Trabajo Prctico N 1

Microscopa, tinciones simples y diferenciales

Alumnos: Polizzotto Axel, Karpinski Ivn, Vera MaraProfesores: Amor Silvia, Bentancor LeticiaMateria: Microbiologa General; comisin BFecha: 10 de octubre de 2013

Resumen

En este trabajo prctico se prepararon extendidos de bacterias con el fin de poder visualizarlas en el microscopio. Para esto se tieron de diferentes maneras, ya sea con tinciones simples o diferenciales.Primero se realiz una tincin simple, utilizando diferentes bacterias, para examinar su morfologa. Luego, se realizaron tinciones de Gram y de esporas.Las tinciones simples fueron exitosas, mientras que las de Gram, una no se pudo observar correctamente, pudindose deber a factores como decoloracin prolongada. La tincin de esporas fue exitosa, ya que se pudo observar esporas teidas.

Introduccin

En este trabajo se prepararon las muestras realizando extendidos de las mismas sobre los portaobjetos, para luego ser visualizados en un microscopio de campo claro como el siguiente:

Sus Partes son:A- OcularesB- ObjetivosC- CondensadorD- PlatinaE- Tornillos macro y micromtricoF- Fuente lumnica

Tincin Simple

En este tipo de coloracin el extendido bacteriano se colorea con un nico reactivo. Por medio de la coloracin simple se puede visualizar la morfologa y disposicin de las clulas bacterianas. Los colorantes ms utilizados son: azul de metileno, cristal violeta y carbol fucsina.

Tincin de Gram

La coloracin diferencial ms importante utilizada en bacteriologa es la tincin de Gram, llamada as en honor al investigador que la desarroll. Esta coloracin divide a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Esta clasificacin es de importancia para la diferenciacin e identificacin de las bacterias.La coloracin de Gram utiliza cuatro reactivos:_Colorante primario (Cristal Violeta): es un colorante bsico que tie a las clulas de color violeta._Mordiente: Ioduro de Gram (Lugol): Este reactivo forma un complejo insoluble cuando se une al colorante primario._Agente decolorante (alcohol-acetona): Este reactivo sirve tanto como solvente de lpidos y como agente deshidratante._Contracolorante (Safranina): Este es el reactivo final, se utiliza para colorear de rojo o rosado a aquellas clulas que fueron previamente decoloradas.nicamente las Gram negativas podrn tomar ste color, en tanto que las Gram positivas retendrn el color prpura del colorante primario.

Tincin de esporas

Para teir esporas, se utiliza esta tcnica, la cual nicamente tie esporas._Colorante primario (Verde de Malaquita): Las cubiertas de las esporas no aceptan fcilmente el colorante primario. Para que ste pueda penetrar, es necesario aplicar calor. Luego de cubrir con el colorante primario, se debe calentar el extendido, tanto las clulas vegetativas como las esporas aparecern de color verde._Agente decolorante (Agua): Una vez que las esporas aceptan el colorante primario, no podrn ser decoloradas con agua y por lo tanto las esporas permanecern verdes. Por otro lado, el colorante no muestra una alta afinidad por los componentes de las clulas vegetativas, as que el agua lo remueve y el resto de las clulas quedarn incoloras._Contracolorante (Safranina): Este colorante se utiliza como contraste para teir las clulas vegetativas incoloras. stas absorben este colorante y aparecern rojas. Las esporas retendrn el color verde del colorante primario.

Materiales y Mtodos

Para la preparacin de un extendido:

Como se parten de muestras slidas primero se debe colocar una gota de agua sobre cada portaobjetos que se utiliza, y luego se toma la muestra correspondiente a cada portaobjeto con un ansa (tocando apenas de la muestra una colonia aislada) y se la coloca sobre el portaobjetos. Se esparce la muestra sobre el portaobjetos, para que luego se observe mejor en el microscopio. Se deja secar la muestra al lado de un mechero, y se procede a fijar la muestra, pasndola sobre la llama del mechero tres veces de manera rpida.

Tincin simple:

Se prepararon extendidos y luego se tieron las siguientes muestras: Escherichia coli con safranina. Pseudomona aeruginosa con cristal violeta. Staphylococcus aureus con azul de metileno. Bacillus cereus con fucsina.

Para cada tincin se procedi de manera similar, preparando el extendido de cada bacteria y luego colocndole el colorante y dejarlo reposar durante 3 minutos, luego se lav con agua y se dej secar junto a la llama de un mechero. Posteriormente se observaron en el microscopio cada muestra.

Tincin de Gram:

Se prepararon extendidos de las siguientes muestras: Escherichia coli mas Staphylococcus aureus. Bacillus cereus mas Pseudomona aeruginosa.

Para la preparacin de los extendidos, se procedi de igual manera que la antes mencionada, con la diferencia que para esta tincin se agregaron dos tipos de bacteria en vez de una para ver las diferencias entre ellas. Luego se secaron y se fijaron las bacterias al portaobjetos.Para ambos preparados, se procedi de la misma manera: Se agreg el colorante primario, cristal violeta, y se dej reposar durante 3 minutos, se procedi a lavar y a agregarle el lugol, que tambin se lo dejo reposar durante 3 minutos. Luego se agreg el agente decolorante, alcohol-acetona, y se lav con agua. Por ltimo, se agreg el contracolorante, safranina, durante 3 minutos tambin, y se lav. Se dej secar cerca de una llama de mechero.Se observaron los dos preparados en el microscopio.

Tincin para esporas:

Se prepar un extendido de Bacillus cereus, se sec al aire y se fij por calor. Luego se cubri el extendido con verde de malaquita y se incub en calor (sobre una olla con agua hirviendo) durante 15 minutos. Se debe evitar que el colorante se evapore, para esto, se fue agregando colorante cada vez que se notaba que se secaba.Pasados los 15 minutos, se enfri el extendido, y se lav cuidadosamente con agua.Se cubri el extendido con safranina durante 3 minutos. Se lav cuidadosamente con agua, se sec al aire y se examin al microscopio.

Resultados

Se obtuvieron los siguientes resultados de las tinciones simples:

Escherichia coli teido con safranina: bacilos de color rosa.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Safranina).

Pseudomona aeruginosa teido con cristal violeta: bacilos de color violeta.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Cristal violeta).

Staphylococcus aureus teido con azul de metileno: cocos de color azul de metilo.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Azul de metilo).

Bacillus cereus teido con fucsina: bacilos de color fucsia.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Fucsina).

En el caso de las Pseudomonas se podan apreciar como cocos con el objetivo de 10x, pero al utilizar el objetivo de 100x, se pudo observar su morfologa correcta. Con respecto al Staphylococcus, como se utiliz como colorante azul de metileno, ste provoc que su visualizacin sea un poco borrosa. Las dos coloraciones restantes fueron realizadas sin problemas y se pudo visualizar su morfologa sin alteraciones.Se obtuvieron los siguientes resultados para las tinciones de Gram:

_Escherichia coli mas Staphylococcus aureus: Cuando se observ la muestra con el objetivo de 100x, se observaron ambas bacterias teidas de color rosa, lo cual indica un posible error al momento de la decoloracin, ya que se debera haber observado al Staphylococcus de color violeta por ser una bacteria Gram positiva.

_Bacillus cereus mas Pseudomona aeruginosa: Al observarse con el objetivo de 100x se pudo visualizar las dos coloraciones, resultando en una coloracin exitosa, ya que los Bacillus se tieron de violeta mientras que las Pseudomonas fueron teidas de rosa.

Se obtuvo el siguiente resultado en la tincin de esporas:

_Bacillus cereus: Se pudieron visualizar correctamente las esporas teidas con de verde, y al resto de las bacterias de color rosa, indicando una coloracin exitosa.

Conclusin

Las tinciones simples son tiles para identificar morfologas de las bacterias, pero no su movilidad, ya que al fijar la bacteria al portaobjeto, sta pierde su movilidad.Las tinciones diferenciales son tiles para observar y clasificar a las bacterias, como la tincin de Gram, la cual separa entre Gram positiva y negativa. Pero se debe tener cuidado cuando se realiza, ya que si no, se pueden obtener falsos positivos o negativos, como lo sucedido en este trabajo, que se obtuvo Staphylococcus de color rosa, produciendo as un falso negativo. Por este motivo, se debe realizar con cuidado las coloraciones y las decoloraciones.

Bibliografa

Gua de Trabajos Prcticos N 1 y 2, Microscopa, preparacin de extendidos, coloraciones simples y diferenciales. Brock; Biologa de los Microorganismos, 12edicin; Editorial: Pearson Education.1

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