur Kerja Penentuan Kadar Protein Enzim Proteolitik

Diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung

reaksi

Ditambahkan 5 ml pereaksi C

Dihomogenkan dan didiamkan selama 10 menit

pada suhu kamar

Ditambahkan 0,5 pereaksi D


Dimasukkan ke dalam kuvet spektofotometer

Diukur absorbansi pada panjang gelombang

maksimum yang diperoleh

Nilai Absorbansi

Larutan

Protease Pekat 70%


Ditentukan kadar protein dengan cara

membandingkan nilai absorbansi dengan kurva

standar yang diperoleh

Lampiran 8 : Alur Kerja Penentuan panjang Gelombang Maksimum

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

Ditambahkan 5 ml pereaksi C dan

dihomogenkan

Didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang

Ditambahkan 0,5 ml reagrn Folin


pada suhu ruang

Dimasukkan ke dalam kuvet spektrofotometer

Diukur pada panjang gelombang 700 � 800 nm

Hasil

1 ml larutan (BSA 300 µg/ml)

Nilai Absorbansi



Lampiran 9 : Alur Kerja Pembuatan Kurva Standar BSA

Dilarutkan dalam aquadest dengan

konsentrasi 0, 60, 120, 180, 240, 300

µ/ml.

Masing � masing diambil 1 ml dan

dimasukkan ke dakam tabung reaksi

Ditambahkan 5 ml pereaksi C dan

dihomogenkan

Didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang.

Ditambahkan 0,5 ml pereaksi D dan

dihomogenkan


Diukur nilai absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum

Ditentukan persamaan garis regresi kurva

standar protein dengan metode Least Square

Kurva standar BSA

Larutan

Bovine Serum Albumin

Nilai Absorbansi


Lampiran 10 : Alur Kerja Pengujian Aktivitas Protease

Ditambahkan 0,5 ml substrat (BSA 300 ug/ml)

Diinkubasi pada suhu 50 °C, 55°C, 60°C, 65

ºC,70 ºC, 75 ºC, 80 ºC selama 10 menit

Didinginkan pada suhu 5ºC selama 10 menit

untuk menghentikan reaksi enzim

Ditambah 5 ml pereaksi C dan dihomogenkan


Ditambahkan 0,5 ml pereaksi D dan

dihomogenkan

didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang

diukur nilai absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum yang diperoleh

diukur kadar proteinnya

Larutan

0,5 ml buffer posfat (pH 6,5) + 0,5 ml larutan enzim

Nilai Absorbansi

Kadar protein akhir reaksi


dikurangi dengan kadar enzim protein kasar

diukur aktivitas enzim dengan membagi ∆ (S)

dengan ∆t

Lampiran 11 : Penentuan Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA) Dengan Menggunakan Spektrofotometer ë=760 nm

No Konsentrasi BSA ug/ml Absorbansi

1. 0 0

2. 60.000 0.060

3. 120.00 0.123

4. 180.00 0.176

5. 240.00 0.226

6. 300.00 0.258

Lampiran 12 : Penentuan Persamaan Garis Regresi Larutan Standar Protein BSA Untuk Berbagai Konsentrasi Dengan menggunakan Spektofotometer ë=760 nm

No. X Y X2 Y2 XY

Nilai aktivitas enzim

Kadar protein sisa substrat


1. 0 0 0 0 0

2. 60.000 0.060 3600 0.0036 3.6

3. 120.00 0.123 14400 0.0151 14.76

4. 180.00 0.176 32400 0.0309 31.68

5. 240.00 0.226 57600 0.0510 54.24

6. 300.00 0.258 90.000 0.0665 77.4

n=6 ÓX=900

= 150

ÓY=0.843

= 0.1405

Ó X2=198.000 Ó Y2=0.1671 ÓXY= 181.68

Dimana :

X= Konsentrasi BSA

Y= Absorbansi rata-rata

Persamaan Garis Regresi: Y = a + bX

b = 22

b = 2900000.1986

843.090068,1816

= 81000188000

7.75808.1090

b = 0.00087666666


a = b

= 0.1450 � 0,00087666666 150

a = 0.00901

Y = a + bX maka :

r =

2

22

2

r =

6

843.01671.0

6

150000.198

6

1405.015068,181

22

r =0.9905

Y= 0.00901 + 0.00087666666X


Lampiran 13. Gambar grafik kurva standar BSA yang Diperoleh

Kurva Standar BSA

Lampiran 14: Contoh Perhitungan Kadar Protein Enzim dan Substrat Terhidrolisis

Contoh perhitungan kadar protein enzim protease kasar dan substrat yang terhidrolisis pada

sample Sp.2 : U1:

1 ml enzim dengan absorbansi 0,9996

Y = 0.009 + 0.00087666666X

r = 0.9905

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150 200 250 300 350

Konsentrasi BSA ( µg/ml )

Absorbansi

Y=0.009+0.00087666666X Linear (Y=0.009+0.00087666666X)


0,9996 = 0,009 + 0,00087666666X

X = 1129,962 µg/ml.

Maka kadar protein enzim protease kasar adalah 1192,962 µg/ml.

Untuk kadar protein 0.5ml protease kasar (564.981 µg) + 0.5 substrat (BSA 300 µg/ml)

diperoleh absorbansi 0,5525

Y = 0.009 + 0.00087666666X

0,5525 = 0.009 + 0, 00087666666X

X = 619,692 µg/ml.

Maka sisa substrat = (enzim + substrat) �enzim

= 619,962 � 564,981

= 54,980 µg

0.5 ml substrat (BSA 300 µg/ml) = 150 µg

Banyaknya substrat terhidrolisis = 150 � 54,980

= 95,019 µg


Aktivitas enzim (V) = s

s

= 10

019,95

= 9,501 Unit

Lampiran 15. Daftar Sidik Ragam dan Uji Duncan Tiga Isolat Terbaik Bakteri Proteolitik Termofilik Sipoholon

a. Daftar Ragam Aktifitas Proteolitik Kasar Bakteri Termofil SP1 Terhadap

Suhu Secara Kuantitatif

Ftabel Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah Fhitung

0,05 0,01

Perlakuan

6

12395.1

2065.849

Galat

14 414.5366 29.609

69.76** 2.85 4.28

Total 20 12809.634

Keterangan ** = berbeda sangat nyata

KK = 9.50%


b. Daftar Ragam Aktifitas Proteolitik Kasar Bakteri Termofil SP2 Terhadap



Derajat bebas

Jumlah kuadrat


0,05 0,01

Perlakuan

6

6932.22

1155.37

Galat

14 226.33 16.167

71.464** 2.85 4.28

Total 20 7158.55

Keterangan ** = berbeda sangat nyata KK = 6.39%


c. Daftar Ragam Aktifitas Proteolitik Kasar Bakteri Termofil SP3 Terhadap



Derajat bebas

Jumlah kuadrat


0,05 0,01

Perlakuan

6

6176.08

1029.34

Galat

14 278.10 19.864

51.818** 2.85 4.28

Total 20 6454.187


d. Daftar Ragam Aktifitas Proteolitik Pemekatan dengan 70% ammonium sulfat Bakteri Termofil SP1 Terhadap Suhu Secara Kuantitatif


Derajat bebas

Jumlah kuadrat


0,05 0,01

Perlakuan

6

12851.63

2135.482

Galat

14 500.989 37.045

57.645** 2.85 4.28

Total 20 13331.526



e. Daftar Ragam Aktifitas Proteolitik Pemekatan dengan 70ammonium sulfat Bakteri Termofil SP2 Terhadap Suhu Secara Kuantitatif


Derajat bebas

Jumlah kuadrat


0,05 0,01

Perlakuan

6

5538.313

923.0521

Galat

14 281.9236 20.1374

45.837** 2.85 4.28

Total 20 5820.236


f. Daftar Ragam Aktifitas Proteolitik Pemekatan dengan 70% ammonium sulfat Bakteri Termofil SP3 Terhadap Suhu Secara Kuantitatif


Derajat bebas

Jumlah kuadrat


0,05 0,01

Perlakuan

6

6131.051

1054.914

Galat 14 97.374 6.955

146.914** 2.85 4.28


Total 20 6228.389


Lampiran 16. Gambar pengambilan sampel dari sumber air panas Sipoholon

Kolam I


Kolam II

Lampiran 17. Gambar Uji Biokimia Tiga Isolat Terpilih


Uji Gelatin

Uji SCA Uji SIM



Documents

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS PROTEASE TERMOFILIK