-
John A. Ryan, Ph.D.Corning IncorporatedLife SciencesTower 2, 4th
floor900 Chelmsford St.Lowel, MA 01851, USA
SommaireIntroduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 1
Que signifie culture de cellules et de tissus? . . . . 1
Comment obtenir des cultures cellulaires? . . . . . 2
quoi ressemblent les cellules cultives? . . . . . . 3
Quelques problmes auxquels sont confronts lescellules en culture
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Comment savoir si des cellules en culture sont"heureuses"? . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
quoi servent les cultures de cellules? . . . . . . . . 6
Rfrences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 7
IntroductionLa culture cellulaire est devenue un des
outilsmajeurs utiliss aujourd'hui dans les sciences de lavie. Ce
guide est conu pour servir d'introductionbasique la culture de
cellules animales. Il convientparfaitement aux personnels de
laboratoire quiutilisent cette technique pour la premire fois,
ainsiqu' ceux qui collaborent avec les chercheurs en cul-ture
cellulaire et qui dsirent mieux comprendre lesconcepts cls et la
terminologie de ce domaine pas-sionnant et en pleine expansion.
Que signifie culture de cellules et de tissus?Culture de tissus
est le terme gnral englobant leprlvement de cellules, tissus ou
organes d'un ani-mal ou d'une plante et leur placement ultrieur
dansun environnement artificiel conduisant leur crois-sance. Cet
environnement est gnralement consti-tu de rcipients de cultures
appropris en verre ouen plastique contenant un milieu liquide ou
semi-solide qui apporte les nutriments essentiels lasurvie et la
croissance. La culture d'organes entiersou de fragments d'organes
intacts dans l'intentiond'tudier leur fonctionnement ou leur
dveloppe-ment prolongs est appele Culture d'organe.Lorsque les
cellules sont retires des fragments d'or-gane avant, ou pendant la
culture, interrompant ainsileurs relations normales avec les
cellules voisines, onappelle cela Culture de cellules.
Introduction la culture de cellules animalesBulletin
Technique
Life Sciences
-
Bien que la culture de cellules animales aitt russie pour la
premire fois par RossHarrison en 1907, il a fallu attendre la
findes annes 1940 et le dbut des annes 1950pour voir apparatre
plusieurs dveloppe-ments qui ont rendu la culture
cellulairelargement disponible comme outil pour lesscientifiques.
Tout d'abord, le dveloppe-ment des antibiotiques a permis
d'viterplus facilement de nombreux problmes decontamination qui
empoisonnaientjusqu'alors les essais de culture. Ensuite sesont
dveloppes des techniques, telles quel'utilisation de trypsine pour
retirer les cel-lules des rcipients de culture, ncessairespour
obtenir des lignes cellulaires cultivesen continu (comme les
cellules HeLa).Enfin, l'aide de ces lignes cellulaires,
lesscientifiques ont pu dvelopper des milieuxde culture cellulaire
standardiss chimique-ment dfinis facilitant normment la cul-ture de
cellules. Ces trois points combinsont permis de nombreux
autreschercheurs d'utiliser la culture de cellules,tissus et
organes dans leur recherche.
Pendant les annes 1960 et 1970, la com-mercialisation de cette
technologie a eu unimpact supplmentaire sur la culture cellu-laire,
impact qui continue de nos jours. Lesentreprises, comme Corning,
ont com-menc dvelopper et vendre des produitspour la culture en
verre et en plastique usage unique, et ont amlior les matriauxet
produits de filtration, les milieux de cul-ture tissulaire liquides
et en poudre, et leshottes flux laminaire. Le rsultat de toutceci
et des autres dveloppements tech-nologiques continus a t une
augmentationcroissante du nombre de laboratoires etd'industries
utilisant aujourd'hui les culturesde cellules.
Comment obtenir des culturescellulaires?Culture primaireLorsque
les cellules sont prleves chirurgi-calement d'un organisme et
places dans unenvironnement de culture appropri, ellesse fixent, se
divisent et prolifrent. C'est cequ'on appelle une Culture primaire.
Ilexiste deux mthodes de base pour fairecela. Dans la premire, pour
les Culturesd'explants, de petits morceaux de tissussont fixs sur
un rcipient de culture enverre ou en plastique trait et baigns
dansdu milieu de culture. Aprs quelques jours,des cellules
individuelles se dplacent del'explant de tissus vers la surface du
rcipi-ent de culture ou le substrat o elles com-
mencent se diviser et prolifrer. Dans ladeuxime, mthode la plus
gnralementutilise, ce processus est acclr enajoutant des enzymes de
digestion (pro-tolytiques), telles que la trypsine ou la
col-lagnase, des fragments de tissus pour dis-soudre le ciment
maintenant les cellulesensembles. Ceci cre une suspension de
cel-lules individuelles qui sont places dans desrcipients de
culture contenant un milieu deculture pour les laisser pousser et
se diviser.Cette mthode est appele Dissociationenzymatique.
RepiquageLorsque les cellules dans le rcipient de cul-ture
primaire ont pouss et couvert tout lesubstrat de culture
disponible, elles doiventtre repiques pour leur donner de la
placeafin davoir une croissance continue. Cela sefait gnralement en
les retirant aussi dli-catement que possible du substrat avec
desenzymes. Ces enzymes sont similaires celles utilises pour
obtenir la culture pri-maire et sont utilises pour rompre
lesliaisons protiques liant les cellules au sub-strat. Certaines
lignes cellulaires peuventtre rcoltes en grattant dlicatement
lescellules du fond du rcipient de culture.Une fois libres, les
cellules en suspensionpeuvent tre divises et places dans denouveaux
rcipients de culture.
Lorsqu'un surplus de cellules est disponible,il est possible de
les traiter avec des agentscryoprotecteurs adapts, comme
ledimthylsulfoxyde (DMSO) ou le glycrol,
2
Des informationssupplmentaires sur laterminologie
etl'utilisation des culturescellulaires sontconsultables sur le
siteInternet de la Society forIn Vitro Biology l'adresse
www.sivb.org/edu_terminology.asp.
Digrer avecdes enzymesproteolytiques
Broyer oudcouper
Prleverles tissus
Mettreen culture
Explants de prpuce humainfixs et colors la surfaced'une bote de
culture de 150mm. Les explants ont tcultivs pendant environ
deuxsemaines. Deux des neufexplants (coins infrieursgauche et
droit) n'ont paspouss. Les explants restantsmontrent une
bonnecroissance. Chaque carrmesure environ 2 cm.
Culture primaire de poissonPoeciliopsis lucida. Lesembryons ont
t broys etdissocis avec une solution detrypsine. Ces cellules ont
tcultives pendant environ 1semaine et ont form unecouche unique
confluence.
Dissociation enzymatique
-
de les congeler dlicatement puis de lesstocker des tempratures
cryogniques (endessous de 130C) jusqu' ce qu'on en aitbesoin. La
thorie et les techniques de cry-oconservation des cellules sont
reprises dansle bulletin technique Corning : Guidegnral de
conservation cryognique de cul-tures de cellules animales (rf.
9).
Acheter ou emprunterUne alternative la constitution de
culturespar culture primaire consiste acheter descultures
cellulaires constitues auprs d'or-ganisations telles que l'American
TypeCulture Collection (ATCC; www.atcc.org)ou le Coriell Institute
for Medical Research(arginine.umdnj.edu). Ces deux organisa-tions
but non lucratif proposent deslignes cellulaires de trs bonne
qualit quisont soigneusement testes afin dassurerl'authenticit des
cellules.
Plus frquemment, les chercheurs obtien-nent (empruntent) des
lignes cellulairesauprs d'autres laboratoires. Cette pratiques'tant
rpandue, elle a un inconvnientmajeur. Il y a une forte probabilit
pour queles cellules obtenues de cette faon ne don-nent pas de
cultures saines et utiles. Ceci estgnralement d aux mlanges
prcdentsou aux contaminations par d'autres lignescellulaires, ou
est le rsultat de contamina-tions par des micro-organismes tels que
lesmycoplasmes, bactries, champignons oulevures. Ces problmes sont
traits endtails dans un bulletin technique Corning :Comprendre et
grer les contaminationsdes cultures cellulaires (rf 7).
quoi ressemblent les cellulescultives? Une fois en culture, les
cellules montrentune grande diversit de
comportements,caractristiques et formes. Certainesparmi les plus
communes sont dcrites ci-dessous. John Paul en donne des dtailsdans
le chapitre 3 de Culture de cellules etde tissus (rf. 3).
Systmes de culture cellulaireDeux systmes de base de culture
cellulairesont utiliss pour cultiver des cellules. Ilssont
essentiellement bass sur l'aptitude descellules pousser attaches
sur un substratde verre ou de plastique trait (systmes deculture
mono-couche) ou flotter libre-ment dans le milieu de culture
(systmesde culture en suspension).
Les cultures mono-couches sont gnrale-ment cultives dans des
botes, flacons T,flacons roulants ou plaques multipuits
traits pour la culture de cellules, le choix sefaisant en
fonction du nombre de cellulesncessaires, de la nature de
l'environnementde culture, du cot et des prfrences
per-sonnelles.
Les cultures en suspension sont gnrale-ment cultives:
1. dans des flacons Spinner (rotationmagntique) ou dans des
Erlenmeyersagits dans lesquels les cellules sontactivement gardes
en suspension dans lemilieu;
2. dans des rcipients de culturestationnaires comme les flacons
T et lesbouteilles dans lesquels, bien qu'elles nesoient pas
maintenues en agitation, lescellules sont incapables de se
fixerfermement au substrat.
De nombreuses lignes cellulaires, surtoutcelles drives de tissus
normaux, sont con-sidres comme adhrentes, c'est direqu'elles
poussent uniquement lorsqu'ellesadhrent un substrat leur
convenant.
Certaines lignes cellulaires qui ne sont plusconsidres comme
normales (frquemmentdsignes par cellules transformes) sontsouvent
capables de crotre soit fixes unsubstrat soit en flottant librement
en sus-pension ; elles sont en suspension. Deplus, certaines
cellules normales, commecelles trouves dans le sang, ne se fixent
pasnormalement aux substrats et poussent tou-jours en
suspension.
Types de cellules Les cellules cultives sont gnralementdcrites
d'aprs leur morphologie (forme etapparence) ou leurs
caractristiques fonc-tionnelles. Il existe trois morphologies
debase:
1. type pithlial: ces cellules sont attaches un substrat et
apparaissent plates et deforme polygonale.
2. type lymphoblaste: ces cellules ne sefixent pas normalement
un substratmais restent en suspension avec uneforme sphrique.
3. type fibroblaste: ces cellules sontattaches un substrat et
apparaissentallonges et bipolaires.
Il faut garder l'esprit que les conditions deculture jouent un
rle important dans ladtermination de la forme et que de nom-breuses
cultures de cellules sont capables deprsenter plusieurs
morphologies.
l'aide de techniques de fusion cellulaire, ilest galement
possible d'obtenir des cellules
3
Les tubes cryognes Corningsont disponibles en diffrentestailles
pour congeler lescellules pour une conservation long terme.
Les botes de culture Corningsont disponibles dansdiffrentes
tailles et formespour cultiver des cellulesadhrentes.
Les flacons de culture Corningsont utiliss pour faire pousserdes
cellules adhrentes.
Les flacons Spinner Corningsont utiliss pour faire pousserdes
cellules non adhrentes ensuspension.
-
4hybrides en fusionnant des cellulesprovenant de deux parents
diffrents. Ellespeuvent prsenter des caractristiques del'un des
parents ou des deux parents. Cettetechnique a t utilise en 1975
pour crerdes cellules capables de produire des anti-corps
monoclonaux taills sur mesure. Cescellules hybrides (appeles
hybridomes)sont formes par la fusion de deux cellulesdiffrentes
mais apparentes. La premireest un lymphocyte driv de la rate
capablede produire l'anticorps dsir. La deuximeest une cellule de
mylome (un type de cel-lule cancreuse) se divisant rapidement etqui
possde la machinerie ncessaire pourfabriquer des anticorps, mais
n'est pas pro-gramme pour produire d'anticorps. Leshybridomes
rsultants peuvent produire degrandes quantits de l'anticorps dsir.
Cesanticorps, appels anticorps monoclonauxdu fait de leur puret,
ont de nombreusesapplications cliniques, diagnostics et
indus-trielles importantes avec une valeur annuellede bien plus
d'un milliard d'euros.
Caractristiques fonctionnelles Les caractristiques des cellules
cultivessont le rsultat de leur origine (foie, cur,etc.) et de leur
facult d'adaptation aux con-ditions de culture. Des marqueurs
biochim-iques peuvent tre utiliss pour dterminersi les cellules
sont toujours porteuses desfonctions spcialises qui sont les leurs
invivo (par exemple, des cellules hpatiquessecrtant de l'albumine).
Des marqueursmorphologiques ou ultra-structuraux peu-vent galement
tre examins (par exempleles cellules du c?ur battantes). Ces
carac-tristiques sont frquemment perdues oumodifies en consquence
du placement descellules dans un environnement artificiel.Certaines
lignes cellulaires finissent pararrter de se diviser et montrer des
signesde vieillissement. Ces lignes sont appelesfinies. D'autres
lignes cellulaires sont, oudeviennent, immortelles ; elles peuvent
con-tinuer se diviser indfiniment et sontappeles lignes cellulaires
continues.Lorsqu'une ligne cellulaire finie "normale"devient
immortelle, elle a subit un change-ment fondamental irrversible
ou"transformation". Ceci peut se produirespontanment ou peut tre
provoqu enutilisant intentionnellement des produits,des
rayonnements ou des virus. Les cellulestransformes poussent
gnralement plusvite et plus facilement, peuvent souventprsenter des
chromosomes supplmen-taires ou anormaux et peuvent frquemmenttre
cultives en suspension. Les cellulespossdant le nombre normal de
chromo-
somes sont appeles cellules diplodes;celles qui possdent un
nombre de chromo-somes diffrents de la norme sont
appelesaneuplodes. Si les cellules forment destumeurs lorsqu'elles
sont injectes desanimaux, elles sont considres commetant
noplasiquement transformes.
Quelques problmes auxquels sontconfrontes les cellules en
culture?viter les contaminations Il existe deux types principaux de
contami-nation des cultures cellulaires : chimique etbiologique. La
contamination chimique estla plus difficile dtecter car elle est
due des agents, tels que les endotoxines, plastifi-ants, ions
mtalliques ou traces de dsinfec-tants chimiques qui sont
invisibles. Leseffets sur la culture cellulaire associs
auxendotoxines sont dcrits en dtails dans lebulletin technique :
Endotoxines et culturecellulaire (rf. 10). Les
contaminantsbiologiques sous forme de levures croissance rapide,
bactries et champignonsont un effet visible sur la culture
(change-ment de turbidit ou de pH du milieu) etsont ainsi plus
faciles dtecter (surtout enabsence d'antibiotiques dans le milieu
deculture). Cependant, deux autres formes decontaminations
biologiques, lesmycoplasmes et les virus, ne sont pas faciles
dtecter visuellement et ncessitentgnralement des mthodes de
dtectionspcifiques.
Il existe deux conditions majeures pourviter les contaminations.
Premirement, unentranement correct la mise en uvre detechniques de
bonne asepsie de la part de lapersonne qui cultive les
cellules.Deuximement, un quipement, matriel enplastique, en verre
et des milieux correcte-ment conus, entretenus et
striliss.L'utilisation soigneuse et slective
(limite)d'antibiotiques conus pour tre utiliss enculture cellulaire
peut galement aider viter les pertes de cultures conscutives une
contamination biologique. Ces conceptssont repris en dtails dans un
bulletin tech-nique Corning : Comprendre et grer lescontaminations
en culture cellulaire (rf. 7).
Trouver un environnement "heureux"Pour les personnes cultivant
des cellules, unenvironnement "heureux" permet aux cel-lules de
faire plus que juste survivre en cul-ture. Gnralement, cela
signifie un envi-ronnement qui, au minimum, permet auxcellules
d'augmenter en nombre par divi-sion cellulaire (mitose). Mieux,
lorsque les
Microphotographie d'une infectionde faible niveau par des
levuresdans une ligne cellulaire de foie(PLHC-1, ATCC # CRL-2406).
Lescellules de levure bourgeonnantessont visibles en plusieurs
endroits(flches). ce faible niveau decontamination, aucune
turbiditdu milieu n'est visible ; cependant,en absence
d'antibiotiques, lemilieu de culture deviendraprobablement trouble
en unejourne.
Ligne cellulaire de type pithlial(Cl-9) drive de foie de rat.
Lescellules mitotiques indiquent quecette culture est en
croissanceactive.
Cellules de type fibroblaste 3T3drives d'embryons de souris.
Cellules CHO-K1 - une lignecellulaire continue
(transforme)largement utilise drive de tissusd'ovaires de hamsters
chinoisadultes en 1957.
-
5conditions sont idales, certaines cellulescultives expriment
leur "bonheur" pourleur environnement en ralisant in
vivod'importantes fonctions physiologiques oubiochimiques, telle
que la contraction mus-culaire ou la scrtion d'hormones et
d'en-zymes. Pour obtenir cet environnement, ilest important de
fournir aux cellules la tem-prature approprie, un bon substrat
pourla fixation et le milieu de culture correct. Laplupart des
problmes associs au "bien-tre" des cellules sont dcrits dans le
bul-letin technique de Corning : Guide gnralpour l'identification
et la rsolution desproblmes courants d'adhrence et de crois-sance
de cultures cellulaires (rf. 8).
La temprature est gnralement rgle surla mme valeur que la
temprature cor-porelle de l'hte partir duquel les cellulesont t
obtenues. Avec les vertbrs sangfroid, une plage de temprature de 18
25C est parfaite ; la plupart des cellules demammifre ncessitent 36
37C. Cetteplage de temprature est gnralementmaintenue l'aide
d'tuves soigneusementtalonnes et frquemment contrles.
Les cellules adhrentes ncessitent gale-ment un bon substrat pour
la fixation et lacroissance. Le verre et les plastiques
sp-cialement traits (pour rendre hydrophileou mouillable la surface
normalementhydrophobe des plastiques) sont les sub-strats les plus
communment utiliss.Cependant, des facteurs d'adhrence,comme le
collagne, la glatine, la fibronec-tine et la laminine, peuvent tre
utilisspour recouvrir les substrats afin d'amliorerla croissance et
la fonction de cellules nor-males drives de cerveau, vaisseaux
san-guins, rein, foie, peau, etc. Souvent les cel-lules adhrentes
normales fonctionnentmieux si elles sont cultives sur une
surfacepermable ou poreuse. Cela leur permet dese polariser (avoir
un haut et un bas tra-vers lesquels des lments peuvent entrer
etsortir de la cellule) comme elles le font dansle corps. Les
inserts Transwell sont desrcipients Corning avec des supports
per-mables base de membrane qui permet-tent ces cellules de
dvelopper une polar-it et d'acqurir la capacit d'exprimer
desfonctions spciales telles que le transport.De nombreuses
cellules spcialises ne peu-vent tre vraiment "heureuses"
(fonctionnernormalement) que si elles sont cultives surun substrat
poreux dans un milieu sanssrum avec un mlange appropri de fac-teurs
de croissance et d'adhrence.
Les cellules peuvent galement tre cul-
tives en suspension sur des microbilles enverre, plastique,
polyacrylamide etmolcules de dextran rticules. Cette tech-nique a t
utilise pour permettre aux cel-lules adhrentes de pousser dans des
sys-tmes de culture en suspension et sedveloppe de faon importante
dans la fab-rication de produits biologiques cellulaires.
Le milieu de culture est le facteur le plusimportant et le plus
complexe grer pourrendre les cellules "heureuses". En plus
desatisfaire aux besoins nutritionnels des cel-lules, le milieu de
culture doit galementpossder tous les facteurs de
croissancencessaires, rguler le pH et l'osmolarit, etfournir les
gaz essentiels (O2 et CO2). Lapartie "nourriture" du milieu de
culture estconstitue d'acides amins, vitamines, selsminraux et
glucides. Ils permettent auxcellules de construire de nouvelles
protineset autres composants essentiels la crois-sance et aux
fonctions et apportent l'nergiencessaire au mtabolisme. Pour plus
d'in-formations sur ce sujet, consulter l'article :Construction of
Tissue Culture Media(Composition des milieux de culture de
tissus)par C. Waymouth dans Growth, Nutrition andMetabolism of
Cells in Culture, Volume 1(1972, rf. 5).
Les facteurs de croissance et hormonesaident rguler et contrler
la vitesse decroissance des cellules et leurs caractris-tiques
fonctionnelles. Au lieu de les ajouterdirectement au milieu, ils
sont souventajouts de manire non dfinie par adjonc-tion de 5 20% de
diffrents srums ani-maux au milieu. Malheureusement, les typeset
concentrations de ces facteurs dans lesrum varient considrablement
d'un lot l'autre. Ceci pose souvent des problmes decontrle de la
croissance et des fonctions.Pour cultiver des cellules
fonctionnellesnormales, les srums sont souvent rem-placs par des
facteurs de croissance spci-fiques.
Le milieu rgule galement la plage de pHde la culture et tamponne
les cellules pourempcher les modifications trop rapides depH.
Gnralement, un tampon base deCO2 - bicarbonate ou un tampon
orga-nique, comme l'HEPES, est utilis pouraider conserver le pH du
milieu dans uneplage comprise entre 7,0 et 7,4 suivant letype de
cellules cultives. En cas d'utilisa-tion d'un tampon CO2
bicarbonate, il estncessaire de rguler la quantit de CO2dissous
dans le milieu. Cela se fait gnrale-ment en utilisant une tuve
rgulant le
Les supports permables Transwellde Corning sont utiliss
pourtudier la migration et le transportcellulaires.
Conditionsenvironnementales debase pour des cellules"heureuses":
Temprature contrle Bon substrat pour
l'adhrence des cellules Milieu et tuve
appropris maintenantl'osmolalit et le pHcorrects
Les cultures en suspension et surmicro-supports peuvent
trecultives dans des flacons Spinneren verre.
Cellules CHO-K1 cultives sur unsupport de microbilles.
-
CO2rgle pour fournir une atmosphrecomprise entre 2% et 10% de
CO2 (pourles tampons bass sur les sels de Earle).Cependant,
certains milieux utilisent untampon CO2 bicarbonate (pour les
tam-pons bass sur les sels de Hanks) ne ncessi-tant pas de CO2
supplmentaire, mais cetampon doit tre utilis dans des
rcipientsscells (pas de bote ni de plaque). Pour plusd'informations
sur ce sujet, consulter l'arti-cle : The Gaseous Environment of the
Cellin Culture (L'environnement gazeux descellules en culture) par
W.F. McLimansdans Growth, Nutrition and Metabolism ofCells in
Culture (1972, Rf. 5).
Enfin, l' osmolarit (pression osmotique) dumilieu de culture est
importante car elleaide rguler le flux de substances quientrent et
sortent de la cellule. Elle est con-trle par l'addition ou la
soustraction desels dans le milieu de culture. L'vaporationdu
milieu de culture dans les rcipients deculture ouverts (botes,
etc.) conduit rapide-ment une augmentation de l'osmolarit,entranant
un stress, une dgradation ou lamort des cellules. Pour les systmes
de cul-ture ouverts (non scells), les tuves niveau d'humidit lev
sont essentiellespour rduire l'vaporation. Pour plus
d'in-formations, consulter l'article de C.Waymouth : Osmolality of
MammalianBlood and of Media for Culture of Mam-malian Cells
(Osmolarit du sang desmammifres et des milieux de culture
decellules de mammifres) (1970, Rf. 6).
Comment savoir si des cellulescultives sont
"heureuses"?L'valuation de l'tat de sant gnral ou du"bonheur" d'une
culture est gnralementbase sur quatre caractristiques
cellulairesimportantes : morphologie, vitesse de crois-sance,
efficacit d'talement et expressionde fonctions particulires. Ces
mmes car-actristiques sont galement largement util-ises pour valuer
les rsultats exprimen-taux.
La morphologie ou forme de la cellule estla plus facile
dterminer mais elle estgalement souvent la moins utile. Bien quedes
changements de morphologie soientfrquemment observs en culture, il
est sou-vent difficile de lier ces observations auxconditions qui
les ont provoqus. C'estgalement une caractristique trs difficile
quantifier ou mesurer avec prcision.
Souvent, le premier signe que quelquechose tourne mal dans une
culture apparat
l'examen microscopique des cellules quimet en vidence des images
d'adhrence oude croissance cellulaires dgrades ouinhabituelles. En
cas de suspicion de prob-lme, une coloration des rcipients de
cul-ture au violet de mthyle ou avec un autrecolorant histologique
simple peut montrerdes images de croissance indiquant un prob-lme.
Ces problmes de croissance sontdcrits en dtails dans le bulletin
techniqueCorning : Guide gnral d'identification etde rsolution des
problmes courants d'ad-hrence et de croissance de cellules en
cul-ture (Rf. 8).
Le comptage cellulaire et autres mthodesd'estimation du nombre
de cellules, d'unautre ct, permettent de dterminer lavitesse de
croissance, qui est sensible auxchangements majeurs de
l'environnementde la culture. Ceci permet de concevoir
desexpriences permettant de dterminer quelensemble de conditions
(milieu de culture,substrat, srum, ustensiles en plastique)
estmeilleur pour les cellules, c'est dire lesconditions induisant
la meilleure vitesse decroissance. Ces mmes techniques ou
simi-laires peuvent tre utilises pour mesurer lasurvie ou la mort
cellulaires et sont souventutilises pour les tests de cytotoxicit
invitro.
L'efficacit d'ensemencement est unemthode de test dans laquelle
de petitesquantits de cellules (20 200) sont placesdans un rcipient
de culture ; le nombre decolonies qu'elles forment est ensuite
comp-t. Le pourcentage de cellules formant unecolonie est une
mesure de la survie, alorsque la taille de la colonie est une
mesure dela vitesse de croissance. Cette mthode detest est
similaire l'analyse de la vitesse decroissance dans son application
mais estplus sensible aux petites variations des con-ditions de
culture.
La dernire caractristique, l'expressiondes fonctions spcialises,
est gnrale-ment la plus difficile observer et mesur-er. Il convient
gnralement d'utiliser desdosages et tests biochimiques
etimmunologiques. Alors que les cellules cul-tives peuvent trs bien
pousser en condi-tions suboptimales, les fonctions
hautementspcialises ncessitent gnralement desconditions de culture
proches de la perfec-tion et sont souvent rapidement perdueslorsque
les cellules sont places en culture.
6
L'examen de la morphologiede ces flacons roulants
colors(contenant des fibroblasteshumains MRC-5) est unebonne faon
de vrifier si lescellules sont "heureuses". Labouteille de gauche a
tourntrop vite, entranant une mau-vaise adhrence et une mau-vaise
croissance et des cellulestrs "malheureuses".
Une colonie de cellules defibroblastes humains fixes
etcolores.
Les plaques Transwell-24 HTS sontutilises pour les tests de
toxicitet les tudes de transport demdicaments.
-
7 quoi servent les cultures decellules?La culture cellulaire est
devenue un desoutils majeurs utiliss en biologie cellulaireet
molculaire. Certains des domainesimportants dans lesquels la
culture cellulairejoue actuellement un rle majeur sontbrivement
dcrits ci-dessous:
Systmes de modlesLes cultures cellulaires fournissent de
bonssystmes de modles pour tudier 1) labiologie et la biochimie
cellulaires de base,2) les interactions entre les cellules et
lesagents induisant des maladies, 3) les effetsdes mdicaments sur
les cellules, 4) leprocessus et le dclenchement du vieillisse-ment
et 5) les tudes nutritionnelles.
Tests de toxicitLes cellules en culture sont largement util-ises
seules ou en conjonction avec des testssur les animaux pour tudier
les effets denouveaux mdicaments, cosmtiques et pro-duits chimiques
sur la survie et la croissanced'une grande varit de types de
cellules.Les cultures de cellules drives du foie etdes reins sont
particulirement importantes.
Recherche sur le cancerLes cellules normales et les cellules
can-creuses pouvant toutes deux tre cultives,les diffrences de base
entre elles peuventtre tudies de prs. De plus, il est possi-ble, en
utilisant des produits chimiques,virus et rayonnements, de
convertir les cel-lules cultives normales en cellules can-creuses.
Ceci permet ainsi d'tudier lesmcanismes conduisant ce
changement.Les cellules cancreuses cultives serventgalement de
systme de test pour dter-miner les mdicaments et mthodes adap-tes
pour dtruire slectivement certainstypes de cancers.
VirologieUne des utilisations les plus prcoces et lesplus
importantes des cultures cellulaires at la rplication de virus dans
les culturescellulaires ( la place des animaux) pour lesutiliser
dans la production de vaccins. Lescultures cellulaires sont
galement large-ment utilises en dtection clinique etisolement de
virus, ainsi qu'en recherchefondamentale pour tudier comment ils
sedveloppent et infectent les organismes.
La cellule comme usine de productionAlors que les cellules
cultives peuvent treutilises pour produire de nombreux pro-
duits importants, trois domaines se sontmontrs plus intressants.
Le premier est laproduction grande chelle de virus pourune
utilisation en production de vaccins.Ceci comprend les vaccins
contre la polio,la rage, la varicelle, l'hpatite B et la rouge-ole.
Le deuxime est la production grandechelle de cellules gntiquement
modifiespour produire des protines prsentant unevaleur mdicale ou
commerciale. Ceci inclutles anticorps monoclonaux, l'insuline,
leshormones, etc. Le troisime est l'utilisationde cellules en
remplacement de tissus etd'organes. La peau artificielle utilise
pourle traitement de brlures et d'ulcres est lepremier produit
disponible dans le com-merce. Toutefois, des tests sont en cours
surdes organes artificiels comme le pancras, lefoie et les reins.
Une rserve potentielle decellules et tissus de remplacement
peutressortir de travaux en cours raliss avecdes cellules souches
adultes et embryon-naires. Ce sont des cellules qui ont lepotentiel
de se diffrencier en plusieurstypes cellulaires diffrents.
Apprendre contrler le dveloppement de ces cellulesreprsente un
espoir pour de nouvellesapproches de traitements pour une
largevarit de pathologies.
Conseil gntiqueL'amniocentse, une technique diagnos-tique qui
permet aux mdecins de prleverdes cellules ftales sur des
femmesenceintes et de les cultiver, a mis la dispo-sition des
mdecins un outil important pourle diagnostic prcoce d'affections
f?tales.Ces cellules peuvent tre examines pourrechercher des
anomalies dans leurs chro-mosomes et gnes l'aide de
caryotypes,chromosome painting et autres techniquesmolculaires.
Gnie gntiqueLa capacit de transfecter ou de reprogram-mer les
cellules en culture par du nouveaumatriel gntique (ADN et gnes) a
fourniun outil prcieux aux biologistes molcu-laires dsireux
d'tudier les effets cellulairesde l'expression de ces gnes
(nouvelles pro-tines). Ces techniques peuvent galementtre utilises
pour produire ces nouvellesprotines en grande quantit dans les
cel-lules en culture pour les tudier. Les cel-lules d'insectes sont
largement utilisescomme usines cellulaires miniatures pourexprimer
des quantits substantielles deprotines qu'elles fabriquent aprs
avoir tinfectes par des baculovirus gntiquementmodifis.
7
Les flacons roulants Corningsont largement utiliss pourproduire
des vaccinsantiviraux.
Le systme de bioracteurCellCube de Corning estidal pour la
production demasse de cellulesadhrentes.
Les flacons ErlenmeyersCorning sont souvent utilisspour cultiver
des cellulesd'insectes en suspension.
Les microplaques Corning sontlargement utilises pour lestests de
criblage de molcules.
-
Thrapie gniqueLa capacit de modifier gntiquement descellules a
galement conduit leur utilisa-tion en thrapie gnique. Les cellules
peu-vent tre prleves sur un patient souffrantd'une dficience dans
une gne fonctionnel,et le gne manquant ou endommag peutalors tre
remplac. Les cellules sont cul-tives un moment puis rimplantes dans
lepatient. Une approche alternative consiste placer le gne manquant
dans un vecteurviral puis "d'infecter" le patient par le virusen
esprant que le gne manquant seraexprim dans les cellules du
patient.
Dcouverte de mdicamentsL'importance des tests bass sur des
cellulesa considrablement augment dans l'indus-trie pharmaceutique,
pas seulement pour lestests de cytotoxicit, mais galement pour
lecriblage haut dbit (HTS) de composspouvant prsenter une utilit
potentiellecomme mdicament. l'origine, ces testsde culture
cellulaire taient raliss dans desplaques de 96 puits, mais les
plaques de 384et 1536 puits sont maintenant de plus enplus
utilises.
Rfrences1. Culture of Animal Cells, A Manual of
Basic Technique (1994) R. Ian Freshney,3rd edition, Alan R.
Liss, Inc., New York.
2. Methods in Enzymology: Cell Culture,Vol. 58, (1979) W. B.
Jacoby and I. H.Pasten, eds. Academic Press, New York.
3. Cell and Tissue Culture (1975) John Paul, 5th edition,
Churchill Livingstone,Edinburgh.
4. Animal Cell Culture Methods, Volume 57,(1998) J. Mather and
D. Barnes, eds.Methods in Cell Biology, Academic Press, San Diego,
1998.
5. Growth, Nutrition and Metabolism ofCells in Culture (1972) G.
H. Rothblatand V. J. Cristofalo eds. Volumes 1-3 byAcademic Press,
New York.
6. Osmolality of Mammalian Blood and ofMedia for Culture of
Mammalian Cells,(1970) C. Waymouth, In Vitro, Volume 6:109-127.
7. Understanding and Managing CellCulture Contamination Corning
LifeSciences Technical Bulletin. This is avail-able on the Corning
Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences.
8. General Guide for Identifying andCorrecting Common Cell
CultureGrowth and Attachment ProblemsCorning Life Sciences
Technical Bulletin.This is available on the Corning LifeSciences
web site at www.corning.com/lifesciences.
9. General Guide for Cryogenically StoringAnimal Cell Cultures
Corning LifeSciences Technical Bulletin. This is avail-able on the
Corning Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences.
10. Endotoxins and Cell Culture Corning LifeSciences Technical
Bulletin. This is avail-able on the Corning Life Sciences web site
at www.corning.com/lifesciences.
Pour plus d'informations sur les produits ou techniques,
consulter notre site Internetwww.corning.com/lifesciences ou
appeler le 1.800.492.1110. En dehors des tats-Unis,appeler le
978.635.2200.
Corning, CellCube et Transwell sont des marques commerciales
dposes de Corning Incorporated, Corning, New York, USA.Discovering
Beyond Imagination, le logo de la flamme de la dcouverte,
CellSTACK, Snapwell et Netwell sont des marques commerciales
deCorning Incorporated, Corning, NY, USA.Corning Incorporated, One
Riverfront Plaza, Corning, New York 14831-0001, USA
2
007
Cor
ning
Inc
orpo
rate
d
Pri
nted
in E
.U.
6/05
KP
5M
C
LS-
AN
-042
Fra
nai
s R
EV
1Corning IncorporatedLife SciencesTower 2, 4th Floor900
Chelmsford St.Lowell, MA 01851t 800.492.1110t 978.442.2200f
978.442.2476
www.corning.com/lifesciences
Distributeursdans le monde
A S I E / P A C I F I Q U EAustraliet 61 2-9416-0492f 61
2-9416-0493Chinet 86 21-3222-4666f 86 21-6288-1575Hong Kongt
852-2807-2723f 852-2807-2152
Indet 91-124-235 7850f 91-124-401 0207 Japont 81 (0) 3-3586
1996/1997f 81 (0) 3-3586 1291/1292Coret 82 2-796-9500f 82
2-796-9300Singapourt 65 6733-6511f 65 6861-2913
Taiwant 886 2-2716-0338f 886 2-2716-0339
E U R O P EFrancet 0800 916 882f 0800 918 636Allemagnet 0800 101
1153f 0800 101 2427Royaume-Unit 0800 376 8660f 0800 279 1117
Pays-Bas & tous lesautres pays europenst 31 (0) 20 659 60
51f 31 (0) 20 659 76 73
A M R I Q U E L A T I N EBrsilt (55-11) 3089-7419f (55-11)
3167-0700Mxiquet (52-81) 8158-8400f (52-81) 8313-8589
