Interaction between the Signaling Molecules WNT7aInteraction between the Signaling Molecules WNT7aand SHH during Vertebrate Limb Development:and SHH during Vertebrate Limb Development:

Dorsal Signals Regulate Anteroposterior PatterningDorsal Signals Regulate Anteroposterior Patterning

Interaction entre les molécules de signalisation Wnt7a et Shh Interaction entre les molécules de signalisation Wnt7a et Shh durant le développement du membre chez les vertébrés :durant le développement du membre chez les vertébrés :

La signalisation dorsal régule la polarisation antéropostérieurLa signalisation dorsal régule la polarisation antéropostérieur

Yingzi Yang and Lee Niswander

Master 1 BE Guyot Vincent

TD BD Rame Marion

Introduction

•Description générale de la formation du membre

•3 centres sont nécessaires à la croissance et à la formation du membre :

La crête au niveau de l’ectoderme apical

Le mésenchyme postérieur

L’ectoderme dorsal

•Ces 3 centres contrôlent les 3 axes de polarité:

-La crête contrôle la croissance proximodistale.

-Le mésenchyme postérieur proximal est impliqué dans la polarité antéropostérieure; cette région du mésenchyme est donc appelée « zone of polarizing activity » (ZPA).

-L’ectoderme dorsal contrôle la polarité dorsoventrale.

Introduction

•2 gènes participent à la signalisation:

Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) -crête

Sonic Hedgehog (Shh) -mésenchyme postérieur (ZPA)

•Les patrons poximodistal et antéropostérieur sont mutuellement dépendants:

une boucle de rétroaction positive est présente entre FGF4 et Shh.

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But de l’article

Montrer que l’interaction entre FGF4 et Shh peut contrôler la localisation de la ZPA.

Démontrer que le signal dorsoventral est requis pour l’expression de Shh, la formation des structures postérieures et la polarité antéropostérieur; et que ce signal est constitué par Wnt7a.

Les auteurs proposent un modèle dans lequel la croissance et la formation du membre sont régis par l’interaction des signaux provenant des trois axes.

FGF4, Shh et la ZPA

Matériel et méthode : Hybridation in situ

-PCR

-Sous-clonage dans le vecteur

-Amplification

-Récupération des plasmides

-Transcription in vitro avec de la digoxygénine

-Révélation

But : Fonction de FGF4

FGF4, Shh et la ZPA

antérieur

postérieur

proximal distal -L’ARN de Shh présent dans le mésenchyme postérieur

-Restriction de Shh à la partie distale.

Stade 24 Stade 26

Stade 20

L’expression de Shh est perdue dans les cellules perdant l’influence de la crête ou d’fgf4

Matériel et méthode : Manipulation du membre

FGF4, Shh et la ZPA

-Incubation à 38°c jusqu’à obtenir le stade désiré

-Petite incision du bourgeon, après enlèvement des membranes

-Insertion de la bille

-Reincubation (24h)

-Fixation (paraformaldehyde)

-Hybridation in situ

But : Fonction de FGF4

FGF4, Shh et la ZPA

-FGF4 est nécessaire pour induire l’expression de Shh

contrôle

But : Fonction de FGF4

FGF4, Shh et la ZPA

-Bmp2, Bmp4 et Hoxd13 sont des cibles directes ou indirectes de la ZPA et sont exprimés près du Shh endogène.

-Cela est vérifié de manière ectopique.

-L’ajout de Shh exogène sans induction par FGF4 ne permet plus l’expression de ces gènes.

Shh doit agir conjointement avec FGF4 pour activer ces gènes.

Matériel et méthode : manipulation du membre

FGF4, Shh et la ZPA

-Incubation à 38°c jusqu’à obtenir le stade désiré

-Petite incision du bourgeon, après enlèvement des membranes

-Insertion de la bille

-Reincubation (24h)

-On retire la bille, puis prélèvement d’un bout de tissus mésenchymateux et insertion sous la crête antérieur d’un membre au stade 19/20

-incubation 6 jours

-Fixation (paraformaldehyde)

-révélation au bleu alcyan

But : Fonction de FGF4

FGF4, Shh et la ZPA

L’expression de Shh, par FGF 4, provoque une activité similaire à la ZPA

-Activité polarisante et symétrie

-Activité polarisante plus faible

But : Fonction de FGF4

FGF4, Shh et la ZPA

-Greffe d’une progress zone ant. et d’une crête (stade 20) près de la bille.

-Apparition d’un deuxième membre.

-Pas de greffe

-Seule conséquence : l’ulna s’épaissit

La ZPA doit agir avec les cellules d’une Progress zone non différenciée pour produire un membre correct.

But : rôle du signal ectodermique

Le signal dorsoventral et Shh

-Distribution inégale de Shh autour de la bille de Fgf4

-Gouttes de PBS dorsales, FGF4 ventral

-Shh détecté plus fortement au mésenchyme dorsal

Un signal venant de l’ectoderme dorsal serait nécessaire pour induire l’expression de Shh.

Matériel et méthode : Suppression de(s) l’ectoderme(s)

Signal dorsoventral et Shh

Suppression de l’ectoderme dorsal :

-application du Nile Blue sulfate (10s) entraînant la formation d’une cloque

-La cloque est enlevée sans abîmer le mésenchyme sous-jacent

Suppression de l’ectoderme ventral :

-On « pèle » l’ectoderme ventral

-Insertion d’une pièce de métal pour empêcher l’adhésion entre le reste du corps et le bourgeon dénudé

But : rôle du signal ectodermique

Le signal dorsoventral et Shh

Le signal provenant de l’ectoderme est bien requis en plus de Fgf4 pour induire l’expression de Shh.

Ce signal provient de la partie dorsale.

Ventral

Dorsal

But : rôle du signal ectodermique

Le signal dorsoventral et Shh

Ce signal est-il aussi nécessaire au niveau endogène?

Ventral

Dorsal

-Baisse de l’expression de Shh

-Effet mineur

But : rôle du signal ectodermique

Le signal dorsoventral et Shh

-Si on enlève entièrement l’ectoderme distal et qu’on ajoute du FGF4 au niveau postérieur pas de Shh.

-Si on enlève l’ectoderme dorsal au niveau distal et qu’on greffe 3 morceaux de cette partie au niveau antérieur peu ou pas d’activité polarisante.

Un signal ectodermique est requis pour maintenir l’expression de Shh endogène aussi bien que l’activité polarisante.

But : Mode d’action de Shh

Le signal dorsoventral et Shh

En augmentant le nombre de cellule exprimant Shh on promouvoit la formation des éléments postérieurs. Shh agit donc de manière dose dépendant.

-on enlève l’ectoderme dorsal distal

-impossibilité de déterminer la polarité dorsoventrale

La perte des éléments du squelettes post peut être reliée à la disparition précoce de Shh.

-Shh fourni pour sauvetage du phénotype?

Matériel et méthode : greffe de cellule transfectées

Wnt7a est le signal ectodermique

-Un gène Wnt7a (souris) est souscloné après PCR dans un plasmide.

-Des fibroblastes embryonnaires de poulet (CEFs) sont transfectés par un système lipofectine contenant ces plasmides.

-Les cellules sont ensuite suspendues dans un petit volume d’un milieu qui permet leur agrégation.

-Ceci permet d’obtenir des agrégats de cellules, qui sont greffés dans le bourgeon.

But : Wnt7a est-il le signal ectodermique

Wnt7a est le signal ectodermique

-La synthèse de Shh est restaurée par Wnt7a

-FGF 4 et Wnt7a sont suffisants pour permettre l’expression de Shh.

Wnt7a est le signal ectodermique

Ni Fgf4 seul, ni Wnt7a seul, ni des cellules transfectés à vide avec une bille de Fgf4 ne permettent le maintient de l’expression de Shh

FGF4 cellules non transfectées + Fgf4

But : Wnt7a est-il le signal ectodermique

Wnt7a est le signal ectodermique

Matériel et méthode : transfection par rétrovirus

-Des plamides portant Wnt7a sont souscloné dans des vecteurs rétroviraux

-Un stock viral est injecté dans un membre de poulet au stade 19 ou 20.

Wnt7a est le signal ectodermique

But : Mode de fonctionnement de Wnt7a

Wnt7a n’a pas besoin d’être exprimé à la surface dorsale pour exercer son effet sur Shh.

Dorsal

ventral

Wnt7a est le signal ectodermique

But : test de la restauration du phénotype

Wnt7a peut se substituer aux fonctions de l’ectoderme dorsal dans la régulation de l’expression de Shh et la formation de la polarité antéropostérieur.

Wnt7a peut restaurer la polarité antéropostérieur mais ne corrige pas la réduction de la taille des éléments du squelette

Rappel des principales conclusions :

-FGF4 est nécessaire pour induire l’expression de Shh

-L’expression de Shh, par FGF 4, provoque une activité similaire à la ZPA

-Un signal venant de l’ectoderme dorsal serait aussi nécessaire pour induire l’expression de Shh.

-Le signal provenant de l’ectoderme dorsal est bien requis en plus de Fgf4 pour induire l’expression de Shh, aussi bien que l’activité polarisante.

-Wnt7a peut se substituer aux fonctions de l’ectoderme dorsal dans la régulation de l’expression de Shh et la formation de la polarité antéropostérieur.

Discussion

Discussion

-L’ectoderme dorsal a un rôle prédominant dans la régulation de Shh et de la ZPA.

-Wnt7a influence 2 aspects du développement du membre: il permet la polarisation dorsoventrale, ainsi que le maintient de l’expression de Shh nécessaire pour la polarité antéropostérieure.

-L’ectoderme ventral influence lui aussi l’expression de Shh mais dans une moindre mesure. Il est possible que le signal dorsal « fort » agisse en combinaison avec le signal ventral plus faible pour maintenir l’expression de Shh dans le mésenchyme postérieur distal.

-Wnt7a ainsi que FGF4 sont nécessaires ensemble pour induire et maintenir l’expression de Shh et former le squelette postérieur.

Discussion

-Le signal provenant de la zone restreinte de la crête sert à confiner la ZPA et Shh dans la partie distale du mésenchyme.

En effet, la boucle de rétro action positive entre FGF4 et Shh disparaît proximalement, du fait de l’éloignement de la crête, source de FGF4.

-2 causes possibles à la restriction postérieure du Shh:

L’expression de Shh dépend de l’état des cellules ou de l’historique de leur développement.

Un signal additionnel peut aussi être nécessaire, là où se combinent les cellules dorsales et ventrales de l’ectoderme (marge postérieure), et celles postérieures.

-La ZPA se forme au niveau de la zone d’interaction des trois protéines.

La croissance proximodistale, l’orientation antéropostérieur et dorsoventrale sont le fait d’interactions réciproques entre ces 3 protéines, notamment grâce à la ZPA.