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Université de Montréal
EFFETS ET MÉCANISMES D'ACTION
D'EXTRAITS PLAQUETTAIRES DE PORC
SUR LA CICATRISATION CUTANEE
PAR PREMIERE ET SECONDE INTENTION
Soraya Allas
Faculté de médecine
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures
en vue de l'obtention du grade de
Philosophiae Doctor (Ph. O . )
en sciences biomédicales
Février 1997
Soraya Allas, 1997
Nationai Library 1*1 of Canada Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographie Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, rue Wellington CMtawaON K1AON4 Ottawa ON K I A ON4 Canada Canada
The author has granted a non- exclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sel1 copies of ths thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retallis ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
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L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de rnicrofiche/film, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
Université de Montréal Faculté des études supérieures
Cette thèse intitulée :
EFFETS ET MÉCANISMES D'ACTION
D'EXTRAITS PLAQUETTAIRES DE PORC
SUR LA CICATRISATION CUTANÉE
PAR PREMIERE ET SECONDE INTENTION
présentée par :
Soraya Allas
a été évaluée par un jury composé des personnes suivantes :
A la mémoire de mon père,
A ma mère, pour ses leçons de force, de courage, et de générosité,
À mon frère, le Docteur Karirn Fayçal Allas,
Mes meilleures pensées s'adressent :
A mes enseignants de l'Université d'Algec les Professeurs Hassouna
Lahreche et Louiza Kaci, qui ont encadré et supervisé ma formation en
pathologie clinique.
Aux Professeurs Patrice Callard et Paul Prud'homme de Saint Maur de
I'llniversité de Paris, pour m'avoir fait partager leurs connaissances en
pathologie clinique.
REMERCIEMENTS
Mes plus vifs remerciements et ma profonde reconnaissance s'adressent à
mon directeur de thèse, le Docteur Paul Brazeau. Je le remercie pour m'avoir
accueilli si chaleureusement au sein de son équipe, pour m'avoir communiqué
son enthousiasme pour la recherche, et pour m'avoir manifesté tout au long
de ma formation une grande disponibilité et un soutien constant.
Je remercie chaleureusement mon codirecteur de thèse, le Docteur Thierry
Abribat, pour les idées et les conseils qu'il m'a donnés, particulièrement au
cours de la rédaction de cette thèse.
Je remercie également :
Le Docteur Pascal Dubreuil, pour son aide précieuse en chirurgie.
Le personnel du laboratoire de Neuroendocrinologie (Centre de recherche
Louis Charles Simard, Hôpital Notre Dame, Université de Montréal), qui a
préparé et testé en culture les extraits plaquettaires utilisés dans ce travail :
Michele Boushira, Louise Brousseau, Jean Cormier, Nicole Rousseau et
Gilles Viau.
Denis Rodrigue, Monique Vasseur et Liette Lemaire, du département de
pathologie de l'université de Montréal, pour leur aide technique remarquable
en histologie.
Myriam Savard de la compagnie Clemex Technologies Inc., pour ses conseils
en analyse d'images.
La compagnie Thératechnologies Inc., et le Centre de recherche Louis
Charles Simard, pour leur soutien financier.
SOMMAIRE
La cicatrisation cutanée met en jeu plusieurs processus tels que la
migration et la prolifération cellulaire, I'angiogénese, la synthèse de
macromolécules de la matrice extracellulaire, et la reépithélialisation. Les
plaquettes sanguines libèrent, au site de la plaie, des facteurs de croissance
(PDGF, TGFP, EGF, IGF-1) et autres protéines, qui agissent de manière
synergique et complémentaire pour initier et réguler ces processus.
Chez l'animal, plusieurs études ont montré que l'application locale d'un
facteur de croissance exogène accélère la guérison des plaies cutanées.
Certaines de ces molécules sont en cours d'évaluation clinique chez des
patients porteurs d'ulcères chroniques (escarres de décubitus, ulcères
veineux, ulcères diabétiques).
Des extraits plaquettaires de porc (EPP), contenant en particulier du
PDGF, du TGFP et de la fibronectine, ont été obtenus dans nos laboratoires
par une méthode originale d'extraction. In vitro, ces extraits augmentent
significativement la prolifération des fibroblastes. Nous avons étudié les effets
de ces extraits plaquettaires sur la cicatrisation de plaies chirurgicales
cutanées chez des jeunes porcs. Pour ce faire, nous avons développé des
méthodologies quantitatives histologiques d'évaluation qui nous ont permis
d'apprécier la qualité du tissu de granulation et celle du recouvrement
épidermique.
Dans un premier temps, 3 concentrations d'extraits plaquettaires
(4x1 08, 2x1 09, 1 x10" plaquettes équivalentlml) ont été appliquées sur des
incisions chirurgicales. A 2x1 0' plaquettes équivalentlml, les plaies sont plus
solides comparées au contrôle, à 5 (Pc0.001), 7 (Pc0.0001) et 10 (P<0.02)
jours postopératoires. Les résultats histomorphométriques indiquent qu'a 5
jours, le tissu de granulation des plaies traitées occupe une étendue plus
importante comparé au contrôle (Pe0.01). II est caractérisé par une plus
grande richesse en cellules (Pc0.01) et en collagène jeune (Pc0.05). A 7 et
1 0 jours. l'organisation du collagène est plus marquée (?<O. 0 1 ). Enfin, a 28
jours, la cicatrice apparait plus fine dans les plaies traitées, comparées au
contrôle (Pc0.0001), ce qui pourrait indiquer un état de remodelage cicatriciel
plus avancé.
Dans un second temps, nous avons appliqué le traitement (2x10'
plaquettes équivaienVml) sur des excisions circulaires. Les résultats obtenus
par les méthodes histomorphométriques sont comparables à ceux observés
sur le modèle d'incisions chirurgicales. De plus, la mesure de paramétres
histologiques épidermiques suggère que la migration des cellules épithéliales
est plus précoce dans les plaies traitées. comparativement aux plaies
contrôles.
Les résultats obtenus dans les 2 modèles expérimentaux indiquent que
les extraits plaquettaires induisent une accélération de la réparation dermique
et épidermique. Ils soulignent l'efficacité d'un traitement multifactoriel, et
permettent de proposer une alternative thérapeutique aux états déficients de
la cicatrisation cutanée.
LISTE DES TABLEAUX
1. Constituants protéiques des extraits plaquettaires (EPP) .. ..... . ... . . .. .74
II. Activité biologique in vitro des extraits plaquettaires (EPP) . . . . . . . . . . . . . .75
111. Incisions chirurgicales : tension de rupture des plaies à 5, 7 et 10
jours postopératoires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -76
IV. Incisions chirurgicales : largeur moyenne des plaies à 5, 7, 10 et 28
jours postopératoires ...... . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . -79
V. Incisions chirurgicales : cellularité des plaies à 5, 7. 10 et 28 jours
postopératoires.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . -82
VI. Incisions chirurgicales : surface du collagène cicatriciel par champ
microscopique au jour 5 postopératoire . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. 84
VII. lncisions chirurgicales : surface du collagène cicatriciel par champ
microscopique au jour 7 postopératoire ..... .................... ... ........... .... 85
VIII. lncisions chirurgicales : surface du collagène cicatriciel par champ
microscopique au jour 10 postopératoire .......................... ............... 87
IX. Incisions chirurgicales : surface du collagène cicatriciel par champ
microscopique au jour 28 postopératoire .. .... . ..... . .. .. ... . . . .. . .. . . ... . .. . . . .. 88
X. Valeurs et significativités des corrélations observées entre les
différents paramètres mesurés au jour 5 postopératoire . .. .. . ............ 90
XI. Valeurs et significativités des corrélations observ5es entre les
différents parametres mesurés au jour 7 postopératoire ..... .. ........ ... 91
XII. Valeurs et significativités des corrélations observées entre les
différents parametres mesurés au jour 1 0 postopératoire . . . . . . . . . . . . . . . .92
XIII. Valeurs et sign ificativités des corrélations observées entre les
différents paramètres mesurés au jour 28 postopératoire . . .. . .. . ....... .93
XIV. Excisions chirurgicales : surface du néoépiderme et longueur de la
jonction dermo-épidermique à 5 et 7 jours postopératoires .............. 95
XV. Excisions chirurgicales : distance entre les bords libres du
néoépiderme à 5 et 7 jours postopératoires ..................................... 95
XVI. Excisions chirurgicales : largeur moyenne des plaies a 5 et 7 jours
postopératoires. .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . .. . .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . -97
XVII. Excisions chirurgicales : cellularité des plaies à 5 et 7 jours
postopératoires.. . . . . .. . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .98
XVIII. Excisions chirurgicales : surface du collagène cicatriciel au jour 5
postopératoire .. . . . . . . . . ... . ... . . . . .. . . .. . .. .. . .. .... .. .... .. . . . . . . . ... . .. .. . . . . . . .. . . .. . . . . ... 99
XIX. Excisions chirurgicales : surface du collagène cicatriciel au jour 7
postopératoire .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -99
LISTE DES FIGURES
1 . Cinétique des différentes phases de la cicatrisation cutanée ............... 3
2 . Principaux rôles des plaquettes au cours de la cicatrisation cutanée ... 6
3 . Origines et rôles de la fibronectine au cours de la cicatrisation cutanée
.......................................................................................................... 15
4 . Fibrilles de collagène mature d'un tissu cutané sain .......................... 19
5 . Fibrilles de collagène cicatriciel 7 jours aptes incision chirurgicale ..... 19
6 . Récapitulatif des principaux évènements de la cicatrisation cutanée . 26
7 . Les modes d'action des facteurs de croissance ................................. 29
8 . Propriétés biochimiques des récepteurs des facteurs de croissance
plaquettaires ..................................................................................... -29
9 . Effets complémentaires des facteurs de croissance au cours du cycle
cellulaire de cellules quiescentes ....................................................... 39
1 O . Principaux effets biologiques des facteurs de croissance plaquettaires
-39 .........................................................................................................
11 . (A) Chirurgie et (6) application des traitements .................................. 63
12 . Disposition des incisions chirurgicales et répartition des traitements .. 63
13. Dispositions des plaies circulaires et répartition des traitements . . . . . . . .72
14. Paramètres histologiques évaluant la qualité du recouvrement . - epidermique ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . .. . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . -72
15. Histogrammes des résultats présentés dans le tableau 111 ........... .... 76
16. Histogrammes des résultats présentés dans le tableau IV ............... 79
17. lncisions chirurgicales à 5 (1) et 7 (2) jours postopératoires avant (A)
et apres (B) analyse d'images .. .............. ............................ ..... .. .. .... 80
18. Incisions chirurgicales à 10 (3) et 28 (4) jours postopératoires avant
(A) et après (B) analyse d'images ....... .... .. ... ........... .. ..... ............ ...... 81
19. Histogrammes des résultats présentés dans le tableau V ................ 82
20. Cellularité des incisions chirurgicales à 5 (1) et 7 (2) jours
postopératoires avant (A) et après (8) analyse d'images ................. 83
21. Collagène cicatriciel à 5 (1) et 7 (2) jours postopératoires avant (A) et
apres (B) analyse d'images ............................................ .. ... ... . ... .... .86
22. Histogrammes des résultats présentés dans les tableaux VI à IX . .. .89
23. Epideme des excisions chirurgicales au jour 5 postopératoire avant
(A) et apres (6) analyse d'images ................................................. ... 96
24. Histogrammes des résultats présentés dans les tableaux XVlll et IXX
.......,........... ,, .............................................................................. 100
ABREVIATIONS ET SYMBOLES
aFGF
EGF
FGF
G- et
GM-CSF
ICAM-1
IGF
IGF-1
11-1 à 8
KGF
LFA-1
PDGF
TGFP
TGFa
VCAM-1
VLA4
EPP
PTRF
DMEM
Facteur de croissance acide des fibroblastes
Facteur de croissance épidermique
Facteur de croissance des fibroblastes
Facteurs de stimulations des colonies de granulocytes et de
granulocytes/macrophages
Intercellular adhesion rnolecule 1 N
« Insulin-like growth factor n: somatomédine
« Insulin-like growth factor1 »: somatornédine C
Interleukine 1 à 8
Facteur de croissance des kératinocytes
(( Lymphocyte function associated 1 u
Facteur de croissance plaquettaire
« Transforming growth factor » P (( Transforming growth factor » a
« Vascular cell adhesion molecule 1 ))
( Vascular leucocyte associated 4 B
Extraits plaquettaires de porc
a Platelet thrombin releasing factors ))
« Dulbecco's Modified Eagle Medium N
@) Polynucléaire neutrophile
@ Monocytelmacrophage - Fibroblaste
@ Kératinocyte
Cellule endothéliale
a Plaquettes sanguines
0 Lymphocyte
Dédicace
Remerciements
Sommaire
Liste des tableaux
Liste des figures
Abréviations et symboles
1. INTRODUCTION
1 PHYSIOLOGIE DE LA CICATRISATION CUTANÉE
............................................ 1 .l Phase vasculaire et inflammatoire .4
1.1 . 1 Réaction vasculaire 1.1.2 Réaction inflammatoire
1.2 Phase proliférative ................................................................ 1 3
1.2.1 Réparation dermique 1.2.2 Angiogénèse 1 -2.3 Réparation épidermique
............................................................................ Contraction -23
............................................................ 1.4 Phase de remodelage .23
1.4.1 Remodelage de la matrice extracellulaire 1.4.2 Diminution de la vascularisation 1.4.3 Diminution de la densité cellulaire
2 FACTEURS DE CROISSANCE PLAQUETTAIRES
............................................................................. 2.1 Généralités 27
2.1.1 Définition 2.1.2 Récepteurs 2.1 .3 Mécanismes d'action post-réceptoriels
2.2 POGF .....................................-...................
2.2.1 Structure moléculaire 2.2.2 Origine cellulaire 2.2.3 Récepteurs 2.2.4 Effets biologiques
2.3.1 Structure moléculaire 2.3.2 Origine cellulaire 2.3.3 Récepteurs 2.3.4 Effets biologiques
2.4.1 Structure moléculaire 2.4.2 Origine cellulaire 2.4.3 Récepteurs 2.4.4 Effets biologiques
........................................................................................ EGF 37
2.5.1 Structure moléculaire 2.5.2 Origine cellulaire 2.5.3 Récepteurs 2.5.4 Effets biologiques
3 PHARMACOTHERAPIE RÉPARATRICE DES PLAIES CUTANÉES
3.1 Facteurs de croissance.. ........................................................ .4 1
3.2 Extraits plaquettaires.. ............................................................ .45
3.3 Autres approches thérapeutiques.. .......................................... 46
II. PRESENTATION DU PROJET DE RECHERCHE
1 BUT DU PROJET DE RECHERCHE ................................................ .48
2 JUSTIFICATION ................................................................................ 48
3 OBJECTIFS SPECIFIQUES ............................................................. -49
PRÉPARATION DES EXTRAITS PLAQUETTAIRES
1.1 Animaux et prélèvements sanguins ......................................... 52 1.2 Préparation du plasma riche en plaquettes .............................. 52
..................................... 1.3 Préparation du concentré plaquettaire 52 1.4 Lavage du concentré plaquettaire ........................................... 53 1 . 5 Extraction ................................................................................ 53
TESTS DE VALIDATION
2.1 Dosage des constituants ......................................................... 54 2.2 Tests in vitro ........................................................................... 56
3 CICATRISATION CUTANÉE PAR PREMIÈRE INTENTION
3.1 Animaux et chirurgie ............................................................... 61 3.2 Traitements ............................................................................ -62 3.3 Prélèvements tissulaires ......................................................... 64
........................................................................... 3.4 Tensiométrie 64 ................................................................................ 3.5 Histologie 65
............................................................... 3.5 Analyses statistiques 68
4 CICATRISATION CUTANÉE PAR SECONDE INTENTION
4.1 Animaux et chirurgie ............................................................... 69 4.2 Traitements ............................................................................ -69
........................................................ 4.3 Prélèvements tissulaires -70 ................................................................................ 4.4 Histologie 70
4.5 Analyses statistiques ............................................................... 71
1 CONSTITUANTS DES EXTRAITS PLAQU ETTAl RES ..................... 74
2 ACTIVITÉ BIOLOGIQUE IN VITRO .................................................. 74
3 CICATRISATION CUTANÉE PAR PREMIERE INTENTION
3.1 Tensiométrie ........................................................................... 75 3.2 Histologie ................................................................................ 77
.......................................................... 3.3 Corrélations statistiques 90
CICATRISATION CUTANÉE PAR SECONDE INTENTION
4.1 Epiderme ............................................................................... -94 4.2 Derme ..................................................................................... 97
CICATRISATION CUTANEE PAR PREMIÈRE INTENTION
2.1 Cellularité .............................................................................. 104 2.2 Collagène .............................................................................. 105 2.3 Solidité .................................................................................. 107 2.4 Corrélations statistiques ........................................................ 108
CICATRISATION CUTANÉE PAR SECONDE INTENTION
3.1 Epiderme ............................................................................. 110 3.2 Cellularité .............................................................................. III 3.3 Collagène ......................................................................... 111
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ......................................................... 112
BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................... 114
ANNEXE I .................................................................................................. 139 Chromatograrnme des extraits plaquettaires de porc (EPP)
I. INTRODUCTION
7 PHYSIOLOGIE DE LA CICATRISATION CUTANÉE
La réparation du tissu cutané est un processus complexe faisant
intervenir des médiateurs chimiques, des éléments cellulaires. et des
protéines de la matrice extracellulaire. Elle comporte la reconstruction d'un
épithélium pluristratifié, l'épiderme, et de la jonction derrno-épidermique. La
réparation du derme sous-jacent aboutit à la formation d'une cicatrice fibreuse
indélébile. ce qui justifie la terminologie de cicatrisation pour désigner la
réparation du tissu cutané. Elle se distingue ainsi des réparations tissulaires
de type régénératif qui reconstituent l'architecture normale des tissus
(exemple : régénération hépatique après nécrose parenchymateuse focale).
Schématiquement, la cinétique de la cicatrisation est divisée en trois
phases interdépendantes et qui se chevauchent dans le temps (Figure 1). La
première phase est immédiate. Elle est vasculaire et inflammatoire. Elle
permet d'assurer l'hémostase et la détersion du foyer inflammatoire, et
prépare à la réparation des tissus. La seconde phase est proliférative. et
conduit à la formation du tissu de granulation. Elle permet la réparation
épidermique et dermique grâce à la prolifération de kératinocytes. de
fibroblastes, a la synthèse de collagène et au développement de la
néoangiogénèse. Enfin, la phase de remodelage, qui se poursuit sur plusieurs
mois, se caractérise par une diminution de la cellularité et de la
vascularisation ainsi que par le remodelage de la matrice extracellulaire, et
conduit à la formation d'une cicatrice fibreuse mature. Elle est accompagnée
durant les premières semaines d'un processus de contraction, nécessaire à la
fermeture des plaies ouvertes.
La cicatrisation cutanée est acquise dans des délais variables, suivant
l'étendue de la perte de substance (exemples : plaies chirurgicales, ulcères)
et du terrain sur lequel elle sumient (âge, état nutritionnel, pathologies
associées). La rapidité du pouvoir de cicatrisation décroît avec l'âge. Chez le
sujet âgé, le déficit affecte toutes les étapes de la cicatrisation (Gerstein,
A.D., 1993). 11 serait d'origine multifactorielle, en partie lié à une production
inadéquate de cytokines. De plus, les pathologies qui retardent la
cicatrisation (exemples : diabète, insumsance veineuse) s'observent plus
fréquemment chez le sujet age.
Les progrés de la biologie cellulaire de ces quinze dernières années
ont permis l'identification de cytokines, en particulier les facteurs de
croissance tissulaires, supports des interactions intercellulaires et entre les
cellules et la matrice extracellulaire. Les facteurs libérés par les plaquettes
jouent un rôle primordial, à la fois dans l'initiation et dans la progression du
processus de réparation, de la réaction inflammatoire initiale, a la maturation
du collagène.
PLAIE JOURS
Figure 1. Cinétique des différentes phases de la cicatrisation cutande.
(modifié d'après Cotran, R.S., Kumar. V., Robbins, S.L. 1994. ln : Pathologie basis
of disease. 5m edition. Saunders, W.B (ed), chap 3, p 89 ; et Moulin, V. 1995.
Growth factors in skin wound healing. European J Celt Biol. 68 : 1-7).
1 . Phase vasculaire et inflammatoire
1.1.1 Réaction vasculaire
Toute plaie cutanée est à l'origine d'une nécrose tissulaire et d'une
effraction vasculaire. Celle-ci est responsable de I'extravasation de cellules
sanguines (globules rouges et plaquettes) ainsi que de protéines
plasmatiques (fibronectine, fibrinogène, thrombospondine, facteur de von
Willebrand), constituant une matrice protéique provisoire sur laquelle les
cellules vont migrer. Elle est rapidement stoppée par la vasoconstriction,
l'adhésion plaquettaire, et la formation du caillot sanguin. Tous ces
événements conduisent à l'arrêt de l'hémorragie et à l'initiation de la réaction
inflammatoire.
Les plaquettes sont des cellules sanguines anucléées. de forme
discoide et mesurant 2 à 3 prn de diamètre. La membrane plasmique
renferme les molécules d'adhésion P-sélectines et des récepteurs
glycoprotéiques appartenant à la famille des intégrines (Bellucci, S., 1 991 ).
Le cytoplasme renferme 2 types spécifiques de granules : les granules
a et les granules 6 qui sont denses aux électrons. Les granules a contiennent
des facteurs de croissance (PDGF, TGFp, EGF, IGF-l), des facteurs de
coagulation (facteur V et VIII), du fibrinogène, de la fibronectine, de la
thrombospondine, de la p-thrornboglobuline, et le facteur plaquettaire 4 (PF4)
(Bellucci, S., 1991 ; Wahl, L.M., 1992). Les granules 6 contiennent des
amines vasoactives (sérotonine et histamine), des nucléotides adényliques
(ADP et ATP) et des ions calcium.
Adhésion et activation daauettaire
La lésion vasculaire permet de mettre en contact les plaquettes
sanguines avec les protéines de la matrice extracellulaire de la paroi
vasculaire: collagène, protéoglycans, fibronectine. Les plaquettes adhèrent
alors au collagène sous endothélial mis à nu (Figure 2). Cette adhésion se
fait par l'intermédiaire d'une protéine plasmatiqie, le facteur de von
Willebrand ou facteur VIII, composé de haut poids moléculaire, de structure
polymérisée et de synthèse endothéliale et mégacaryocytaire (Wahl, L. M.,
1992). Ce facteur se lie d'une part au récepteur glycoprotéique plaquettaire
Glb et d'autre part au collagène IV et V (Meyer, D., 1983). Les plaquettes sont
activées principalement par le contact du collagène avec les parois
vasculaires et par la thrombine formée des l'initiation de la coagulation
plasmatique. Cette activation se traduit par des modifications structurelles et
biochimiques.
Les plaquettes deviennent sphériques en même temps qu'elles
subissent des changements ultrastructuraux: modification du système
microtubulaire, apparition de pseudopodes et d'invaginations, et organisation
concentrique des granules de stockage (Bellucci, S., 1991). Ces modifications
augmentent l'adhésion, facilitent l'agrégation plaquettaire et prépare à la
libération de médiateurs.
L'activation plaquettaire entraîne très rapidement la libération de
médiateurs chimiques stockés dans les granules (a et 6) et de substances
formées à partir des phospholipides de membranes : facteur activant les
plaquettes (PAF), thromboxane A2 et autres prostaglandines, leucotrienes
(Wahl, L.M., 1992). De plus, le complexe des glycoprotéines de surface GPllb
et GPllla est le siège de changements conformationnels qui permettent la
fixation du fibrinogène plasmatique. Cette fixation est consolidée par
l'exposition de la thrombospondine a la surface des plaquettes (Bellucci, S.,
1991). Par ailleurs, les plaquettes subissent un réarrangement des
phospholipides de membrane qui permet la liaison du facteur X. L'interaction
du facteur X et du facteur V, exprime a la surface des plaquettes, conduit à
l'activation de la voie intrinseque de la coagulation (Furie, B., 1988).
1 facteurs de croissance amines vasoactives
ADP 2. LIBÉRATION DE MÉDIATEURS
recrutement
membrane 1-11
Figure 2. Principaux rdles des plaquettes au cours de la cicatrisation cutan4e. - Collagèna;m plaquettes; fl Von Willabrand; @ fibrinogène ; TxA2 : thromboxane A2; GPllb.
GPl l la et GPla: rbcepteurs glycoprotéiques.
Hémostase
L'hémostase est l'ensemble des événements physiologiques
aboutissant à la formation du caillot sanguin, qui est constitué principalement
de plaquettes agrégées, de fibrine. de fibronectine plasmatique et plaquettaire
et de globules rouges.
L'ADP et le thromboxane A2 initient I'agrégation des plaquettes et
permettent leur activation. Les plaquettes vont se superposer et former le clou
blanc plaquettaire, caractéristique de I'hémostase primaire. Le thromboxane
A2 possède également des propriétés vasoconstrictives permettant de limiter
la vélocité du flux sanguin, ce qui lui confère un rôle supplémentaire dans
I'hémostase (Wahl, L.M., 1992).
L'activation des voies de la coagulation est synchrone de I'agrégation
plaquettaire, et aboutit à la formation de thrombine à partir de prothrombine.
La combinaison de I'ADP, du thromboxane A2, de la thrombine et à un
moindre degré de la sérotonine et du PAF, permet une agrégation
plaquettaire plus importante. Les plaquettes ainsi agrégées s'assemblent en
une masse compacte. Leur adhésion est facilitée par les modifications
morphologiques qu'elles ont subies, et elle est renforcée par la présence de la
fibronectine. Une fois la thrombine formée, elle transforme le fibrinogène en
fibrine. La fibrine vient se mêler aux plaquettes agrégées et constitue un
réseau de mailles qui piègent les globules rouges et parfois les
polynucléaires. Elle permet la stabilisation et l'ancrage des agrégats aux
parois vasculaires : c'est l'hémostase secondaire et définitive.
1 .1.2 Réaction inflammatoire
Les facteurs chimiques libérés au cours de l'activation plaquettaire vont
permettre l'initiation de la réaction inflammatoire, c'est à dire l'installation des
phénomènes vasculo-exsudatifs et la migration des leucocytes
(polynucléaires, monocytes, lymphocytes).
1.1.2.1 Phénomènes vasculo-exsudatifs
L'histamine, la sérotonine et les leucotriènes induisent une
vasodilatation et une augmentation de la perméabilité vasculaire
accompagnée de l'exsudation d'un liquide œdémateux riche en protéines
plasmatiques, contenant en particulier des immunoglobulines, du complément,
des kinines et du fibrinogène.
1.1.2.2 Polvnucléaires neutro~hiles
a) Miaration
Les polynucléaires neutrophiles sont présents dans le sang et ne
migrent dans les autres tissus qu'à l'occasion d'une réaction inflammatoire.
Présentes dès la sixième heure, ces cellules sont les premières à apparaître
dans l'espace de la plaie. Le passage des polynucléaires de la lumière
vasculaire au tissu comprend 3 étapes successives : (1) la margination et
l'adhésion aux parois vasculaires ; (2) le passage à travers l'endothélium ou
diapédèse ; (3) la migration dans les tissus.
La margination, l'adhésion et la diapédèse sont facilitées par la
vasodilatation et l'augmentation de la perméabilité vasculaire. Elles impliquent
des molécules d'adhésion présentes a la surface des polynucléaires et des
cellules endothéliales (Belivilacqua, M.F., 1993). Ces molécules appartiennent
a la famille des sélectines (P- et E-sélect ines) , des immunoglobulines
(exemples : CAM-1, VCAM-1) et des intégrines (exemples : LFA-1, VLA-4).
La migration dans les tissus se déroule sous l'influence d'un gradient
de facteurs chimiotactiques. Ces facteurs proviennent de diverses sources :
produits bactériens (en particulier peptides munis d'une N-formyl-méthionine
en position amino terminale) , débris tissulaires, fractions du complément
(C5a) , métabolisme de l'acide arachidonique (leucotrienes B$ , dégranulation
plaquettaire (PDGF, TGFP 1 , PF4), cellules inflammatoires (IL-8, 1 , GM-
CSF, G-CSF) (Deuel, T.F., 1991 ; Drake, W.T., 1993 ; Garner, W.R., 1994 ;
Gimbrone, M.A., 1984 ; Tonnesen, M.G., 1 984). Ils exercent leur stimulation
via des récepteurs membranaires spécifiques présents sur les polynucléaires.
b) Rôle
Les polynucléaires neutrophiles sont présents 24 à 48 heures au site
de la plaie. Par leur pouvoir phagocytaire et le déversement du contenu de
leurs granules cytoplasmiques, ils sont impliqués dans la détersion du foyer
inflammatoire et la prévention de l'infection (Wahl, L.M., 1992). En effet, les
protéases acides et neutres (collagénase, élastase, et
mucopolysaccharidase) lysent les tissus nécrosés et la fibrine exsudée,
tandis que le lysosyme, la lactoférine et la myélopéroxydase ainsi que les
radicaux libres oxydants fournis par l'activation du métabolisme des
polynucléaires, permettent la destruction des bactéries. Une neutropénie ou
une pathologie de la fonction des neutrophiles (locomotion, phagocytose)
augmentent le risque d'infection qui affecte significativement la réparation
tissulaire (Simpson, D.M., 1 972).
1.1.2.3 Monocvtes et macro~hacres
a) Miaration
Les monocytes sont des cellules sanguines originaires de la moelle
osseuse qui migrent dans tous les tissus, même en l'absence de réaction
inflammatoire. Ils y vivent plusieurs semaines, et peuvent se différencier en
macrophages. Comme les polynucléaires, les monocytes affluent dans le
foyer inflammatoire par margination et adhésion, diapédese puis migration
chimiotactique. Ils se déplacent, avec les h istiocytes déjà présents dans le
conjonctif, vers le foyer inflammatoire où ils s'immobilisent.
Cette migration est aussi précoce que celle des polynucléaires, mais
moins intense et plus prolongée. En effet, les macrophages, qui survivent au
site de la plaie, prédominent entre le troisième et cinquième jour. La migration
des monocytes est déterminée par les molécules d'adhésion et plusieurs
substances chirniotactiques : liposaccharides des micro-organismes,
protéines basiques des lysosomes des polynucléaires, fraction C5a du
complément, fibronectine, collagène, ainsi que le PDGF, le PF4, et surtout le
TGFPl libérés par les plaquettes (Cavaillon, J.M., 1994 ; Deuel, T.F., 1991 ;
Leibovich, S.J., 1988 ; Wahl, L.M., 1992).
b) Activation
Dans le foyer inflammatoire, les monocytes et histiocytes sont activés
en macrophages sous l'influence de différents facteurs : fibrine. lymphokines
(exemple : interféron y) et notamment le TGF P (Wahl, L.M., 1992). Cette
activation se traduit par des modifications morphologiques et fonctionnelles :
les cellules présentent une hypertrophie du noyau et du cytoplasme, la
quantité de mitochondries est augmentée ainsi que celle de I'ergastoplasme
et du Golgi, le métabolisme cellulaire global est plus élevé ainsi que les
activités de pinocytose, de phagocytose et de sécrétion. Les médiateurs
libérés par les macrophages succèdent à ceux des plaquettes, constituant
ainsi la deuxième vague de cytokines et de facteurs de croissance. Ce sont
essentiellement le TGFP, le PDGF, le TGFa, I'IGF-1, le TNFa (Tumor
necrosis factor a), et des interleukines ( IL I , IL-6) (Barbul, A., 1 992).
c) Rôles
Les macrophages sont impliques dans la détenion de la plaie, et
succèdent ainsi à l'action des polynucléaires. Ils phagocytent et détruisent des
particules diverses, libèrent des substances anti-bactériennes et lytiques. La
lyse laisse persister les structures antigéniques du matériel phagocyté qui,
une fois extériorisées sur la membrane du macrophage, préparent a la
réaction immunitaire.
Les macrophages sont nécessaires au bon déroulement de la
cicatrisation. II est bien connu que la déplétion in vivo d'une plaie en
macrophages entraîne un retard à la formation et à l'extension du tissu de
granulation (Leibovich, S. J., 1975). En effet. les macrophages constituent une
source continuelle des médiateurs chimiques qui stimulent les étapes
ultérieures de la cicatrisation, en particulier I'angiogénèse, la prolifération de
fibroblastes, et le dépôt de collagène (Barbul, A., 1992). La composition du
micro-environnement de la plaie, en particulier I'hypoxie, l'acidité, et
l'augmentation de l'acide lactique, stimulent la production de facteurs
angiogéniques par les macrophages (Jensen, J.A., 1986).
Les lymphocytes sont des cellules originaires de la moelle osseuse
impliquées dans les défenses immunitaires. La migration des lymphocytes
dans le foyer inflammatoire est régie par les mêmes mécanismes que celle
des polynucléaires et des macrophages (margination, diapédèse) , et fait
également intervenir des molécules d'adhésion et des facteurs
chimiotactiques. L'apparition des lymphocytes au site de la plaie coïncide
avec la période pendant laquelle prédominent les macrophages (Barbul, A.,
1 992).
En l'absence d'une infection surajoutée ou de tout autre stimulus
antigénique, le rôle des lymphocytes dans le processus de cicatrisation n'est
pas essentiel. Leur présence reste toutefois nécessaire à l'obtention d'un
résultat normal. En effet, l'utilisation d'agents stimulant les lymphocytes T
(vitamine A, arginine, IL-2) augmente la force de tension des plaies et les
dépôts de collagène (Barbul, A., 1986 ; Ehrlich, H.P., 1968), tandis que la
déplétion in vivo en lymphocytes T affecte la cicatrisation et conduit à une
diminution de la synthèse de collagène et de la solidité de la cicatrice
(Peterson, J.M.. 1987). Par ailleurs, des travaux indiquent que les
lymphocytes T suppresseurs/cytotoxiques auraient un effet contre régulateur
sur la cicatrisation, comme en témoignent l'augmentation du dépôt de
collagène et de la force de tension des plaies secondaires a leur déplétion
(Barbul, A., 1989).
L'activation des lymphocytes dépend de leur interaction avec les
macrophages. Celle ci implique la présentation aux lymphocytes des
substances antigéniques à la surface des macrophages, et aboutit à la
libération de lymphokines comme l'interféron y et les interleukines (IL2 à 8).
L'interféron y, bien connu pour son action antivirale, stimule plusieurs
sécrétions macrophagiques (Wahl, L.M., l992), inhibe la prolifération des
fibroblastes ainsi que la production de collagène (Duncan, M.R., 1984 ;
Jimenez. S.A., 1984).
2.1 Phase ~roliférative
2.1.1 Réparation dermiaue
Le tissu conjonctif synthétisé sur le site de la plaie, également appelé
tissu de granulation, est composé de cellules (macrophages et fibroblastes),
de vaisseaux et d'une matrice extracellulaire. Les fibroblastes prolifèrent et
produisent les nouveaux composés du tissu conjonctif (collagène et
protéoglycans). L'apport nutritionnel est assuré par les nouveaux vaisseaux.
Cette néoangiogénese est essentielle au développement de la matrice
extracellulaire, laquelle apporte support et protection aux capillaires
néoformés.
Prolifération de fibroblastes
Dans le derme sain, les fibroblastes sont présents à l'état quiescent, et
clairsemés entre les bandes de collagène. Après la lésion, ils sont activés et
migrent des berges et de la base de la plaie vers le foyer inflammatoire ou ils
sont retrouvés des le troisième jour. Là, ils se multiplient et synthétisent le
collagène et les protéoglycans.
La migration et la prolifération des fibroblastes est sous l'influence de
composants de la matrice extracellulaire (fibronectine, collagène) et de divers
médiateurs acheminés par voie sanguine (IGF-1) ou libérés au cours de la
phase inflammatoire comme le PDGF, le TGFP, le PF4, le FGF (Buckley-
Sturrock, A., 1989 ; Deuel, T. F., 1991 ; Poslethwaite, A.E., 1987). Les
fibroblastes activés sont également susceptibles de produire des facteurs
(PDGF, TGFP, IGF-1) régulant leur propre prolifération (Antoniades, H. N.,
1991 ; Messadi, D.V., 1994 ; Morgan, C. J., 1992). Le TGFP stimulerait la
prolifération des fibroblastes en provoquant la libération de PDGF (Soma, Y.,
1989).
2.1.1.2 Svnthese des composants matriciels
Les fibroblastes sont à l'origine de la synthèse de collagène, de
glycoprotéines (fibronectine et laminine) et de protéoglycans (acide
hyaluronique). Ces composés forment la nouvelle matrice extracellulaire
succédant à la matrice protéique (fibrine, fibronectine) déposée Ion de la
phase vasculaire (Clark, R.A.F., 1993).
Fi bronectine
La fibronectine est une glycoproteine dimérique de 440 kDa, composée
de 2 sous-unités reliées par une paire de ponts disulfures. Chaque sous-unité
est repliée en une série de domaines globulaires séparés par des segments
de chaîne polypeptidique flexible (Schwanbauer, J. E., 1 992). La fibronectine
existe sous 3 formes : (1) une forme soluble dimérique qui circule dans le
sang et d'autres fluides corporels, la fibronectine plasmatique ; (2) des
oligomeres attachés à la surface des cellules, la fibronectine de surface
cellulaire ; et (3) des fibrilles très insolubles présentes dans la matrice
extracellulaire, la fibronectine matricielle (Hynes, R.O., 1982).
La fibronectine est peu abondante dans le tissu cutané sain (Clark,
R.A.F., 1990). Au cours de la cicatrisation, elle est déposée pendant la phase
vasculaire, véhiculée par le sang et sécrétée par les plaquettes activées, et
pendant la phase de réparation dermique, synthétisée et sécrétée par les
fibroblastes et les kératinocytes.
La fibronectine est une molécule multifonctionnelle (Figure 3). Elle
possède des sites liant le collagène, l'héparine et la fibrine. Plusieurs sites
présents sur les 2 tiers de sa partie carboxy-terminale, dont un site RGDS
(ArgGlyAspSer), sont reconnus par des récepteurs cellulaires appartenant a
la famille des integrines (Clark, R.A.F., 1990). Par ces caractéristiques, la
fibronectine est responsable de l'attachement et de la migration de cellules :
fibroblastes, kératinocytes, cellules endothéliales. Elle est aussi impliquée
dans I'6ch2faudage de la matrice collagéne mature. En effet. (1) le dkpôt de
fibronectine au sein des plaies précède celui du collagène, (2) l'inhibition in
vitro de la formation de fibronectine par les fibroblastes empiSche les dépôts
de collagène de type I et III (Clark, R.A.F., 1988 et 1990). Des travaux ont
montré que la fibronectine recouvre préférentiellement le collagène de type
III ; elle s'associe peu au collagène de type 1, sauf lorsque celui-ci est
denaturé après la plaie et qu'il faut assurer son élimination par phagocytose
(Grinnell, F., 1981 ).
La fibronectine joue également d'autres r6les au cours de la
cicatrisation cutanée. Elle peut enrober des fragments de fibrine, de
collagéne, ainsi que des bactéries, pour permettre leur phagocytose par les
macrophages (opsonisation). Enfin, c'est un facteur chimiotactique pour les
monocytes, les fibroblastes et les cellules endotheliales (Clark, R.A.F., 1990).
CAILLOT OPSONISATION MIGFU4TION
1 CHIMIOTACTISME 1
piïmiE-1 ÉCHAFAUDAGE DE LA MATRICE
PHAGOCYTOSE 1 1 1
8 [ANGIOGBYISE~ 1 . 71 DERMIQUE I D ~ E R S I O N DU I
FOYER 1 INFiAMMATOIRE 1 1 ~PITHCLIALISATION 1
Figure 3. Originea et r6les de la fibronectine au cours de la cicatrisation cutanée.
b) Protéoa lvca ns
Durant les premiers jours, l'acide hyaluronique est un composé
important de la matrice extracellulaire. II joue un rôle dans l'hydratation mais
pourrait aussi promouvoir la migration et la prolifération cellulaire (Goslen,
J.B., 1988). Des le cinquième jour, il est remplacé par le chondroïtine-4-
sulfate, le dermatane-sulfate et I'héparan sulfate, dont les taux diminuent avec
la maturation de la cicatrice. Leurs fonctions comprennent la régulation de la
synthèse du collagène, avec augmentation de la polymérisation des
monomères de collagène par le chondroïtine-4 sulfate, mais aussi la
stabilisation de l'adhérence cellule-fibronectine (héparan sulfate), diminuant
ainsi la migration cellulaire (Goslen, J.B., 1988).
c) Collagène
Les collagènes constituent une famille de protéines fibreuses très
caractéristiques. Ce sont les protéines les plus abondantes chez les
mammifères où elles représentent 25% des protéines totales. Dans le derme,
elles sont le composé protéique majeur et confèrent au tissu résistance et
solidité.
Structure moléculaire
Les molécules de collagène ont une structure hélicoïdale à 3 brins
(Miller, E.J., 1992). Chaque brin est une chaîne polypeptidique, la chaîne a,
d'environ 1000 acides amines. Les 3 chaînes sont enroulées les unes autour
des autres en une super-hélice régulière, pour former une molécule d'environ
300 nrn de longueur et de 1.5 nm de diamètre. Les collagènes sont très riches
en proline et en glycine. Les étapes préalables a la formation de l'hélice et
permettant sa stabilisation, comporte une hydroxylation des résidus proline et
lysine et une glywsylation des chaînons d'hydroxylysine.
Les collagènes forment une super-famille de protéines comprenant au
moins 19 types (Prockop, D .J. ;1995). Les types I et III sont parmi les mieux
caractérisés, et sont ceux impliqués dans la cicatrisation cutanée. La forme
moléculaire la plus répandue du collagène type I est hétérotrimérique,
constituée de 2 chaînes al(l) et d'une chaîne a2(1) (Miller, E.J., 1987). Le
collagène type I est le seul collagène des tendons, de I'osséine, de la dentine
et représente 80% du collagène dans le derme adulte. Le collagène type III
est un trimère de chaînes al (Ill), fortement glycosylé. II représente la majeure
partie du collagène du derme fœtal, et seulement 20% chez l'adulte (Clore,
J.N., 1979).
Organisation
Les molécules de collagène sont
extracellulaire sous forme de précurseurs s
secrétees dans la
olubles, les procollagè
matrice
nes, qui
subissent une protéolyse éliminant les 2 polypeptides terminaux. Cette
protéolyse est nécessaire à l'assemblage des molécules de collagène.
Les molécules de collagène s'alignent et s'assemblent en files
parallèles pour former les fibrilles de collagène, visibles en microscopie
électronique et dont le diamètre varie entre 10 et 300 nm (Figure 4). Les
fibrilles s'agrègent en faisceaux de plusieurs micromètres de diamètre, les
fibres de collagène, visibles en microscopie optique. Les molécules de
collagène de type III, fortement glycosylées. ne forment que des fibres fines
(aussi appelées fibres de réticuline) et entourées de protéog l ycans.
Affinités tinctoriales
Les fibres de collagène sont colorées assez électivement en jaune, par
le safran, en bleu (bleu d'aniline) ou en vert (vert lumière) par le trichrome de
Masson. L'orientation régulière des molécules dans les fibres se traduit par
une biréfringence en lumière polarisée. Cette biréfringence est augmentée
après coloration au rouge sirius car les molécules du colorant, de forme
allongée, s'alignent parallèlement au grand axe des molécules de collagène
(Junquiera. L.C.U.,1979). La coloration au rouge sirius, observée en lumière
polarisée, est considérée par plusieurs auteurs comme spécifique du
collagène. De plus, elle permet de distinguer les fibres fines (biréfringence de
jaune à vert) des fibres épaisses densément empaquetées (biréfringence de
rouge à orange) (Dayan D., 1989 ; Junquiera L.C.U., 1982).
Twes de collaciene au cours de la cicatrisation
Des études ont montré que le collagène de type III se dépose très tôt,
en même temps que la fibronectine (Kurkinen M., 1980). Chez le rat, la
synthese de collagène de type III est augmentée au cours des dix premières
heures, constituant 30% du collagène total (Clore J.N., 1979). La présence de
collagène de type III a été démontré chez l'enfant, 24 à 48 heures après une
chirurgie (Gay, S., 1978). Durant les premiers jours, le collagène type III est
synthétisé plus abondamment que le collagène type 1, le ratio s'inverse par la
suite pour redevenir proche de la normale (Gay, S., 1978 ; Levenson S.M.,
1965).
Contrôle du métabolisme du collagène
La synthèse de collagène est stimulée par l'acide ascorbique, par des
facteurs de croissance (IGF-1, TGFp) et des cytokines comme l'IL-1 (Ignotz,
R.A., 1986 ; Phillips, C., 1992). La dégradation est assurée par une famille de
métalloproteinases, les collagénases (Jeffrey, J. J., 1992). Ces enzymes sont
produites par plusieurs types cellulaires (fibroblastes, macrophages,
polynucléaires neuttophiles), et leur sécrétion est induite par plusieurs stimuli,
comme des facteurs de croissance (PDGF, EGF).
Figure 4. Fibrilles de collagène mature d'un tissu cutané sain.
Peau de rat. Microscopie électronique. Coloration : acétate d'uranyl.
Figure 5. Fibrilles de collagène (i)) 7 jours après incision chirurgicale.
Peau de rat. Microscopie électronique. Coloration : acétate d'uranyl. Les fibrilles sont
de diamètre très variable, et parsemées au sein de la matrice extracellulaire.
2.1.2 Anniociénèse
De nouveaux vaisseaux sanguins apparaissent au site de la plaie vers
les cinquième et sixième jours, formés à partir des veinules adjacentes.
Plusieurs étapes marquent l'élaboration de nouveaux vaisseaux: (1) la
dégradation protéolytique de la membrane basale de la veinule mère ; (2) la
migration des cellules endothéliales en direction des stimuli angiogéniques ;
(3) la prolifération de cellules endothéliales et la formation de bourgeons
pleins, puis de tubes ; (4) I'accolement des péricytes au nouveau
endothélium ; (5) la formation de la membrane basale et de la couche
musculaire lisse.
Les facteurs stimulant I'angiogénese, libérés principalement par les
plaquettes et les macrophages, agissent sur une ou sur plusieurs de ces
étapes. Le FGF et le TGFp provoquent la synthèse par les cellules
endothéliales de proteases et antiprotéases, permettant une destruction
limitée des membranes basales, ainsi que de facteurs de croissance
également angiogéniques comme le bFGF, le PDGF, I'IGF-1 (Bennett, N.T.,
1993 ; Schweigerer, L., 1987 ; Thomas, K.A., 1986 ). La migration des
cellules endothéliales se fait sous l'effet de facteurs chimiotactiques comme le
VEGF(c( vascular endothelial growth factor D), le bFGF et le PDGF (Folkman,
J., 1992). Le bFGF, le TGFP et le TNFa permettent la formation de tubes
vasculaires (Leibovich, S. J., 1988 ; Menvin, J.R., 1990 ; Thomas, K.A., 1986).
La réépithélialisation est la reconstitution de l'épiderme en un
épithélium pluristratifié et kératinisé, recouvrant la plaie. Elle comprend la
migration, la prolifération et la différenciation des cellules épidermiques.
Mioration des kérat inocvtes
Les kératinocytes basaux d'un épiderme sain repose sur une
membrane basale par l'intermédiaire d~hémidesmosornes. Quelques heures
après une blessure, les kératinocytes basaux des berges de la plaie et ceux
des annexes épidermiques se déplacent en direction du centre de la plaie. I ts
migrent, probablement regroupés en petit amas (Stenn, K.S., 1992), d'abord
sur une matrice protéique provisoire constituée de protéines d'origine
plasmatique (fibrine, fibronectine, vibronectine), puis sur une matrice
protéique qu'ils vont former. Les cellules migratoires subissent des
modifications morphologiques (formation de lamellipodes), s'équipent de
filaments contractiles (actine et rnyosine) et perdent leurs structures
d'attachements cellulaires (desrnosornes et tonofilaments). De plus, elles
sécrètent des collagénases (Saarial ho-Kere, U. K., 1 993), ainsi que
I'activateur du plasminogène (Stenn, K.S., 1992). Elles expriment des
récepteurs appartenant a la famille des intégrines qui permettent la liaison à la
fibronectine (Cavani, A., 1993 ; Grinnell, F., 1992). Tous ces caractères
morphophysiologiques contribuent au phénomène migratoire.
La migration cellulaire serait initiée par la perte de contact des cellules
avec la membrane basale lésée et impliquerait, à la fois, des médiateurs
solubles (libérés localement par les kératinocytes et les cellules du granulome
inflammatoire) et des protéines matricielles. Le TGFP est sécrété par les
kératinocytes qui expriment eux mêmes des récepteurs au TGFP (Schmid, P.,
1993). 11 stimule la migration de ces cellules, favorise leur production en
fibronectine (Nickoloff, B.J., 1988) et provoque l'expression des intégrines
(Gailit, J., 1 994). Initialement d'or~gine plasmatique et plaquettaire, puis
synthétisée par les kératinocytes, adhérente aux kératinocytes qui expriment
ses récepteurs, la fibronectine joue un rôle de premier plan dans la migration
des kératinocytes. Elle procurerait un support migratoire de meilleure qualité
que la laminine et le collagène de type IV (Stenn, K.S., 1992).
2.1.3.2 Prolifération et différenciation des kératinocvtes
Après 48 à 72 heures, les cellules épithéliales en arrière du front de
migration commencent à proliférer afin de recouvrir la plaie. La prolifération
est sous l'influence de divers facteurs de croissance (EGF, KGF, FGF, IGF-1)
libérés soit par les kératinocytes (Ansel, J., 1990 ), soit par les cellules du
tissu de granulation (fibroblastes, macrophages). Les kératinocytes expriment
des récepteurs à I'EGF (Wenczak, B.A., 1992). au KGF (Werner, S., 1994).
au PDGF (Antoniades, H.N., 1 WI) , à I'IGF-1 (Antoniades, H.N., 1993) et aux
interleukines (Blanton, R.A., 1989). Ils sécrètent diverses cytokines (EGF,
TGF a, IGF-1, PDGF, FGF) qui régulent leur prolifération.
Au cours de la phase proliférative, la différenciation des cellules
épithéliales se fait graduellement, par l'acquisition des antigènes
épithéliaux (filaggrine, involucrine, transglutaminase, lectrine, Ulex europeus
ligand), et l'apparition des structures de jonction (Olerud, J.E., 1988 ; Stenn,
K.S., 1992). Dès la formation d'un épithélium recouvrant ta plaie en totalité,
les cellules épidermiques retrouvent leur phénotype stationnaire de départ et
rétablissent leur liaisons anatomiques avec les cellules voisines et avec la
membrane basale.
La jonction demo-épidermique permet de relier l'épiderme aux fibres
de collagène dermique. C'est une couche riche en glycoprotéines qui
comprend de la superficie à la profondeur 3 zones successives : la lamina
lucida riche en laminine et ou l'on retrouve l'antigène de la pemphigoïde
bulleuse, la lamina densa constituée de collagène de type IV, et une couche
de fibrilles d'ancrage (collagène type VII). Au cours de la cicatrisation
cutanée, l'antigène de la pemphigoïde bulleuse, la laminine et la fibronectine.
le collagène de type IV et le collagène de type VI1 sont synthétisés par les
kératinocytes migratoires. La régénération de ces composés n'est pas
synchrone, et les mécanismes d'assemblage ne sont pas encore parfaitement
élucides. L'antigène de la pemphigoïde bulleuse est présent dans le front de
reepithélialisation, et serait un des premiers à réapparaître. suivi de la
laminine, du collagène de type IV et de la fibronectine (Stenn, K.S.. 1992).
1.3 Contraction
La contraction est un mouvement centripète qui participe avec
I'épithélialisation et le dépôt de tissu conjonctif à la fermeture des plaies
ouvertes. Elle a pour but de faciliter la cicatrisation et de parer a l'infection.
Les théories proposées aujourd'hui pour expliquer la contraction des plaies.
impliquent la participation du fibroblaste et du myofibroblaste, cellule
mésenchymateuse dlhistogénèse discutée (fibroblaste, cellule musculaire
lisse), ayant à la fois les propriétés du fibroblaste (synthèse de collagène), et
celles de la cellule musculaire lisse (contraction) grâce a la présence
intracytoplasmique de myosine et d'actine (Rudolph, R., 1992 ; Grinnel, F.,
1994). Ces cellules exerceraient des forces sur la matrice extracellulaire en
réorganisant les fibrilles de collagène présentes à leur voisinage. Les travaux
des dernières années ont permis d'identifier certains facteurs régulant ce
mécanisme. II s'agit soit de structures permettant la liaison entre les cellules
et le collagène (intégrines a2f311 récepteurs présents à la surface des
fibroblastes ; fibronectine se liant aux myofibroblastes), soit de cytokines
stimulant les fibroblastes directement (PDGF) ou indirectement (TGFP)
(Clark, R.A.F., 1989 ; Shiro, J.A., 1991 ; Welch, M.P., 1990 ).
1.4 Phase de remodelaae
1.4.1 Remodelaoe de la matrice extracellulaire
Cette étape comporte des modifications quantitatives et qualitatives de
la composition de la matrice extracellulaire. Les quantités de fibronectine, de
collagène de type III et de protéoglycans déposés dans les tous premiers
jours diminuent progressivement sous l'effet des protéases sécrétées par les
cellules de la plaie (polynucléaires, macrophages, fibroblastes, kératinocytes),
tandis qu'augmente la synthèse de collagène de type I amenant à la formation
de fibres de plus en plus épaisses (Agren, M.S., 1992) (Figure 5).
L'appauvrissement graduel de la plaie en eau, secondaire aux variations des
protéoglycans, permet le rapprochement des fibres de collagène néoformées,
et facilitent la formation de liaisons covalentes. Les fibres s'organisent alors
en faisceaux de plus en plus denses (Levenson, S.M., 1965), et s'alignent par
la suite parallèlement aux lignes de tension (Daly C. H., 1982).
L'augmentation progressive de la solidité d'une plaie dans le temps est
proportionnelle à la quantité de collagène déposé, à son organisation spatiale,
au diamètre de ses fibres, et a la formation de liaisons covalentes. (Forrest,
L.. 1983 ; Doillon, C.J., 1985 ; Ehrlich, H.P., 1996). Tout au long de la phase
de remodelage, il existe un équilibre entre la synthèse de coilagène et la
collagénolyse, pour fournir au tissu en réparation une solidité optimale. Le
processus de maturation reste néanmoins imparfait, puisque le diamètre des
fibres du collagène cicatriciel et leur organisation (parallèle à la surface de la
peau) n'atteignent jamais ceux du collagène dermique (à la fois parallèle et
perpendiculaire à la surface de la peau), et que la solidité d'une cicatrice
dermique reste toujours inférieure à celle d'un tissu cutané sain (Levenson,
S.M., 1968).
1 -4.2 Diminution de la vascularisation
Le remodelage de la matrice extracellulaire s'accompagne d'une
diminution du nombre de capillaires et de la formation de vaisseaux de gros
calibres : artérioles et veinules. L'arrêt de la neoangiogénèse est sous
l'influence du TGFp et de la composition de la matrice extracellulaire
(fibronectine, collagène). Le TGFp inhibe la prolifération des cellules
endothéliales de manière directe ou en inhibant l'activité de facteurs
angiogéniques comme
1987). Le collagène
endot héliales (Madri,
le FGF et I'EGF (Auerbach. W., 1994 ; Takehara, K.,
type I inhibe in vitro la migration des cellules
J.A., 1992). De plus, la liaison des facteurs
angiogéniques aux composants matriciels pourrait moduler leur mode d'action
sur les cellules cibles. C'est le cas du FGF avec les sulfates d'héparan, et du
TGFP avec le collagène de type IV ou les protéoglycans (Folkman, J.. 1992 ;
Ruoslahti, E., 1991).
1.4.3 Diminution de la densité cellulaire
Si les facteurs stimulant la prolifération fibroblastique et les activités de
synthèse des macromolécules de la matrice extracell ulaire sont en grande
partie identifiés, les messages qui arrêtent ces processus sont moins bien
connus. L'interféron y semble y jouer un rôle de premier ordre, en inhibant
directement la prolifération des fibroblastes et la production de collagène
(Duncan, M.R., 1985 ; Jimenez, S.A., 1984). La matrice collagénique elle
même pourrait exercer un rétrocontrôle négatif sur la prolifération des
fibroblastes, ainsi que sur sa synthèse (Clark, R.A.F., 1993).
En conclusion, la cicatrisation cutanée regroupe un ensemble
d'événements coordonnés (récapitulatif dans la figure 6)) au sein desquels
les facteurs plaquettaires se positionnent à la fois comme initiateurs et
modulateurs. La croissance de nos connaissances de la physiologie et de la
biologie de la cicatrisation ouvre des perspectives importantes pour la
compréhension et la prise en charge thérapeutique des états déficients de la
réparation cutanée tels que le vieillissement physiologique et le diabète.
1 1 I N F L A M M A T I O N 1
\ Remodelage /'
1 Contraction
Figure 6. Récapitulatif des principaux 6v6nernentr impliqués dans la
cicatrisation cutanée.
(modifié, d'aprés Barbul, A., Pines, E., Caldwell, M., Hunt, T.K (eds). 1988. in :
Gmwth factors and other aspects of wound healing : Biological and dinical
implications)
FACTEURS DE CROISSANCE PLAQUETTAIRES
2.1 Généralités
2.1.1 Définition
Identifiés à partir d'extraits tissulaires ou de séquence d'ADNc, les
facteurs de croissance ont été initialement dénommes pour leur capacité de
stimuler la prolifération cellulaire. Cette caractéristique les distingue des
éléments essentiels, cofacteurs et nutriments qui sont nécessaires aux
processus métaboliques, mais qui sont insuffisants pour initier la division
cellulaire. Aujourd'hui, on reconnaît aux facteun de croissance plusieurs
activités régulatrices dans la physiologie cellulaire, et les auteurs s'accordent
pour dire que la terminologie de ((facteurs polypeptidiques régulateurs)) leur
serait plus approprié (Robinson, C. J., 1 993).
Au cours des différentes étapes de la cicatrisation cutanée, les
facteun de croissance sont acheminés par voie sanguine au site de la plaie,
ou libérés localement par différents types cellulaires : plaquettes sanguines,
polynucléaires, monocytes, macrophages, fibroblastes, cellules endothéliales
et kératinocytes. La, ils agissent de concert selon un mode endocrine.
paracrine ou autocrine (Figure 7) pour stimuler la migration, la prolifération et
l'activité biosynthétique des cellules.
Les principaux facteurs de croissance plaquettaires, dont il sera
question dans la discussion qui suit, appartiennent a quatre grandes familles:
PDGF, TGFp , IGF et EGF. Ils sont aussi libérés par d'autres types
cellulaires, et constituent, avec le FGF, les facteurs de croissance clés
impliqués dans la réparation tissulaire. Ce sont des polypeptides de petit
poids moléculaire (compris entre 5 et 30 kDa), synthétisés sous la forme de
précurseur de haut poids moléculaire, dont le clivage protéolytique donne
naissance à la protéine biologiquement active.
2.1.2 Récepteurs
L'activité des facteurs de croissance s'exerce par l'intermédiaire de
récepteurs à haute affinité localisés dans la membrane plasmique des cellules
cibles (Figure 8). Ces récepteurs sont des glycoprotéines transmembranaires
à traversée unique comportant 3 domaines : un domaine extracellulaire se
liant au signal externe, un domaine transmembranaire hydrophobe et un
domaine intracellulaire possédant un site catalytique kinase spécifique des
résidus tyrosine (PDGF, IGF-1, EGF) ou sérine et thréonine (TGFB).
2.1 .3 Mécanismes d'action post-rece~toriels
La liaison du facteur de croissance au récepteur entraîne un
changement conformationnel dans le domaine extracellulaire du récepteur qui
provoque 'sa dirnérisation. La dimérisation du récepteur permet de stabiliser
les interactions entre les domaines cytoplasmiques adjacents et conduit à
l'activation de la fonction kinase (Ullrich, A., 1990). La structure
heterotétramérique du récepteur de I'IGF-1 représente une variation de ce
thème. Ici, la liaison du facteur de croissance au récepteur induit une
interaction allostérique des 2 moitiés ap.
Quoiqu'il en soit, l'activation de la tyrosine kinase conduit à la
phosphorylation des résidus tyrosine présents dans le récepteur
(autophosphorylation) et ceux de différentes substrats intracellulaires tels que
la phosphatidylinositol3-kinase (Ptdlns3-kinase) , le facteur activateur de la
GTPase (GAP), la phospholipase Cy (PLCy), le raf. La phosphorylation de ces
protéines intracellulaires est un des premiers maillons de la chaîne de
transduction du signal biologique dont on commence à entrevoir les
mécanismes (Pazin, M.J., 1992 ; Ullrich, A., 1990).
ENDOCRINE PARACRINE AUTOCRINE
Figure 7. Les modes d'action des facteurs de croissance.
ENDOCRINE: le facteur de croissance véhiculé par la circulation sanguine, agit a distance de son foyer initial de synthèse et de sécrétion ; PARACRINE: le facteur de croissance agit sur une cellule adjacente ; AUTOCRINE: le facteur de croissance agit sur la cellule qui le secrète.
Recepteur EGF IGF-1 PDGFa PDGF B TGFB
type II
Ligand EGF, TGFa, IGF-1, IGF2 PDGF AA, PDGF TGFPI,
HBEGF Insuline AB, BB BB, AB p2, p3
Arnphiréguline
Figure 8. PropriétBs biochimiques des rdcepteurs des facteurs de croissance plaquettaires.
RBgion riche 1 :;::ne tyrosine O Domaine &rine en cystéines 3 ~Pm$noglobu~ines r thréonine kinase
IK: lnterkinase
2.2 PDGF
2.2.1 Structure moléculaire
Le PDGF est une glycoprotéine dimérique d'environ 30 kDa. II est
constitué de 2 chaînes polypeptidiques A et B, codées par 2 gènes
homologues. Ces 2 chaînes , de taille identique, présentent entre elles une
homologie de structure de 60% avec une conservation parfaite des 8 résidus
cystéines. Elles sont reliées entre elles par 3 ponts disulfures, et peuvent
s'associer pour former des homo- ou des hétérodimères (AA, BB, AB)
(Antoniades, H.N., 1983 ; Heldin, C. H., 1979 ; Johnson, A., 1982). Elles sont
synthétisées chacune a partir d'un précurseur comportant respectivement 21 1
et 109 acides aminés. La dimérisation et la formation des ponts disulfures a
lieu durant la synthese, dans le réticulum endoplasmique. La structure
dimérique est nécessaire à l'activité biologique du PDGF : la réduction de la
molécule inactive le PDGF de manière irréversible.
2.2.2 Origine cellulaire
La synthese du PDGF a lieu principalement dans les rnégacaryocytes.
Le facteur est stocké dans les granules a des plaquettes et libéré lors de
l'activation plaquettaire. Chez l'homme, les plaquettes sanguines produisent
les 3 isoformes de PDGF : AB (65%). BB (23%), AA (12%) (Hammacher, A.,
1988). On retrouve environ 0.06 ng de PDGF par 106 plaquettes (Ross, R.,
1986). Le PDGF porcin est un homodimère de chaînes B, et présente des
caractéristiques structurales et immunologiques très voisines du PDGF B
humain (Poggi, A., 1984 ; Stroobant, P., 1984).
Au cours de la cicatrisation cutanée, le PDGF est aussi synthétisé et
sécrété par d'autres types cellulaires : cellules endothéliales, cellules
musculaires lisses vasculaires, fibroblastes (Ross, R., 1986). Les
macrophages synthétisent une protéine apparentée au PDGF qui se lie au
récepteur de PDGF (Matsuoka, J., 1989). Cette protéine ainsi que le PDGF
AA se retrouve dans le liquide de la plaie plusieurs jours après la chirurgie
(Dvonch, V. M., 1992).
2.2.3 Récepteur
L'activité du PDGF s'exerce par l'intermédiaire de 2 types de
récepteurs cellulaires a et p. Ces 2 récepteurs possèdent un domaine
extracellulaire comportant 5 boucles immunoglobulines )) (Figure 8, p 29),
et peuvent former les dimères aa, ap et pp. Le PDGF BB peut se lier aux 2 récepteurs. tandis que le dimère AA ne
peut interagir qu'avec le récepteur a (Hart, C.E., 1988 ; Heldin, C.H.. 1988).
Les récepteurs au PDGF sont présents sur les fibroblastes, les cellules
endothéliales capillaires. les cellules musculaires lisses vasculaires. mais
peuvent être induits dans les cellules telles que les kératinocytes qui ne les
expriment pas à l'état basal (Antoniades, H.N., 1991). La plupart des cellules
possèdent 5 fois plus de récepteurs p que de récepteurs a, et les 2 types de
récepteurs ne semblent pas conduire à la même réponse biologique. Par
exemple, seul le récepteur p ( et donc la forme BB ou AB du PDGF) transmet
le signal chimiotactique pour les fibroblastes (Heldin, C.H., 1991 ). Ainsi, la
réponse d'une cellule dépend non seulement du type de récepteur qu'elle
exprime, mais aussi de la forme de PDGF qui se présente à elle.
2.2.4 Effets bioloaiaues
Les études menées au cours des vingt dernières années ont permis
d'attribuer au PDGF un rôle dans la pathogénese de I'athérosclérose, la
différenciation cellulaire, l'embryogenèse, et la croissance tumorale. La
découverte de l'homologie entre le PDGF B et le produit de I'oncogene du
virus sarcomatogene simien (v-sis) a permis d'établir le lien entre la
croissance tumorale induite par un virus et le processus de contrôle de la
croissance cellulaire physiologique (Deuel, T.F., 1991).
Au cours de la réparation tissulaire, le PDGF est un médiateur
important. II est chimiotactique pour les polynucléaires neutrophiles, les
monocyteslmacrophages et les fibroblastes. II est mitogène pour les cellules
musculaires lisses, les cellules endothéliales capillaires et surtout pour les
fibroblastes. ln vitm. l'exposition transitoire de fibroblastes au PDGF permet
aux cellules d'entrer dans le cycle cellulaire, c'est à dire de passer de la
phase GO à la phase GI (Figure 9, p 39). Ce critère fait du PDGF un facteur
de compétence, et le distingue des facteurs de progression tels que le FGF et
I'IGF-1 (Morgan. W.J., 1992).
Les fonctions du PDGF sur la réparation épidermique ne sont pas
clairement définies. Les expériences de l'équipe dlAntoniades indiquent que le
PDGF agirait selon un mode autocrine sur les kératinocytes, ce qui implique
une participation directe de ce facteur dans l'activation des cel Iules
(Antoniades, H. N., 1991 ). En effet, absents dans les kératinocytes d'un
épiderme sain, les ARNs messagers de PDGF et de récepteurs au PDGF
sont coexprirnés dans les kératinocytes rapidement après l'induction d'une
plaie. Les niveaux d'expression sont corrélés avec l'évolution du processus
de réparation : élevés en phase proliférative, ils diminuent après
réépithélialisation complète.
Enfin, le PDGF induit la synthèse de composants de la matrice
extracellulaire provisoire (fi bronectine et acide h yaluronique) , ainsi que des
metalloprotéinases inteivenant dans I'angiogénèse et le remodelage cicatriciel
(Deuel, T.F., 1991 ; Jeffrey, J.J, 1992).
2.3 TGFB
2.3.1 Structure moléculaire
Cinq isoformes fortement homologues ont été identifiés (TGFB1 a p5),
dont trois chez l'homme (TGFp1 à TGFB3) (Pimentel, E., 1994). Le TGFP1, le
plus étudié de ces facteurs, est I'isofome tissulaire le plus abondant. et
l'unique isoforme des plaquettes sanguines humaines. Sa structure
moléculaire chez l'homme et le porc est identique (Roberts, A. B., 1 988).
Le TGFp1 est une protéine homodimérique de 25 kDa, comportant 112
acides aminés. Les 2 sous-unités sont reliées entre elles par des ponts
disulfures (Pimentel, E., 1994). Elles sont initialement synthétisées sous la
forme d'un précurseur inactif comprenant 390 acides aminés. dont la
protéolyse de la partie C-terminale génère la molécule de TGFf.3. Dans les
cellules, le segment N-terminal du précurseur reste associé à la molécule de
TGFP pour former un petit ou un grand complexe latent, biologiquement
inactif (Roberts, AB. 1995). Dans le plasma humain, la forme latente de TGF
p a été identifiée comme étant un complexe a*-rnacroglobuline-TGFP.
L'activation des formes latentes dans le milieu extracellulaire, libère la
molécule active, et constitue l'élément déterminant du contrôle des fonctions
biologiques du TGFP. Des études in vitro suggèrent que la plasmine, la
t hrombospondine et l'acidité de la plaie participeraient à ce mécanisme
d'activation (Sato, Y., 1989 ; Schultz-Cherry, S., 1993).
2.3.2 Oriaine cellulaire
Le TGFp est, comme le PDGF, principalement contenu dans les
granules a des plaquettes sanguines. La synthèse et la sécrétion est aussi
assurée dans les polynucléaires neutrophiles, les monocytes, les lymphocytes
T , les cellules endothéliales, les fibroblastes et les kératinocytes (Barbul, A.,
1992 ; Bennett, N.T., 1993 ; Messadi, D.V., 1994 ; Schimd, P., 1993).
Trois types de récepteurs ont été identifiés (Massagué, J., 1994). Le
type Il un peptide d'environ 65 kDa, et le type II (Figure 8, p 29), un peptide
d'environ 100 kDa, sont présents dans de nombreux types cellulaires, tandis
que le type III, molécule d'environ 300 KDa, est beaucoup moins répandu. De
nature protéoglycane, il constitue un récepteur de stockage, et présente le
TGFp avec une affinité accrue à ses deux récepteurs de signalisation (type I
et II), porteurs d'une activité sérinelthréonine kinase par leur domaine
intracytoplasmique. La liaison de TGFB sur le récepteur de type II induit une
hétérodimérisation 1/11 et une transphosphorylation du domai ne
intracytoplasmique du type i par le type II.
2.3.4 Effets biolociiaues
Le TGFP doit son nom à sa capacité de permettre à des fibroblastes
non transformés de proliférer et de former des colonies en culture en agar
mou (DeLarco, J.E., 1 978). 11 est reconnu aujourd'hui pour sa participation
dans l'embryogenèse , le métabolisme des hydrates de carbone, ainsi que la
régulation du système immunitaire (immunosuppression) et de l'hématopoïèse
(Sporn, M.B., 1992).
À la fois chimiotactique. régulateur de la prolifération et de la
différenciation cellulaire, ainsi que de I'angiogénese et du remodelage de la
matrice extracellulaire, le TGFp est le facteur de croissance qui possède le
plus large faisceau d'activités au cours de la réparation tissulaire. Des
concentrations fentomolaires (1 0-l3 à 1 O-'' M) de TGFB sont suffisantes pour
attirer les monocytes, les polynucléaires, les lymphocytes et les fibroblastes
au site de la plaie (Wahl, SM., 1987)' et toutes les études retrouvent une
courbe dose réponse bimodale (Mustoe. T.A.. 1991 ; Roberts, AB., 1995). Le
TGFP permet aussi la migration des kératinocytes.
L'action du TGFp sur la prolifération cellulaire, est bifonctionelle : tantôt
inhibitrice, tantôt stimulatrice. En effet, le TGFp inhibe la prolifération des
kératinocytes. des leucocytes et des cellules endothéliales (Bennett, N.T.,
1993 ; Roberts, A.B., 1995), et se distingue ainsi des autres facteurs de
croissance. II est mitogène pour les fibroblastes en induisant la synthèse et la
sécrétion de PDGF et créant ainsi une boucle autocrine (Soma, Y., 1989).
Par ailleurs. le TGFp est le plus puissant stimulateur connu de la
synthèse du procollagène de type 1 (Ignotz, R.A., 1986). De plus, II induit
également la synthese de glycoaminoglycans, de fibronectine et des
inhibiteurs des metalloprotéinases, tandis qu'il inhibe celle des
métalloprotéinases (Edwards, DR. , 1987 ; Roberts, A. B., 1995). Tous ces
effets favorisent un dépôt net de collagène (Pierce, G. F., 1992 ; Quaglino, D.,
1990). Plusieurs observations plaident d'ailleurs en faveur du rôle de TGFp
dans la formation des cicatrices hypertrophiques et des chéloïdes . ainsi que
dans la fibrogénèse de différentes pathologies inflammatoires chroniques
comme la fibrose pulmonaire idiopathique et la cirrhose hépatique (Border,
W.A., 1992 ; Roberts, A.B., 1995).
Des études prouvent que la participation du TGF p à I'angiogénese est
indirecte, et passe par le recrutement et l'activation des monocytes, sources
de puissants facteurs angiogéniques tels que l'IL-1 et le TNFa (Wahl, L.M..
1992). Enfin, le TGFp intervient aussi dans la différenciation cellulaire. II
permet notamment la transformation des fibroblastes en myofibroblastes, en
provoquant l'expression de l'a-actine (Desmoulieres. A., 1993).
2.4.1 Structure moléculaire
L'IGF-1 (ou somatomedine C) est un monomère de 7.6 kDa composé
de 70 acides aminés et comprenant 3 ponts disulfures. II présente une
homologie de séquence de 50 % avec la proinsuline (Baxter, R.C., 1986). 11
est synthétisé sous la forme d'un précurseur constitué de 195 acides aminés
(Bennett, N.T., 1993).
2.4.2 Oriaine cellulaire
Chez l'adulte, la synthèse de I'IGF-1 est assurée dans de nombreux
tissus (foie, hypophyse, cartilage, os, poumon, rein, muscle squelettique et
cardiaque), sous le contrôle de l'hormone de croissance. Dans le plasma,
I'IGF-1 est lié à des protéines porteuses spécifiques (IGFBP-1 à 6),
régulatrices de son activité locale, et dont la plus abondante est I'IGFBP-3
(Blum, W.F., 1990 ; Shimasaki, S., 1991). L'IGF-1 forme avec I'IGFBP-3, et
une sous-unité acide labile (ALS :acid-labil subunit), un complexe circulant
inactif de 150 kDa. L'IGF-1 est aussi présent dans les granules a des
plaquettes sanguines (Bennett, N.T.,1993 ), il est également produit par les
fibroblastes, et les cellules musculaires lisses sous le contrôle d'autres
facteurs de croissance comme le PDGF et le FGF (Clemmons, D.R., 1983 et
1985).
Le récepteur à I'IGF-1 est semblable au récepteur de l'insuline. C'est
un héterotétramère de 350 kDa, constitué de 2 sous-unités a contenant le site
de liaison de I'IGF-1, et 2 sous-unités P contenant l'activité tyrosine kinase
(Bennett, N.T., 1993). Les 4 sous-unités sont reliées entre elles par des ponts
disulfures (Figure 8, p 29). Le récepteur à I'IGF-1 est présent sur des cellules
impliquées dans la réparation tissulaire telles que les monocytes, les cellules
endothéliales, les fibroblastes, et les kératinocytes (Underwood, L. E., 1 986).
2.4.4 Effets biolocrieiues
L'IGF-1 agit selon un mode endocrine, paracrine, ou autocrine pour
réguler la synthèse de l'ADN, la division et le métabolisme cellulaire. II est
connu pour jouer un rôle dans la croissance des os et du cartilage,
I'embryogénèse , le métabolisme du glucose. et l'athérosclérose (LeRoith, D.,
1 992).
Bien qu'initialement discutée (Lynch, S.E., 1989), la participation de
I'IGF-1 dans la réparation tissulaire est aujourd'hui bien documentée: (1)
I'IGF-1, d'origine plasmatique et de production locale, est présent dès les
premiers jours dans le liquide de la plaie (Suh, DY., 1992)' (2) l'expression
des ARN messagers de I'IGF-1 augmente rapidement après l'induction de la
plaie (Gartner. M. H., 1992), (3) l'administration systémique dilGF-1 permet de
corriger le défaut de cicatrisation chez des rats hypophysectornisés dont les
taux d'lGF-1 plasmatique sont diminués (Mueller, R-V., 1994), (4) In vitro,
I'IGF-1 est chimiotactique pour les cellules endothéliales (Grant, M., 1987). et
(5) il stimule la prolifération des fibroblastes en permettant aux cellules
d'atteindre la phase de synthèse d'ADN (Morgan, C.J., 1992).
2.5 EGF
2.5.1 Structure moléculaire
L'EGF appartient à une famille de quatre protéines, qui comprend
également le TGFa, I'amphiréguline et I'EGF liant l'héparine (H BEGF). Ces
protéines sont caractérisées par une structure comportant 3 boucles
maintenues chacune par un pont disulfure. nécessaire à leur activité
biologique (Bennett, N.T., 1993). L'EGF est un monomère de 6,2 kDa,
constitué de 53 acides aminés, et synthétisé sous la forme d'un précurseur
glycoprotéique transmembranaire de 1207 acides aminés (Bell, G. I., 1 986 ;
Bennett, N.T., 1993).
2.5.2 Origine cellulaire
Initialement isolé a partir de glandes sous maxillaires de souris mâles,
I'EGF est aussi synthétisé dans le rein, la glande lacrymale. les glandes de
Brunner, et il est retrouvé dans la salive, les larmes et l'urine (Bennett. N.T.,
1 993). Les mégacaryocytes synthétisent de I'EGF que l'on retrouve dans les
plaquettes (environ 500 prnoll10'~ plaquettes) (Pesonen, K., 1 989).
2.5.3 Récepteur
Tous les membres de la famille EGF se lient au même récepteur, une
glycoprotéine transmembranaire de 170 kDa (Carpenter, G., 1990) (Figure 8,
p 29). Une cellule normale possède environ 20,000 récepteurs EGF (Gill,
G.N., 1987). Le récepteur à I'EGF est le premier récepteur protéique qui fut
identifié à une kinase spécifique de la tyrosine (en 1982), et, plusieurs années
plus tard, on montra que l'oncogène viral erbB codait une version tronquée de
ce récepteur dépourvue de domaine extracellulaire, mais possédant un
domaine tyrosine kinase constitutivement actif (Carpenter, G., 1 990).
2.5.4 Effets biolorriaues
Inhibiteur de la sécrétion gastrique chez l'homme et dénommé pour
cela urogastrone, I'EGF est aussi impliqué dans l'embryogenèse, et dans le
métabolisme et la physiologie cellulaire (synthèse d'ADN, phosphorylation des
protéines, transport d'ions). En 1965, Cohen démontre que I'EGF stimule la
prolifération des cellules épidermiques (Cohen, S., 1965). Les études
ultérieures révèlent qu'il est également mitogene pour les fibroblastes,
chimiotactique pour les kératinocytes et les fibroblastes, et qu'il partage ces
caractéristiques avec le TGFa (Bennett, NT., 1993).
Facteurs de compétence PDGF et FGF permettent le passage de Go (état quiescent) à Gj
Facteurs de progression IGF-1 et EGF permettent la progression dans la phase Gq
Figure 8. Effets complémentaires des facteurs de croissance au cours
du cycle cellulaire de cellules quiescentes (exemple : fibroblastes). Les 4
phases du cycle cellulaire dans l'ordre successif : G1 : (gap 1) phase de
préparation ; Ga : (gap 2 ) ; S : synthèse des histones et de l'ADN ; M : mitose
et cytodierèse.
PDGF
EGF
Figure 10.
Origine cellulaire 1 Cellules cibles 1 Effets biologiques
synthkse de composants matriciels
a @
@ @ @ 1 @ $ chirniotactisrne
@ @ 3 chirniotactisrne prolifération.
a prolifération
chirniotactisrne
a
- QS chirniotactisrne, prolifération
Principaux effets biologiques des facteurs de croissance
-*
plaquettai res.
prolifération, synthèse de collagene
PHARMACOTHERAP~E RÉPARATRICE DES PLAIES CUTANÉES
Les plaies cutanées sont un domaine important de la dermatologie.
puisqu'elles concernent aussi bien la plaie superficielle, le geste de petite
chirurgie, la brûlure, que des pathologies chroniques telles que l'ulcère
diabétique, l'ulcère veineux ou l'escarre de décubitus. Ces pathologies, dont
la fréquence. liée au vieillissement de la population, est en continuelle
croissance, constituent un véritable problème de santé publique. et posent
d'importants défis thérapeutiques.
Le traitement des plaies cutanées a de tout temps, suscité un grand
intérêt. Les premiers écrits datent de l'Égypte antique, et sont retrouvés dans
les papyrus d'Edwin Smith (1500 av J.C.) et dlEbers (1550 av. J.C.) qui
décrivent notamment l'utilisation de miel, ingrédient qui aurait des propriétés
antiseptiques, aseptiques et antibiotiques (Brown, H., 1992). La complexité du
processus de guérison a historiquement limité les approches
pharmacologiques visant à accélérer la réparation tissulaire, et a favorisé le
développement de pansements et de topiques davantage orientés vers la
protection et le confort de la plaie, et dont l'efficacité clinique n'a pas toujours
été prouvée.
L'amélioration des connaissances en physiologie de la cicatrisation
cutanée, et en particulier l'identification du rôle des facteurs de croissance, a
permis d'envisager depuis les dix dernières années de nouvelles voies
pharmacathérapeutiques. Des études précliniques ont testé un, ou plus
rarement, 2 facteurs de croissance, sur différents modèles de plaies
physiologiques et pathologiques. Dans la plupart des études, les molécules
ont été obtenues par ADN recombinant. Les résultats cnt été très
encourageants. et plusieurs de ces molécules sont en cours d'évaluation
clinique.
3.1 Facteurs de croissance
3.1.1 PDGF
3.1.1.1 Études précl iniaues
Le PDGF a été largement teste sur plusieurs modèles de guérison
physiologique (incisions et excisions chirurgicales). L'application locale de
concentrations supraphysiologiques de PDGF induit la formation d'un tissu de
granulation plus abondant, une angiogénese plus développée, une
épithélialisation plus rapide, et une cicatrice plus solide (Pierce, G.F., 1988;
Pierce, G.F., 1991; Pierce, G. F., 1992 ; Mustoe, T.A., 1991 ). Le PDGF aurait
pour principales cibles les macrophages, et déclencherait une série
d'événements sécrétoires tels, qu'une application unique le jour de la chirurgie
est suffisante pour influencer la réparation pendant 49 jours (Pierce, G.F.,
1989b). La plupart des effets sont reproductibles dans diverses situations
pathologiques (diabète, ischémie, irradiations) (Grotendorst, G. R., 1985 ;
Greenhalgh, DG., 1990 ; Mustoe, T.A., 1989 ; Mustoe, T.A., 1994a).
Études cliniaues
Des études cliniques menées en double aveugle, montrent que 28
jours de traitement quotidien au PDGF-BB diminue de près de la moitié la
taille des escarres de décubitus (Robson, MC., IW2b ; Mustoe, T.A., 1 9Wb,
Pierce, G.F., 1994). Dans l'une d'entre elles, l'analyse morphologique et
imrnunohistochimique des biopsies prélevées au bord de l'ulcère, révèlent que
les lésions traitées présentent une quantité de fibroblastes et de
néovaisseaux plus importante, ainsi qu'une maturation du collagène plus
avancée que les plaies contrôles (Pierce, G. F., 1994).
Par ailleurs, Steed et col1 rapportent une augmentation significative de
la guérison des ulcères diabétiques, après 20 jours de traitement quotidien au
PDGF-BB incorporé a un gel de methylcellulose (Steed, D.L., 1995b).
3.1.2 TGFB
3.1.2.1 Études ~récliniaues
Le TGFP, administré localement en solution saline ou incorporé a
diverses matrices (méthylcellulose à 3%. émulsion ou éponge de collagène).
induit une augmentation significative de la solidit6 des plaies chirurgicales
(Mustoe. T.A., 1987, Ksander, A.K., 1989 ; Pierce. G.F., 1 98Sb, Pierce, G.F..
1991). L'effet est également démontré chez le rat âgé (Puolakkainen, P.A.,
1995). ainsi que dans d'autres modèles de plaies avec retard de cicatrisation
(radiothérapie, traitement aux glucocorticoïdes ou à I'adriamycine) (Cromack.
D.T., 1993 ; Pierce, G.F., l989a ; Curtsinger, L. J., 1989). De plus, le TGF p apparaît tout aussi efficace lorsqu'il est administré par voie intraveineuse
(Beck, L. S., 1993), ce qui indique qu'il peut aussi agir en mode endocrine.
La diminution de la production des monocytes médullaires par
radiothérapie (Cromack. D.T.. 1993 ) et la disparition locale de macrophages
induite par un traitement aux glucocorticoïdes (Pierce. G. F.. 1 98%).
n'empêchent pas l'expression de l'activité du TGFp, ce qui suggère que les
fibroblastes sont les principales cibles du traitement et écarte l'implication des
macrophages.
3.1.2.2 Études cliniaues
Les propriétés immunosuppressives et fibrosantes du TGF P ont
dictées la prudence dans la conduite des études cliniques. La première étude
clinique, toute récente, portant sur des ulcères veineux. a été peu concluante.
principalement à cause d'un effet placebo important (Robson, M.C.. 1995).
Toutefois, il est a noter que le TGF p2 s'est avéré antérieurement efficace sur
une série de trous maculaires, en induisant une fibrose localisée responsable
d'une adhésion choriorétinienne et d'une amélioration de la vision (Glaser,
B.M., 1992).
3.1.3 EGF
3.1.3.1 Études ~récliniaues
Chez le rat et le porc, l'application d'EGF permet d'accélérer la
réépithélialisation de plaies cutanées profondes (Brown, G. L., 1986 ; Nanney,
L.B., 1 990)' augmente le volume du tissu de granulation (Nanney, L.B., 1990),
et la solidité des plaies (Brown, G. L., 1 988 ; Norquist, R., 1 988). Les auteurs
expliquent I'activité de I'EGF sur la réparation dermique par la stimulation de
la prolifération des fibroblastes, et conséquemment le dépôt de collagène.
3.1.3.2 Études cliniaues
L'application d'EGF à des zones donneuses de patients nécessitant
une greffe cutanée, a permis une régénération épidermique plus rapide
(Brown, G.L., 1989). Par ailleurs, un traitement biquotidien à I'EGF sur une
petite série d'ulcères chroniques survenus dans des situations variées
(diabète, arthrite rhumatoïde, ancienne cicatrice de brûlure), a montré une
réduction de la taille des lésions, précédemment traitées sans succès avec
des thérapeutiques classiques (Brown, G.L., 1991).
Les résultats de récentes études souligne l'importance des protéines
porteuses dans le contrôle de l'activité de I'IGF-1. En effet. l'application
simultanée dYlGF-1 et dllGFBP-1 augmente la solidité des incisions
chirurgicales (Jyung, R.M., 1994b), et induit un tissu de granulation plus
abondant dans un modèle d'ulcère cutané (Zhao, L.L., 1995), tandis que
l'application d'lGF-1 seul reste sans effets. Le résultat est superposable chez
l'animal irnmunosupprhné, avec l'administration systémique d'lGF-1 et
d'lGFBP-3 (Hamon, G.A., 1993). A ce jour, aucune étude clinique utilisant
I'IGF-1 n'a été menée.
La plupart des études ont intéressé le bFGF, le mieux caractérisé des
membres de la famille FGF qui comprend au moins 9 polypeptides
homologues (Mason, 1. J., 1 994). Mitogene pour les fibroblastes et puissant
facteur angiogénique (Montesano, R., 1986)' le bFGF induit in vivo une
angiogenèse très développée et un dépôt de collagène qui se traduit par une
cicatrice plus solide (Mustoe, T.A., 1991 ; Pierce, G.F., 1992 ; Hom. D.B.,
1992). Cependant, il apparaît inactif en milieu ischémique (Mustoe, T.A..
1 994a).
Chez l'homme, les résultats de la première étude clinique indiquent que
le bFGF peut être efficace pour traiter les escarres de décubitus (Robson.
M.C., 1992a). Après 22 jours de traitement (à raison d'une application locale
tous les 3 jours), 70% des lésions traitées au FGF ont totalement guéri.
L'analyse des biopsies révèle une augmentation de la densité des fibroblastes
et des neovaisseaux.
3.1.6 Traitements rnultifactoriels
Très peu d'études ont évalué l'effet d'un traitement comportant une
association de facteurs de croissance. En comparant les effets de l'application
de PDGF et d'lGF-1 sur des plaies cutanées chez le porc, Lynch et col1
démontrent que la combinaison des deux facteurs induit une réponse
dermique (largeur du tissu de granulation) et épidermique (hauteur du
néoépiderme et longueur des projections épithéliales) plus importante que ne
le fait le PDGF seul, tandis que I'IGF-1 seul est sans effets (Lynch, S.E..
1987). La réponse dermique est corrélée avec une augmentation de la
densité des fibroblastes, et vient confirmer les effets synergiques du PDGF et
de I'IGF-1 observés in vitro (Morgan, C.J., 1992). Des études ultérieures ont
confirmées l'action synergique de PDGF et IGF-1 sur la réparation cutanée en
montrant notamment une augmentation de la formation de col!agene attestée
par des dosages d'hydroxyproline (Lynch, S.E., 1989). Par ailleurs, Kiritsy et
col1 ont montré que l'application quotidienne de PDGF-BB et d'lGF-1, chez
des souris diabétiques âgées de plus de 15 semaines, accélère d'environ
30% la fermeture des plaies comparativement au PDGF-BB seul (Kiritsy,
C.P., 1995). Cependant, ces résultats ne sont pas retrouvés chez des souris
diabétiques plus jeunes (8 à 12 semaines), ou seule la combinaison PDGF et
IGF2 s'avère efficace (Greenhalgh, D.G., 1993). Selon les auteurs, les taux
élevés d'insuline endogène chez les souris jeunes (jusqu'à 10 fois supérieurs
à ceux des souris âgées), et son affinité pour les récepteurs a I'IGF-1 lui
permettrait d'entrer en compétition avec I'IGF- 1 exogène, ce qui expliquerait
les résultats divergents entre les deux études.
3.2 Extraits plaauettaires
En 1982, Knighton décrit une technique originale qui permet d'extraire
des facteurs biologiquement actifs contenus dans les plaquettes sanguines
(Knighton, D.R., 1982). La PDWHF (Platelet derived wound healing formula),
actuellement commercialisée (Curative Technologies, Inc., Setauket, N.Y.),
est une préparation plaquettaire autologue. Elle est constituée principalement
de PDGF, TGFP, EGF, PF4 ainsi que de fibronectine et de thrombospondine.
En bref, des échantillons sanguins sont collectés dans des tubes siliconés
contenant un tampon acide-citrate-dextrose, et centrifuges. Le surnageant, le
plasma riche en plaquettes, est centrifugé. Le concentré plaquettaire alors
obtenu est suspendu dans une solution tampon (108 plaquetteslml) et incubé
avec de la thrombine (1 Ulml), ce qui permet de libérer les facteurs
biologiques.
Une activité de ces facteurs a pu être démontrée in vivo, chez le lapin
(Knighton, D.R., 1982). L'injection de concentré plaquettaire dans la cornée
entraîne un épaississement du stroma cornéen avec une augmentation de la
densité des capillaires et des fibroblastes, et une augmentation des taux
d'h ydroxyproline comparativement aux cornées contrôles.
Sur la base de ces résultats, la première étude clinique est menée
chez 49 patients porteurs d'ulcères chroniques d'étiologies variées (Knighton,
D. R., 1986). Les auteurs rapportent une réépithélialisation complète en moins
de 5 mois (1 0.6 semaines en moyenne) de toutes les lésions, traitées chaque
jour avec des extraits plaquettaires autologues. Bien que deux autres études
(Knighton, D.R., 1990 ; Atri, S.C., IWO) viennent étayer ces résultats. le
potentiel thérapeutique de ces préparations plaquettaires est vite mis en
doute (Krupski, W.C., 1991). Plus encore, récemment, Steed et col1 ont
constaté un taux de récidives élevé (68.8%) pour 16 patients diabétiques dont
les plaies avaient apparemment guéries après 20 semaines de traitement
(Steed, D. L., 1 995a).
3.3 Autres approches théra~eutiaues
Les facteurs stimulateurs des colonies (GM-, G-, et M-CSF) et les
interleukines (IL-1, IL-2) ont fait l'objet de récentes études précliniques (De
Cunzo, L.P., 1990 ; Middleton, S.C., 1991 ; Jyung, R., 1994a), mais les
résultats obtenus restent encore parcellaires pour offrir de véritables espoirs
sur le potentiel thérapeutique de ces cytokines. II en est de même pour les
composants de la matrice extracellulaire (acide hyaluronique, collagène).
Les greffes composites, comprenant un épiderme de culture et un substitut
dermique, sont en cours d'évaluation (Hansbrough, J.F., 1993), et
représentent une alternative intéressante pour le traitement des plaies avec
perte de substance.
II. PRESENTATION DU PROJET DE RECHERCHE
1 BUT DU PROJET DE RECHERCHE
Le but de ce projet de recherche est de démontrer que la préparation
de facteurs plaquettaires, obtenue dans nos laboratoires par une méthode
originale d'extraction, est biologiquement active in vivo en permettant
l'accélération de la guérison de plaies cutanées.
JUSTIFICATION
1. Malgré la profusion de produits revendiquant des propriétés
cicatrisantes. il n'existe à ce jour aucun traitement médical qui
permet d'accélérer de manière fiable et reproductible la guérison des
plaies cutanées. Les ulcères chroniques et les plaies des sujets
âgés sont des situations connues pour leur cicatrisation déficiente.
Elles représentent aux côtés de la plaie chirurgicale et de la perte de
substance traumatique, autant de cibles thérapeutiques.
2. Les facteurs plaquettaires, en particulier le PDGF, le TGFP et la
fibronectine, sont libérés dans les premières minutes qui suivent une
lésion, et contribuent à l'initiation et à la progression du processus
de réparation. Ces facteurs agissent de manière synergique et
complémentaire pour stimuler la migration. la prolifération et l'activité
biosynthétique des cellules.
3. Chez l'Homme et chez l'animal, l'application locale de facteurs de
croissance exogènes augmentent la quantité du tissu de granulation,
le dépôt de collagène, la néoangiogénese, la solidité de la cicatrice
et facilitent la fermeture des plaies. Les effets sont plus importants
lorsque 2 facteurs sont associés.
4. Les extraits plaquettaires préparés dans nos laboratoires
contiennent des facteurs de croissance (PDGF, TGFp) et de la
fibronectine. Ils ont démontré in vitm leur activité et leur innocuité.
En effet, testés sur des cuttures primaires de fibroblastes de porc, ils
induisent une prolifération cellulaire significativement augmentée par
rapport au contrôle, tout en préservant la physiologie des cellules.
3 OBJECTIFS SPÉCIFIQUES
Pour atteindre notre but, deux expérimentations ont été menées chez
le porc, animal phylogénétiquement proche de l'homme. Les tissus cutanés
porcin et humain sont comparables du fait de leur épaisseur identique, de la
raréfaction relative de la pilosité et de la présence d'une couche adipeuse
sous cutanée. Dans la première partie expérimentale, les études ont porté sur
un modèle de cicatrisation par première intention, représentatif de véritables
plaies chirurgicales. Dans la seconde partie expérimentale, on a choisi un
modèle de cicatrisation par seconde intention qui permet d'apprécier le
recouvrement épidermique, critère essentiel de la guérison de plaies avec
perte de substance.
3.1 Modèle de cicatrisation par memière intention
Nous avons teste l'effet de l'application locale des extraits plaquettaires
sur des incisions chirurgicales linéaires suturées. Ces effets ont été comparés
chez le même animal à celui d'un traitement placebo, afin d'écarter les
variations physiologiques inter-individuelles. Les objectifs spécifiques sont les
suivants :
1. Déterminer la concentration optimale d'extraits plaquettaires qui
permet d'obtenir une guérison rapide et une cicatrice solide. Trois
concentrations croissantes ont été testées.
2. Déterminer les effets des extraits plaquettaires au cours de
l'évolution du processus de réparation. de la formation du tissu de
granulation à celle de la cicatrice fibreuse mature. Quatre temps
d'évolutions ont été étudiés : 5, 7, 10 et 28 jours postopératoires.
Pour ce faire, nous avons évalué la solidité de la cicatrice par
tensiométrie et la qualité de la réparation tissulaire par une analyse
morphologique et une étude histologique quantitative comprenant: surface,
largeur moyenne et cellularité de la plaie, surface du collagène cicatriciel.
Dans la majorité des travaux publiés dans la littérature, l'évaluation des
paramètres histologiques repose sur des études qualitatives ou semi
quantitatives, introduisant une grande part de subjectivité dans l'analyse. Les
quelques études véritablement quantitatives (décompte cellulaire à l'aide d'un
compteur manuel, mesure des surfaces par planimétrie ou calculs
mathématiques) restent longues, fastidieuses et souvent imprécises. Devant
ces carences, il nous a semblé intéressant de développer une méthode
d'analyse facilement reproductible qui permettent de quantifier avec précision
les paramètres histologiques. Nous avons pour cela choisi d'utiliser un logiciel
d'analyse d'images, récemment commercialisé, qui offre une grande
souplesse dans la manipulation de l'image microscopique.
3.2 Modéle de cicatrisation Dar seconde intention
Nous avons testé l'effet de l'application locale des extraits plaquettaires
sur des plaies chirurgicales circulaires. Comme dans le premier modèle, ces
effets ont été comparés chez le même animal à celui d'un traitement placebo.
Une seule concentration d'extraits a été testée, choisie sur la base des
résultats de la première partie expérimentale. L'objectif est de déterminer les
effets des extraits plaquettaires sur ta réparation dermique et épidermique à 5
et 7 jours postopératoires. L'évaluation a été faite par histologie qualitative et
quantitative.
1 PRÉPARATION DES EXTRAITS PLAQUETTAIRES îEPP1
1.1 Animaux et rél lève ment sanauin
Un jeune porc mâle Yorkshire (20 à 28 kg) a été acclimaté aux
conditions de l'animalerie pendant 2 à 5 jours, avec nourriture et boisson à
volonté. Le jour du prélèvement sanguin, l'animal a été anesthésié au
fiuothane (Halothane à 2%. Wyeth-Ayerst Canada) après prémédication de
Kétamine (22 rnglkg en injection intramusculaire, Kétaset, Wyeth-Ayerst
Canada). On a procédé a une trachéotomie en introduisant un tube de 7mm
(Mallinckrodt Canada) dans la trachée. Après avoir branché l'animal au
respirateur, on a dégagé la carotide et on y a introduit un cathéter
cardiovasculaire (7F, Pro Flo, USCI) connecté à un robinet à deux voies
(Baxter) et à un septum (Jetco). Après avoir injecté environ 2 ml de salin
hépariné dans le système de canulation et aspiré le même volume. on a
collecté environ 450 ml de sang stérile dans le sac principal d'un sac triple
(CLX CPDA-1 , Miles Canada).
1.2 Prénaration du plasma riche en la au et tes PRP)
Le sang a été centrifugé à 1375 g pendant 4.5 niinutes (Frein : 3, Rotor
JS-4.2, Centrifugeuse Beckman J6-B). Le surnageant, le plasma riche en
plaquettes (PRP), a été transféré dans le deuxième sac.
1.3 Préparation du concentre daauettaire
Le PRP a été immédiatement centrifugé à 5000 g pendant 5 minutes
(Frein maximum, Rotor JS-4.2, Beckman J6-6). Le surnageant, le plasma
pauvre en plaquettes a été transféré dans le troisième sac. II est resté dans le
deuxième sac un volume d'environ 10 ml : le concentré plaquettaire. Un sac
de plasma-Lyte A a été connecté à un dispositif de médication secondaire
suivi d'un septum et d'une aiguille de 18Gx l'h. et 48 g de plasma-Lyte A
(Baxter) ont été alors injectés dans le deuxième sac. Puis, on a laissé reposer
le concentré plaquettaire pendant 2 heures. II a été ensuite déposé sur un
agitateur horizontal a 25 RPM pendant toute la nuit à 22 O C .
i .4 Lavaae du concentré daauettaire
Le lendemain. les contenus des 6 concentrés plaquettaires ont été
rassemblés dans un sac leukotrap à 6 lignes et centrifugés à 180 g pendant
15 minutes (Frein maximum, Rotor JS-4.2, Beckman J6-B). Le surnageant a
été transféré dans un sac C M à 6 lignes eo: centrifugé à 5000 g pendant 8
minutes (Frein maximum, Rotor JS-4.2, Beckman J6-B). Le surnageant a été
jeté, et on a injecté 48 g de plasma-Lyte A dans le sac contenant le culot Je
plaquettes. On a laisse reposer le culot pendant 1 heure, II a été ensuite
déposé sur un agitateur horizontal à 23 RPM jusqu'à resuspension complète
(environ 1 heure). On a introduit alon 360 g de plasma-lyte A. On a mesuré
le volume obtenu, et on a prélevé 1 ml dans un tube en polypropylène pour
comptage hématologique (plaquettes, globules rouges, globules blancs). La
moyenne de plaquettes par sac est de 571. 13x10~. On a transféré le tout
dans des tubes coniques de 250 ml et on a centrifugé à 2900 g pendant 20
minutes (Frein maximum, Rotor JS-4.2, Beckman J6-B).
1.5 Extraction
Le surnageant a été jeté, le culot resuspendu à 1x1 0'' plaquettes I ml
avec de l'eau picopure a 4OC, puis gelé en couches minces dans l'azote
liquide, pour être enfin lyophilise. Les plaquettes lyophilisées ont été
resuspendues dans de l'eau picopure à 4OC1 et centrifugées dans des tubes
Oak Ridge à 40,000 g pendant 30 minutes à 4OC (Frein maximum. Rotor JA-
20, Beckman J2-21). Les échantillons ont été aliquotés dans des tubes de 1,
2, ou 5 ml que'l'on a conservé a -80°C.
2 TESTS DE VALIDATION
Dans un but comparatif, tous les tests décrits ci-dessous ont été
effectués en parallèle sur un échantillon d'extraits plaquettaires PTRF
(« platelet thrombin releasing factors D) préparé dans nos laboratoires
conformément à la méthode décrite par Knighton (Knighton. D.R., 1982).
2.1 Dosacle des constituants
2.1.1 Protéines
Les concentrations en protéines ont été mesurées par la méthode de
Lowry (Lowry, D. H . , 1 95 1 ), avec utilisation d'une trousse commerciale (Sigma
Chemical, St Louis, MO).
2.1.2 PDGF
Les concentrations en PDGF ont été mesurées par dosages
radioimmunologiques (RIA) avec des anticorps dirigés contre le PDGFBB
humain. Les réactifs ont été fournis dans une trousse commerciale
(Amersham International, UK). Les extraits à doser ont été incubés 20 à 24
heures à 22OC avec le PDGFBB radioactif et les anticorps, puis le complexe
antigène-anticorps a été précipité avec un anticorps anti-immunoglobulines G
de chèvre (18 à 24 heures d'incubation à 22 OC). Les tubes ont été
centrifugés 35 minutes à 3200 RPM. On a mesuré la radioactivité des culots à
l'aide d'un compteur gamma (Micromedic, 4/600). Tous les échantillons ont
été dosés en duplicata.
Les concentrations en TGFp1 ont été mesurées par dosage
immunoenzymatique (méthode ELISA). Les réactifs ont été fournis dans une
trousse commerciale (Test quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN).
Toutes les étapes techniques ont été effectuées conformément au
protocole du manufacturier. Avant les dosages, les extraits ont été mélangés
à de l'acide chlorydrique 1 N, incubes pendant 10 minutes à température
ambiante, puis neutralisés avec une solution tampon. L'acidification est un
mode d'activation connue du TGFPl latent (Lawrence, D.A., 1985; Roberts,
AB., 1995). Elle libère la forme active, et permet son dosage. Les
échantillons ont été ensuite incubés sur support solide (plaque micro-Elisa)
précoaté par des récepteurs type II au TGFP humain. Après lavage, on a
ajouté I'immunoconjugué anti-TGFpl péroxydase. La liaison de l'antigène et
de l'anticorps a été révélée après addition du substrat (eau oxygénée qui
oxyde la tétramethylbenzidine). La densité optique a été lue à l'aide d'un
spectrophotomètre à 450 nm. Tous les échantillons ont été dosés en
duplicata.
2.1.4 Fibronectine et thrombos~ondine
Les concentrations ont été mesurées par dosage immunoenzymatique
(méthode ELISA). Les réactifs ont été fournis dans une trousse commerciale
(Asserachrom, Diagnostica Stago, Asnières-sur-Seine, France), et toutes les
étapes techniques ont été effectuées conformément au protocole du
manufacturier. En bref, les échantillons ont été incubés sur plaque micro-Elisa
précoatée anti-fibronectine (ou anti-thrornbospondine), puis en présence de
I'immunoconjugué. L'activité enzymatique a été révélée par le substrat ortho-
phénylènediamine en présence d'eau oxygénée (Fibronectine) ou de
peroxyde d'urée (Thrombospondine). La densité optique a été lue à 492 nm.
Le dosage des constituants des échantillons EPP et PTRF a été
complété par une analyse par chromatographie liquide à haute pression
(HPLC).
2.2 Tests in vitro
Deux tests biologiques ont été effectués sur des cultures primaires de
fibroblastes de porc. Le test de prolifération évalue les effets des échantillons
sur la croissance cellulaire, tandis que le test au MTT (bromure de 3-[4,5-
Dirnéthylthiaz0l-2-yl]-2~5-diphényltétrazoIium) rend compte de la viabilité
cellulaire, attestée par la présence de déshydrogénases mitochondriales.
2.2.1 Prélèvements tissulaires
Un jeune porc mâle Yorkshire (1 5 kg) a été acclimaté aux conditions de
l'animalerie pendant 2 à 5 jours, avec nourriture et boisson à volonté. Le jour
du préièvement, l'animal a été anesthésié au fîuothane (Halothane a 2%,
Wyeth-Ayerst Canada) après prémédication de Kétarnine (15 mgtkg en
injection intramusculaire, Kétaset, Wyeth-Ayerst Canada ). La région postéro-
intérieure est rasée, lavée avec une compresse imprégnée de cidex (Johnson
& Johnson), rincée a l'eau, puis aspergée abondamment d'éthanol à 70%.
Des lanières de peau de 15x2 cm ont été prélevées aseptiquement et
plongées dans des bains successifs d'éthanol à 70%, de tampon PBS, et
enfin d'un milieu de culture de lavage constitué de « Dulbecco's Modified
Eagle Medium N (Gibco BRL) supplémenté par 5% de pénicilline-
streptomycine (Gibco BRL) et 1.25 pgglrnl de fongizone (Gibco BRL).
2.2.2 Dioestion enzv maticlue
Sous ta hotte à flux laminaire, les lanières de peau ont été transférées
dans des boites de pétri contenant 100 ml du milieu de culture de lavage.
Elles ont été découpées aseptiquement en échantillons mesurant 2x2.5 cm
que l'on a incubé pendant 1 heure sous la hotte. Les échantillons ont été
ensuite lavés dans 3 bains successifs contenant 100 ml de tampon PBS
stérile.
La digestion enzymatique a été faite sous agitation magnétique dans
100 ml de pronase (Bohringer Mannheim). obtenus en diluant 1 mg Iml de
DMEM supplémenté de 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco BRL). Elle
s'est déroulée pendant 7 heure à 37OC et 5% de COz. La pronase a été
ensuite décantée, et les échantillons ont été lavés avec du milieu de lavage.
Pour terminer la digestion, ils ont finalement été incubés 18 heures à 37OC et
5% de CO2 dans 100 ml de collagénase IV (Sigma) obtenus en diluant 300
Ulml de DMEM supplémenté de 1 % de pénicilline-streptomycine et de 10% de
sérum de veau fœtal (Hyclone).
2.2.3 Mise en culture
La suspension cellulaire obtenue a été filtrée sur une membrane de
polypropylène et centrifugée à 800 g pendant 5 minutes. Le surnageant a été
décanté et le culot cellulaire a été resuspendu dans du DMEM. À l'aide d'un
compteur électronique (Coulter Electronics of Canada Ltd), on a procédé a un
décompte cellulaire sur 500 pl d'une solution obtenue après mélange de 10 ml
d'lsoton II (Coulter) et de 50 pl de culot cellulaire.
Les cel!uies ont été ensuite ensemencées à une densité de 50x10~
dans des bouteilles contenant 25 ml de DMEM supplémenté de 10% de
sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine, et gardées à
l'incubateur à 37OC et 5% de CO2. Après changement du milieu de culture à
deux reprises (4 et 24 heures plus tard) environ 30% des cellules ont
adhérées. Les cellules ont été exposées à la trypsine (Gibco) tous les 2 jours.
2.2.4 Tests bioloaiaues
2.2.4.1 Test de ~rolifération cellulaire
Jour-1 Au passage 3, les cellules ont été dispersées pendant 3 à
4 minutes avec 10 ml de trypsine-EDTA (Gibco) a laquelle on a ajouté 15 mM
d'une solution HEPES (Sigma) pour ajuster le pH à 7.4. On a arrêté la
dispersion avec 1 ml de sérum de veau fœtal, et les cellules ont été
centrifugées 5 minutes a 800 g. Après resuspension du culot dans du DMEM,
on a procédé à un décompte cellulaire sur 500 pl de solution obtenue après
mélange de 10 ml d'lsoton II (Coulter) et de 50 pl de culot cellulaire.
Les cellules ont été alors ensemencées à une densité correspondant
à 80,000 celluleslml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal, et 1% de
pénicilline-streptomycine, dans des plaques de 12 puits (1 mtlpuits) que l'on a
conservé a l'incubateur (37OC et 5% de COz) pendant 18 heures.
Jour0 Après adhésion, les cellules ont été lavées avec du
DMEM chauffé à 37*C1 puis avec 1 ml de milieu de lavage. On a alors ajouté
à chaque puits 900 pl de milieu expérimental (DMEM, 0.5% de sérum de
sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine) et 100 pl de
l'échantillon EPP (1 XI 0" plaquetteslrnl). Chaque plaque comporte 3 doses
d'échantillon et un contrôle négatif (DMEM supplémenté de 0.5 % de sérum
de veau foetal et 1 % de pénicilline-streptomycine), effectués en triplicata. Les
3 doses d'échantillon ont été obtenues après dilutions sériées dans le milieu
expérimental :
1) 80 ullml 800 pl d'échantillon + 200 pl de milieu expérimental (ME)
2) 40 ullml 500 pl de la solution précédente + 500 pl de ME
3) 20 ullml 500 pl de la solution précédente + 500 pl de ME
Dans un but comparatif, 3 doses (80, 40, et 20 pllml) d'un échantillon
PTRF ont été préparées. On a préparé également du sérum de veau fœtal à
10% (1 00 pl de SVF dans 900 pl de DMEM) pour servir de contrôle positif.
Jour 2 Les cellules ont été dispersées avec de la trypsine EDTA
maintenue a 37OC, lavées avec du DMEM chauffé à 37 O C , et dispersées a
nouveau. Lorsque les cellules sont complètement détachées, la dispersion est
arrêtée avec 100 pl de sérum de veau fœtal. Les cellules mises en
suspension, ont été mélangées à de I'isoton II, et un comptage au compteur a
été effectué sur un mélange de 500 pl.
2.2.4.2 Test de l'activité métaboliaue
Le bromure de 3-[4. 5-Diméthylthiazol-2-YI]-2, 5-diphényltétrazolium ou
MTT est un sel de tetrazolium soluble dans I'eau, qui donne une solution de
couleur jaune lorsqu'il est préparé dans un milieu sans rouge phénol. Le
clivage du tétrazolium par les déshydrogénases mitochondriales des cellules
vivantes permet de convertir le MTT en un formazan insoluble dans l'eau et
de couleur violacée (Mossman, T., 1983). Ce composé, dissous dans de
I'isopropanol, peut être mesuré par spectrophotométrie. Additionné à des
cellules en culture, le MTT permet ainsi d'évaluer la viabilité des cellules et la
cytotoxicité d'un produit.
b) préparation des réactifs
MTT : 500 mg de MTT (ICN) ont été dilués dans 100 ml de tampon PBS. La
solution a été filtrée avec un filtre de 0.22 mm et conservée à 4*C a l'abri de
la lumière.
(4 Lysing buffer B : On a ajouté une solution de DMF (Anachernia) à 50%
(105 ml de DMF et 105 ml d'eau), à une solution SOS (BioRad) à 20% (409
de SDS et 180 ml DMF à 50%). Le pH a été ajuste à 4.7, et la solution
obtenue a été complétée à 200 ml avec le DMF à 50%.
C) protocole
La technique au MTT telle que décrite dans la littérature (Carmichael,
J.. 199 1 ) a été adaptée à notre modèle de culture cellulaire.
Jour4 Les techniques de dispersion et de comptage identiques
à celles décrites pour le précédent test, ont été effectuées également sur des
fibroblastes au passage 3. Les cellules ont été ensemencées à une densité
correspondant à 8500 cellules par 200 pl de DMEM supplémenté de 10 % de
sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine, dans des plaques de
96 puits (200 pl Ipuits) que l'on a conservé a l'incubateur (37OC et 5% de COz)
pendant 18 heures.
Jour O Après adhésion, les cellules ont été lavées avec du
DMEM chauffé à 37OC, puis avec 1 ml de milieu de lavage. On a alors ajouté
a chaque puits 90 pl de milieu expérimentai (DMEM, 0.5% de , 1% de
pénicilline-streptomycine) et 10 pl de l'échantillon concentré 10 fois. Chaque
plaque comporte 5 échantillons a 3 doses, un contrôle négatif (DMEM
supplémenté de 0.5 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-
streptomycine), et un contrôle positif, effectués en triplicata.
Jour 2 Toutes les étapes qui suivent ont été effectuées à l'abri de
la lumière. Vingt cinq pl de réactif MTT ont été ajoutées dans chaque puits à
une concentration de 5 mglml, et les plaques ont été conservées 2 heures à
37OC. Puis, on a ajouté 100 pl de lysing buffer par puits, et on a laissé incuber
18 heures à 37OC. Le lendemain. les plaques ont été lues à l'aide d'un
spectrophotometre Elisa à une longueur d'onde de 470 nm.
2.2.4.3 Analyses des données
Pour chaque test, on a calculé les moyennes des valeurs des 3 puits _c
l'erreur standard à la moyenne (SEM). Le test t de Student a été utilisé pour
comparer les résultats de l'échantillon étudié (EPP et standard PTRF) par
rapport au contrôle négatif.
CICATRISATION PAR PREMIÈRE INTENTION
3.1 Animaux et chirurqie
Trente deux porcs femelles Yorkshire (15 à 20 kg) ont été acclimatées
aux conditions de l'animalerie pendant 4 jours, avec nourriture et boisson à
volonté. Le jour de l'expérience (jour O), les animaux ont été anesthésiés avec
de la kétamine (22 mglkg en injection intramusculaire, Kétaset, Wyeth-Ayent
Canada) après prémédication a I'atapérone (2.2 mglkg en injection
intramuscusculaire, Stresnil, Janssen Pharmaceutica Inc).
La région dorsale a été rasée, lavée avec une éponge imprégnée de
savon liquide bactéricide, rincée à l'eau, puis aspergée abondamment
d'éthanol à 70%. Quatre incisions chirurgicales linéaires (numérotées 1 a 4),
profondes (intéressant le derme et une partie de l'hypoderme), mesurant 5 à 6
cm de long ont été effectuées à I'aide d'une lame de bistouri, sur la région
dorsale à 2-3 cm de part et d'autre de la ligne médiane (figures l l a et 12).
Les incisions ont été épongées avec des compresses de gaze stériles et
refermées avec des points de suture pratiqués tous les centimètres avec du
Dermalon 4.0. Le protocole décrit ci-dessus a été approuvé par le comité
d'éthique animale de la Faculté de Médecine Vétérinaire de l'université de
Montréal (Saint-Hyacinthe, Québec) où les expériences ont été réalisées.
2 Traitements
Le jour de l'expérience, les 3 concentrations d'extraits plaquettaires
(EPP) ont été préparées. Après décongélation à température ambiante d'un
aliquot de 5 ml d'extraits plaquettaires (concentration : lo to plaquetteslml), on
a procédé à des dilutions sériées en milieu aqueux (eau picopure) afin d'éviter
une surcharge ionique (Les extraits ont été préparés avec du plasma-Lyte, cf
chap 111 3.1). Les concentrations suivantes ont été obtenues:
-. 2x 10' ~laauetteslrnl : 1 volume de 10'' plaquettes/ml pour 4
volumes d'eau
4x 108 ~laauetteslml : 1 volume de la solution précédente pour 4
volumes d'eau
Le traitement placebo servant de contrôle, a été préparé en diluant 25
mg d'albumine porcine (RIA Grade, Sigma chemicals) dans 5 ml de sérum
salin. Tous les traitements ont été acheminés vers l'animalerie sur glace pilée.
Des la fermeture de l'incision, on a appliqué au site de la plaie, à l'aide
d'une seringue de 3 ml (figures 1lb et 12), 100 pl d'une des solutions
suivantes:
albumine porcine incision 1
4x1 o8 plaquettes Iml incision 2
2x1 O' plaquettes Iml incision 3
1 x10" plaquettes /ml incision 4
Les plaies ont été recouvertes individuellement avec des compresses
de gaze stériles. Afin de protéger les plaies, toute la région dorsale de l'animal
a été pansée avec des bandes d'élastoplaste. Les animaux ont été placés
dans des cages numérotées, et répartis en 4 groupes expérimentaux égaux
(n=8) selon la date du sacrifice: (1) au jour 5, (2) au jour 7, (3) au jour 10, et
(4) au jour 28 postspératoire.
Figure 11. (A) Chirurgie et (B) application des traitements.
1) Contrôle
4) 10'' pllml
Figure 12. Disposition des incisions (1 à 4) et
répartition des traitements.
Pour chaque incision, une bandelette est réservée à
l'histologie (H). et 4 bandelettes sont réservées à la <I cm>
tensiométrie (T).
3.3 Prélévements tissulaires
Les animaux ont été euthanasiés avec une dose léthale de barbiturique
et la région dorsale a été rasée à nouveau. Pour chaque incision, une
bandelette cutanée d'environ 1 cm de large et perpendiculaire a l'axe de la
plaie a été découpée entre 2 points de sutures. Les bandelettes ont été
immergées dans du formaldéhyde tamponné à 10Y0 (Biopharm) contenu dans
des flacons codés. Ensuite, un lambeau de peau, grossièrement
rectangulaire, comportant les 4 incisions, a été prélevé, protégé par une
enveloppe de plastique, déposé sur de la glace pilée, et acheminé vers la
salle de tensiornétrie. Les plaies œdematiées (1'6 9%) ont été écartées de
l'étude. II en est de même pour les plaies restées ouvertes (4,7 %) imputables
aux gestes brusques de l'animal contre les parois métalliques des cages.
3.4 Tensiométrie
Le même jour, les lambeaux de peau ont été soigneusement
dégraissés et les fils de sutures retirés. Pour chaque incision, 3 à 4
bandelettes cutanées perpendiculaires à l'axe de la plaie et mesurant environ
9 mm de large, ont été découpées à l'aide de plusieurs lames de bistouri
montées sur un support rigide. Chaque bandelette a été testée au tensiometre
(Instron 11 01, lnstron Corp., Canton, MA). L'appareil permet de mesurer la
force requise pour rompre le tissu cutané porteur de la plaie. Les valeurs sont
exprimées en Newtons. Pour des raisons techniques (résistance de la plaie
trop forte pour l'appareillage en place), les animaux sacrifiés au jour 28 post-
opératoire n'ont pas fait l'objet d'une étude tensiométrique.
La tensiométrie, abondemment décrite dans la littérature, est une
méthode d'évaluation physique classique et reconnue de la résistance d'une
plaie (Garrel, 0.. 1991 ; Mustoe, A., 1987 ; Pierce, G.F., 1989b, 1991).
3.5 Histoloaie
3.5.1 Pré~aration des échantillons
Après 48 heures de fixation dans le formaldéhyde tamponné à 10%. les
bandelettes ont été retaillees de manière à éliminer les territoires traversés
par les fils de suture (2 mm à partir de chaque bord vertical). Les échantillons
ont été déshydratés et inclus en paraffine selon les procédés classiques (R.,
Hould, 1988). Des coupes étagées de 4 prn et 8 Pm d'épaisseur ont été
confectionnées.
Les coupes de 4 pm ont été colorées à I'hématoxyline phloxine saffran
(HPS) à l'aide d'un colorateur automatique (Miles) selon les standards
techniques classiques (R., Hould, 1988). Les coupes de 8 pm ont été
colorées au rouge sirius par la méthode décrite par Sweat (Sweat, F., 1964).
La solution de rouge sirius a été obtenue a partir de rouge sirius F3BA
(Verona Dyestuffs, Union, NJ) a 0.1% dans une solution saturée d'acide
picrique. Après déparaffinage et lavage à l'eau courante, les coupes ont été
immergées 30 minutes dans la solution au rouge sirius, puis déshydratées.
éclaircies au toluène et montées. Afin de prévenir les variations de coloration
inter-coupes risquant de gêner l'analyse d'images, tous les échantillons d'un
même groupe expérimental ont été colorés le même jour en respectant
scrupuleusement les temps des étapes techniques.
3.5.2 Étude mor~holoaiaue
Toutes les coupes colorées à I'hématoxyline phloxine saffran ont été
observées au microscope optique (optiphot 2, Nikon) et ont fait l'objet d'une
étude morphologique afin de noter la qualité de la réparation dermique et
épidermique.
3.5.3 Étude quantitative
Une caméra vidéo tnple CCD (640 x 480 pixels, Sony) connectée à un
microscope optique (optiphot 2, Nikon) permet la capture de l'image
microscopique. Le signal optique est transmis à un digitaliseur et processeur
d'images incorporé à un ordinateur (Intel 486166 Mhz) muni d'une carte vidéo
(1280 x 1024 pixels). L'image digitalisée est alors visualisée sur un moniteur
de haute résolution (1280 x 1024 pixels, Multiscan 17sf Sony), tandis qu'un
second moniteur identique présente l'interface utilisateur. L'analyse d'images
utilise le logiciel Vision 2.0 (Clemex technologies Inc., Longueuil, Québec,
Canada) fonctionnant sur l'interface graphique Microsoft Windows 3.11.
3.5.3.2 Principe et méthodes
Toutes les coupes histologiques ont été analysées sous une même
intensité lumineuse. Pour les coupes observées en lumière polarisée, des
réglages de la caméra (gain vidéo, équilibre du blanc) ont été effectuées de
manière à obtenir à l'écran une image proche de celle observée à l'oculaire.
Les zones et objets d'intérêts (plaie, noyaux cellulaires, collagène) ont
été détectés et binarisés sur la base des 3 paramètres définissant leur couleur
(teinte, saturation, intensité). Cette étape a été suivie d'une série de
manipulations (ou opérations binaires) jusqu'à obtention d'une détection
satisfaisante. Des corrections manuelles ont été apportées à chaque fois que
I'on a jugé la détection automatique insatisfaisante. Toutes ces instructions
ont été regroupées et classées dans un programme (ou routine) que I'on a fait
exécuter pour chaque image sous analyse. Une routine a été mise au point
pour chaque paramètre a mesurer et pour chaque groupe expérimental.
Les données numériques ont été sauvegardées dans Microsoft Excel
4.0. À des fins de microphotographie, les images binaires ont été stockées
sur le disque dur et importées dans un logiciel de présentation (Microsoft
Powerpoint 2.0). Une imprimante (720 x 720 dpi, Epson Stylus) fournit les
impressions couleurs sur papier.
Paramétres mesurés
Dans toute notre étude, un champ microscopique représente le
territoire microscopique visualisé à l'écran du moniteur.
a) Étendue de la plaie
La surface totale occupée par la plaie dans le derme (exprimée en
mm2) a été déterminée a l'objectif 4x par détection binaire. Afin d'écarter
l'influence des variations d'épaisseur du derme (inter-coupes et inter-
individuelles), nous avons rapporté cette surface à I'épaisseur du derme.
Nous avons pour cela calculé le rapport de la surface occupée par la plaie sur
celle d'un territoire microscopique de largeur fixe (1.6 mm) et d'épaisseur
égale à celle du derme de la coupe sous analyse (I'épaisseur du derme de
nos échantillons varie entre 1025 et 21 01 pm). Les résultats sont exprimés en
pourcentage.
Dans un but comparatif, nous avons déterminé la largeur moyenne de
la plaie (exprimée en pm) a partir de mesures effectuées automatiquement
tous les 27 pm, en dehors des zones occupées par les annexes cutanés (50 a
80 mesures par plaie).
Sur les coupes colorées a I'HPS, la cellularité moyenne de la plaie a
été déterminé à l'objectif 40x par le décompte de tous les noyaux cellulaires.
Dans la mesure du possible, 5 champs microscopiques contigus par plaie ont
fait l'objet d'un décompte cellulaire.
C) Collaaene
Les coupes colorées au rouge sirius ont été observées en lumière
polarisée afin de distinguer les fibres fines (biréfringence de jaune à vert) des
fibres épaisses densément empaquetées (biréfringence de rouge à orangé).
La surface moyenne des 2 variétés de collagène a été déterminée à l'objectif
40x et exprimée en Dans la mesure du possible, 5 champs
microscopiques contigus par plaie, ont été analysés. On a calculé ensuite la
somme des surfaces occupée par les 2 variétés de collagène.
3.6 Analvses statisticiues
Pour chaque paramètre mesuré (tensiométrie et histologie), on a
procédé à une analyse de variance à une voie pour mesures répétées à l'aide
d'un logiciel de statistiques (Sigmastat 1 .O, Jandel Scientific). L'effet des
traitements par rapport au contrôle a été déterminé par comparaisons
multiples (test de Dunnett). Une valeur de P < 0.05 a été considérée comme
statistiquement significative. En parallèle, les relations entre les différents
paramètres mesurés ont été évaluées par des tests de corrélation (calcul du
coefficient de corrélation et du taux de significativité).
4 CICATRISATION PAR SECONDE lNT ENTION
4.1 Animaux et chiruraie
Quatre porcs femelles Yorkshire (20 kg) ont été acclimatées aux
conditions de l'animalerie pendant 4 jours, avec nourriture et boisson a
volonté. Le jour de l'expérience (jour O), les animaux ont été anesthésiés avec
de la kétamine (20 mglkg en injection intramusculaire, Kétaset, Wyeth-Ayerst
Canada), puis inhalation de fluothane (Wyeth-Ayerst Canada ).
La région dorsale a été rasée, lavée avec une éponge imprégnée de
savon liquide bactéricide, rincée à l'eau, puis aspergée abondamment
d'éthanol à 70%. Seize excisions circulaires profondes (intéressant le derme
et une partie de l'hypoderme), situées à 2-3 cm de la ligne médiane du dos (8
plaies au niveau de la région antérieure et 8 plaies au niveau de la région
postérieure) ont été effectuées a I'aide d'une pince à biopsie cylindrique de 4
mm de diamètre (Acu Punch, Acuderm Inc, Ft Lauderdale, FL).
Le protocole décrit ci-dessus a été approuvé par le comité d'éthique
animale du Centre de Recherche Louis-Charles Simard ou les expériences
ont été réalisées.
4.2 Traitements
La concentration 2x10' plaquettes /ml a été choisie pour traiter les
plaies sur la base des résultats obtenus dans la première partie
expérimentale. Le jour de l'expérience, le traitement et placebo ont été
préparés tel que décrit précédemment (chapitre 111, 2.1). Après avoir épongé
soigneusement les plaies a I'aide de compresses de gaze stériles. les
traitements ont été appliques de manière à remplir les excisions et répartis tel
que shématisé dans la figures 13 (page 72). Au total, chez chaque animal, 8
plaies ont été traitées avec les extraits plaquettaires et 8 plaies ont été
traitées avec l'albumine porcine. Afin de prévenir l'influence de la localisation
anatomique, les sites des traitements des plaies de la région postérieure ont
été inversés.
Les plaies ont été ensuite recouvertes individuellement avec des
pansements occlusifs, et toute la région dorsale de l'animal a été pansée avec
des bandes d'élastoplaste. Les animaux ont été placés dans des cages
numérotées, et répartis en 2 groupes expérimentaux égaux selon la date du
sacrifice: ( 1 ) au jour 5, (2) au jour 7 post-opératoire.
4.3 Prélèvements tissu taires
Les animaux ont été euthanasiés avec une dose léthale de
barbiturique. Les plaies ont été prélevées en totalité, et immédiatement
immergées dans du formaldéhyde tamponné à 10% (Biopharm) contenu dans
des flacons codés.
4.4 Histoloaie
Après 48 heures de fixation, les plaies ont été coupées
transversalement en 2 moitiés égales. Une des 2 moitiés est déshydratée et
incluse en paraffine selon les procédés classiques (R., Hould, 1988). Des
coupes étagées de 4 pm et 8 pm d'épaisseur ont été confectionnées et
colorées tel décr~t précédemment (chapitre 111, 5.1). Les coupes ont fait l'objet
d'une étude morphologique et d'une analyse d'images tels que décrit
précédemment (chapitre 111, 5.2 et 5.3). La surface et la largeur moyenne (4 à
15 mesures par plaie) de la plaie ont été déterminée à l'objectif 2x.
Afin d'apprécier la qualité du recouvrement épidermique, 3 paramêtres
supplémentaires ont été mesurés sur les coupes colorées à I'HPS (figure 14,
page 72):
a) Surface du néoéoiderme
La surface de l'épithélium recouvrant la plaie a été déterminée à
l'objectif 2x.
b) Lonpueur du néoéoidene
La longueur du néoépiderrne a été déterminée à I'objectif 2x. Elle
permet d'évaluer le degré de réépithélialisation.
c) Distance entre les bords libres du néoédderme
Pour toutes les plaies qui ne sont pas réépithélialisées en totalité, la
distance entre les bords libres du néoépiderrne a été mesurée à I'objectif 2x.
Pour toutes les plaies entièrement réépithélialisées, cette distance a été
considérée nulle (égale à 0)
4.5 Analyses statistiaues
Pour chaque paramètre histologique, le test t de Student a été utilisé
pour comparer les résultats du traitement aux extraits plaquettaires par
rapport au contrôle. Le test exact de Fisher a été utilisé pour comparer le
nombre de plaies épithélialisées en totalité des contrôles et traitées.
O O
O O EPP
1 Contrale EPP
Figure 13. Disposition des plaies circulaires et rdpartition des
traitements. EPP : extraits plaquettaires de porc (concentration : 2x 1 og pllml). Les plaies des régions antérieures et postérieures sont séparées par
10 cm de peau saine. Au sein de chaque groupe de traitement, les plaies
sont séparées par 2 cm de peau saine.
PLAIE
Hypoderme
Figure 14. ParamUres histologiques évaluant la qualité du
recouvrement &pidermique. D : distance entre les bords libres du
néoépiderme, - longueur et surface du néoépiderme.
CONSTITUANTS DES EXTRAITS PLAQUERAIRES DE PORC
Le tableau I rapporte les doses des différents composants protéiques
de nos extraits plaquettaires (EPP) et à titre de comparaison, celles des
extraits plaquettaires obtenus selon la méthode de Knighton (PTRF). Les
concentrations en facteurs de croissance (PDGF, TGFp 1 ) ainsi qu'en
fibronectine et thrombospondine sont nettement plus élevées dans les EPP,
ce qui se traduit par un taux de protéines totales plus de 3 fois supérieur à
celui retrouvé dans les extraits de Knighton. Contrairement aux extraits de
Knighton, l'albumine n'est présente qu'à l'état de traces, ce qui réduit
drastiquement le rapport albuminelprotéines.
Tableau t. Constituants protéiques des extraits plaquettaires (EPP et PTRF :
1 XI 0'' plaquettesfml). Th bs : Thrornbospondine, Fbn : Fibronectine. Les dosages de
PDGF et TGFP1 ont été effectués en duplicata.
PT RF
EPP
Les profils HPLC présentés en annexe confiment la présence plus
importante de protéines de haut poids moléculaire dans les EPP
comparativement aux extraits de Knighton. .
ProMines
mglml
1.9
6.6
2 ACTIVITÉ BIOLOGIQUE IN VlTRû
Albumine
cigfml
188
40
AlblProt
%
9.9
0.6
Le tableau II montre que les EPP induisent une prolifération cellulaire
dépendante de la dose, plus importante comparée au contrôle et aux extraits
PTRF de Knighton. De plus, la réponse au MTT apparaît plus élevée
comparée au contrôle et aux extraits PTRF de Knighton.
TGFf31
nglml
151
169
PDGF
ng/ml
81
171
Thbs
pglml
2.9
10.2
Fbn
pglml
5.6
13.1
1 Prolifération (%)/Contrôle MTT (%)/Contrble
Tableau II. Activité biologique in vitro des extraits plaquettaires (EPP). Les
résultats sont exprime en pourcentage par rapport au contrôle de l'échantillon étudie
(PTRF, EPP). Les tests ont été effectués en triplicata.
PTRF
3 CICATRISATION PAR PREMIÈRE INTENTION
Huit plaies sur un total de 128 (6'3%) ont été écartées de l'étude (2
présentaient un œdeme macroscopique et 6 se sont ouvertes à la suite des
mouvements brusque de l'animal contre les parois métalliques des cages).
Les porcs présentant 2 plaies insatisfaisantes ont été éliminés de l'étude. ce
qui a réduit le nombre d'animaux à 7 pour le groupe 5 jours et à 6 pour le
groupe 7 jours. Pour des raisons techniques (fixation, coloration), 2 plaies du
groupe 5 joun n'ont pu bénéficier d'une étude sur le collagène, et une plaie
du groupe 28 joun n'a pu être analysée. Dans tous les cas, le nombre de
plaies étudiées pour chaque groupe de traitement a été supérieur ou égal à 5.
II a été précisé dans chaque tableau de résultats.
20 pl 40 pl 80 pl
1 34 146 205
3.1 Tensiometrie (Tableau III, figure 15)
20 pl 40 pl 80 pl
187 206 209
Les extraits plaquettaires augmentent la tension de rupture des plaies.
L'analyse statistique révèle qu'à 5 jours, les plaies sont plus solides aux
concentrations 2x10~ /ml et 1x1 0'' /ml (respectivement +65% et +32%,
P=0.00015). À 7 et 10 jours, seule la concentration intermédiaire (2x10~ /ml)
permet d'obtenir un résultat significatif (respectivement +54%, P= 0.00002 et
+ 39%' P=0.013).
Traitement 1 JOUR 5 1 JOUR 7 1 JOUR 10
Contrôle
EPP: 4x10' /ml
EPP: 1 x10'~/rnl
EPP: 2x1 0' /ml
Tableau III. Incisions chirurgicales : tension de rupture des plaies (en
Newtons) à 5, 7, et I O jours postopératoires. Les valeurs présentées sont les
moyennes + SEM de n valeurs moyennes (nznombre de plaies). Les valeurs écrites
en gras sont significatives par rapport au contrôle ( b ~ + 0.02, d ~ < 0.001, 'P< 0.0001 ).
n=7
3.18 + 0.53
JOURS POSTOPÉRATOIRES
n=7
4.31 -t 0.48
O contrôle 0 4x10~1ml
2xl0~/rnl
I O ' ~ / ~ I
n=6
9.72 c 0.84
Figure 15. Histogrammes des r8sultats présentés dans le tableau III. ( b ~ < 0.02,
d~ < 0.001, .P < 0.0001).
n=8
37.30 k 2.23
n=6
13.61 + 0.57 '
n=8
43.40 + 2.87
3.2 Histologie
Sur toutes les coupes histologiques examinées des 4 groupes
d'animaux, l'épithélium est pluristratifié, différencié et kératinisé en surface. La
morphologie est normale ; il n'y a notamment pas d'hyperplasie de la couche
basale ni d'hyperacanthose, les noyaux sont réguliers dotés d'une chromatine
fine.
3.2.2 Derme
Au jour 5, toutes les plaies sont constituées d'un tissu de granulation
riche en macrophages mêlés à des lymphocytes et des fibroblastes. II existe
quelques polynucléaires éosinophiles, retrouvés le plus souvent dans la
lumière des capillaires. Les cellules baignent dans un tissu conjonctif lâche,
peu fibreux. On retrouve des amas de fibrine particulièrement dans la moitié
inférieure de la plaie. La néovascularisation est discrète.
Au jour 7, le tissu de granulation est peuplé de fibroblastes plus
nombreux, mêlés à des macrophages et des lymphocytes regroupés souvent
en îlots. La vascularisation est plus marquée, constituée de capillaires . La
fibrose est plus marquée, constituée le plus souvent de fins faisceaux de
fibres de collagène.
Dans la plupart des plaies traitées, la substance fondamentale est
moins abondante, et on ne retrouve pas de fibrine. contrairement aux plaies
contrôles où la fibrine est encore présente à l'état de traces.
Au jour 10, la réaction inflammatoire est estompée, laissant place à un
tissu cicatriciel jeune riche en fibroblastes. Les fibres de collagène s'agencent
en trousseaux plus épais. Aucune différence marquante n'est observée entre
plaies traitées et contrôles.
Au jour 28. le tissu cicatriciel est à présent mature, les fibres de
collagène forment des trousseaux épais entre lesquels sont parsemés des
fibroblastes. Aucune différence marquante n'est observée entre plaies traitées
et contrôles.
b) Étendue de la plaie (Tableau IV, Figures 16 à 18)
Les résultats statistiques obtenus pour les paramètres surface et
largeur moyenne sont superposables. Pour la clarté de la présentation, nous
ne rapporterons que ceux relatifs à la largeur moyenne.
Au jour 5, l'analyse statistique révèle que les 3 concentrations
croissantes d'EPP testées augmentent la largeur moyenne des plaies
(respectivement +88%, +107%, + I l 6 %, P=0.005), tandis qu'au jour 7, seule
la concentration 2x10' /ml diminue de manière significative la largeur
moyenne des plaies (-50%, P=0.01). Au jour 10, il n'existe aucune difference
statistiquement significative entre les plaies contrôles et traitées quelle que
soit la concentration testée (P> 0.05). Enfin, au jour 28, la largeur moyenne
des plaies est diminuée de manière très significative pour les 3 concentrations
d'EPP (respectivement -14%, -24%, -22%, P= 0.00003).
Traitement 1 JOURS 1 JOUR7 1 JOUR 10
contrôle 89.9 1 13.3
EPP: 4x10' /ml
388.7 k 26.5
EPP: 2x1 O' /ml
Tableau IV. Incisions chirurgicales : largeur moyenne des plaies (en pm) a 5, 7,
I O et 28 jours postopératoires. Les valeurs présentées sont les moyennes k SEM
de n valeurs moyennes (n=nombre de plaies). Les valeurs écrites en gras sont
significatives par rapport au contrôle ( b ~ < 0.02, 'P < 0.01, 'P < 0.0001).
41 3.1 + 27.1
n=7
168.9 + 18.9
EPP: 1x10'~ /ml
JOURS POSTOPÉRATOIRES
n=7
186.2 k 7.1 O
; O contrôle 4x1 0'lml
l 2x1 o g m 10~~1rnl
n=6
368.1 I 59.7
193.8 k 31.9
Figure 16. Histogrammes des r6sultats présentés dans le tableau IV. ( b ~ < 0.02.
=P < 0.01, eP < 0.0001).
n=8
430.4 f 38.5
n=6
192.5 i 14.0
n=8
426.5 + 27.9
328.4 I 56.8 530.3 c 45.4
Figure 17. Incisions chirurgicales a 5 (1) et 7 (2) jours postopératoires avant (A) et après ((B analyse d'images. Hématoxyline-phloxine-safran. EPP: Extraits plaquettaires de porc. I I I I la largeur moyenne de la plaie est calculée à partir de mesures sérielies .
Figure 18. Incisions chirurgicales à 10 (3) et 28 (4) jours postopératoires avant (A) et après (B) analyse d'images. Hématoxyline-phloxine-safran. EPP: Extraits plaquettaires de porc. I I I I la largeur moyenne de la plaie est calculée à partir de mesures sérielles .
c) Cellularité (Tableau V, figures 19 et 20)
Au jour 5, les 3 concentrations d'EPP augmentent la cellularité des
plaies (respectivement +58%, +75%, +76%, P=0.009). Au jour 7, 10 et 28,
aucune diff6rence significative n'est notée entre les plaies contrôles et les
plaies traitées quelle que soit la concentration testée (P> 0.05).
1 Traitement 1 JOUR5 1 JOUR7 1 JOUR 10 1 JOUR28 1
Tableau V. Incisions chirurgicales : cellularité des plaies à 5, 7, I O et 28 jours
postopératoires. Les valeurs présentées sont les moyennes I SEM de n valeurs
moyennes (n=nombre de plaies). Les valeurs écrites en gras sont significatives par
contrôle
' EPP: 4x1 o8 /ml
EPP: 2x l0~/ml
EPP: 1xl0 '~/ml
rapport au contrôle ('P < 0.01 ).
O contrôle 4x1 04mi
2x1 o9/rnl
.tolo/mr
1 1 n=6 1 n=5 1 n=8 1 n=7 1
76.9+ 13.0
n=7
126.61 13.8 n=7
134.9f 14.7 n=7
135.0f 10.1
Figure 19. Histogrammes des resultats pr6sentés dans le tableau V ('P < 0.01 ).
178.7k13.4
n=6
153.7 + 29.7 n=6
140.8 + 10.7 n=6
165.0 k 18.2
118.8+13.6
n=8
128.4 & 12.4
n=8
135.3 I 8.2 n=8
117.8 + 8.04
55.1k2.4
n=8
71 .9 c 13.2 n=8
57.3 + 2.9 n=8
62.lk 6.3
Figure 20. Cellutarité des incisions chirurgicales h 5 (1) et 7 (2) jours postopératoires avant (A) et après (B) analyse d'images.
noyaux cellulaires, EPP: Extraits plaquettaires de porc.
d) Collaaène
= Jour 5 (Tableau VI, figures 21 p 86 et 22 p 89)
Le collagène de la plaie est constitué en majorité par des fibres fines
présentant une biréfringence jaune verte. L'analyse statistique révèle que la
surface occupée par les fibres fines de collagène est plus importante pour les
plaies traitées aux 3 concentrations d'extraits comparativement au contrôle
(respectivement +53%, +58%, +49%, P=0.02), tandis que celle occupée par
les fibres plus épaisses ne montre pas de différence significative (P> 0.05). Le
total des surfaces des 2 types de collagène est également plus important pour
les 3 concentrations d'extraits (respectivement +47%, +48%, +45%, P=O.O3).
De plus, le rapport fibres épaisses lfibres fines entre les plaies contrôles et
traitées ne diffère pas significativement (P> 0.05).
Traitement
1 EPP : 4x1 o8 Iml / ?41.71178.17 / 49.6611 5.73 1 791.37185.Ol a 1
Contrôle
n=6
Fibres fines
Tableau VI. Incisions chirurgicales : surtace du collag8ne cicatriciel par champ
microscopique (en au jour 5 postop8ratoire. Les valeurs présentées sont
les moyennes I SEM de n valeurs moyennes (n=nombre de plaies). Les valeurs
écrites en gras sont significatives par rapport au contrôle ('P c 0.05).
483.68446.86
n=7
EPP : 2x1 09/m
n=6
Fibres &paisses Total
56.47116.04
729.95k73.05
540. 15k53.21
68.00Q0.85 797.96485.41
Jour 7 (Tableau V11. figures 21 p 86 et 22 p 89)
Les fibres épaisses présentant une biréfringence rouge orangée sont
plus nombreuses. Les résultats quantitatifs sont inverses à ceux observés au
jour 5 : la surface occupée par les fibres épaisses est plus importante pour les
3 concentrations d'extraits (respectivement +97%. +112%, +79%. P=0.002)
comparées au contrôle, tandis que celle occupée par les fibres plus fines ne
montre pas de différence statistiquement significative (P> 0.05). Le total des
surfaces des 2 types de collagène est également plus important pour les 3
concentrations d'extraits (respectivement +Z%, +3O%, +30%, P=O.OO5). De
plus, le rapport fibres épaisses /fibres fines est augmenté de manière
significative dans les plaies traitées aux 2 premières concentrations
(contrôle : 0.32 I 0.04, EPP 4x10~ Irnl : 0.60 ~t 0.07, EPP 2x10' Irnl : 0.66 + 0.10, EPP 1x10'~ Irnl : 0.47 I 0.07, P=0.03).
Traitement 1 Fibres fines 1 Fibres &paisses 1 Total
Contrôle
n=6
EPP : 4x1 0' Iml
n=6
EPP : 2x109/m
n=6
Tableau VII. Incisions chirurgicales : surface du collagdne cicatriciel par
champ microscopique (en au jour 7 postop6ratoire. Les valeurs présentées
sont les moyennes t SEM de n valeurs moyennes (n=nombre de plaies). Les
valeurs écrites en gras sont significatives par rapport au contrôle ('P c 0.01).
9397.0I583.2
EPP : lx10'~/ml
n=5
- --
9602.4 k757.1
5523.2+516.3C
1 0707.2k469.6
14920.3k610.8 "
--
5938.8i541 .l - - - -
15541.2k522.3 "
5025.3S95.lc 1 5732.6i804.8
Figure 21. Collagène cicatriciel a 5 (1) et 7 (2) jours postopératoires avant (A) et aprés (B) analyse d'images. Rouge sinus observé en lumière polarisée. EPP: Extraits plaquettaires de porc.
Fibres fines, Fibres épaisses.
Jour 10 (Tableau VIII, figure 22 p 89)
Les proportions des 2 variétés de collagène sont inversées, les fibres
épaisses sont nettement majoritaires. L'analyse statistique révèle que seule la
concentration 2x10' /ml augmente de manière significative la surface occupée
par les fibres épaisses (+4l%, P=0.003). Aucune différence significative n'est
observée pour les fibres fines. Le total des surfaces des 2 types de collagène
a tendance à augmenter pour la concentration 2x10' Iml, mais le seuil de
significativité n'est pas atteint (P=O. 055). Le rapport fibres épaisses /fibres
fines n'est augmenté de manière significative que pour les plaies traitées avec
la concentration 2x10' Iml (contrôle : 1.57 k 0.29, EPP 4x10~ Iml : 1.82 + 0.24, EPP 2x10~1rnl : 2.61 I 0.31. EPP 1x10'~ /ml : 2.19 k 0.30, P=0.04).
/ Traitement 1 Fibres fines 1
-
EPP : 2x10~1rn
n=8
19793.1+1161.1
1
EPP : 4x10~ /ml
n=8
Contrôle
n=8
Tableau V111. Incisions chirurgicales : surface du colbg&ne cicatriciel par
champ microscopique (en au jour 10 postop6ratoire. Les valeurs
présentées sont les moyennes t SEM de n valeurs moyennes (n=nombre de
plaies). Les valeurs écrites en gras sont significatives par rapport au contrôle
(=P c 0.01).
7892.7k667.3
EPP : 1x1 ~ ' ~ / r n l
n=8
8548.2i1096.3 1 1244.8t812.0
13535.8+1116.5
6904.8t769.2
21428.5k1152.9
13751 .O51 005.3 20655.7k913.6
: Jour 28 (Tableau IX, figure 22 p 89)
Aucune difference statistiquement significative n'est notée entre les
plaies contrôles et les plaies traitées quelle que soit la concentration testée et
le type de collagène.
1 Traitement ( Fibres fines
Contrôle
n=8
EPP : 4x1 0' Iml
n=8
EPP : 2x1 0' lm 537.6k152.4
n=8
Fibres Bpaisser 1 Total
EPP : 1x1 0 '~1 rn l
n=7
Tableau U(. Incisions chirurgicales : surface du coilag&ne cicatriciel par champ
microscopique (en au jour 28 postop6ratoire. Les valeurs présentées sont
les moyennes t SEM de n valeurs moyennes (n=nombre de plaies).
569.6194.7
3.3 Corrélations statistiaues
a) Jour 5
Comme l'indique le tableau X. il existe une corrélation significative
entre la solidité des plaies et la quantité de collagène déposé au sein du tissu
de granulation (fibres fines. fibres épaisses). Par ailleurs. la quantité de fibres
fines et la solidité augmentent avec le nombre de cellules. Enfin, la largeur
des plaies augmente avec la cellularité.
( Fibres Bpaisses ( Fibres fines
Fibres &paisses
Fibres fines
Largeur
r
3
Largeur
Tableau X. Valeurs et significativites des corrélations observees entre les
diff6rents paramdtres mesurés au jour 5 postopBratoire. Les valeurs de P
écrites en gras sont significatives, r : coefficient de corrélation.
Jour 7 b) -
Le tableau XI montre que la solidité et la quantité de fibres épaisses
croissent parallèlement. De plus, la solidité des plaies apparaît inversement
corrélée avec la largeur moyenne et la cellularité de la plaie. Enfin. comme au
jour 7. la largeur des plaies évolue en parallèle avec la cellularité.
Fibres @aisses Fibres fines ~-7- Largeur 1 CeIIuIarit6 1
Fibres Bpaisses
r
P
Fibres fines
Tableau XI. Valeurs et significativités des corrdlations observees entre les
difkents pararnWes mesur8s au jour 7 postopdratoire. Les valeurs de P
écrites en gras sont significatives. r : coefficient de corrélation.
-0.099
0.655
c) Jour 10
La solidité des plaies n'est corrélée avec aucun paramètre histologique
analysé. La quantité de fibres épaisses diminue avec celle des fibres fines.
Fibres &paisses
Fibres fines
Largeur
r
P
1 Fibres épaisses Fibres fines
Tableau XII. Valeurs et significativités des corr6lations obsew&es entre les
differents panm&res mesurés au jour 10 postop6ntoire. Les valeurs de P
écrites en gras sont significatives. r : coefficient de corrélation.
d) Jour 28
Le tableau Xlll indique, comme au jour 10, que fibres fines et fibres
épaisses sont inversement corrélées.
1 Fibres fines 1 Largeur
1 Fibres Bpairses
Cellularité
Tableau XIII. Valeurs et significativit6s des corrélations observ6es entre les
differents paramdtres mesurds au jour 28 postopdratoire. Les valeurs de P
écrites en gras sont statistiquement significatives. r : coefficient de corrélation.
4 ClCATRlSATl ON PAR SECONDE INTENTION
4.1 Édderme
Les plaies épithélialisées présentent. selon les zones (berges ou centre
de la plaie). un épithélium mono ou pluristratifié et mature. Cet épithélium
dessine des bourgeons épithéliaux qui s'enfoncent dans le derme.
Lorsque la plaie est partiellement épithélialisée, on retrouve au niveau des
berges de la plaie, une couche de kératinocytes organisée en une ou
plusieurs strates, progressant sur le plancher dermique. Un bouchon fibrino-
leucocytaire recouvre la surface non épidermisée.
4.1.2 Étude quantitative (Tableaux XIV et XV, figure 23)
a) Jour 5
Deux des 16 plaies contrôles et 6 des 16 plaies traitées sont
entièrement réépithélialisées, mais l'analyse statistique ne révèle pas de
différence significative (test exact de Fisher, P=0.13). Par contre, la distance
entre les bords libres du néoépiderme est nettement diminuée pour les plaies
traitées comparativement aux plaies contrôles (-44%. P=0.009). Par ailleurs,
la surface du néoépidene des plaies traitées tend à être plus importante que
celle des plaies contrôles, mais le seuil de significativité n'est pas atteint
(P=O. 10). Enfin. la longueur de l'épiderme est significativement plus grande
pour les plaies traitées (+46%, P-0.004).
b) Jour 7
Neuf des 16 plaies contrôles et 10 des 16 plaies traitées sont
entièrement réépithélialisées. La distance entre les bords libres du
néoepiderme est sensiblement la même pour les plaies contrôles et traitées.
Aucune différence n'est observée entre la surface (P=0.96) et la longueur de
jonction dermo-épidermique (P=0.33) entre les plaies contrôles et traitées.
-- - - 1 SuInce du n608piderme 1 Longueur du néoépidsne
Tableau XIV. Excisions chirurgicales : surface (en mm2) et longueur du
ndodpidemie (en pm) à 5 et 7 jours postopdratoires.
contrôle
EPP: 2x1 O' /ml
l JOUR 5 JOUR 7
JOUR 5
0.2089kû.021 6
0.2621F0.0241
contrôle
Tableau XV. Excisions chirurgicales : distance (en pn) entre les bords libres
du n6odpideme a 5 et 7 jours postop6ratoires.
JOUR 7
0.4740fl.0267
0.471220.0380
( EPP: 2x1 O' /ml I 874.6 k 189.6"
Dans les 2 tableaux. les valeurs présentées sont les moyennes k SEM de 16
valeurs par groupe. Les valeurs écrites en gras sont significatives par rapport au
contrôle ('P < 0.01).
1568.2 + 209.2
41 8.0 k 163.6
JOUR 5
2956.1 K277.4
4319.1+337.SC
483.7 1 153.7
JOUR 7
5631 -61394.3
51 18.92348.8
4.2 Derme
Au jour 5, le tissu de granulation est abondant constitué de
macrophages, lymphocytes et de polynucléaires retrouvés en surface mêlés à
de la fibrine et des globules rouges. Les capillaires néofonés sont nombreux.
Les fibres de collagène sont présentes et fines pour la plupart. Au jour 7, les
cellules baignent dans un tissu conjonctif nettement plus fibreux. Aucune
différence marquante n'a été observée entre les plaies traitées et contrôles.
4.2.2 Étendue de la laie (Tableau XVI)
Au jour 5, 11 n'existe aucune différence statistiquement significative
entre la largeur moyenne des plaies contrôles et traitées. Au jour 7, la largeur
moyenne des plaies traitées a tendance à diminuer, mais le seuil de
significativité n'est pas atteint (P=0.08).
JOUR 5 JOUR 7
contrôle
Tableau XVI. Excisions chirurgicales : largeur moyenne des plaies (en pm) à 5
et 7 jours post-op6ratoires. Les valeurs présentées sont les moyennes 2 SEM de
16 valeurs moyennes par groupe.
EPP: 2x1 0' /ml
2735.4 2 123.3
2497.2 i 127.6
2272.2 t 84.3
4.2.3 Cellularité (Tableau XVII)
Au jour 5, les extraits plaquettaires augmentent de manière significative
le nombre de cellules présent au sein du tissu de granulation (+13%,
P=0.002). Au jour 7, les cellules sont moins nombreuses dans les plaies
traitées (-14%, P=0.024).
JOUR 5
Tableau XVII. Excisions chirurgicales : cellularit4 des plaies (nombre de
cellules lchamp microscopique) A 5 et 7 jours postop6ratoires. Les valeurs
présentées sont les moyennes k SEM de 16 valeurs moyennes. Les valeurs écrites
en gras sont significatives par rapport au contrôle (aP < 0.05, 'P c 0.01).
JOUR 7
contrôle 176.0 -c 7.7 253.4 + 10.3
4.2.4 Collaaene
a) Jour 5 (Tableau XVIII, figure 24)
La quantité de fibres fines , de fibres épaisses et de collagène total est
significativement plus élevée dans les plaies traitées (respectivement + 54%)
P=0.005 ; + 78%, P=0.001, + 59%, P=0.0002). Mais il n'y pas de différence
significative entre le rapport fibres épaisses /fibres fines des plaies contrôles
et traitées.
Traitement 1 Fibres fines 1 Fibres Bpaisses 1 Total
EPP : 1 1488.01147.9~ 1 525.8k53.7 ( 2013.9t152.9~ 1 contrôle
Tableau XVIII. Excisions chirurgicales : surface du collagdne cicatriciel par
champ microscopique (en au jour 5 postop6ratoire.
b) Jour 7 (Tableau XIX, figure 24)
968.7k89.6
La quantité de fibres épaisses et de collagène total est
significativement plus élevée dans les plaies traitées (respectivement + 75%,
P<0.0001; + 78%, P<0.0001). De plus, le rapport fibres épaisses /fibres fines
est augmenté de manière significative dans les plaies traitées (contrôle : 4.42
+ 0.60, EPP : 8.86 11.31, P=0.005).
7
295. 3136.9
Tableau XIX. Excisions chirurgicales : surface du collagdne cicatriciel par
champ microscopique (en au jour 7 postop&ntoire.
Dans les 2 tableaux ci-dessus les valeurs présentées sont les moyennes I SEM de
16 valeurs moyennes. Les valeurs écrites en gras sont significatives par rapport au
contr6le ( O P 0.01, *P < 0.00VP c 0.001).
1 264.0594.6
Tra'rtement
contrôle
EPP :
Fibres fines
1393.5*191.1
1 1 20.4+1 35.1
Fibres Bpaisses
4372.1 kî84.4
7663.6k338.3'
Total
5765.6k20.4.9
8783.9S91.2"
JOUR 5 i . Fibres fines gïibres épaisses motal 1
Contrôle EPP: 2xl0~/ml
JOUR 7
Figure 24. Excisions chirurgicales : surface du collagène
cicatriciel à 5 et 7 jours postopératoires. Histogrammes des
résultats présentés dans les tableaux XVlll et IXX
(=P < 0.01, d~ < 0.001, eP C 0.0001).
V. DISCUSSION
Le PDGF et le TGFP font partie des facteurs de croissance clés
impliqués dans la cicatrisation cutanée et constituent des agents
thérapeutiques potentiels (Greenhalgh, D.G.. 1996 ; Pierce, G. F., 1995a).
Libérés initialement par les plaquettes sanguines où ils sont plus abondants,
ils contribuent notamment à la migration des leucocytes au site de la plaie, à
la prolifération des fibroblastes et à la synthèse des constituants de la matrice
extracellulaire (Bennett, N.T., 1993 ; Deuel, T.F., 1991 ; Roberts, A.B., 1995).
Le PDGF est connu pour son activité mitogène sur les fibroblastes en
permettant aux cellules d'entrer dans la phase G1 du cycle cellulaire (Morgan,
W. J., 1 992), tandis que le TGFP stimulerait indirectement la prolifération des
fibroblastes en induisant la sécrétion de PDGF (Soma, Y., 1989). La
fibronectine joue également un rôle important au cours de la cicatrisation
cutanée, mais son potentiel thérapeutique a été surtout évalué dans la
guérison des plaies de cornée (Gipson, I.K., 1993). D'origine plasmatique ou
cellulaire, elle participe à l'hémostase, à I'angiogénèse, à l'échafaudage de la
matrice collagène et a I'épithélialisation (Clark, R.A.F., 1990).
L'analyse comparative des dosages biochimiques et biologiques avec
les extraits plaquettaires de Knighton indiquent que nos extraits plaquettaires
fournissent une plus grande quantité de facteurs de croissance (PDGF et
TGFP) et de protéines matricielles (fibronectine et thrombospondine), et une
plus faible quantité d'albumine. Les taux plus élevés de ces 2 facteurs dans
nos extraits expliqueraient la plus grande activité observée en culture
cellulaire comparée & celle des extraits de Knighton.
En documentant nos expériences à l'aide de plusieurs paramètres
quantitatifs, nous démontrons dans cette étude que l'application unique d'une
concentration optimale de nos extraits plaquettaires au moment de la
chirurgie, accélère la guérison des plaies sur des modèles d'incisions et
d'excisions chirurgicales. Cette étude est la première étude temporelle et
multiparamétrique qui évalue les effets sur la cicatrisation cutanée de facteurs
biologiques obtenus par une source naturelle (plaquettes sanguines).
La qualité de la réparation d'une plaie cutanée dépend de celle de
plusieurs facteurs tels que le tissu de granulation, I'épithélialisation. la
contraction, et le remodelage.
En recherche préclinique, la mesure de paramètres histologiques
quantitatifs est un moyen d'objectiver la qualité de la réparation d'une plaie
cutanée. La plupart des méthodes décrites dans la littérature sont semi-
quantitatives, ou utilisent des outils de mesure non automatisés comme le
micromètre, le planimetre et le compteur cellulaire. Les progrès en
informatique ont abouti a la mise au point de systèmes d'analyse d'images
permettant la quantification automatique d'images rnacro ou microscopiques.
Ces outils, de plus en plus performants et conviviaux, trouvent davantage leur
application en recherche biomédicale, même par des utilisateurs peu familiers
avec la programmation informatique. Dans le cadre de la recherche en
cicatrisation, leur utilisation est récente et encore limitée à quelques
paramètres. Elle a permis par exemple de quantifier l'intensité ou la surface
d'un marquage irnmunohistochimique (Puola k kainen, P. A., 1 995). la surface #
des noyaux cellulaires (Pierce, G.F., 1990), ou la densité optique d'une
coloration histochimique (Houghton, P.E., 1995).
En recherche clinique, le degré ,ou le temps, de la fermeture d'une
plaie est le principal paramètre quantitatif utilisé pour évaluer la qualité de la
réparation cutanée. II reflète la qualité du recouvrement épidermique mais ne
renseigne pas sur celle du tissu de granulation sous-jacent.
En utilisant un logiciel d'analyse d'images récemment commercialisé,
nous avons mis au point des méthodologies histologiques quantitatives
d'évaluation d'une plaie cutanée. La cellularité, ainsi que la quantité et
l'organisation du collagène reflètent la qualité du tissu de granulation. Ces
paramètres, tels que déterminés dans notre étude, peuvent être évalués sur
simple biopsie, et pourraient ainsi trouver également leur applicatior: dans le
cadre de protocoles de recherche clinique visant à juger l'efficacité de
nouveaux traitements.
2 CICATRISATION PAR PREMIÈRE INTENTION
La cicatrisation par première intention survient à la suite d'une plaie
dont les bords sont affrontés, où la réaction inflammatoire est peu importante.
C'est le cas des incisions chirurgicales. des plaies nettes parées et suturées.
Sur ce modèle, nous avons comparé les effets de 3 concentrations
croissantes d'extraits plaquettaires appliquées à des incisions longitudinales.
2.1 Cellularité
Les premiers jours de la cicatrisation se caractérisent par l'afflux de
macrophages et de fibroblastes au site de la plaie. Ces cellules forment avec
les cellules endothéliales, le support cellulaire du tissu de granulation. Le
PDGF, le TGFP et la fibronectine sont des facteurs chimiotactiques connus
pour les monocytes/macrophages et les fibroblastes (Clark, R.A.F., IWO). De
plus, en les aidant à s'attacher à la matrice extracellulaire, la fibronectine
favorise la migration des cellules.
Les macrophages sont essentiels au bon déroulement de ta
cicatrisation et jouent un rôle pivot dans la transition entre la phase
inflammatoire et la formation du tissu de granulation. Activés, ils produisent de
nombreux médiateurs chimiotactiques, mitogenes et angiogéniques (Barbul,
A., 1992). Le PDGF est connu pour participer a cette activation et provoquer
notamment la sécrétion de TGFPl (Pierce, G.F., 1989b). Ces 2 facteurs
permettent l'activation des fibroblastes, qui à leur tour synthétisent du PDGF,
du TGFp et de I'IGF-1 activant leur propre prolifération (Antoniades, H.N.,
1991 ; Messadi, D.V., 1994 ; Soma, Y, 1989).
Au jour 5, nous avons démontré que les 3 concentrations dlEPP
augmentent le nombre total de cellules (majoritairement des macrophages.
mais aussi de nombreux fibroblastes et cellules endothéliales). Ces cellules
sont contenues dans un environnement riche en substance fondamentale (et
parfois en fibrine) et pauvre en collagène, L'accumulation locale de cellules
obsewées dans les plaies traitées s'expliquerait en premier lieu. par la
conjugaison des effets chirniotactiques et mitogenes des facteurs contenus
dans les extraits plaquettaires. Puis. par le recrutement et l'activation des
macrophages et des fibroblastes de la plaie. ces facteurs viendraient
augmenter et amplifier la cascade d'événements sécrétoires du foyer
inflammatoire, ce qui aboutirait à la migration de nouveaux macrophages et la
prolifération de nouveaux fibroblastes.
Dans notre expérience, la richesse en cellules n'est que transitoire; le
phénomène inflammatoire et prolifératif se stabilise puisque nous avons
montré qu'au cours des jours suivants (7 et 10), la celiularité entre les plaies
contrôles et traitées ne varient pas de manière significative. Enfin, la présence
des signaux physiologiques inhibiteurs de la prolifération fibroblastique
expliquerait qu'à 28 jours, les plaies contrôles et traitées ne sont plus
peuplées que par des fibroblastes clairsemés au sein du tissu cicatriciel.
2.2 Cotlaaene
Au cours de la cicatrisation cutanée, les fibroblastes activés
synthétisent le collagène et autres constituants de la matrice extracellulaire
(fibronectine, protéoglycans). Le collagène est déposé au sein de la plaie des
les premiers jours. La quantité de collagène augmente de manière
progressive durant le 2 premières semaines et se stabilise par la suite.
Initialement organisé en fibres fines (constituées surtout de molécules de type
III), le collagène cicatriciel forme progressivement des fibres de plus en plus
épaisses (constituées surtout de molécules de type 1). Durant la phase de
remodelage de la cicatrice qui se poursuit pendant plusieurs mois, ces fibres
s'assemblent en trousseaux de plus en plus denses dont la formation est
facilitée par des liaisons covalentes intra- et intermoléculaires (Agren, M.S.,
1992).
La mesure de la quantité de collagène déposé au sein de la plaie reste
un paramètre difficile à évaluer de manière directe à cause de l'abondance du
collagène dermique au voisinage immédiat de la plaie et de l'absence de
véritables méthodes quantitatives. Les dosages en h yd roxyproline de matériel
inséré sous la peau (éponges de polyvinyl ou pièces grillagées en métal) ne
sont qu'un indicateur indirect. II en est de même pour les études
immunohistochimiques qui apprécient l'activité biosynthétique des fibroblastes
(nombre de fibroblastes marqués par des anticorps anti-procollagène (Pierce,
G.F., 1989b), intensité et surface du marquage (Pierce, G.F., 1990)). Les
études immunohistochimiques (immunofluorescence) publiées dans la
littérature et utilisant des anticorps anti-collagène type 1 et III, n'ont évalué que
l'intensité du marquage fluorescent détecté par analyse d'images (Gorodesky,
R., 1991). Enfin, les études quantitatives utilisant la coloration au rouge sirius
observée en lumière polarisée sont basées sur des mesures
unidimensionnelles (évaluation au micromètre de l'influx de collagène au site
de la plaie et calcul approximatif de la surface (Pierce, G. F., 1 990)).
Dans notre étude, nous évaluons le collagène déposé par une mesure
bidimensionnelle réelle (surface par champ microscopique) après détection
par analyse d'images, ce qui donne un aperçu plus précis de la quantité de
collagène présente.
Les résultats obtenus dans notre expérience indiquent que les effets du
traitement sur la formation du tissu cicatriciel sont perceptibles au cours des 2
premières semaines. Ils induisent initialement un dépôt de collagène jeune
plus important (jour 5). A ce stade d'évolution, la corrélation observée entre
cellularité et fibres fines de collagène suggère que l'augmentation locale de
cellules au site de la plaie contribuerait à une synthèse plus importante de
collagène. Au jour 7, nous avons montré la présence d'une organisation plus
marquée des fibres de collagène. persistante 3 jours plus tard (jour 10) à la
concentration 2x10' pl /ml, mais qui se stabilise par la suite (jour 28).
Synthèse et organisation du collagène seraient médiés directement par le
TGFP, bien connu pour son pouvoir fibrosant in vitro et in vivo (Roberts, A.B.,
1995) et pour son action stimulatrice in vivo sur l'organisation des fibres
néoformées (Pierce, G.F., 1992). Le PDGF interviendrait indirectement
puisqu'il peut provoquer l'expression de TGFp dans les fibroblastes et les
macrophages, tandis que la fibronectine procurerait un réceptacle aux
molécules de collagène (Clark, R.A.F., 1 990).
2.3 Solidité
En recherche préclinique, la solidité de la plaie déterminée par
tensiométrie est un paramètre d'évaluation physique classique de la qualité de
la réparation d'une plaie cutanée. Elle est minime dans les tous premiers jours
où elle n'a pour support que le caillot fibrineux. Elle est habituellement
corrélée par la suite avec l'abondance et le degré d'organisation du collagène
présent au sein des plaies. De plus, des travaux ont montré que l'inhibition de
la formation des liaisons covalentes (par un traitement au p aminoproprionitrile) diminue la tension de rupture des plaies (Pierce. G.F.,
1991). indiquant que la stabilité chimique du collagène (ou maturation) joue
aussi un rôle dans la solidité des cicatrices. II est bien connu que l'application
de PDGF et TGFP exogènes augmente la tension de rupture d'incisions
cutanées 5 à 21 jours après la chirurgie (Mustoe, T.A.. 1087 ; Pierce. G.F.,
1989b ; Pierce, G.F., 1990). Chez le rat, Fiegel et al observent les mêmes
effets avec les extraits plaquettaires obtenus selon la méthode de Knighton
(qui associent PDGF et TGFB), 7 à 21 jours après l'incision chirurgicale
(Fiegel, V. D., 1992). Dans cette dernière étude. les concentrations efficaces
se situent entre 3,3xl O' et 1x1 0" plaquettes équivalent /ml, et la réponse au
traitement est concentration dépendante. Bien que notre modèle animal soit
différent, les résultats que nous avons obtenus en tensiométrie indiquent que
l'efficacité des facteurs de nos extraits se situent dans un intewalle
comparable de concentrations.
2.4 Corrélations statistiuues
Bien que statistiquement, les corrélations ne constituent pas des
relations de cause à effet, elles nous permettent. en accord avec la
morphologie, d'émettre les hypothèses suivantes:
a) au iour 5:
Le traitement comparé au contrôle induirait une réaction inflammatoire
et une prolifération fibroblastique plus marquée, responsable d'une plaie plus
étendue (corrélation largeur de la plaie avec cellularité). La réaction
inflammatoire et proliférative conduirait a un dépôt de collagène jeune
(corrélation fibres fines de collagène avec cellularité), dont I'abondance serait
responsable d'une plus grande solidité de la plaie (corrélation fibres fines
avec tensiométrie). La corrélation cell ularité avec tensiornétrie vient soutenir
cette dernière hypothèse. En bref, l'augmentation de la solidité des plaies
serait due à l'abondance en collagène jeune, elle même liée a la
richesse cellulaire.
b) au iour 7:
Dans les plaies traitées, l'atténuation de la réaction inflammatoire et
proliférative réduirait l'étendue de la plaie (corrélation largeur avec cellularité).
La présence plus importante des fibres épaisses de collagène serait
responsable d'une plus grande solidité (corrélaticn fibres épaisses avec
tensiométrie). En bref, a ce temps d'évolution, l'augmentation de la
solidité des plaies ne serait plus déterminée par le dépôt de collagène
jeune, mais par le degré d'organisation des fibres de collagène.
c) au iour 10:
Dans les plaies traitées, l'activité biosynthétique des fibroblastes
diminue au profit de I'organisation des fibres de collagène (corrélation
négative fibres fines avec fibres épaisses). Ni la quantité de collagène jeune
(contrairement au jour 5), ni I'organisation des fibres (contrairement au jour 7)
ne joueraient un rôle essentiel dans la solidité de la plaie (absence de
corrélation collagène avec tensiométrie). Ceci suggère l'intervention d'autres
facteurs comme par exemple la stabilité chimique des fibres de collagène. En
bref, l'augmentation de la solidité de la plaie ne serait plus déterminée
par le degré d'organisation des fibres de collag6ne. Elle serait due à une
maturation (ou stabilité chimique) plus avancée des fibres de collagène.
d) au iour 28 :
L'activité biosynthétique des fibroblastes reste toujours diminuée au
profit de I'organisation des fibres de collagène (corrélation négative fibres
fines avec fibres épaisses). A quantité de collagène égale, la cicatrice des
plaies traitées est plus fine. Ceci pourrait s'expliquer par I'organisation des
fibres de collagène en trousseaux plus épais, et traduirait un état de
remodelage de la matrice extracellulaire plus avancé.
3 CICATRISATION PAR SECONDE INTENTION
La cicatrisation par seconde intention intervient à la suite de la
formation d'une plaie dont les bords demeurent séparés. La guérison se fait
après le dépôt d'un volume important de tissu de granulation, la
réépithelialisation et la contraction de la plaie permettant d'accélérer le
recouvrement épidermique et de réduire le volume de tissu cicatriciel. Sur ce
modèle, nous avons évalué les effets de la concentration d'extraits
plaquettaires optimale en tensiométrie (2x10' pllrnl) à 2 temps de l'évolution
initiale d'une plaie (5 et 7 jours).
3.1 Édderme
La réépithélialisation ou recouvrement épidermique survient très
rapidement après la lésion cutanée. Elle débute par la migration des cellules
épithéliales en direction du centre de la plaie, sur une matrice protéique
constituée en particulier de fibronectine qui procure par I'intermédiaire de ses
nombreux sites de liaisons, un substratum anatomique d'ancrage (Clark.
R.A.F., 1990). Les cellules migratoires proviennent de l'épithélium sain qui
borde la plaie et des annexes cutanées. Elles commencent rapidement a
proliférer afin de reconstituer une architecture stratifiée, tandis que se poursuit
le processus de migration. Dès que I'épithélialisation est complétée, les
cellules retrouvent leur phénotype stationnaire et s'ancrent à la nouvelle
membrane basale par I'intermédiaire d'hémidesmosomes.
Synthétisé et sécrété par les kératinocytes, le TGFP inhibe leur
croissance (Hebda, H.N., 1988 ; Lynch, S.E., 1989), mais favorise leur
migration (Nickoloff, B.J., 1988). L'activité du PDGF sur les kératinocytes
n'est pas bien connue, elle impliquerait un mode d'action autocrine
(Antoniades, H.N., 1991). Lynch et al ont montré que l'application de PDGF
sur des plaies ouvertes n'a pas d'effet sur la croissance épidermique (Lynch,
S.E., 1987 et 1989).
Les résultats obtenus dans notre expérience au jour 5 suggèrent que
les facteurs présents dans nos extraits plaquettaires influencent davantage la
migration des kératinocytes (distance entre les bords libres du néoépiderme
44% plus courte que le contrôle et longueur du néoépiderme 46% plus longue
que le contrôle) que la croissance épithéliale (surface du néoépiderme non
significative), et corroborent les connaissances actuelles sur l'activité
stimulante du TGFP et de la fibronectine sur la migration des kératinocytes.
Ces effets ne sont que transitoires, puisque qu'au jour 7 aucune différence sur
la réparation épidermique n'est observée entre les plaies contrôles et traitées.
Le tissu de granulation des plaies ouvertes se constitue à partir du plan
hypodermique et se caractérise par son abondance. Son exubérance peut
contribuer à la formation de cicatrices hypertrophiques, comme c'est le cas
pour les brûlures et les plaies infectées, tandis que sa rareté empêche la
fermeture de la plaie, comme c'est le cas pour les ulcères chroniques des
jambes.
Notre traitement affecte la cellularité du tissu de granulation de manière
superposable à ce qui a été observe dans la première partie expérimentale,
avec une augmentation initiale du nombre total de cellules. Au jour 7, la
cellularité des plaies traitées est nettement diminuée, ce qui suit la tendance
observée dans la première partie expérimentale. L'absence de parallélisme
avec l'étendue des plaies s'expliquerait par l'intervention du phénomène de
contraction, toujours plus important dans les plaies ouvertes et qui a pour but
de réduire le volume de tissu cicatriciel.
3.3 Collaaene
Les résultats obtenus restent dans l'ensemble superposables à ceux de
la première partie expérimentale. Dans les plaies traitées, le dépôt de
collagène jeune est initialement plus abondant (jour 5) et l'organisation des
fibres de collagène est plus marquée (jour 7) comparés aux plaies contrôles.
Au jour 5, l'absence d'un ratio fibres épaisses/fibres fines significatif ne
permet pas de conclure à une organisation plus importante des fibres, même
en présence d'une plus grande quantité de fibres épaisses.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Sur un modèle d'incisions chirurgicales, nous avons démontré que
l'application unique d'une concentration cptimale de nos extraits plaquettaires
au moment de la chirurgie, permet d'augmenter la solidité des plaies. Les
études histomorphométriques indiquent que les plaies traitées se
caractérisent initialement par une réaction inflammatoire, proliférative et
biosynthétique transitoirement plus intense, puis par une organisation et une
maturation du collagène plus marquées que les plaies contrôles. Tous ces
effets reflètent une accélération de la réparation dermique.
Les différents paramètres histologiques quantitatifs évalués par
analyse d'images, ont permis de corréler les mesures tensiométriques, ce qui
valide nos méthodes d'évaluation et rend compte de la fiabilité de l'outil
histologique couplé à l'outil informatique. Les corrélations statistiques nous
ont amené à formuler des hypothèses qui pourraient expliquer, en partie, les
résultats observés. Ainsi, l'augmentation de la solidité de la plaie traduirait des
mécanismes d'action qui diffèrent au cours de l'évolution. Elle serait
initialement liée à la quantité des fibres de collagène présent au sein de la
plaie (jour 5)' puis à leur organisation (jour 7) et à leur maturation (jour 10).
Les résultats obtenus dans le modèle d'excisions chirurgicales
corroborent ceux observés dans le premier modèle. Ils confirment notamment
l'effet du traitement initialement sur la synthèse, puis sur l'organisation des
fibres de collagène. Ils suggèrent en plus que les facteurs biologiques
contenus dans ces extraits accélèrent la réparation épidermique,
principalement par leur action stimulatrice sur la migration des kératinocytes.
Nos expériences ont été réalisées sur des jeunes porcs dont le pouvoir
de cicatrisation est celui d'un organisme en possession de ses pleines
capacités. Les effets bénéfiques observés permettent d'espérer des effets au
moins superposables sur des modèles physiologiques et pathologiques de
retards de cicatrisation (vieillissement physiologique. diabète. ulcères
chroniques).
Le potentiel thérapeutique des facteurs de croissance est de plus en
plus exploité dans d'autres secteurs de la réparation tissulaire (tractus
gastrointestinal, cornée, tendons). Récemment, une expérience réalisée au
Centre de recherche L. C. Simard a montré que nos extraits plaquettaires
induisent un épaississement de la néo-intima dans des anévrismes
carotidiens expérimentaux (D . , Venne, 1 996). Ces résultats préliminaires
ouvrent de nouvelles perspectives dans les domaines d'application d'une
thérapeutique multifactorielle.
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ANNEXE I
Chromatogramrne des extraits plaquettaires de porc (EPP)
A titre de comparaison, le chromatogramme d'un échantillon PTRF (en
pointillé) a été rapporté sur la même figure.
La localisation des différentes protéines sur le chromatogramme est proposée
sur la base de leur poids moléculaire.
Alb
EGF
FbN
FbNG
F W
PDGF-BB
PA1 N
PF4
Thbs
TGFp
PTG
Albumine
Facteur de croissance épidermique
Fi bronectine
Fibrinogène
Facteur de von Willebrand
Facteur de croissance plaquettaire BB
(( Plasminogen activator in hibitor »
Facteur plaquettaire 4
Thrornbospondine
(< Transforming growth factor )) P p thromboglobuline
h-iilleiuiiuii PDA Cliroiiiatogruii Plot - Sn~iivle Nnirie EP-95-1 L
--
Column : YltlC-Pak CoIumn Diol-120 I Sarnple Code : EP-G5-11 Solvant A : pficspfiale saliiie pH 7,2
I Flow rate : 1 milmiri Wave length : 214 nrn Attenuation : auto scale Run Cdt : 1009; A 60 min
I
