I N D U C I B L E A C I D R E S I S T A N C E

IN E S C H E R I C H I A COLI

b y

NAZAR ULLAH R A J A

A t h e s i s s u b m i t t e d f o r t h e d e g r e e

DOCTOR OF P H I L O S O P H Y

i n t h e

U n i v e r s i t y o f L o n d o n

D e p a r t m e n t o f B i o l o g y

U n i v e r s i t y C o l l e g e L o n d o n

1 9 9 2

1 -

ProQuest Number: 10608859

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P.O. Box 1346 Ann Arbor, Ml 48106- 1346

DEDICATI-ON

T h i s t h e s i s i s d e d i c a t e d t o my p a r e n t s

a n d

n e p h e w s n a m e l y U m e r , A l i , U s a m a ,

I m r a n a n d J u n a i d

- 2 -

ACKNOWLEDGEMEN TS

I w i s h t o t h a n k P r o f . R o b i n J . R o w b u r y a n d D r . D a v i d G. S m i t h f o r

s u p e r v i s i o n o f r e s e a r c h a n d f o r t h e i r v a l u a b l e s u g g e s t i o n s a n d a d v i c e

t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y .

I am t h a n k f u l t o M a r g a r e t G o o d s o n , f o r b a c t e r i a l s t r a i n s a n d t e c h n i c a l

h e l p , a n d o t h e r f r i e n d s i n t h e l a b o r a t o r y f o r t h e i r c o o p e r a t i o n .

I am g r a t e f u l t o t h e O v e r s e a s R e s e a r c h S t u d e n t s (ORS) a w a r d s s c h e m e f o r

t h e i r a w a r d .

I l i k e t o a c k n o w l e d g e Dr . C r i s t a l l a D e m e t r i o u a n d D r . A. H a r r i s o n f o r

t h e i r h e l p i n p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s .

L a s t b u t n o t t h e l e a s t I w i s h t o e x p r e s s my g r a t i t u d e t o my f a m i l y

e s p e c i a l l y f a t h e r Mr. F a z a l Kar im Ra j a and my b r o t h e r Dr . Aman U l l a h R a j a

f o r t h e i r f i n a n c i a l a nd mor a l s u p p o r t i n t h e c o m p l e t i o n o f t h i s p r o j e c t .

3

A B S T R A C T

The a c i d s e n s i t i v i t y o f E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 s t r a i n s w a s s t u d i e d .

The i n t r o d u c t i o n of ColV#I-K94 i n t o t h e c e l l s , made t h e m m o r e s e n s i t i v e t o

a c i d a nd h y d r o g e n p e r o x i d e t r e a t m e n t s t h a n c e l l s w i t h o u t Col V p l a s m i d s .

T h e o r g a n i s m s t e n d e d t o h a b i t u a t e w h e n t h e y w e r e g r o w n a t p H 5 . 0 , a

s u b - o p t i m a l v a l u e , a nd showed r e s i s t a n c e w h e n e x p o s e d t o a c i d a n d

w h e r e a s t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s , w h i c h w e r e g r o w n a t t h e o p t i m a l pH of

7 . 0 , w e r e s i g n i f i c a n t l y m o r e s e n s i t i v e t o a c i d c o n d i t i o n s .

H a b i t u a t i o n i n d u c e d t h e s y n t h e s i s of seme p r o t e i n s , wh i ch c o n f e r r e d on t h e

c e l l s r e s i s t a n c e a g a i n s t a c i d t r e a t m e n t s , a n d t h e s e w e r e e i t h e r

s y n t h e s i s e d in l o w e r a m o u n t s i n n o n - h a b i t u a t e d c e l l s o r n o t a t a l l , a t

37 ° C , w h e n s t u d i e d b y o n e d i m e n s i o n a l a n d t w o d i m e n s i o n a l SDS

p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . Some s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s w h i c h

i nduce d a t 37 °C and 44 °C w e r e f o r m e d i n v e r y s m a l l a m o u n t s o r n o t a t

a l l a t 24 ° C g r o w t h t e m p e r a t u r e .

A u t o r a d i o g r a p h i c s t u d i e s s h o w e d t h a t t h e i n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d

p r o t e i n s o c c u r r e d w i t h i n 5 mi n o f a n a c i d s h i f t f r o m pH 7.0 t o pH 4 . 3 .

Ad d i t i on of 10 mM p h o s p h a t e b u f f e r in NB of pH 4.3 i n h i b i t e d i n d u c t i o n o f

h a b i t u a t i o n i n P 6 7 8 - 5 4 b u t n o t i n P 6 7 8 - 5 4 o m p A .

One p r o b a b l e s i t e o f a c i d i n j u r y w a s DNA. I t w a s s h o w n t h a t f o r

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s t h e ENA was l e s s damaged and r e p a i r e d b e t t e r , a f t e r

4 -

a c i d t r e a t m e n t s , c ompar ed w i t h n o n - h a b i t u a t e d c e l l s when e x a m i n e d t h r o u g h

t r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e n t s u s i n g b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f pBR 322 a s a

t r a n s f o r m a t i o n i nd e x . T h e p r o b a b l e b i o c h e m i c a l b a s i s o f DNA r e p a i r wa s

s t u d i e d u s i n g m u t a n t s a l t e r e d i n u v r A , r e c A a n d poJ_A.

5 -

C o n t e n t s

PageD e d i c a t i o n 2

Ack nowl ed geme n t s 3

A b s t r a c t 4

C o n t e n t s 6

L i s t o f T a b l e s 14

L i s t o f F i g u r e s 16

A b b r e v i a t i o n s 18

1. 1NTRCDUCTICN

1 . 1 . P l a s m i d s and t h e i r p r o p e r t i e s 21

1 . 2 . Co1V p i a s m i d - s p e c i f i e d p r o p e r t i e s 23

1 . 2 . 1 . B a c t e r i o c i n s and c o l i c i n s 23

1 . 2 . 2 . C o l i c i n o g e n i c p l a s m i d s 23

1 . 2 . 3 . Gr oup i ng o f p l a s n i d s 23

1 . 2 . 4 . C h a r a c t e r i s t i c s o f ColV p l a s m i d s 24

1 . 2 . 5 . S i m i l a r i t y be tween ColV f a c t o r and t h e F p l a s mi d 24

1 . 2 . 6 . G o l i c i n V s y n t h e s i s 25

1 . 2 . 7 . I nnxmi ty t o c o l i c i n V 25

1 . 2 . 8 . P l a s m i d i n c c m p a t i b i 1 i t y 26

1 . 2 . 9 . P l a s m i d r e p l i c a t i o n 28

1 . 2 . 1 0 . Sex p i 1 i 29

1 . 2 . 1 1 . S u r f a c e e x c l u s i o n 30

1 . 2 . 1 2 . P l a s mi d s p e c i f i e d c o n j u g a t i o n 31

1 . 3 . C e l l e n v e l o p e o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a :component s and c h a r a c t e r i s t i c s 33

1 . 3 . 1 . C y t o p l a s m i c membrane 33

1 . 3 . 1 . 1 . I n t e g r a l membrane m e t h y l - a c c e p t i n gr e c e p t o r s / t r a n s d u c e r s 37

1 . 3 . 2 . P e p t i d o g l y e a n l a y e r 37

- 6 -

1 . 3 . 3 . P e r i p l a s m i c s pa c e 39

1 . 3 . 4 . Ou t e r membrane 40

1 . 3 . 4 . 1 . P h o s p h o l i p i d s 40

1 . 3 . 4 . 2 . L i p o p o l y s a c c h a r i d e 42

1 . 3 . 4 . 3 . P r o t e i n s 45

1 . 3 . 4 . 3 . 1 . Mur e i n l i p o p r o t e i n 45

1 . 3 . 4 . 3 . 2 . QnpA p r o t e i n s 45

1 . 3 . 4 . 3 . 3 . P o r i n s 46

1 . 3 . 4 . 3 . 3 . a . P o r i n s c h a n n e l s in b a c t e r i a l p h y s i o l o g y 46

1 . 3 . 4 . 3 . 3 . b . D i f f u s i o n t h r ough p o r i n c h a n n e l s 48

1 . 3 . 4 . 4 . P r o t e i n s i n v o l v e d in s p e c i f i c d i f f u s i o np r o c e s s e s 49

1 . 4 . M o t i l i t y and c h e mo t a x i s of E . c o l i 51

1 . 4 . 1 . F l a g e l l u m 51

1 . 4 . 1 . 1 . F i l a m e n t 51

1 . 4 . 1 . 2 . Hook 53

1 . 4 . 1 . 3 . Bas a l body 53

1 . 4 . 2 . Chemotax i s 54

1 . 4 . 2 . 1 . Mechani sm o f s e n s o r y t r a n s d u c t i o n p r o c e s s 54

1 . 5 . P u b l i c h e a l t h i mpor t a nc e of E s c h e r i c h i a c o l i 56

1 . 5 . 1 . E x t r a i n t e s t i n a l d i s e a s e s 56

1 . 5 . 1 . 1 . I n f e c t i o n i n rran 56

1 . 5 . 1 . 2 . I n f e c t i o n i n a n i ma l s 57

1 . 5 . 1 . 2 . a . Sys t e mi c c o l i b a c i 1l o s i s 57

1 . 5 . 1 . 2 . b . Bovine m a s t i t i s 58

1 . 5 . 2 . I n t e s t i n a l d i s e a s e s 59

1 . 5 . 2 . a . E n t e r o t o x i g e n i c s t r a i n s 59

- 7 -

1 . 5 . 2 . b . E n t e r o p a t h o g e n i c s t r a i n s 60

c . E n t e r o i n v a s i v e s t r a i n s 60

d. E n t e r o a d h e r e n t s t r a i n s 61

e . E n t e r o h a e m o r r h a g i c s t r a i n s 61

1 . 5 . 3 . V i r u l e n c e o f GolV+ o r g a n i s ms 61

1 . 5 . 3 . 1 . Enhanced a d h e s i o n t o e p i t h e l i a l s u r f a c e s 61

1 . 5 . 3 . 2 . A u t o a g g l u t i n a t i o n and m o t i l i t y i n h i b i t i o n 62

1 . 5 . 3 . 3 . I n c r e a s e d s e r um r e s i s t a n c e 63

1 . 5 . 3 . 4 . Enhanced i r o n u p t a k e 65

1 . 5 . 3 . 5 . C o l i c i n p r o d u c t i o n 67

1 . 5 . 3 . 6 . VnpA p r o t e i n 70

1 . 6 . A d a p t i v e r e s p o n s e s t o s t r e s s 71

1 . 6 . 1 . A d a p t i v e r e s p o n s e t o a l k y l a t i n g a g e n t s 71

1 . 6 . 2 . A d a p t i v e r e s p o n s e t o o x i d a t i v e s t r e s s 71

1 . 6 . 3 . A d a p t i v e r e s p o n s e t o s t a r v a t i o n s t r e s s 73

1 . 6 . 4 . H e a t - s h o c k r e s p o n s e 75

1 . 6 . 4 . 1 . H e a t - s h o c k g e ne s 76

1 . 6 . 4 . 2 . E f f e c t o r s 76

1 . 6 . 4 . 3 . R e g u l a t i o n o f h e a t - s h o c k r e s p o n s e 78

1 . 6 . 5 . I n d u c t i o n o f t h e h e a t - s h o c k o r r e l a t e ds t r e s s s y s t e m 79

1 . 6 . 5 . 1 . I n d u c t i o n by t e m p e r a t u r e u p s h i f t andby e t h a n o l 79

1 . 6 . 5 . 2 . I n d u c t i o n o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n sby v i r a l i n f e c t i o n 80

1 . 6 . 5 . 3 . I n d u c t i o n o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s bya l k a l i n e and a c i d i c s h i f t 81

1 . 6 . 5 . 4 . I n d u c t i o n o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s byUV l i g h t 81

- 8 -

1 . 6 . 6 . The h e a t - s h o c k r e s p o n s e and t h e r m o t o l e r a n c e 82

1 . 6 . 7 . B i o c h e m i s t r y o f s t r e s s r e l a t e d r e s p o n s e 82

1 . 6 . 7 . 1 . C h a r a c t e r i s t i c s of Lon p r o t e i n 83

1 . 6 . 7 . 2 . C h a r a c t e r i s t i c s of DnaK p r o t e i n 85

1 . 6 . 7 . 3 . C h a r a c t e r i s t i c s of GroE p r o t e i n 85

1 . 6 . 8 . EN\ r e p a i r 86

1 . 6 . 8 . 1 . a . A d a p t i v e r e s p o n s e 86

1 . 6 . 8 . 1 . b . Mechani sm o f a d a p t i v e r e s p o n s e 88

1 . 6 . 8 . 2 . E r r o r - p r o n e ( i n d u c i b l e ) r e p a i r 88

1 . 6 . 8 . 2 . a . Mndel o f SOS r e g u l a t i o n 88

1 . 6 . 8 . 2 . b . Lex A c l e a v a g e 89

1 . 6 . 8 . 2 . C . B i o c h e mi c a l a s p e c t of SOS r e g u l a t i o n 90

1 . 6 . 9 . Compar i son o f t h e SOS, h e a t - s h o e k anda d a p t i v e r e g u l a t o r y s y s t e m 90

1 . 7 . The pH h o m e o s t a s i s of t h e b a c t e r i a l c e l l 92

1 . 7 . 1 . P e r t u r b a t i o n o f pH^ 93

1 . 7 . 2 . B u f f e r i n g c a p a c i t y o f t h e c e l l 94

1 . 7 . 3 . Components o f pH h o m e o s t a s i s s y s t e m 94

1 . 7 . 4 . Mechani sm o f m a i n t a i n i n g pH h o m e o s t a s i s 94

1 . 7 . 4 . a . A N a + /H+ a n t i p o r t e r i n r e g u l a t i o n ofi n t e r n a l pH 95

1 . 7 . 4 . b . A K + /H+ a n t i p o r t e r i n r e g u l a t i o n o fc y t o p l a s m i c pH 95

1 . 7 . 5 . S e n s i t i v i t y o f E n t e r o b a c t e r i a a t a c i d i c pH 95

1 . 7 . 6 . S e n s i t i v i t y t o o r g a n i c a c i d s / p r e s e r v a t i v e s 97

1 . 7 . 7 . Mechani sm o f i n h i b i t i o n 97

1 . 7 . 8 . S e n s i t i v i t y t o h yd r ogen p e r o x i d e 98

- 9 -

1 . 7 . 9 . R e c o v e r y o f i n j u r e d c e l l s 98

1 . 7 . 1 0 . R e p a i r r e s p o n s e o f ac i d / H_0~- damagedE.col_i 1 99

1 . 7 . 1 1 . H a b i t u a t i o n t o a c i d s t r e s s 100

1 . 8 . Aims o f t h i s s t u d y 102

2. MATERIALS AND VETODS

2 . 1 . B a c t e r i a l s t r a i n s 103

2 . 2 . Media 103

2 . 3 . Growth c o n d i t i o n s 103

2 . 4 . Measurement o f o p t i c a l d e n s i t y 106

2 . 5 . Measurement o f v i a b l e c o u n t 106

2 . 6 . H a b i t u a t i o n o f E . c o l i t o a c i d pH 106

2 . 7 . E f f e c t of h a b i t u a t i o n on r e s i s t a n c e o f E . c o l it o a c i d pH 107

2 . 8 . C o l i c i n p r o d u c t i o n t e s t 107

2 . 9 . S e n s i t i v i t y o f t h e o r g a n i s ms t o p u t a t i / e a g e n t s 108

2 . 1 0 . S e n s i t i v i t y t o hydr ogen p e r o x i d e 108

2 . 11 . S e n s i t i v i t y t o u r e a 108

2 . 12 . S e n s i t i v i t y t o weak a c i d s 110

2 . 13 . M o t i l i t y 110

2 . 1 4 . N e g a t i v e c h e mo t ax i s 110

2 . 1 5 . R e s p i r a t i o n o f h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e dc e 11s 111

2 . 1 6 . R e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s 112

2 . 1 7 . Re c ove r y o f i n j u r e d o r g a n i s ms 112

2 . 1 8 . I n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s 114

2 . 1 8 . 1 . P r o t e i n a n a l y s i s o f h a b i t u a t e d andn o n - h a b i t u a t e d c e l l s 114

2 . 1 8 . 1 . 1 . Sample p r e p a r a t i o n 114

2 . 1 8 . 1 . 2 . P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s 114

2 . 1 8 . 1 . 3 . One d i m e n s i o n a l SDS p o l y a c r y l a m i d e ge l e l e c t r o p h o r e s i s 115

- 10 -

2 . 1 8 . 1 . 3 . a . P o u r i n g o f g e l 115

2 . 1 8 . 1 . 3 . b . Loa d i ng o f ge l 115

2 . 1 8 . 2 . 1 . TWo d i me n s i o n a l SDS p o l y a c r y l a m i d e ge l e l e c t r o p h o r e s i s 116

2 . 1 8 . 2 . 2 . Sample p r e p a r a t i o n 116

2 . 1 8 . 2 . 3 . S e t t i n g up and r u n n i n g o f I so E l e c t r i c f o c u s i n g 116

2 . 1 8 . 2 . 4 . S e t t i n g up and r u n n i n g t h e p r o t e i n s int h e s e cond d i me n s i o n 117

2 . 1 9 . I n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s s t u d i e dby p u l s e l a b e l l i n g 118

2 . 1 9 . 1 . Time c o u r s e s t u d y f o r t h e i n d u c t i o n of s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s 118

2 . 1 9 . 2 . I n h i b i t i o n o f h a b i t u a t i o n by E . c o l i a t pH 4 . 3by t h e a d d i t i o n o f p h o s p h a t e 118

2 . 2 0 . D r y i n g t h e p o l y a c r y l a m i d e g e l s f o ra u t o r a d i o g r a p h y 119

2 . 2 1 . A u t o r a d i o g r a p h y 119

2 . 2 2 . S i z i n g of p l a s m i d 119

2 . 2 3 . C u r i n g o f p l a s m i d s 123

2 . 2 4 . P r e p a r a t i o n o f compe t en t c e l l s andt h e i r t r a n s f o r m a t i o n 123

2 . 2 5 . S e n s i t i v i t y o f ED1829ColV, I -K94-pBR 322 t o pH 3 . 0 124

2 . 2 6 . I s o l a t i o n o f pRR 322 p l a s m i d DNA f o ra g a r o s e ge l e l e c t r o p h o r e s i s 125

2 . 2 7 I s o l a t i o n o f p l aa m i d ENA f r om h a b i t u a t e d andn o n - h a b i t u a t e d c e l l s f o r t r a n s f o r m a t i o n p u r p o s e s 126

3. RESULTS

3 . 1 . S t u d i e s on a c i d s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e dColV and ColV" c e l l s 127

3 . 1 . 1 . Compar i son be tween t h e s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d GolV+ and ColV c e l l s t o f a t t y a c i d s 127

3 . 1 . 2 . Compar i son be tween t h e s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d 131 ColV and ColV’ c e l l s t o H ^

3 . 1 . 3 . Compar i son be tween t h e s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d GolV and ColV c e l l s t o u r e a 134

- 11 -

3 . 2 . R e c o v e r y o f n o n - h a b i t u a t e d i n j u r e d c e l l s

3 . 3 . S t u d i e s on t h e a c i d s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d ED1829ColV,I -K94 c e l l s

3 . 3 . 1 . Compar i s on be tween t h e s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e dand n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s ms t o f a t t y a c i d s

3 . 3 . 2 . Compar i s on be tween t h e s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e dand n o n - h a b i t u a t e d c e l l s t o

3 . 3 . 3 . Compar i s on be tween t h e a c i d s e n s i t i v i t y o f ED1829ColV, I-K94 c e l l s grown a t 44 °C and 37 °C

3 . 4 . E f f e c t o f a c i d on t h e r e s p i r a t i o n o f h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d ED1829ColV, I -K94, c e l l s a t pH 3 . 0

3 . 5 . E f f e c t o f a c i d on m o t i l i t y and c h e mo t a x i s o f h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s ms

3 . 5 . 1 . E f f e c t o f a c i d on t h e m o t i l i t y of h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d ED1829ColV, I-K94 o r g a n i s ms

3 . 5 . 2 . E f f e c t o f a c i d on c h e mo t a x i s o f h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d ED1829ColV,I-K94 c e l l s

3 . 6 . E f f e c t o f a c i d on r e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s

3 . 6 . 1 . Leakage o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s f rom s t a t i o n a r y p h a s e c e l l s

3 . 6 . 2 . Leakage o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s f rom e x p o n e n t i a l p h a s e c e l l s

3 . 7 . I n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s a t pH 3 . 0

3 . 7 . 1 . P r o t e i n s y n t h e s i s of 37 °C f o r c e l l s grown a t pH 7 . 0 and pH 5 . 0

3 . 7 . 2 . P r o t e i n s y n t h e s i s o f 24 °C grown pH 7 . 0 v e r s u s pH 5 . 0 o r g a n i s ms

3 . 7 . 3 . P r o t e i n s y n t h e s i s o f o r g a n i s ms grown a t 44 °C and pH 7 . 0 or pH 5 . 0

3 . 7 . 4 . Time c o u r s e f o r i n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s a t 37 C by pH 7 . 0 grown v e r s u s pH 4 . 3 t r a n s f e r r e d o r gan i s ms

3 . 8 . P h o s p h a t e e f f e c t on new p r o t e i n s y n t h e s i s by E . c o l i a t pH 4 . 3

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134

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136

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159

164

164

170

3 . 9 . P l a s m i d ENA. f r a m a c i d - t r e a t e d o r g a n i s m s 177

3 . 9 . 1 . a . T r a n s f o r m i n g a b i l i t y of pBR 322 f r o ma c i d - t r e a t e d o r g a n i s ms 177

3 . 9 . 1 . b . I n c r e a s e d r e p a i r by h a b i t u a t e d c e l l s 179

3 . 9 . 1 . e . B i o c h e mi c a l b a s i s o f ENA r e p a i r 182

3 . 9 . 2 . E l e c t r o p h o r e t i c m o b i 1 i t y o f a c i d - t r e a t e dpBR 322 p l a s m i d ENA 182

4. DISCUSSICN

4 . 1 . Ac i d e f f e c t on ColV, I -K94+ c e l l s 189

4 . 1 . 1 . Ac i d s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d c e l l s 189

4 . 1 . 2 . S e n s i t i v i t y o f a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s 191

4 . 2 . Ac i d s e n s i t i v i t y a f t e r t s n p e r a t u r e u p s h i f t 194

4 . 3 . E f f e c t o f a c i d on m o t i l i t y and c h e mo t ax i s 197

4 . 4 . E f f e c t s of a c i d on r e l e a s e of c e l l u l a rc o n s t i t u e n t s 198

4 . 5 . Recove ry of i n j u r e d c e l l s 199

4 . 6 . E f f e c t o f a c i d on r e s p i r a t i o n 201

4 . 7 . E f f e c t o f a c i d pH on s y n t h e s i s ofs t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s 202

4 . 8 . E f f e c t of p h o s p h a t e on t he s y n t h e s i s o f p r o t e i n si nduced a t a c i d pH 204

4 . 9 . E f f e c t of a c i d on Di>4\ o f h a b i t u a t e d o r g a n i s m s 206

5. REFERENCES 208

- 13 -

L i s t o f T a b l e s

Page

1. F u n c t i o n of t r .a r e g i o n genes 31

2. P o r i n s of E . c o L i K-12 47

3. O u t e r membrane p r o t e i n s i nvo l ve d i n s p e c i f i c t r a n s p o r t 50

4. G o l i c i n s w i t h known mode of a c t i o n 69

5. Saxe h e a t - s h o c k p r o t e i n s of E . c o L i 84

6. C h a r a c t e r i s t i c s of E . coLi s t r a i n s 104

7. P l a s m i d s u s e d and t h e i r p r o p e r t i e s 105

8. S p e c i f i c a t i o n o f m a r k e r p l a s mi d s 120

9. E f f e c t of f a t t y a c i d s on E. coLi s t r a i n s 129-130

1C. E f f e c t of on E . c oLi s t r a i n s a t pH 7 . 0 132

11. E f f e c t o f on E. coLi s t r a i n s a t pH 4 . 5 133

12. E f f e c t o f u r e a on E . c oLi s t r a i n s 135

13. E f f e c t o f i n c u b a t i o n in d i f f e r e n t med i a on r e c o v e r y of EEM8290olV,I-K94 c e l l s a f t e r 10 rain of e x p o s u r et o 10 r rMH2C'2 a t pH 3 . 0 137

14. E f f e c t of i n c u b a t i o n in d i f f e r e n t me d i a on r e c o v e r y of ED1829ColV, 1-K94 c e l l s a f t e r 65 min o f e x p o s u r et o a c e t i c a c i d a t pH 4 . 5 138

15. E f f e c t o f i n c u b a t i o n in d i f f e r e n t med i a or. r e c o v e r y of EL1829CL1V, I-K94 c e l l s a f t e r 60 min of e x p o s u r et o f o r mi c a c i d a t pH 4 . 5 139

16. E f f e c t o f f a t t y a c i d s on ED2829GolV, I -K94, h a b i t u a t e dand n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s a t pH 4 . 5 141-142

17. E f f e c t o f H2G2 on ED1829GolV,I-K94, ha b i tu a te dand n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s a t pH 7 . 0 141

18. E f f e c t o f H?0 2 on ED1829ColV, I -K94, h a b i t u a t e dand n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s a t pH 3 . 0 145

19. E f f e c t of g r owt h t e m p e r a t u r e s on s e n s i t i v i t y of ED1829ColV,I-K94 o r ga n i s ms t o f a t t y a c i d s a t pH 7 . 0 147

- 14 -

20. E f f e c t of a c i d on r e s p i r a t i o n of ED1829CblV, I -K94, h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s

21. E f f e c t o f a c i d on m o t i l i t y o f h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d c e l l s , a t r o a n t e m p e r a t u r e

22. E f f e c t o f a c i d on s t a t i o n a r y p ha s e ED1829ColV, I-K94c e l l s ; r e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s

23. E f f e c t o f a c i d on e x p o n e n t i a l pha s e ED1829ColV, I -K94c e l l s ; r e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s

24. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in ED1829ColV,I -K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0 and pH 5 . 0 , a t 37 C, s t u d y t h r o u g h u n i d i m e n s i o n a l ge l

25. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in ED1829ColV,I -K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0 and pH 5 . 0 , a t 37 C, s t u d y t h r o u g h b i d i m e n s i o n a l ge l

26. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in EDI829CbIV, I -K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0 and pH 5 . 0 , a t 24 C, s t udy t h r o u g h uni d i m e n s i o n a l ge l

27. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in ED1829GolV,I-K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0 and pH 5 . 0 , a t 24 C, s t u d y t h r o u g h b i d i m e n s i o n a l ge l

28. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in ED1829ColV,I -K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0 and pH 5 . 0 , a t 44 °C, s t u d y t h r o u g h u n i d i r r e n s i o n a l ge l

29. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in P673-51 and P678-54 crapA a t pH s h i f t f r om pH 7 . 0 t o 4 . 3 , a t 37 °C, s t u d y t h r o u g h u n i d i m e n s i o n a l ge l

30. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in P678-54 and P678-54 crnpA on a c i d - s h i f t a t pH 4 . 3 and pH 4 . 3 + 10 rrM p h o s p h a t e

31. B i o l o g i c a l a c t i v i t y o f p l a s m i d ENA. f r c m a c i d - t r e a t e d (19 m i n ) c e l l s t r a n s f o r m e d i n t o o r g a n i s ms grown a t pH 7 . 0

32. B i o l o g i c a l a c t i v i t y o f p l a a n i d ENA f rom a c i d - t r e a t e d (7 m i n ) c e l l s t r a n s f o r m e d i n t o o r g a n i s ms grown a t pH 7 . 0

33. I n c r e a s e d r e p a i r o f a c i d - da ma ge d p l a a n i d ENA in a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s

34. B i o l o g i c a l a c t i v i t y o f p l a s m i d ENA f r c m a c i d - t r e a t e d c e l l s t r a n s f o r m e d i n t o r e c i p i e n t s grown a t pH 7 . 0

149

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165

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178

180

181

183

- 15 -

L i s t o f F i g u r e s

Page

1. Nfep o f ColV, I - K 9 4 : : Tn9C'3 d e r i v a t i v e pWS12 27

2. The rmp o f F p l a s m i d 32

3. Sc h e ma t i c r e p r e s e n t a t i o n of t he s t r u c t u r e o f E . coLio u t e r m e m b r a n e - p e p t i d o g l y c a n ccmplex 34

4. B u i l d i n g b l o c k s o f t h e E.col - i p e p t i d o g l y c a n 36

5. G e n e r a l s t r u c t u r e o f p h o s p h o l i p i d s 41

6. S t r u c t u r e o f l i p i d A f r c m L P S o f S. ty.phimur.i4jm 43

7. S t r u c t u r e o f LPS 44

8. S t r u c t u r e o f t he E . c oLi f l a g e l l u m 52

S'. P r o c e s s o f s e n s o r y t r a n s d u c t i o n o f E . coLiand S . typhimur-iuxn 55

10. L o c a t i o n c f h e a t - s h o c k genes on t h e E . c o L i1i nkage map 77

11. ENA r e p a i r by N - g l y c o s y l a s e 87

12. T h r e e r e g u l a t o r y ne t works of E . c o l i t h a t canbe i nduced by a g e n t s t h a t damage ENA 91

13. Zone of c l e a r a n c ^ of s e n s i t i v e c e l l s shown by c o l i c i n p r o d u c i n g 14 Col s t r a i n and i t s m u t a n t c e l l s 109

14. T o t a l amount o f d i s s o l v e d in aqueous s o l u t i o n 113

15. S t a n d a r d c u r v e f o r s i z i n g o f ML p l a s m i d s 121

16. S i z i n g o f ColV p l a s m i d 122

17. N e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f h a b i t u a t e d and 153-155n o n - h a b i t u a t e d , ED1829CoJV,1-K94 c e l l s t o a c i d i cv a 1ae s

18. P r o t e i n s i nduce d in ED1829ColV, I-K94 a t pH 5 . 0 ,37 C, s t u d y by uni d i me n s i o n a l ge l 161

19. P r o t e i n s i nduce d in ED1829ColV,I-K94 a t pH 5 . 0 ,o37 C, s t u d y by b i d i m e n s i c n a l ge l 163

- 16 -

20. P r o t e i n s i n d u c e d in ED1829ColV,I -K94 a t pH 5 . 0 ,24 C, s t u d y by u n i d i m e n s i o n a l ge l

21. P r o t e i n s i nd u c e d in ED1829ColV, I-K94 a t pH 5 . 0 ,24 C, s t u d y by b i d i r n e n s i o n a l ge l

22. P r o t e i n s i nd u c e d i n ED1829ColV, I-K94 a t pH 5 . 0 and 44 °C

23. P r o t e i n s i nd u c e d a t a c i d - s h i f t f r c m pH 7 . 0 t o 4 . 3 in P673-54

24. P r o t e i n s i nd u c e d a t a c i d - s h i f t f r c m pH 7 . 0 t o 4 . 3 in P 6 7 8 -54 orapA

25. P r o t e i n s i nd u c e d a t a c i d - s h i f t f r c m pH 7 . 0 t o 4 . 3 ,i n P678-54 crapA, and a t pH 4 . 3 + 10 rrM p h o s p h a t e

26. P r o t e i n s i nduc e d a t a c i d - s h i f t f rcrn pH 7 . 0 t o 4 . 3 ,in P678- 54 , and a t pH 4 . 3 + 25 rrM phos p t i a t e

27. P l a s m i d |H'& f r c m a c i d - t r e a t e d (pH 3 . 0 f o r 10 m i n ) pBR 322' E . coLi

23. P l a s m i d +DN\ f r om a c i d - t r e a t e d (pH 3 . 0 f o r 7 m i n ) pBR 322 E . c oLi

29. R e p a i r o f a c i d - d a r m g e d p l a s m i d a f t e r a c i d - t r e a t m e n t of pRR 322+ E . c oL i

30. P l a s mi d DT'A f r c m a c i d - t r e a t e d (pH 3 . 0 f o r 5 mi l l ) pBR 322+ E . c o U

166

167

169

172

173

175

176

134

185

187

183

- 17 -

A b b r e v i a t i ons

Lengt h nm nanomet e r

/ m m i c r o m e t e r

rrm m i l l i m e t e r

Jvfess p g m i c r o g r a m

mg m i l l i g r a m

g gram

Volume ^il m i c r o l i t r e

ml m i l l i l i t r e

1 1i t r e

Time S second

min m i n u t e

h r hour

d day

Media NA n u t r i e n t a g a r

NA+D n u t r i e n t a g a r + 0.5% s odium d e o x y c h o l a t e

NB n u t r i e n t b r o t h

Chemi ca l s Ca Cl ^ c a l c i u m c h l o r i d e

ENA d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d

EETTA e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d

PCI h y d r o c h l o r i c a c i d

hydr ogen p e r o x i d e

LPS 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e

NaCl sod ium c h l o r i d e

- 18 -

NaCI-I s od i um h y d r o x i d e

RNA r i b o n u c l e i c a c i d

SDS sod i um dode c y l s u l p h a t e

Mi s e e l l a n e o u sA

rrA

ca

c cc

oc

°c

Ci

jLiCi

EAEC

EHEC

EIEC

EPEC

EIEC

D H 2°

IEF

kDa

LT

ST

P+

P

pH

PHo

PHi

a n p e r e

mi 11 i a n p e r e

a p p r o x i m a t e l y

c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r

open c i r c u l a r

d e g r e e C e l c i u s

c u r i e

m i c r o c u r i e

e n t e r o a d h e r e n t E . c o l i

e n t e r c h a e m o r r h a g i c E . c o l i

e n t e r o i n v a s i v e E . c o l i

e n t e r o p a t h o g e n i c E . c o l i

e n t e r o t o x i g e n i c E . c o l i

d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r

i s o e l e c t r i c f o c u s i n g

k i l o d a l t o n s

h e a t l a b i l e t o x i n

h e a t s t a b l e t o x i n

EDI829 E . c o l i s t r a i n

EDI829 ColV, I-K94 E . c o l j s t r a i n

hydr ogen ion c o n c e n t r a t i o n

e x t e r n a l pH

i n t e r n a l pH

- 19 -

pM m i c r c m o l a r s o l u t i o n

rrM m i l l i m o l a r s o l u t i o n

M m o l a r s o l u t i o n

MV m o l e c u l a r w e i g h t

CD o p t i c a l d e n s i t y

UV u l t r a v i o l e t

UTI u r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n

w/v w e i g h t t o volume

V vol t

mV mi 11 i vo 11

- 20 -

1. In t r o d u c t i o n .

1 . 1 . P l a s m i d s a n d t h e i r p r o p e r t i e s .

P l a s m i d s a r e e x t r a c h r o m o s o m a l g e n e t i c e l e m e n t s made up of d o u b l e s t r a n d e d

DNA and e x i s t p r e d o m i n a n t l y in c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r ( ccc ) f o r m w h i c h

can be s t a b l y i n h e r i t e d . Some p l a s m i d s a r e c a p a b l e of i n t e g r a t i n g i n t o t h e

h o s t c h r o m o s o m e a n d a r e k n o w n a s e p i s o m e s .

P l a s m i d r e p l i c a t i o n i s e i t h e r u n d e r s t r i n g e n t o r r e l a x e d c o n t r o l . I n

s t r i n g e n t c o n t r o l t h e r e p l i c a t i o n i s s t r i c t l y r e l a t e d t o c h r o m o s o m a l

r e p l i c a t i o n a n d 1 - 2 p l a s m i d c o p i e s e x i s t p e r c e l l . A l a r g e

s e l f - 1 r a n s f e r a b l e p l a s m i d l i k e Col V s h o w s s t r i n g e n t r e p l i c a t i o n a n d

r e q u i r e s c e l l t o c e l l c o n t a c t f o r t r a n s f e r o f g e n e t i c m a t e r i a l f r o m d o n o r

t o t h e r e c i p i e n t o r g a n i s m s . U n d e r r e l a x e d r e p l i c a t i o n c o n t r o l , u p t o 50

p l a s mi d c o p i e s p e r chromosome a r e p r e s e n t and h e r e t h e r e p l i c a t i o n o f t h e

p l a s m i d s i s i n d e p e n d e n t o f t h e c o n t r o l on c h r o m o s o m a l DNA r e p l i c a t i o n ,

a l t h o u g h h o s t c ompone n t s a r e n e e d e d f o r t h e c o p y i n g of t h e p l a s m i d . S m a l l

or i n t e r me d i a t e - s i z e , m u l t i c o p y , n o n - c on j u g a t i v e p l a s m i d s f a l l i n t o t h i s

c a t e g o r y .

Two o r mor e c o m p a t i b l e p l a s m i d s can c o - e x i s t i n a b a c t e r i a l c e l l w h e r e a s

i n c o m p a t i b l e p l a s mi d s c a n n o t e x i s t t o g e t h e r a nd a f t e r a f ew g e n e r a t i o n s of

b a c t e r i a l g r owt h one o r t h e o t h e r i s l o s t . I n c o m p a t i b l e p l a s m i d s p r o b a b l y

e i t h e r c ompe t e f o r an a t t a c h m e n t s i t e on t h e h o s t membr ane o r p r o d u c e t h e

s a m e r e p r e s s o r t h a t i n h i b i t s i n i t i a t i o n o f r e p l i c a t i o n .

21 -

A number o f c h a r a c t e r i s t i c s a r e p l a s m i d - s p e c i f i e d s u c h a s t h e f o l l o w i n g :

1. C o l i c i n o g e n i c p l a s m i d s e n c o d e t h e a b i l i t y t o p r o d u c e p r o t e i n t o x i n s ,

i . e c o l i c i n s .

2. V i r u l e n c e p l a s m i d s c o d e f o r i n c r e a s e i n t h e p a t h o g e n i c i t y o f t h e

i n v a d i n g o r g a n i s m w i t h i n a h o s t , l i k e Co l V p l a s m i d s w h i c h c o d e f o r ;

a . I n c r e a s e d s e r u m r e s i s t a n c e .

b . E n h a n c e d i r o n u p t a k e .

c . E n h a n c e d a d h e r e n c e t o h o s t c e l l s u r f a c e s .

3. T h e r e s i s t a n c e o r R f a c t o r s ( a n d s o m e o t h e r p l a s m i d s ) c a n c a r r y

r e s i s t a n c e t o a n t i b i o t i c s , i n o r g a n i c i o n s a n d o t h e r b a c t e r i o c i d a l

a g e n t s .

4. D e g r a d a t i v e p l a s m i d s c o d e f o r t h e a b i l i t y t o s y n t h e s i s e c a t a b o l i c

e n z y m e s .

5. S o m e p l a s m i d s c o d e f o r f e r m e n t a t i o n o f c e r t a i n s u g a r s .

P l a s m i d s a r e v e r y u s e f u l t o o l s f o r g e n e t i c e n g i n e e r s i n c l o n i n g DNA

t e c h n o l o g y . Many e u k a r y o t i c g e n e s can be i n c o r p o r a t e d in p l a s m i d v e c t o r s ,

f o r t h e s y n t h e s i s o f e u k a r y o t i c g e n e p r o d u c t s .

2 2 -

1 . 2 . C o l V p l a s mi d - s p e c i f i e d p r o p e r t i e s :

1 . 2 . 1 . B a c t e r i o c i n s a n d c o l i c i n s .

B a c t e r i o c i n s a r e t h e c ompounds p r o d u c e d by same b a c t e r i a l s t r a i n s c a p a b l e

of k i l l i n g t h e s e n s i t i v e c e l l s of c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s a n d a r e p r o t e i n

in n a t u r e ( H a r d y , 1 9 7 5 ) . C h i e f l y t h e y a r e p r o d u c e d b y G r a m - n e g a t i v e

o r g a n i s m s l i k e me mb e r s of t h e e n t e r o b a c t e r i a c e a e . C o l i c i n s a r e t h e v e r y

w i d e l y s t u d i e d b a c t e r i o c i n s r e p o r t e d f r o m E s c h e r i c h i a c o l i a n d S . s o n n e i .

However , G r a m - p o s i t i v e o r g a n i s m s can p r o d u c e c e r t a i n s u b s t a n c e s w h i c h a r e

a n a l o g o u s t o b a c t e r i o c i n s s u c h a s t h o s e p r o d u c e d b y S t a p h y l o c o c c u s a n d

S t r e p t o c o c c u s ( H a r d y , 1 9 7 5 ) .

1 . 2 . 2 . Co 1 i c i n og e n i c p l a s m i d s :

T h e c o 1 i c i n o g e n i c p l a s m i d s , l i k e o t h e r p l a s m i d s , a r e s u p e r c o i l e d

c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r m o l e c u l e s . T h e y c o d e f o r c o l i c i n o g e n y a n d a r e

named f o r t h e k i n d o f c o l i c i n t h e y p r o d u c e s u c h a s E, K, I , B, A a n d V

e t c . , c o l i c i n s .

1 . 2 . 3 . G r o u p i n g o f C o l p l a s m i d s :

T h e Co l p l a s m i d s f a l l i n t o t w o d i s t i n c t g r o u p s d e p e n d i n g u p o n t h e i r

m o l e c u l a r w e i g h t s ( H a r d y e t _ a l . , 1 9 7 3 ) .

G r o u p 1: c o n t a i n s s m a l l p l a s m i d s o f m o l e c u l a r w e i g h t a p p r o x i m a t e l y

5 x 1 0 ^ . T h e y a r e n on - c o n j u g a t i v e , t h e i r r e p l i c a t i o n i s

23 -

u n d e r r e l a x e d c o n t r o l a n d u p t o 50 c o p i e s p e r c e l l a r e p r e s e n t ; t h e

c o l i c i n s p r o d u c e d by t h e m a r e m o s t l y c e l l f r e e , e x e m p l i f i e d by Co l A, C o l E

a n d C o l K p l a s m i d s .

Gr oup 2: c o n t a i n s l a r g e p l a s m i d s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s b e t w e e n 6 1 x 1 0 ^

t o 1 1 3 x 1 0 ^ . T h e y a r e s e l f - t r a n s m i s s i b l e , c o n j u g a t i v e , s h o w s t r i n g e n t

r e p l i c a t i o n a nd a r e p r e s e n t i n 1 - 2 c o p y n u m b e r p e r c h r o m o s o m e , t h e i r

c o l i c i n i s c e l l b o u n d a s e x e m p l i f i e d b y C o l V , C o l l a n d C o l B .

1 . 2 . 4 . C h a r a c t e r i s t i c s o f C o l V p l a s m i d s ;

ColVs a r e l a r g e F - l i k e p l a s m i d s , a s e x e m p l i f i e d by C o l V , I - K 9 4 w h i c h i s a

s e l f - t r a n s m i s s i b l e , c o n j u g a t i v e p l a s mi d w i t h s t r i n g e n t r e p l i c a t i o n c o n t r o l

and c o n f e r s 1 - 2 copy number p e r chromosome ( H a r d y , 1975) . I t c o d e s f o r

t h e s y n t h e s i s o f c o l i c i n s V a n d l a a n d i t s i m m u n i t y f a c t o r s . I t h a s a

m o l e c u l a r w e i g h t o f 9 4 x 1 0 ^ ( C l o w e s , 1972) . I t f a l l s i n t o i n c o m p a t i b i l i t y

( I n c F l ) g r o u p w i t h t h e t r a n s f e r p r o p e r t i e s w h i c h a r e u n d e r d e r e p r e s s e d

c o n t r o l c o d e d b y t h e t r a r e g i o n .

1 . 2 . 5 . S i m i l a r i t y b e t w e e n C o l V f a c t o r a n d t h e F p l a s m i d ;

Marked h o m o l o g y e x i s t s b e t w e e n Co l V f a c t o r s a n d t h e F p l a s m i d ( S h a r p

e t ^ _ a l . , 1 9 7 3 ) w h i c h i s e v i d e n t f r o m t h e f o l l o w i n g f a c t s ;

1. E l e c t r o n m i c r o s c o p y h e t e r o d u p l e x s t u d i e s d e m o n s t r a t e t h a t C o l V , I - K 9 4

and t h e F p l a s mi d s h a r e e x t e n s i v e p o l y n u c l e o t i d e s e q u e n c e s i m i l a r i t i e s a n d

t h e t r a n s f e r r e g i o n of F i s homologous t o C o l V , I - K 9 4 ( S h a r p e t a l . , 1973)

e x c e p t f o r t h e s u r f a c e e x c l u s i o n g e n e s .

2. The sex p i l i of ColV, I -K94 and t h e F p l a s m i d a r e e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l

w h e n s t u d i e d t h r o u g h s e r o l o g i c a l t e c h n i q u e s ( H a r d y , 1 9 7 5 ) .

3. The f i n O g e n e p r o d u c t c a n r e p r e s s t h e t r a n s f e r o f F a n d C o l V , I - K 9 4 .

4. B o t h b e l o n g t o t h e I n c F l g r o u p ( L a n e , 1 9 8 1 ) .

1 . 2 . 6 . C o l i c i n V s y n t h e s i s :

C o l i c i n V wh i c h i s a sma l l m o l e c u l a r w e i g h t , d i a l y z a b l e , p r o t e i n c a p a b l e

of k i l l i n g t h e s e n s i t i v e c e l l s o f c l o s e l y r e l a t e d s p e c i e s , w a s d i s c o v e r e d

f i r s t b y G r a t i a i n 19 2 5 , f o l l o w i n g i s o l a t i o n o f E . c o l i V s t r a i n f r o m a

r a b b i t i n f e c t i o n ( G r a t i a , 1932 ) . M a x i m u m p r o d u c t i o n o f c o l i c i n V t a k e s

p l a c e d u r i n g t h e l a t e e x p o n e n t i a l p h a s e of t h e c u l t u r e a n d t h e p r o d u c t i o n

i s t e m p e r a t u r e d e p e n d e n t a s c o l i c i n c e a s e s t o b e s y n t h e s i s e d a t 25 ° C o r

l o w e r . P u r i f i c a t i o n o f c o l i c i n V s e e m s t o b e m o r e d i f f i c u l t t h a n t h e

p u r i f i c a t i o n o f o t h e r c o l i c i n s b u t p u r i f i e d m a t e r i a l h a s b e e n o b t a i n e d

and m o l e c u l a r w e i g h t i s a p p r o x i m a t e l y 4000 d ( F r i c k e t a l . , 1981 ; Y a n g a n d

Kon i s ky , 1984). K i l l i n g a c t i o n o f c o l i c i n i s a t w o s t e p e v e n t , w h e r e t h e

c o l i c i n m u s t b i n d t o r e c e p t o r s i n t h e o u t e r m e m b r a n e o f t h e s e n s i t i v e

c e l l s ( s t a g e I) a nd s u b s e q u e n t e v e n t s ( s t a g e I I ) a r e e n e r g y d e p e n d e n t ; t h e

c e l l s t r e a t e d w i t h u n c o u p l i n g a g e n t s r e m a i n s u s c e p t i b l e t o r e s c u e b y

t r y p s i n wh i c h p r o b a b l y d e s t r o y s t h e c o l i c i n a d s o r b e d t o t h e r e c e p t o r s of

t h e t a r g e t c e l l s ( H a r d y e t a l . , 1 9 7 3 ) .

1 . 2 . 7 . I m m u n i t y t o c o l i c i n V:

The Col f a c t o r a l s o c o d e s f o r t h e i m m u n i t y f a c t o r w h o s e g e n e p r o d u c t ,

- 25 -

m o l e c u l a r w e i g h t 6 5 0 0 d ( F r i c k e t a l . , 1 9 8 1 ) , r e n d e r s C o l + c e l l s

r e s i s t a n t t o t h e l e t h a l a c t i v i t y o f t h e i r own c o l i c i n a n d c e r t a i n o t h e r

t y p e V c o l i c i n s . I mmuni t y c o n f e r r e d b y ColV, c a n b e o v e r c o m e by a h i g h

c o n c e n t r a t i o n o f c o l i c i n .

I mmuni ty p r o t e i n , i s c o d e d b y a g e n e ( c v i ) , c l o s e l y l i n k e d w i t h c o l i c i n

p r o d u c t i o n g e n e ( c v a ) , a n d i s c on s t i t u t i v e 1 y s y n t h e s i s e d .

1 . 2 . 8 . P l a s m i d i n c o m p a t i b i l i t y :

I n c o m p a t i b i l i t y i s t h e p h e n o m e n o n t h r o u g h w h i c h t w o c l o s e l y r e l a t e d

p l a s m i d s c a n n o t c o e x i s t in t h e b a c t e r i a l c e l l s t a b l y . I f t wo p l a s m i d s of

t h e same i n c o m p a t i b i l i t y g r o u p a r e i n t r o d u c e d i n t o a b a c t e r i a l c e l l t h e n

a f t e r a f ew g e n e r a t i o n s m o s t of t h e d a u g h t e r c e l l s w i l l c o n t a i n o n l y o n e

of t h e p l a s m i d k i n d s . I n c o m p a t i b i l i t y i s t h o u g h t t o b e a c o n s e q u e n c e of

t h e m e c h a n i s m c o n t r o l l i n g p l a s m i d r e p l i c a t i o n a n d s e g r e g a t i o n a t c e l l

d i v i s i o n .

The p h e n o m e n o n m a y b e d u e t o t h e f a c t t h a t p l a s m i d s o f t h e s a m e

i n c o m p a t i b i l i t y g r o u p c o m p e t e f o r t h e a t t a c h m e n t s i t e s a t t h e h o s t

membr ane . The a t t a c h m e n t s i t e ma y b e i m p o r t a n t e i t h e r f o r i n i t i a t i o n of

r e p l i c a t i o n o r e s s e n t i a l f o r p l a s m i d s e g r e g a t i o n a t t h e t i m e o f c e l l

d i v i s i o n .

ColV, I -K94 e x i s t s in n a t u r e a s a c o i n t e g r a t e p l a s mi d h a v i n g t w o r e p l i c o n s :

R e p l , w h i c h i s s i m i l a r t o R e p A r e p l i c o n o f I n c F I I p l a s m i d s a n d R e p 2

(Fig. 1), w h i c h i s h o m o l o g o u s t o t h e s e c o n d a r y r e p l i c a t i o n r e g i o n o f F

f a c t o r s b e l o n g i n g t o I n c F l . I n s p i t e o f t h e f a c t t h a t C o l V , I - K 9 4 p l a s m i d

ha s a R e p - A l i k e r e p l i c a t i o n r e g i o n , i t d o e s n o t g e n e r a l l y b e h a v e l i k e

I n c F I I p l a s m i d s .

26

p W515

0/131

Repl

Rep 2*90 301

£ anegion jnc D

Fi g . 1. Map of t h e ColV, I -K94 :: Tn 903 d e r i v i t i v e pWS12. C o o r d i n a t e s a r e

in k i l o b a s e s . Rep 1 a nd Rep 2: r e p l i c a t i o n r e g i o n s , i n c D : i n c o m p a t i b i l i t y

l o c u s , o r i T : o r i g i n o f t r a n s f e r , x ^ , a n d x ^ : i n v e r t e d r e p e a t s

( a d a p t e d f r o m W e b e r e t a l . , 1 9 8 4 ; W e b e r a n d P a l c h a u d h u r i , 1 9 8 5 ) .

27 -

W e b e r e t__a l . , ( 1984 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e c o l i c i n - p r o d u c i n g p l a s m i d s

pWS12, pWS16, Tn903 d e r i v a t i v e s of ColV, I -K94 showed i n c o m p a t i b i l i t y w i t h

b o t h I n c F I a nd I n c F I I p l a s m i d s . Wh e r e a s pWS15 and pWS17, EcoRI d i g e s t s of

pWS12, p l a s m i d s e x p r e s s e d o n l y I n c F I I i n c o m p a t i b i l i t y b u t n o t I n c F I

i n c o m p a t i b i l i t y of t h e i r p a r e n t a l ColV p l a s mi d . Though pWS12 h a s a n I n c F I I

r e p l i c o n , RepI , i t d o e s n o t n o r ma l l y e x p r e s s I n c F I I i n c o m p a t i b i l i t y d u e t o

t h e p r e s e n c e o f s e c o n d r e p l i c o n , R e p 2 . When R e p 2 i s d e l e t e d t h e n Col V

b e h a v e s a s a n I n c F I I p l a s m i d .

1 . 2 . 9 . P l a s m i d r e p l i c a t i o n :

R e p l i c a t i o n s t a r t s a t a s p e c i f i c s i t e on t h e ENA t e r m e d a s o r i V , o r i g i n of

v e g e t a t i v e r e p l i c a t i o n , b y a d d i n g d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e s t h r o u g h DNA

p o l y m e r a s e t o t h e RNA p r i m e r . T h e r e p l i c a t i o n r e g i o n s o f C o l V , I - K 9 4 a r e

r e p r e s e n t e d in F i g . 1, C o l V , I - K 9 4 u s e s o n l y R e p l f o r r e p l i c a t i o n s i n c e

r emoval of Rep2 a s in pWS16 h a s no e f f e c t on t h e s t a b i l i t y of t h e p l a s m i d .

M o r e o v e r , i n a c t i v a t i o n o f R e p 2 b y i n t r o d u c i n g t h e p l a s m i d i n t o a p o l A

m u t a n t s t r a i n d o e s n o t a f f e c t t h e s t a b i l i t y a n d r e p l i c a t i o n o f p W S 1 6

( W e b e r e t a l . , 1 9 8 4 ) .

I n i t i a t i o n of r e p l i c a t i o n t a k e s p l a c e b y p r o d u c i n g a n i c k a t o n e o f t h e

ENA s t r a n d s a t o r i V f o l l owe d by u n w i n d i n g of t h e DMA f o r s y n t h e s i s of t h e

ne w c o m p l e m e n t a r y s t r a n d . E l e c t r o n m i c r o g r a p h i c s t u d i e s s h o w t h e

r e p l i c a t i o n of F p l a s mi d i s b i d i r e c t i o n a l a n d s y m m e t r i c a l . T h e d i r e c t i o n

o f r e p l i c a t i o n f o r C o l V , I - K 9 4 i s u n k n o w n .

Fo r r e p l i c a t i o n o f F, a s f o r o t h e r p l a s m i d s , h o s t f a c t o r s a r e r e q u i r e d

( Sc o t t , 1984). Th e s e i n c l u d e d n a B , d n a C a n d d n a E ( p o l y m e r a s e I I I ) . L a r g e

- 28 -

p l a s m i d s l i k e F can r e p l i c a t e i n d n a A m u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l i s i n c e

t h e y p r o d u c e t h e i r own DnaA g e n e p r o d u c t b e c a u s e dna A i s i n t e g r a t e d i n t o

t h e p l a s m i d DNA. T h e Dn a B i s t h e r e p l i c a t i v e h e l i c a s e o f E . c o l i ( P a r k ,

1987) . M o r e o v e r , RNA s y n t h e s i s i s r e q u i r e d d u r i n g t h e i n i t i a t i o n o f

p l a s m i d r e p l i c a t i o n w h i c h a c t s t o p r i m e DNA s y n t h e s i s o f n e w s t r a n d .

1 . 2 . 1 0 . S e x p i l i :

T h e s e a r e e l o n g a t e d , f i l a m e n t o u s s t r u c t u r e s , e s s e n t i a l f o r c o n j u g a t i o n ,

p r e s e n t on t h e s u r f a c e o f F + , H f r a n d c e r t a i n o t h e r p + b a c t e r i a

b e l o n g i n g t o t h e g e n e r a E s c h e r i c h i a , S h i g e l l a , S a l m o n e l l a a n d P r o t e u s .

T h e i r n u m b e r s a r e d e p e n d e n t u p o n e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s , i n c r e a s i n g

d u r i n g l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e a n d r e a c h i n g m a x i m u m d u r i n g l a t e

e x p o n e n t i a l p h a s e . The t r a n s f e r - p r o f i c i e n t c e l l s s y n t h e s i s e m o r e s e x p i l i

a f t e r r a p i d wa s h i n g , a d d i t i o n of a n t i b o d i e s s p e c i f i c t o p i l i o r d e c r e a s i n g

t h e i n t e r n a l c o n c e n t r a t i o n of 3' 5' c y c l i c AMP. S t a t i o n a r y p h a s e a n d

a mi n o a c i d s t a r v e d c u l t u r e s h a v e n o s e x p i l i ( T o m o e d a e t _ _ a l . , 1 9 7 5 ) .

The p r o x i m a l t r a c i s t r o n s l i k e J , A, L, E , K, B, V, W, C, U, F , H a n d p r o b a b l y G a r e

r e s p o n s i b l e f o r t h e s y n t h e s i s a nd a s s e m b l y of p i l i . A m u t a t i o n i n t ^ a l o c i

whi ch c o d e f o r t h e s y n t h e s i s of p i l i r e n d e r s t h e p l a s m i d c o n t a i n i n g c e l l

u n a b l e t o c o n j u g a t e . S i m i l a r l y w h e n t h e p i l i a r e s h e a r e d b y b l e n d i n g o r

t r e a t e d w i t h a n t i p i l u s a n t i b o d i e s , c o n j u g a t i o n c a n n o t t a k e p l a c e .

A n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t F p i l i shows c r o s s r e a c t i v i t y f o r Col V - s p e c i f i e d

sex p i l i s u g g e s t i n g t h a t t h e s e x p i l i e n c o d e d a r e e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l .

F - l i k e s ex p i l i h a v e a t u b e l i k e s t r u c t u r e , m a d e u p o f r e p e a t e d s u b u n i t s

29 -

of p i l i n wh i ch a r e a r r a n g e d in a h e l i c a l m a n n e r a r o u n d t h e c e n t r a l p o r e .

B a c t e r i o p h a g e s l i k e R17 and MS2 a d s o r b t o t h e s i d e o f t h e F p i l i w h e r e a s

Ml 3 b i n d s t o t h e p i l u s t i p .

T h e r o l e o f s e x p i l i i n c o n j u g a t i o n i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . T h e t w o

p r o p o s e d f u n c t i o n s a r e : 1. t o p r o v i d e a h o l l o w t u b e f o r t r a n s f e r o f DNA

f r o m d o n o r t o t h e r e c i p i e n t , o r 2 . t o b r i n g d o n o r a n d r e c i p i e n t t o g e t h e r

by r e t r a c t i o n e s t a b l i s h i n g c l o s e wa l l t o w a l l c o n t a c t a f t e r t h e p i l u s t i p

ha s become a t t a c h e d t o t h e r e c i p i e n t ( M a n n i n g a n d A c h t m a n , 1979) . T h e

t r a n s f e r of p l a s mi d DNA i s p o s s i b l e b y b o t h m e t h o d s (Ou a n d A n d e r s o n ,

1 9 7 0 ) .

1 . 2 . 1 1 . S u r f a c e e x c l u s i o n :

The phenomenon of s u r f a c e e x c l u s i o n i s m e d i a t e d t h r o u g h t h e g e n e p r o d u c t s

of t r a S and t ra- T and i s a m e c h a n i s m t o e n s u r e t h a t p l a s m i d - c o n t a i n i n g

s t r a i n s do n o t m a t e w i t h t h e c e l l s b e a r i n g t h e s a m e o r c l o s e l y r e l a t e d

p l a s mi d s . T h e t r a S a n d t r a T g e n e p r o d u c t s c o n f e r a n a d d i t i v e e f f e c t

d u r i n g t h i s p r o c e s s a n d a m u t a t i o n i n e i t h e r g e n e a b o l i s h e s s u r f a c e

e x c 1 u s i o n .

T h e p r o t e i n c o d e d by t r a T i s l o c a l i z e d i n t h e o u t e r m e m b r a n e o f F +

c e l l s and p r e v e n t s t h e s t a b l e c o n n e c t i o n s b e t w e e n d o n o r a nd r e c i p i e n t . I t s

m o l e c u l a r w e i g h t i s 25 kDa a nd t h e r e a r e a p p r o x i m a t e l y 2 9 , 00 0 c o p i e s p e r

c e l l . The t r a S g e n e p r o d u c t , 18 k Da , o c c u r s i n t h e i n n e r m e m b r a n e a n d

p r e v e n t s DNA t r a n s f e r a f t e r t h e e s t a b l i s h m e n t o f s t a b l e c o n n e c t i o n s

be t we e n d o n o r s and r e c i p i e n t s ( M a n n i n g a n d A c h t m a n , 1979 ) a c t i n g i n a n

u nk n o w n w a y .

- 30 -

1 . 2 . 1 2 . P l a s m i d s p e c i f i e d c o n j u g a t i o n :

S i n c e Co l V, I - K94 and t h e F f a c t o r s h a r e e x t e n s i v e hcmology i n t h e t r a

r e g i o n , t h e r e f o r e , t h e e v e n t s i n t r a n s f e r o f p l a s m i d ENA. o f one , may a p p l y

f o r t h e o t h e r . The t r a r e g i o n ( F i g . 2 ) , c o m p r i s i n g o f 1 / 3 gencme or

33 k i l o b a s e s o f F p l a s m i d ( W i l l e t t s and W i l k i n s , 1984 ) , c ode s f o r

f u n c t i o n s n e c e s s a r y f o r t r a n s f e r o f p l a s m i d DN\ and i s shown in T a b l e 1.

T a b l e 1. F u n c t i o n s o f t r a r e g i o n g e n e s .

(Frcm Wi 1 l e t t s and S k u r r a y , 1980; Har dy , 1981; W i l l e t t s and W i l k i n s , 1984)

t r a g e n e ( s ) f unc t i ons

J c o n t r o l s t r a o p e r o n s w i t c h i n g on

J , A , L , E , K, B , V , W, C , U, F , H s y n t h e s i s o f s ex p i l iand p o s s i b l y G

A and J i n v o l v e d in p i l i n p r o d u c t i o n

Y and Z i n v o l v e d in n i c k i n g o f BN\ s t r a n df o r t r a n s f e r

I ENA h e l i c a s e i n v o l v e d in unwi nd i ngof p l a s m i d DT̂ \. s t r a n d

S and T S u r f a c e e x c l u s i o n

G and N I n v o l v e d in f o r mi ng s t a b l e m a t i n ga g g r e g a t e s

D, I and G i n v o l v e d i n p i l u s r e t r a c t i o n

G e n e r a l l y , i n r e p r e s s e d p l a s mi d s l i k e f i n , f i n O a n d fi-nP ge ne p r o d u c t s

a c t t o g e t h e r a t an o p e r a t o r t r a O ( F i nne ga n and W i l l e t t s , 1973 ) , whi ch

i n h i b i t t h e t r a n s c r i p t i o n o f t r a J ge ne c o d i n g f o r a p r o d u c t ( J ) r e q u i r e d

t o s w i t c h on t r a n s c r i p t i o n o f t r a o p e r o n . In c o n t r a s t , ColV and F a r e

d e r e p r e s s e d p l a s n i d s s i n c e t h e i r t r a o pe r on i s e x p r e s s e d c o n s t i t u t i v e l y

and t he y a r e a b l e t o t r a n s f e r t h e m s e l v e s i n t o r e c i p i e n t c e l l s .

- 31 -

0 /9 4traregion

tra Q \ fm p o r l T %

inc

F i g . 2. T h e m a p o f F p i a s m i d . o r i T : o r i g i n o f t r a n s f e r , i n c :

i n c o m p a t i b i l i t y r e g i o n , o r i V : o r i g i n o f v e g e t a t i v e r e p l i c a t i o n .

32 -

1 . 3 . C e l l e n v e l o p e s o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a : c o m p o n e n t s a n d

c h a r a c t e r i s t i c s .

T h e e n v e l o p e o f t h e Gr am- n e g a t i v e c e l l i s c o m p o s e d o f t h e i n n e r m o s t

c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s u r r o u n d e d b y t w o f u r t h e r l a y e r s : a t h i n

p e p t i d o g l y c a n l a y e r a n d t h e o u t e r m e m b r a n e ( F i g . 3 ) , w h i c h g i v e a n

a p p e a r a n c e of a t r i l a m i n a r " r a i l r o a d t r a c k " in e l e c t r o n m i c r o g r a p h s . T h e

e n v e l o p e g i v e s s t r u c t u r a l i n t e g r i t y a n d o f f e r s a p r o t e c t i v e b a r r i e r

a g a i n s t a n t i b i o t i c s and h y d r o l y s i n g e nzymes . T h e s e l a y e r s a r e d i s c u s s e d in

t h e f o l l o w i n g s e c t i o n o f t h i s c h a p t e r .

1 . 3 . 1 . C y t o p l a s m i c m e m b r a n e :

The c y t o p l a s m i c membr ane a c t s a s an o s mo t i c b a r r i e r b e t w e e n t h e c e l l a n d

i t s s u r r o u n d i n g s a n d i s c o m p o s e d o f p h o s p h o l i p i d s a n d p r o t e i n s . T h e

p h o s p h o l i p i d s a r e a m p h i p a t h i c m o l e c u l e s c o n s i s t i n g o f a h y d r o p h i l i c p o l a r

r e g i o n a nd long h y d r o p h o b i c l i p i d c h a i n s . In a n a q u e o u s e n v i r o n m e n t , t h e

p h o s p h o l i p i d s t e n d t o a g g r e g a t e i n a f a s h i o n t o b u r y t h e i r h y d r o p h o b i c

t a i l s a nd l e a v e t h e i r h y d r o p h i l i c h e a d s e x p o s e d t o w a t e r c o n s t i t u t i n g a

t h i n b i l a y e r . Some p r o t e i n s a r e b u r i e d in t h e me m b r a n e , some c r o s s i t a n d

a r e e x p o s e d a t b o t h s i d e s .

V a r i o u s p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s a r e a t t r i b u t a b l e t o t h e c y t o p l a s m i c

m e m b r a n e w h i c h i n c l u d e t r a n s p o r t o f s o l u t e s i n t o t h e c e l l , e l e c t r o n

t r a n s p o r t a nd o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n , b i o s y n t h e s i s of l i p i d s , s y n t h e s i s

of p e p t i d o g l y c a n , DNA r e p l i c a t i o n , p r o t e i n s e c r e t i o n s , m o t i l i t y a n d

c h e m o t a x i s .

33 -

P r o t e i n c o t o l y z i n g

s p e c i f i c , f a c i l i t a t e d

d i f f u s i o n

O m p A

L i p o p o l y s o c c h a r i d e s

T r i m e r s o f

p o r m p r o t e m

M u r e i n l i p o p r o t e i n P h o s p h o l i p i d P e p t i d o g l y c a n( M u r e i n )

Fi g . 3. S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f E s c h e r i c h i a c o l i o u t e r m e m b r a n e - p e p t i d o g l y c a n c o m p l e x ( a d a p t e d f r o m N i k a i d o a n d V a a r a , 1 9 8 5 ) .

34 -

The c y t o p l a s m i c membr ane fo rms a h y d r o p h o b i c p e r m e a b i l i t y b a r r i e r t o m o s t

h y d r o p h i l i c m o l e c u l e s . A s i d e f r o m a f e w m o l e c u l e s t h a t s e e m t o d i f f u s e

f r e e l y e .g w a t e r , e n t r y o f m o s t m o l e c u l e s i n t h e c e l l r e q u i r e s s p e c i f i c

p r o t e i n s t h a t m e d i a t e t h e i r u p t a k e .

Most s u b s t a n c e s a r e t r a n s p o r t e d a c r o s s t h e membr ane by t h r e e m e t h o d s which

a r e namel y : a c t i v e t r a n s p o r t , c a r r i e r - m e d i a t e d t r a n s p o r t o r f a c i l i t a t e d

d i f f u s i o n a nd g r o u p t r a n s l o c a t i o n . In a c t i v e t r a n s p o r t , c a r r i e r p r o t e i n s

a r e i n v o l v e d i n t h e t r a n s p o r t o f s u b s t a n c e s u p h i l l a g a i n s t t h e

e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t w h i c h i s e n e r g y d e p e n d e n t a n d t h e e n e r g y i s

o b t a i n e d b y h y d r o l y s i s o f AT P b y m e m b r a n e b o u n d A T P a s e . I n

c a r r i e r - m e d i a t e d t r a n s p o r t t h e p a s s a g e of s u b s t a n c e s t a k e s p l a c e t h r o u g h

t h e c a r r i e r p r o t e i n s w i t h o u t a ny e x p e n d i t u r e o f e n e r g y , t h e r e f o r e , i t i s

c a l l e d f a c i l i t a t e d o r p a s s i v e t r a n s p o r t o r f a c i l i t a t e d d i f f u s i o n . W h e r e a s

in g r o u p t r a n s 1 o c a t i o n t h e s o l u t e s u n d e r g o c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n

e x e m p l i f i e d by t h e p h o s p h o t r a n s f e r a s e s y s t e m o f g l u c o s e a n d m a n n o s e in

E. co l i . A smal l c a r r i e r c y t o p l a s m i c p r o t e i n , H P r , w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t

of 9 kDa i s p h o s p h o r y l a t e d wh i c h t r a n s f e r s t h e P t o a s p e c i f i c s u b s t r a t e

on t h e o u t e r s u r f a c e , t r a n s p o r t s t h e p h o s p h o r y l a t e d s u g a r t o t h e i n n e r

s u r f a c e a n d r e l e a s e s i t i n t o t h e c y t o p l a s m .

The e l e c t r o n t r a n s p o r t c a r r i e r s a nd c y t o c h r o m e s y s t e m o f t h e r e s p i r a t o r y

c h a i n a r e e mbedded in t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . P a i r s of e l e c t r o n s f r o m

v a r i o u s d o n o r s a r e t r a n s f e r r e d t o NADH o r a f l a v o p r o t e i n and t h e n p a s s e d

35 -

f r o m o n e c a r r i e r t o a n o t h e r t i l l t h e u l t i m a t e e l e c t r o n a c c e p t o r (O^ )

r e s u l t i n g in g e n e r a t i o n of ATP and f r e e e n e r g y . T r a n s f e r a n c e o f a p a i r of

e l e c t r o n s f rcan NADH t o r e s u l t s in g e n e r a t i o n o f 3 ATP m o l e c u l e s f r o m

ADP a n d P . .1

The c y t o p l a s m i c membr ane i s a s e a t of a number of b i o s y n t h e t i c p r o c e s s e s .

T h e s e i n c l u d e t h e s y n t h e s i s o f p h o s p h o l i p i d s , l i p o p o l y s a c c h a r i d e s a n d

p e p t i d o g l y c a n s . D u r i n g 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s y n t h e s i s , t h e s u b u n i t s o f

p o l y s a c c h a r i d e a r e a s s e m b l e d on a l i p i d c a r r i e r f o r u l t i m a t e t r a n s f e r t o

t h e l i p i d A c o r e . S i mi l a r l y t h e N - a c e t y l m u r a m i e a c i d p e n t a p e p t i d e a t t a c h e s

t o t h e c a r r i e r whi ch r e c e i v e s N - a c e t y l g l u c o s a m i n e f r o m UDP t o f o r m t h e

d i s a c c h a r i d e f o r t r a n s f e r r i n g t o t h e g r o w i n g c e l l w a l l .

The c y t o p l a s m i c membr ane a s wel l i s i n v o l v e d i n t h e d i v i s i o n o f b a c t e r i a

t h r o u g h b i n a r y f i s s i o n w h e r e t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a t t h e e q u a t o r i a l

z one s t a r t s g r o w i n g i n w a r d l y t i l l t h e c o m p l e t i o n o f a t r a n s v e r s e s e p t u m

f o r d i v i d i n g t h e b a c t e r i u m i n t o t w o e q u a l d a u g h t e r c e l l s .

B a c t e r i a l c h e m o t ax i s i s a n o t h e r c y t o p l a s m i c m e m b r a n e f u n c t i o n a s s o c i a t e d

w i t h t r a n s p o r t . By s p e c i f i c a l l y s e n s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t o f

a t t r a c t a n t s o r r e p e l l e n t s , E s c h e r i c h i a c o l i c a n m o d i f y t h e f l a g e l l a r

r e s p o n s e a n d m o v e t o w a r d o r a w a y f r o m s u b s t a n c e s . B o t h t h e p r o t e i n s

r e s p o n s i b l e f o r s e n s i n g t h e c h e m i c a l g r a d i e n t ( s e n s o r y t r a n s d u c e r s ) a n d

t h e p r o t e i n s t h a t d r i v e t h e f l a g e l l a ( t h e f l a g e l l a r m o t o r ) a r e i n t e g r a l

m e m b r a n e p r o t e i n s .

- 36 -

1 . 3 . 1 . 1 . I n t e g r a l m e m b r a n e m e t h y 1 - a c c e p t i n g r e c e p t o r s / t r a n s d u c e r s :

T h e s e p r o t e i n s a r e n o t i n v o l v e d i n t r a n s p o r t b u t d o a c t a s s p e c i f i c

r e c e p t o r s f o r c h e m o t a c t i c e f f e c t o r s . U n l i k e t h e p e r i p l a s m i c b i n d i n g

p r o t e i n s ( s e e s e c t i o n 1 . 3 . 3 ) , t h e y r e c o g n i z e a s i g n a l a n d u n d e r g o

m e t h y l a t i o n a nd a r e , t h e r e f o r e , known a s t r a n s d u c e r s a s w e l l a s r e c e p t o r s

( M a c n a b , 1 9 8 7 b ) .

T h e r e a r e f o u r we l 1 - c h a r a c t e r i z e d p r o t e i n s o f t h i s s o r t : T s r ( t a x i s t o

s e r i n e a nd r e p e l l e n t s i n c l u d i n g a c i d s ; a l s o c a l l e d MCPI ) , T a r ( t a x i s t o

a s p a r t a t e a n d r e p e l l e n t s ; M C P I I ) , T r g ( t a x i s t o r i b o s e a n d g a l a c t o s e ;

M C P I I I ) , a n d T a p ( t a x i s a s s o c i a t e d p r o t e i n ; M C P I V _ ) ; a f i f t h , T i p E E s

( t a x i s - i n v o 1 v e d p r o t e i n ) , i s l e s s u n d e r s t o o d .

T h e s e p r o t e i n s h a v e s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t (ca. 60 kDa) a n d f i r s t l y t h e y

a c t a s c o n v e n t i o n a l r e c e p t o r s , b i n d i n g s p e c i f i c c h e m o e f f e c t o r s w i t h h i g h

a f f i n i t y . Se c o n d l y , t h e y a c t a s s e c o n d a r y r e c e p t o r s f o r s u g a r s , w h i c h t h e y

r e c o g n i z e i n d i r e c t l y by p e r i p l a s m i c b i n d i n g p r o t e i n s . T h i r d l y , t h e y a c t a s

d e t e c t o r s o f e n v i r o n m e n t a l p a r a m e t e r s s u c h a s p H a n d t e m p e r a t u r e .

F o u r t h l y , t h e y a r e " r e c e p t o r " f o r a v a r i e t y of h y d r o p h o b i c compounds b u t

l i t t l e i s known of t h e m e c h a n i s m by wh i ch t h e y s e n s e t h e c o m p o u n d s ( Ts o

a n d Ad l e r , 1 9 7 4 ) .

1 . 3 . 2 . P e p t i d o g l y c a n l a y e r :

The p e p t i d o g l y c a n l a y e r whi ch i s a t t a c h e d t o t h e o u t e r membr ane i s made up

o f t h e r e p e a t e d u n i t s o f N - a c e t y l m u r a m i c a c i d t e t r a p e p t i d e a n d

N - a c e t y l g l u c o s a m i n e l i n k e d w i t h {3-1,4 b o n d s , a s s h o w n i n F i g u r e 4,

- 37 -

N- a c e t y 1g l ucos a mi ne N - a c e t y l g l u c o s a m i n e

N- a c e t y l r r u r a mi c a c i di

N- a c e t y l m u r a m i c a c i d r

O\ C H K , c H2 ° h O/ N

// "V .o

\. C H-,0 H°x Y ^

\ \ ° H

K\

c h2o h

q / --------° \\

o

o

N H C O C H , N H C O C H 3 N H C O C H 3

C H3 -C h -c o

L - a l a n i n e

D - g l u t a mi c a c i d

me s o - d i a mi nop i me l i c a c i d

D - a l a n i n e

N H C O C H ,

C H3 -C h -c o

L - a l a n i n e

D - g l u t a m i c a c i d

m e s o - d i a mi nop i me l i c a c i d

D - a l a n i n e

F i g . 4. B u i l d i n g b l o c k s o f t h e E . c o l i p e p t i d o g l y c a n .

- 38 -

c o n s t i t u t i n g t h e b a c k b o n e o f t h e b a c t e r i a l c e l l r e s p o n s i b l e f o r

m a i n t a i n i n g t h e s h a p e and i n t e g r i t y of t h e c e l l . In G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a

t h e p o l y s a c c h a r i d e c h a i n s a r e c r o s s l i n k e d by d i r e c t p e p t i d e b o n d s b e t w e e n

t e t r a p e p t i d e s .

1 . 3 . 3 . P e r i p l a s m i c s p a c e :

The s p a c e b e t w e e n t h e c y t o p l a s m i c a nd o u t e r m e m b r a n e s i s r e f e r r e d t o a s

t h e p e r i p l a s m i c s p a c e w h i c h may b e f i l l e d w i t h p e r i p l a s m i c g e l , a t e r m

c o i n e d b y H o b o t e t a l . , ( 1984) a n d i s r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g t h e

d i s t a n c e be t we e n t h e two membr ane s . T h e p e r i p l a s m i c g e l i s m a d e u p o f a

s pongy p e p t i d o g l y c a n ; t h e h o l e s in t h e s p o n g e c o n t a i n an a q u e o u s s o l u t i o n

of t h e p e r i p l a s m i c p r o t e i n s , o l i g o s a c c h a r i d e s , m o n o s a c c h a r i d e s , a n d o t h e r

s m a l l s o l u t e s . T h e p e r i p l a s m i c p r o t e i n s , a r e g r o u p e d i n t o a t l e a s t 3

d i s t i n c t c l a s s e s d e p e n d i n g u p o n t h e i r f u n c t i o n s .

P e r i p l a s m i c b i n d i n g p r o t e i n s a r e w a t e r s o l u b l e p r o t e i n s h a v i n g s p e c i f i c

b i n d i n g s i t e s f o r many a c t i v e s u g a r s , amino a c i d s e t c . T h e y a r e l i k e l y t o

b e i n v o l v e d in p a s s i n g t h e b o u n d s o l u t e t o s p e c i f i c t r a n s m e m b r a n e

t r a n s p o r t p r o t e i n s .

T h r e e p e r i p l a s m i c p r o t e i n s , p r o d u c t s of t h e m g l B , r b s B _ / r b s P , a n dhi s

m a l E „ g e n e s , b i n d s u g a r s (g 1 u c o s e / g a l a c t o s e , r i b o s e , a n d m a l t o s e ,hi

r e s p e c t i v e l y ) w i t h h i g h a f f i n i t y a n d s p e c i f i c i t y a n d t r a n s f e r t h e m t o

m e m b r a n e - a s s o c i a t e d t r a n s p o r t s y s t e m (Macnab, 1987b) . When a s s o c i a t e d w i t h

t h e i r l i g a n d s , t h e y can a l s o b i n d t o i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s t h a t a r e

member s of t h e c h e mo t ax i s s y s t e m, namel y , t h e m e t h y l - a c c e p t i n g c h e m o t a x i s

p r o t e i n s T r g ( f o r M g l B a n d R b s B ) a n d T a r ( f o r M a l _ ) .hj hj

- 39 -

D e t o x i f y i n g e n z y m e s : i n v o l v e d i n d e t o x i f i c a t i o n o r d e g r a d a t i o n o f

a n t i m i c r o b i a l a g e n t s , e . g J 3 - l a c t a m a s e p r e s e n t i n s ome G r a m - n e g a t i v e

o r g a n i s m s , r e a c t s w i t h p e n i c i l l i n t h u s m a k i n g i t h a r m l e s s f o r t h e

m i c r o o r g a n i s m .

S c a v e n g i n g enz yme s : i n v o l v e d i n d e g a d a t i o n o f s u b s t a n c e s w h i c h a r e t o o

l a r g e or h i g h l y c h a r g e d t o p a s s t h r o u g h c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i n t o a f o r m

a b l e t o b e t r a n s l o c a t e d a c r o s s t h e membr ane s u c h a s a l k a l i n e p h o s p h a t a s e

a n d 5 ' - n u c l e o t i d a s e ( H a m m o n d e t a l . , 1 9 8 4 ) .

1 . 3 . 4 . O u t e r m e m b r a n e :

The o u t e r membr ane (Fig. 3), w h i c h i s a c o a r s e m o l e c u l a r s i e v e , c o n s i s t s

of a b i l a y e r o f a m p h i p a t h i c m o l e c u l e s , w i t h i n t e r s p e r s e d p r o t e i n

m o l e c u l e s . I t i s a n a d d i t i o n a l l a y e r i n G r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s

c o n s t i t u t i n g a p e r m e a b i l i t y b a r r i e r t o m a n y e n v i r o n m e n t a l i n h i b i t o r s a n d

a n t i b i o t i c s . The o u t e r membr ane endows E s c h e r i c h i a c o l i w i t h a n e f f e c t i v e

b a r r i e r a g a i n s t t h e a c t i o n o f b i l e s a l t s , l y s o z y m e , a n d c o m p l e m e n t a n d

a f f e c t s p h a g o c y t o s i s .

The o u t e r membr ane i s composed of t h r e e m a j o r c o n s t i t u e n t s : p h o s p h o l i p i d s ,

1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s a n d p r o t e i n s , w h i c h a r e d i s c u s s e d h e r e .

1 . 3 . 4 . 1 . P h o s p h o l i p i d s :

In E s c h e r i c h i a c o l i t h e p h o s p h o l i p i d s ( F i g u r e 5) of t h e o u t e r m e m b r a n e a r e

q u i t e s i m i l a r t o t h o s e o f c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . T h e

40 -

o

A.

OII

« 2 °—O—C—R

R—C—O - C HO

* 2 °—O—P —O—XIo

B. P h o s p h a t i d y l e t h a n o l amine X: —C —C —N

P h o s p h a t i d y 1 g l y c e r o l X: —C H_—C H—C Ho0 HC | c

O H

OII

Di p h o s p h a t idy l g l y c e r o l R—C—O—C RO £JLR—C—O—C H O

X: —C H0 —C H—C H_0— P —O—C2 u 2

I I.O H O

F i g . 5: A. Ge n e r a l s t r u c t u r e o f p h o s p h o l i p i d s , R: f a t t y a c i d c h a i n .

B. S t r u c t u r e of t h e m a j o r t yp e s o f p h o s p h o l i p i d s .

- 41 -

p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i s e n r i c h e d i n o u t e r m e m b r a n e w h e r e a s

p h o s p h a t i d y l g l y c e r o i a n d d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l a r e e n r i c h e d i n t h e

c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . T h e p h o s p a t i d y l e t h a n o l a m i n e c o n t e n t o f E . c o l i i s

s l i g h t l y h i g h e r t h a n t h a t o f S. t y p h i m u r i u m .

1 . 3 . 4 . 2 . L i p o p o l y s a c c h a r i d e :

L i p o p o l y s a c c h a r i d e (LPS) i s c o n s i d e r e d t o b e t h e e n d o t o x i n , w i t h l i p i d A

( F i g . 6 ) r e t a i n i n g t h e t o x i c i t y a n d t h e p o l y s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s

c o n f e r r i n g t h e a n t i g e n i c s p e c i f i c i t y . LPS i s c o m p o s e d of t h r e e p a r t s : t h e

p r o x i ma l , h y d r o p h o b i c l i p i d A r e g i o n ; t h e d i s t a l , h y d r o p h i l i c O a n t i g e n

p o l y s a c c h a r i d e r e g i o n w h i c h p r o t r u d e s o u t ; a n d t h e c o r e p o l y s a c c h a r i d e

r e g i o n w h i c h c o n n e c t s t h e t wo ( F i g u r e 7) . T h e l i p i d A i s m a d e u p o f

P ~ l , 6 - D - g l u c o s a m i n e d i s a c c h a r i d e , a n d i s s u b s t i t u t e d w i t h s i x o r s e v e n

s a t u r a t e d f a t t y a c i d s (Nikaido a n d V a a r a , 1987) . T h e p r o x i m a l e n d o f t h e

c o r e r eg i o n i s r i c h i n n e g a t i v e l y c h a r g e d g r o u p s . T h e p h o s p h a t e ,

p y r o p h o s p h a t e and COOH of KDO c o n f e r a s t r o n g n e g a t i v e c h a r g e t o t h e

s u r f a c e of an e n t e r o b a c t e r i u m whi ch can b e r e d u c e d b y s u b s t i t u t i o n w i t h

e t h a n o l a m i n e . T h e p r o p e r t i e s o f m u t a n t s s y n t h e s i z i n g i n c o m p l e t e L P S

m o l e c u l e s r e f l e c t t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f t h e LPS o f o u t e r m e m b r a n e .

Loss o f O a n t i g e n r e s u l t s i n l o s s o f v i r u l e n c e . E . c o l i K - 1 2 c o m p l e t e l y

l a c k s t h e O a n t i g e n w h e r e a s B s t r a i n l a c k s i n a d d i t i o n t h e m o r e d i s t a l

p a r t o f t h e c o r e . F u r t h e r m o r e , t h e l o s s o f m o r e p r o x i m a l p a r t o f c o r e

r e g i o n , a s i n Re t o R ^ , r e s u l t in " d e e p r o u g h m u t a n t s ” w h i c h a r e

s e n s i t i v e t o h y d r o p h o b i c a g e n t s ( F i g u r e 7 ) .

42 -

0 <— P - 0

CH26h

? ^ h ^ ' 0 C=0 L .I CH3

(CH2)i2c h3

X H

9? - 0 CH3(CH2)|0CHa

CH-OH(CH2)jo

c h3

yO H

T J - & >Y L 'OHc h 2CH-OH(CH2),0ch3

F i g . 6 . S t r u c t u r e o f l i p i d A f r o m t h e LPS o f S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m .

- 43

A:

G\ c

EtN

KDOG ©Ar a - N H,

Abe Glcv Gl c NAc

Vlvhn—>Rha—H3al /

Gal ( ? P

\ \ \V Q

KDO

CD

© °

->G1 c —>Ga 1 —>G1 c —>He p —>He p —>KDO----- =>Glc NI® °-€P

I ©Etn

G l c N

O p o l y s a c c h a r i d e Cor e o l i g o s a c c h a r i d e L i p i d Aj --------------------------------M --------------------------------------------------------------------- | j _______________

I------------------- Re LPS- —

-Rd.

-Rd.

■S (Wild Type) LPS-

GalB: Z - c o l j K12 p G l c NAG--G1 c--G1 c--G1 c->

C: E . c o l i B G l c - - G l c - >

F i g . 7. S t r u c t u r e o f LPS. (A) LPS f r c m S. t yph imur ium LT2 and i t s m u t a n t s .Re t h r o u g h Rd 1 r e f e r t o t h e chemotypes o f LPS t h e m u t a n t s p r o d u c e d . ( B )LPS f r c m E . c o l i K12. (C) LPS f r c m E . c o l i B. D o t t e d l i n e s r e p r e s e n t p a r t i a l s u b s t i t u t i o n . In B and C, d o t t e d a r e a (==) shows s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y w i t h S . t y p h i m u r i u m LPS. In E . c o l i K-12 , t h e c o r e p o r t i o n i s d i f f e r e n t h a v i n g rhamnosyl r e s i d u e on one s i d e of KDO. MDreover , l i p i d A c a r r i e s 2 f a t t y a c i d s c h a i n s i n s t e a d o f t h r e e . A b b r e v i a t i o n s : Abe, a b e q u o s e ; kfen, D-mannose;Rha, L- r ha mnos e ; G a l , g a l a c t o s e ; CAc, O - a c e t y l ; G l c NAc, N - a c e t y 1- D - g l u c o s a m i n e ; G l c , D - g l u c o s e ; Hep, L - g l y c e r o - D - r r a n n o s e h e p t o s e ; KDO, 2 - k e t o - 3 - d e o x y o c t o n i c a c i d ; E|N, e t h a n o l a m i n e ; P, p h o s p h a t e ; G l c N, D - g l u c o s a m i n e ;Ara N H ^ 4 - a m i n o a r a b i n o s e .

- 44 -

1 . 3 . 4 . 3 . P r o t e i n s :

Abou t h a l f t h e w e i g h t of o u t e r m e m b r a n e i s m a d e u p o f " m a j o r " p r o t e i n s

whi ch i n c l u d e , m u r e i n l i p o p r o t e i n , OnpA p r o t e i n a nd p o r i n s . R e l a t i v e l y f e w

enzymes a r e l o c a t e d i n t h e o u t e r m e m b r a n e , l i k e p h o s p h o l i p a s e A^ a n d

p r o t e a s e s , c o n t r a r y t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ( S a l t o n , 1 9 8 7 ) .

1 . 3 . 4 . 3 . 1 . M u r e i n l i p o p r o t e i n :

L i p o p r o t e i n i s a smal l m o l e c u l a r w e i g h t (7 .2 kDa ) p r o t e i n a n d t h e r e a r e

5a p p r o x i m a t e l y 7 x 1 0 c o p i e s i n e a c h c e l l . A b o u t o n e t h i r d o f t h e m a r e

c o v a l e n t l y l i n k e d w i t h t h e p e p t i d o g l y c a n l a y e r t h r o u g h t h e g r o u p of

i t s C - t e r m i n a l l y s i n e w h i l e t h e r e s t a r e f r e e . T h e i r p o l y p e p t i d e s a r e

m o s t l y in t h e a l p h a - h e l i c a l f o r m a n d s h o w c r o s s l i n k i n g ( L a m b e r t , 1988) .

1 . 3 . 4 . 3 . 2 . OmpA p r o t e i n s :

The GnpA p r o t e i n i s a ma j o r c o n s t i t u e n t o f t h e o u t e r m e m b r a n e ( F i g . 3) ,

w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f c a 35 k Da , s i m i l a r t o p o r i n s , b u t b e h a v e s

r a t h e r d i f f e r e n t l y u p o n s o l u b i l i z a t i o n i n SDS a t l ow t e m p e r a t u r e b e i n g

e x t r a c t e d a t room t e m p e r a t u r e u n l i k e p o r i n s . I t i s p r e s e n t in a b u n d a n c e5

l i k e p o r i n s in o u t e r membr ane and i t s c opy number a p p r o a c h e s t o 1 0 p e r

c e l l . I t c a n b e c r o s s - l i n k e d c h e m i c a l l y t o u n d e r l a y i n g p e p t i d o g l y c a n .

The GnpA p r o t e i n i s r i c h i n j } - s h e e t s t r u c t u r e a n d a p p e a r s t o s p a n t h e

t h i c k n e s s o f t h e m e m b r a n e . I t i s h e a t - m o d i f i a b l e a n d a n t i s e r a r a i s e d

a g a i n s t t h e G n p A p r o t e i n o f E s c h e r i c h i a c o l i c r o s s r e a c t w i t h a n

e q u i v a l e n t p r o t e i n in Sa l mone l l a t y p h i m u r i um. The GnpA p r o t e i n s h a v e t wo

45 -

i m p o r t a n t f u n c t i o n s ; 1 . t o s t a b i l i z e t h e o u t e r m e m b r a n e a n d h e l p i n

m a i n t a i n i n g s h a p e o f t h e c e l l ( R e i t h m e i r a n d B r a g g , 1977) , 2. t o a c t a s

r e c e p t o r s i n c o n j u g a t i o n i n a s s o c i a t i o n w i t h L P S ( L u g t e n b e r g a n d

Van A l p h e n , 1 9 8 3 ) .

1 . 3 . 4 . 3 . 3 . P o r i n s :

The p r o t e i n s coded by ompF, ompC a nd phoE g e n e s a r e t e r m e d p o r i n s w h i c h

a r e w a t e r f i l l e d p o r e s o r d i f f u s i o n c h a n n e l s f o r t h e p a s s a g e o f

h y d r o p h i l i c m o l e c u l e s up t o ca 600 D a c r o s s t h e o u t e r m e m b r a n e ( F i g . 3).

The c h a r a c t e r i s t i c s of t h e s e p o r i n s a r e l i s t e d in T a b l e 2. T h e y c o n s t i t u t e4

maj o r o u t e r membr ane p r o t e i n s w i t h c a 1 0 c o p i e s / c e l l , t h e e x a c t n u m b e r

d e p e n d i n g u p o n t h e g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e i r m a i n f u n c t i o n i s t o a l l o w

d i f f u s i o n of n u t r i e n t s a c r o s s t h e o u t e r membr ane b u t a n t i b i o t i c s a n d o t h e r

i n h i b i t o r s can a l s o u s e them. The QmpF and GnpC p o r i n s f a v o u r n e u t r a l a n d

c a t i o n i c c o m p o u n d s w h e r e a s t h e P h o E p r o t e i n f a v o u r s a n i o n s .

1 . 3 . 4 . 3 . 3 . a . P o r i n c h a n n e l s i n b a c t e r i a l p h y s i o l o g y :

E n t e r i c b a c t e r i a h a v e t o s u r v i v e i n a n e n v i r o n m e n t t h a t i s f u l l o f

p o w e r f u l d e t e r g e n t s ( t h e b i l e s a l t s ) , and t h e p r o p e r t i e s o f p o r i n c h a n n e l s

a r e i d e a l f o r e x c l u d i n g t h e s e l a r g e , n e g a t i v e l y c h a r g e d , h y d r o p h o b i c

compounds (Nikaido and Vaara , 1987). The s y n t h e s i s of G n p F p o r i n i s k n o w n

t o be r e p r e s s e d a t h i g h o s m o l a r i t y and t e m p e r a t u r e and some s t r a i n s u n d e r

c o n d i t i o n s t h a t mimic t h e i n t e r i o r of an imal body s w i t c h f r o m l a r g e r OmpF

c h a n n e l t o n a r r o w GnpC c h a n n e l s a n d l o s e 50% o r s o o f t h e p e r m e a b i l i t y

t o w a r d s m a l l n u t r i e n t s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 0 0 t o 2 0 0 , w h i l e

p e r m e a b i l i t y t o w a r d l a r g e r , m o r e h y d r o p h o b i c , o r n e g a t i v e l y c h a r g e d

46 -

T a b l e 2; P o r i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i K-12 .

Name Ai t e r n a t i ve names

E s t i m a t e d d i a m (nm)

R e c e p t o r f o r p h a g e / c o l i c i n

QnpF l a , 0 - 9 , b 1 . 16 T u l a , c o l i c i n A

GnpC I b , 0 - 8 , c 1 . 08 T u l b , Ma i ,

PhoE I c , e , E 1 . 16 TC23, TC45

- 47 -

compounds i s d r a s t i c a l l y r e d u c e d b e c a u s e of t h e r e s t r i c t i v e p r o p e r t i e s of

QnpC c h a n n e l s (Nikaido and Vaara , 1985). On t h e o t h e r h a n d , t h e Q n p F p o r i n

i s p r o b a b l y b e n e f i c i a l w h e n b a c t e r i a a r e o u t o f t h e a n i m a l b o d y .

1 . 3 . 4 . 3 . 3 . b . D i f f u s i o n t h r o u g h p o r i n c h a n n e l s :

The o u t e r m e m b r an e o f E . c o l i a c t s a s a m o l e c u l a r s i e v e t h a t a l l o w s t h e

p a s s a g e o f s m a l l h y d r o p h i l i c m o l e c u l e s t h r o u g h p o r i n s . D i f f u s i o n o f

s o l u t e s t h r o u g h t h e s e c h a n n e l s i s a f f e c t e d g r e a t l y by t h e p h y s i c o c h e m i c a l

p r o p e r t i e s o f t h e s o l u t e s . T h r e e m a j o r f a c t o r s t h a t i n f l u e n c e t h e

p e n e t r a t i o n o f t h e s e s o l u t e s a r e t h e s i z e , e l e c t r i c a l c h a r g e a n d

h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s o l u t e m o l e c u l e s ( N i k a i d o a n d V a a r a , 1 9 8 7 ) .

S i ze of a s o l u t e : t h e c h a n c e s of t h e s o l u t e m o l e c u l e t o s u c c e s s f u l l y e n t e r

t h e c h a n n e l by t h e p r o c e s s of r a n d a n c o l l i s i o n s i s g r e a t l y i n f l u e n c e d b y

t h e s i z e . The r a t e of d i f f u s i o n of d i s a c c h a r i d e s t h r o u g h Q n p F a n d OmpC i s

n e a r l y t w o o r d e r s o f m a g n i t u d e l o w e r t h a n t h e r a t e o f d i f f u s i o n o f a

p e n t o s e .

H y d r o p h o b i c i t y of t h e s o l u t e : p e r m e a b i l i t y t h r o u g h Qn p F c h a n n e l s i n E . c o l i

i s a f f e c t e d n e g a t i v e l y b y t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s o l u t e .

E l e c t r i c a l c h a r g e : Q n p F a nd QnpC p o r i n s h a v e a p r e f e r e n c e f o r c a t i o n s a n d

u n c h a r g e d m o l e c u l e s a n d d i f f u s i o n o f u n c h a r g e d s u g a r s t h r o u g h t h e s e

c h a n n e l s was s e v e r a l t i mes f a s t e r t h a n t h a t o f c o r r e s p o n d i n g n e g a t i v e l y

c h a r g e d s u g a r a c i d s .

48 -

1 . 3 . 4 . 3 . 4 . P r o t e i n s i n v o l v e d i n s p e c i f i c d i f f u s i o n p r o c e s s e s :

T h e p r o t e i n s i n v o l v e d in s p e c i f i c d i f f u s i o n p r o c e s s e s a r e l i s t e d i n

Ta b l e 3. The g e n e p r o d u c t of lamB i s i n v o l v e d i n t h e p a s s a g e o f m a l t o s e

a nd m a l t o d e x t r i n s t h r o u g h t h e o u t e r membr ane . When lamB i s f u l l y i n d u c e d

v e r y l a r g e c opy n u m b e r s of p r o t e i n a r e p r o d u c e d , c o m p a r a b l e t o t h o s e of

p o r i n s . Th i s p r o t e i n r e s e m b l e s p o r i n s i n t h e s e n s e t h a t i t f o r m s t i g h t l y

a s s o c i a t e d t r i m e r s s t a b l e i n SDS, i s r i c h i n p - s h e e t s t r u c t u r e , a n d i s

a s s o c i a t e d w i t h m u r e i n . I t a l s o a c t a s a r e c e p t o r of l a m b d a p h a g e ( N i k a i d o

a n d V a a r a , 1 9 8 7 ) .

The g e n e p r o d u c t o f t s x i s t h e r e c e p t o r f o r p h a g e T 6 a n d r e q u i r e d f o r

d i f f u s i o n of n u c l e o s i d e s . T h e s e f u n c t i o n s a r e n o t d e p e n d e n t on t h e T onB

p r o d u c t . A p a r t f r o m LamB and Ts x , t h e p r o p e r f u n c t i o n s o f o t h e r p r o t e i n s

r e q u i r e t h e TonB p r o d u c t ( P o s t l e and Good, 1983) . T h e T o n B i s a s s u m e d t o

b e i n v o l v e d in 11 e n e r g y c o u p l i n g 11 b u t i t s p r e c i s e r o l e i s n o t c l e a r y e t .

A n u m b e r o f o u t e r m e m b r a n e m i n o r p r o t e i n s ( T a b l e 3) a r e i n v o l v e d in

t r a n s p o r t o f v a r i o u s c h e l a t e s o f f e r r i c i o n .

49 -

T a b l e 3: O u t e r membrane p r o t e i n s i n v o l v e d i n s p e c i f i c t r a n s p o r t .

Name Mol Wt in kDa

R e c e p t o r f o r p h a g e s / c o l i c i n s

Ton B r e q u i r e m e n t

S o l u t e t r a n s p o r t e d

LamB c a . 47 lambda - k f e l t o s e , m a l t o d e x t r i n

Tsx " 26 T6 , c o l i c i n K - N u c l e o s i d e s

BtuB " 6 6 BF23, E - c o l i c i n s + Vi t ami n B ^

Ci r n 7 4 C o l i c i n s I and V ? F e r r i c i r o n ?

FhuA(TonA)

" 78 T 1 , c o l i c i n M + F e r r i chrcme

FecA " 80 . 5 + F e r r i c c i t r a t e

FepA " 81 C o l i c i n B ■f E n t e r o c h e l i n

Adapted f r c m N i k a i d o and Va a r a , ( 1987) .

- 50 -

1 . 4 . M o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s o f E . c o l i :

M o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s u r v i v a l o f

E s c h e r i c h i a c o l i and n u m e r o u s o t h e r o r g a n i s m s t h a t a r e m o t i l e . T h e m o t i l i t y

and t a x i s s y s t e m s of E s c h e r i c h i a c o l i a nd S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m r e s e m b l e

e a c h o t h e r c l o s e l y a nd b o t h t h e o r g a n i s m s h a v e a q u i t e e x t e n s i v e r a n g e o f

s t i m u l i t o w h i c h t h e y r e s p o n d b y m o v i n g i n t h e d i r e c t i o n o f i n c r e a s i n g

s t i m u l u s i n t e n s i t y ( in c a s e of a t t r a c t a n t ) o r d e c r e a s i n g s t i m u l u s i n t e n s i t y

( r e p e l l e n t ) . The m e c h a n i s m i n v o l v e s s e n s i n g t e m p o r a l g r a d i e n t s o f s t i m u l u s

and r e s p o n d i n g a c c o r d i n g l y by me a ns of t h e l ocomotor y m a c h i n e r y of t h e c e l l

( M a c n a b , 1 9 8 7 b ) .

1 . 4 . 1 . F l a g e l l um:

M o v e m e n t o f E . c o l i i n v o l v e s t h e r o t a t i o n of a f l a g e l l u m ( F i g . 8 ) w h i c h

c o n s i s t s of an e x t e r n a l f i l a m e n t , a s h o r t c u r v e d s e gme n t known a s h o o k a n d

a c o m p l e x s t r u c t u r e o f r i n g s a n d r o d s c a l l e d t h e b a s a l b o d y ( M a c n a b ,

1 9 8 7 a ) .

1 . 4 . 1 . 1 . F i 1 a m e n t :

T h e f i l a m e n t i s t h e p r o p u l s i v e c o m p o n e n t o f t h e f l a g e l l u m , i t d o e s n o

c hemomec ha n i ca l work b u t i s p a s s i v e l y d r i v e n b y a m o t o r a t i t s b a s s a n d

p e r f o r m s t h e f u n c t i o n of m o v e m e n t by r o t a t i o n a n d n o t b y b e n d i n g . I t i s

s i g n i f i c a n t c l i n i c a l l y i n t e r m s o f i t s v a r i a b i l i t y i n a n t i g e n s

( M a c n a b , 1 9 8 7 a ) .

51 -

f l a g e l l a r f i l a m e n t

oCJ

,.m„O'

o u t e rl r;«3 /^Km e m b r a n e

2 7 ^ r̂ ~~1̂ =^H>wn3 PePKriogly rann l a y e riK i n n e r

j, f m e m b r a n e( M-ring)

rotor s ta tor (S-nng)

F i g . 8 . S t r u c t u r e o f t h e E s c h e r i c h i a c o L i f l a g e l l um.

- 52 -

C h a r a c t e r i s t i c s o f f i l a m e n t :

The f l a g e l l a r f i l a m e n t i s c ompos e d of a p r o t e i n c a l l e d , f l a g e l l i n , w h o s e

m o l e c u l a r w e i g h t i s 55 kDa. The f i l a m e n t l e n g t h r a n g e s b e t w e e n 5 t o 10 jum

and h a s a c o n s t a n t d i a m e t e r of a p p r o x i m a t e l y 2 0 nm t h r o u g h o u t t h e l e n g t h .

I s o l a t e d f l a g e l l a r f i l a m e n t s can be r e a d i l y d e p o l y m e r i z e d i n t o m o n o m e r i c

f l a g e l l i n b y m i l d a c i d o r h e a t ( A s a k u r a , 1970) . F l a g e l l i n a n d f l a g e l l a r

f i l a m e n t s a r e p o t e n t a n t i g e n s a n d t h i s h a s p r o v i d e d a b a s i s f o r

d i s t i n g u i s h i n g s t r a i n s .

1 . 4 . 1 . 2 . H o o k :

The f i l a m e n t i s c o n n e c t e d t o t h e c e l l b y t h e h o o k , w h i c h i s s t r u c t u r a l l y

homologous t o t h e f i l a m e n t b u t composed of a d i s t i n c t hook p r o t e i n w h o s e

m o l e c u l a r w e i g h t i s ca . 42 kDa. The hook i s a p p r o x i m a t e l y 80 nm l o n g a n d

i s b e l i e v e d t o a c t a s a f l e x i b l e c o u p l i n g o r j o i n t b e t w e e n t h e c e l l a n d

f i l a m e n t ( M a c n a b , 1 9 8 7 a ) .

1 . 4 . 1 . 3 . B a s a l b o d y :

The hook i s c o n n e c t e d t o a complex s t r u c t u r e of r i n g s a nd r o d s e mbedded in

t h e c e l l s u r f a c e . T h i s c o n s i s t s o f a s e t o f f o u r r i n g s ; t h e o u t e r t w o

r i n g s (known a s L a nd P) a r e s p a c e d a p a r t b u t j o i n e d t h r o u g h c y l i n d r i c a l

wal l t o t h e i n n e r two r i n g s (S and M) a s s h o w n i n t h e s c h e m a t i c d i a g r a m

F i g . 8 . T h e Mot A a n d M o t B p r o t e i n s , w h i c h a r e i n t e g r a l c y t o p l a s m i c

p r o t e i n s , a r e n e c e s s a r y f o r mo t o r r o t a t i o n bo t h c o u n t e r c l o c k w i s e (CCW) a n d

(CW) c l o c k w i s e ( M a c n a b , 1 9 8 7 a ) .

53

1 . 4 . 2 . C h e m o t a x i s :

M o t i l e b a c t e r i a e x h i b i t a c h e m o t a c t i c r e s p o n s e a f t e r t a s t i n g t h e i r

e n v i r o n m e n t b y m e a n s o f s p e c i f i c c h e m o r e c e p t o r s ( s e e s e c t i o n 1 . 3 . 1 . 1 ).

They show p o s i t i v e c h e m o t a x i s t o w a r d s a t t r a c t a n t s l i k e s u g a r s a n d a m i n o

a c i d s a n d n e g a t i v e c h e m o t a x i s f r o m r e p e l l a n t s s u c h a s p h e n o l , a c i d o r

a l k a l i ( Ts o a n d A d l e r , 1974 ; L e i v e a n d D a v i s , 1 9 8 0 ; M a c n a b , 1 9 8 7 b ) .

1 . 4 . 2 . 1 . M e c h a n i s m o f s e n s o r y t r a n s d u c t i o n p r o c e s s :

A s c h e m a t i c model f o r s e n s o r y t r a n s d u c t i o n of E . c o l i a n d S . t y p h i m u r i u m i s

Shown in F i g . 9. The M C P - t y p e r e c e p t o r s b i n d s p e c i f i c c h e m i c a l s s u c h a s

a s p a r t a t e o r m a l t o s e compl e xed t o p e r i p l a s m i c b i n d i n g p r o t e i n ( s e e s e c t i o n

1 . 3 . 3 ) a n d c a u s e e x c i t a t i o n ( M a c n a b , 1 9 8 7 b ) . T h e e x c i t a t i o n s i g n a l

( Se x c i t ^ c a u s e s e n h a n c e d CCW r o t a t i o n o f t h e f l a g e l l a r m o t o r i f t h e

s t i m u l u s i s an i n c r e a s e in a t t r a c t a n t c o n c e n t r a t i o n . T h e s i g n a l p r o b a b l y

c o m p r i s e s a c h a n g e in t h e a s s o c i a t i o n s t a t e a n d s m a l l - m o l e c u l e - b i n d i n g

s t a t e o f v a r i o u s c h e m o t a c t i c p r o t e i n s ( CheY, C h e Z , C h e A , C h e W ) . T h e

a d a p t a t i o n s i g n a l ^ acj a p^^ p r o g r e s s i v e l y c a n c e l s t h e e x c i t a t i o n s i g n a l

a n d t h e m o t o r r e t u r n s t o i t s u n s t i m u l a t e d CCW/CW r a t i o ; t h e p r o c e s s

i n v o l v e s a c h a n g e i n t h e m e t h y l a t i o n o f t h e M C P s , m e d i a t e d b y a

m e t h y l t r a n s f e r a s e and a m e t h y l e s t e r a s e . B i n d i n g o f C h e Z a n d C h e Y t o t h e

f l a g e l l a r s w i t c h p l a c e s i t i n CCW a n d CW s t a t e r e s p e c t i v e l y .

54 -

METHYLATION - d e p e n d e n t SYSTEM

a1»ractont ( s ) r e c eptor ( MCP) CCW

e x c i t

adapt

A MW FLAGELLARMOTOR

Fi g . 9. P r o c e s s of s e n s o r y t r a n s d u c t i o n o f E . c o H a n d S . t y p h n n u r _ i u m .

S p e c i f i c c h e m i c a l s ( s o l i d c i r c l e ) , c h a n g e i n t h e a s s o c i a t i o n s t a t e a n d

sma l 1 - m o l e c u l e b i n d i n g s t a t e ( s o l i d s q u a r e ) . A b b r e v i a t i o n s : S

e x c i t a t i o n s i g n a l ; a d a p t a t i o n s i g n a l ; MCP, m e t h y 1 - a c c e p t i n g

r e c e p t o r s / t r a n s d u c e r s ; CheY, C h e Z , C h e A a n d CheW, c h e m o t a x i s p r o t e i n s

( a d a p t e d f r o m M a c n a b , 1 9 8 7 b ) .

55 -

1 . 5 . P u b l i c h e a l t h i m p o r t a n c e o f E s c h e r i c h i a c o l i :

T h e p a t h o g e n e s i s o f E . c o l i i s c l a s s i f i e d i n t o 2 b r o a d g r o u p s ; 1.

e x t r a i n t e s t i n a 1 d i s e a s e s , 2. i n t e s t i n a l d i s e a s e s .

1 . 5 . 1 . E x t r a i n t e s t i n a l d i s e a s e s :

1 . 5 . 1 . 1 . I n f e c t i o n i n m a n :

E . c o l i i s a n i m p o r t a n t a e t i o l o g i c a l a g e n t f o r u r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n

(UTI) . T h e UTI b e i n g m o s t common in f e m a l e s ( S o n n e n w i r t h , 1 9 8 0 ) a n d

i n c r e a s i n g in i n c i d e n c e w i t h a g e in b o t h s e x e s ( S u s s m a n , 1985 ) . V a r i o u s

t y p e s of u r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n a r e c a u s e d b y E s c h e r i c h i a c o l i , a mong

t hem c o v e r t b a c t e r i u r i a (CBU) o r a s y m p t o m a t i c b a c t e r i u r i a i s t h e m o s t

common. I t i s now r e c o g n i z e d t h a t t h e s i l e n t p h a s e o f i n f e c t i o n ma y b e

p u n c t u a t e d by s y mp t o m a t i c e p i s o d e s whi ch l ead t o i n f e c t i o n l i m i t e d t o t h e

b l a d d e r ( a c u t e c y s t i t i s ) o r k i d n e y ( p y e l o n e p h r i t i s ) .

The p a t h o g e n i c i t y o f E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s r e s p o n s i b l e f o r u r i n a r y

t r a c t i n f e c t i o n may r e s t u p o n t h e p r o d u c t i o n o f d i f f e r e n t v i r u l e n c e

f a c t o r s ; amongs t t h e m a r e c a p s u l a r (K) a n t i g e n , s o m a t i c (O) a n t i g e n a n d

h a e mo l ys i n w h i l s t t h e p r e s e n c e of c o l o n i z i n g f a c t o r ( l e a d i n g t o i n c r e a s e d

a d h e r e n c e t o e p i t h e l i a l membr ane ) may a l l o w E . c o l i t o e s t a b l i s h t h e m s e l v e s

in t h e u r i n a r y t r a c t a nd r e s i s t t h e w a s h - o u t e f f e c t s o f u r i n e f l o w ( Re i d

a n d S o b e l , 1 9 8 7 ; S u s s m a n , 1 9 8 5 ) .

I n s e p t i c a e m i a , E s c h e r i c h i a c o H e n t e r t h e b l o o d c i r c u l a t i o n i n l a r g e

n u m b e r s , o v e r a p e r i o d o f t i m e , e i t h e r f r o m a n i n f e c t e d t i s s u e l e s i o n ,

a f t e r i n v a s i v e p e n e t r a t i o n f r o m t h e i n t e s t i n e o r m o s t c o m m o n l y f r o m a

u r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n . In t h e c a s e of s e p t i c a e m i a , l i k e b a c t e r a e m i a , t h e

m i c r o - o r g a n i s m s a r e r emoved by t h e p h a g o c y t i c s y s t e m f r o m c i r c u l a t i o n b u t

i t i s t h e e n d o t o x i n (LPS) r e l e a s e d f r o m t h e o r g a n i s m s i n t h e b l o o d w h i c h

c a u s e t h e s y m p t o m s ( S u s s m a n , 1 9 8 5 ) .

M e n i n g i t i s d u e t o E s c h e r i c h i a co l i i s an i n f e c t i o n o f t h e n e w b o r n a n d 80%

of t h e c a u s a t i v e s t r a i n s c o n t a i n t h e K1 a n t i g e n ( M c C r a k e n e t a l . , 1974) .

T h e E . c o l i i s o l a t e d f r o m c e r e b r o s p i n a l f l u i d o f a n e w b o r n b a b y w i t h

m e n i n g i t i s c r o s s r e a c t e d w i t h t h e s e r u m r a i s e d a g a i n s t N . m e n i n g i t i d i s

(Gr ados a nd Ewing, 1970) i n d i c a t i n g s t r u c t u r a l homol ogy o f K a n t i g e n w i t h

t h e m e n i n g o c o c c a l g r o u p B p o l y s a c c h a r i d e ( L i u e t a l . , 1 9 7 1 ) .

Wound i n f e c t i o n s d u e t o E s c h e r i c h i a c o l i a r e common f o l l o w i n g s u r g i c a l

o p e r a t i o n s s u c h a s a p p e n d i c e c t o m y .

1 . 5 . 1 . 2 . I n f e c t i o n i n a n i m a l s :

1 . 5 . 1 . 2 . a . S y s t e m i c c o l i b a c i 1 l o s i s :

E . co l i can c a u s e c o l i s e p t i c a e m i a in f a r m a n i m a l s , w h e r e t h e o r g a n i s m s p a s s

t h r o u g h t h e m u c o s a o f t h e a l i m e n t a r y t r a c t a n d e n t e r t h e b l o o d s t r e a m

c a u s i n g g e n e r a l i z e d i n f e c t i o n . I t a f f e c t s c a l v e s t h a t f a i l t o a b s o r b gamma

g l o b u l i n f r o m c o l o s t r u m a f t e r t h e i r b i r t h . I t i s a p o t e n t i a l l y f a t a l

i n f e c t i o n o f t e n l e a d i n g t o d e a t h of t h e c a l v e s w i t h i n a f e w d a y s o f b i r t h .

I t i s c h a r a c t e r i z e d by e n l a r g e m e n t of t h e s p l e e n a n d h a e m o r r h a g e s on t h e

s u r f a c e s of h e a r t , p e r i t o n e u m and b l ood v e s s e l s ( L i n t o n a n d H i n t o n , 1988) .

I t w a s r e p o r t e d t h a t o f 31 E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s i s o l a t e d f r o m

g e n e r a l i z e d i n f e c t i o n of c a l v e s , 25 p r o d u c e d c o l i c i n V ( S m i t h , 1 9 7 4 ) .

57 -

ColV s t r a i n s a r e h i g h l y p a t h o g e n i c and t h i s p r o p e r t y c a n e a s i l y b e l o s t

by c u r i n g t h e p l a s m i d s w h i l e on i t s r e i n t r o d u c t i o n t h e v i r u l e n c e c a n b e

r e s t o r e d . T h e v i r u l e n c e o f t h e Col s t r a i n s i s n o t d u e t o t h e t o x i c i t y

of c o l i c i n V b u t d u e t o t h e i r a b i l i t y t o s u r v i v e in t h e b l o o d a n d i n t e r n a l

o r g a n s o f t h e i n f e c t e d h o s t . S t u d i e s o f o r a l l y f e d c o l o s t r u m - d e p r i v e d

c a l v e s a d m i n i s t e r e d Col a n d Co l f o r m s r e v e a l e d t h a t t h e c a l v e s g i v e n

t h e Col V f o r m w e r e n o r m a l i n a p p e a r a n c e a f t e r 24 h r w h e r e a s o n e s

a d m i n i s t e r e d w i t h Col V w e r e s e r i o u s l y i l l w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n s of

o r g a n i s m s in b l ood , k i d n e y s and l u n g s ( S m i t h a n d H u g g i n s , 1976) . S i m i l a r

r e s u l t s w e r e o b s e r v e d i n c h i c k e n s i n j e c t e d i n t r a m u s c u l a r l y w i t h Col V

a n d Col f o r m s , c o n f i r m i n g t h e p a t h o g e n i c i t y o f Co l V+ s t r a i n s ( S m i t h

a n d H u g g i n s , 1 9 7 6 ) .

S y s t e m i c c o l i b a c i 1 l o s i s i s c o m m o n i n 2 - 3 w e e k o l d l a m b s a n d t h e

i n f e c t i o n may b e e i t h e r g e n e r a l i z e d o r l o c a l i z e d ( L i n t o n a n d H i n t o n ,

1988) . C o l i s e p t i c a e m i a , a n i m p o r t a n t c a u s e o f l o s s e s i n t h e p o u l t r y

i n d u s t r y , o c c u r s in c h i c k e n s a ge d 5 - 1 2 we e ks c h a r a c t e r i z e d b y f i b r i n o u s

p e r i c a r d i t i s , a i r s a c c u l i t i s a n d s y n o v i t i s ( L i n t o n a n d H i n t o n , 1 9 8 8 ) .

1 . 5 . 1 . 2 . b . B o v i n e m a s t i t i s :

The i n c i d e n c e r a t e f o r b o v i n e m a s t i t i s c a u s e d b y E s c h e r i c h i a c o l i h a s

r i s e n r a p i d l y . The p r e - d i s p o s i n g f a c t o r s l i k e u s e o f i n t r a m a m m a r y t u b e ,

i n c r e a s e in h e r d s i z e , c h a n g e s in m e t h o d s of h o u s i n g and d e c r e a s e d t i m e on

p a s t u r e , t e a t d i p p i n g and d r y cow t h e r a p y h a v e r e n d e r e d t h e mammary g l a n d

s u s c e p t i b l e t o o p p o r t u n i s t E . c o l i . T h e i n f e c t i o n i s c h a r a c t e r i z e d b y

r e s p o n s e s wh i c h r a n g e f r o m m i l d t o a c u t e r e a c t i o n s . In a c u t e c a s e s , t h e

o r g a n i s m s m u l t i p l y r a p i d l y w i t h o u t a ny c h e c k a nd c a u s e t o x a e m i a r e s u l t i n g

58 -

in s e v e r e damage t o t h e u d d e r ; d e a t h may o c c u r w i t h i n 24 h r ( L i n t o n a n d

H i n t o n , 1 9 8 8 ) .

1 . 5 . 2 . I n t e s t i n a l d i s e a s e s :

C e r t a i n E . c o l i s t r a i n s e x h i b i t p a t h o g e n i c i t y a n d c a u s e d i a r r h o e a

i n c l u d i n g , e n t e r o t o x i g e n i c , e n t e r o p a t h o g e n i c , e n t e r o i n v a s i v e ,

e n t e r o a d h e r e n t , a n d e n t e r o h a e m o r r h a g i c t y p e s ( L e v i n e , 1 9 8 7 ) .

1.5.2.a. E n t e r o t o x i g e n i c s t r a i n s : ETEC s t r a i n s a r e r e s p o n s i b l e f o r c a u s i n g

d i s e a s e r a n g i n g f r o m t h e m i l d t r a v e l l e r ' s d i a r r h o e a t o t h e s e v e r e

c h o l e r a l i k e s y n d r o m e a n d i n f a n t d i a r r h o e a i n l e s s d e v e l o p e d c o u n t r i e s .

ETEC d i a r r h o e a i s l e s s common i n USA a n d o t h e r d e v e l o p e d c o u n t r i e s .

ETEC i n f e c t i o n i s a c q u i r e d by i n g e s t i n g c o n t a m i n a t e d f o o d o r w a t e r . T h e

b a c t e r i a a d h e r e t o t h e h o s t t i s s u e t h r o u g h h a i r l i k e f i l a m e n t o u s

o r g a n e l l e s c a l l e d f i m b r i a e a nd c o l o n i z e t h e p r o x i m a l s m a l l i n t e s t i n e . T h e

f i m b r i a e a r e r i g i d s t r u c t u r e s of 6 - 7 nm d i a m e t e r e n c o d e d by p l a s m i d s ;

many b u t n o t a l l , m e d i a t e h a e m a g g l u t i n a t i o n of c e r t a i n e r y t h r o c y t e s w h i c h

i s u n a f f e c t e d b y m a n n o s e .

The e n t e r o t o x i g e n i c s t r a i n s p r o d u c e a h e a t - l a b i l e e n t e r o t o x i n (LT) , o r

h e a t - s t a b l e (ST) one , o r b o t h . T h e h e a t - l a b i l e t o x i n i s q u i t e s i m i l a r t o

t h e c h o l e r a t o x i n , w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f 80 k D a , h a s s e r o l o g i c a l

s p e c i f i c i t y and a c t i v a t e s a d e n y l c y c l a s e . T h e h e a t - s t a b l e t o x i n , on t h e

o t h e r h a n d , i s 8.5 kDa and a c t i v a t e s g u a n y l c y c l a s e . T h e c l i n i c a l f e a t u r e s

of t h e ETEC i n f e c t i o n a r e w a t e r y d i a r r h o e a , n a u s e a , a b d o m i n a l c r a m p s a n d

59 -

l o w g r a d e f e v e r .

1.5.2.b. E n t e r o p a t h o g e n i c s t r a i n s : EPEC we r e f o u n d in e p i d e m i c s o f s e v e r e

d i a r r h o e a in i n f a n t s . T h e s t r a i n s h a v e t r a n s m i s s i b l e p l a s m i d s a n d

Sh i g e l l a - 1 ik e i n v a s i v e n e s s . W h e n E P E C s t r a i n s l a c k i n g L T , ST , a n d

i n v a s i v e n e s s w e r e f ed t o a d u l t v o l u n t e e r s t h e y c a u s e d d e f i n i t e d i a r r h o e a

( L e v i n e e t a l . , 1 9 7 8 ) .

EPEC s t r a i n s c a u s e a p e c u l i a r u l t r a s t r u c t u r a l h i s t o p a t h o l o g i c l e s i o n i n

human i n t e s t i n e ( v i s i b l e by e l e c t r o n m i c r o s c o p y ) t h a t i s n o t o b s e r v e d w i t h

ETEC s t r a i n s . T h e l e s i o n s i n v o l v e d e s t r u c t i o n o f m i c r o v i l l i b y E P E C

b a c t e r i a w i t h o u t any f u r t h e r d e s t r u c t i o n o f h o s t c e l l s ( P o l o t s k y e t a l . ,

1 9 7 7 ) .

The c l i n i c a l f e a t u r e s of EPEC i n f e c t i o n a r e f e v e r , m a l a i s e , v o m i t i n g , a n d

d i a r r h o e a w i t h mu c u s b u t w i t h o u t b l ood . The EPEC i l l n e s s s eems m o r e s e v e r e

t h a n o t h e r d i a r r h o e a l i n f e c t i o n s .

1.5.2.C. E n t e r o i n v a s i v e s t r a i n s : E I E C s t r a i n s a r e , o f s e r o t y p e s d i s t i n c t

f r o m ETEC a nd EPEC, and a r e s i m i l a r t o S h i g e l l a in c e r t a i n r e s p e c t s . T h e y

c a u s e an i n v a s i v e , d y s e n t e r i c f o r m o f d i a r r h o e a l i l l n e s s i n v o l u n t e e r s .

EI EC p e n e t r a t e , p r o l i f e r a t e w i t h i n t h e e p i t h e l i u m o f t h e l a r g e i n t e s t i n e

( l e s s f r e q u e n t l y t h e s m a l l i n t e s t i n e ) a n d e v e n t u a l l y c a u s e t h e d e a t h o f

t h e h o s t c e l l w i t h o u t any s y s t e m i c p h a s e . T h e i n v a s i v e n e s s o f E I E C a n d

S h i g e l l a i s d e p e n d e n t u p o n p l a s m i d c o d e d o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n .

C l i n i c a l l y , E I E C i l l n e s s i s c h a r a c t e r i z e d b y f e v e r , s e v e r e a b d o m i n a l

c r a m p s , m a l a i s e , t o x a e m i a , a n d w a t e r y d i a r r h o e a f o l l o w e d b y g r o s s

d y s e n t e r y w i t h s t o o l s c o n t a i n i n g b l o o d a n d m u c u s ( L e v i n e , 1 9 8 7 ) .

- 60 -

1.5.2.d. E n t e r o a d h e r e n t s t r a i n s : EAEC a r e i d e n t i f i e d b y t h e i r p r o p e r t y of

a d h e r e n c e t o H e p - 2 c e l l s ( M a t h e w s o n e t a l . , 1 9 8 5 ) , a n d c a u s e m i l d

d i a r r h o e a in human v o l u n t e e r s . EAEC do n o t p r o d u c e LT, ST, o r i n c r e a s e d

l e v e l o f S h i g a - l i k e t o x i n o r i n v a d e e p i t h e l i a l c e l l s .

1 . 5 . 2 . e . E n t e r o h a e m o r r h a g i c s t r a i n s : E s c h e r i c h i a c o l i 0 1 5 7 : 5 7 w a s a

s e r o t y p e and n o t r e c o g n i z e d a s a c a u s a t i v e a g e n t o f d i a r r h o e a l d i s e a s e ,

u n t i l i s o l a t e d i n a USA o u t b r e a k o f h a e m o r r h a g i c c o l i t i s i n 1 9 8 2 .

0157:H7 h a s e me r ged a s an e n t e r i c p a t h o g e n o f p u b l i c h e a l t h i m p o r t a n c e

when a s s o c i a t e d w i t h o u t b r e a k s o f h a e m o r r h a g i c c o l i t i s a n d h a e m o l y t i c

u r ae m i c s ynd r ome , and d i a r r h o e a i n n u r s i n g h o m e s , d a y c a r e c e n t r e s a n d

s c h o o l s i n C a n a d a a n d t h e U n i t e d S t a t e s .

The c l i n i c a l f e a t u r e s o f t h e d i s e a s e a r e b l o o d y b u t c o p i o u s d i a r r h o e a ,

t h e s e f e a t u r e s d i s t i n g u i s h i t f r o m d y s e n t e r y b y S h i g e l l a o r E I E C .

1 . 5 . 3 . V i r u l e n c e c h a r a c t e r i s t i c s o f C o l V + o r g a n i s m s .

1 . 5 . 3 . 1 . E n h a n c e d a d h e s i o n t o e p i t h e l i a l s u r f a c e s .

B a c t e r i a l c o l o n i z a t i o n f a c t o r s , s u r f a c e c omp o n e n t s t h a t e n h a n c e c o l o n i z i n g

a b i l i t y , i n f l u e n c e t h e c o m p l e x i n t e r a c t i o n b e t w e e n b a c t e r i a a n d h o s t

an imal t i s s u e s s u c h t h a t g r e a t e r n u m b e r s g a i n a c c e s s t o p o t e n t i a l n e w

n i c h e s t o p r o l i f e r a t e r a p i d l y a t p a r t i c u l a r s i t e s . I n v a s i v e b a c t e r i a m u s t

n o r ma l l y c o l o n i z e animal muc os a e b e f o r e c r o s s i n g t h e e p i t h e l i a l l i n i n g s t o

e n t e r i n t o s t e r i l e r e g i o n s of t h e b o d y s o c o l o n i z a t i o n f a c t o r s a r e v e r y

i m p o r t a n t c o m p o n e n t s f o r i n v a s i o n ( W i l l i a m s e t a l . , 1 9 8 8 ) .

61

E . c o l i s t r a i n s p r o d u c e a d h e s i n s ( c o l o n i z a t i o n f a c t o r s ) t o c o l o n i z e

t h e muc os a l s u r f a c e s of t h e h o s t a n d e . g . e n a b l e t h e m s e l v e s t o o v e r c o m e

f i r s t l y t h e c l e a r i n g m e c h a n i s m o f t h e p e r i s t a l t i c m o v e m e n t a n d s e c o n d l y

t h e p r e s e n c e of t h e i n h i b i t o r y muc us wh i ch i s a t t a c h e d t o t h e e p i t h e l i u m .

P r o d u c t i o n of a d h e s i n s i s e n c o d e d by v a r i o u s p l a s m i d s , a n d e n a b l e s t h e

b a c t e r i a t o a d h e r e t o t h e m u c o s a l s u r f a c e s e . g . of t h e i n t e s t i n a l t r a c t

and by e l i m i n a t i o n o f t h o s e p l a s m i d s t h e b a c t e r i a l o s e t h e p r o p e r t y of

a d h e r i n g t o t h e s u r f a c e o f e p i t h e l i a l m e m b r a n e s .

S t r a i n s of E . co l i K-12 wh i ch h a r b o u r Co l V+ a d h e r e d in v i t r o 2 - 3 t i m e s

b e t t e r t o d i s c s o f m o u s e i n t e s t i n a l t i s s u e t h a n i s o g e n i c Col V s t r a i n s

( C l a n c y a n d S a v a g e , 1981) . T h i s o b s e r v a t i o n w a s c o n f i r m e d b y T e w a r i

(1986) by d e m o n s t r a t i n g t h a t ColV c e l l s a d h e r e d i n g r e a t e r n u m b e r s t h a n

a s t r a i n l a c k i n g t h e ColV p l a s mi d . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s a r e i m p o r t a n t

in a d h e s i o n t o mucous s u r f a c e s . The h y d r o p h o b i c i t y of t h e t w o s t r a i n s w a s

i n v e s t i g a t e d , and s u r f a c e s of ColV w e r e m u c h m o r e h y d r o p h o b i c t h a n t h e

ColV c e l l s . The ColV p l a s m i d - e n c o d e d s e x p i l i w e r e r e s p o n s i b l e f o r t h e

i n c r e a s e d h y d r o p h o b i c i t y . H y d r o p h o b i c i t y was d e c r e a s e d w h e n t h e c u l t u r e s

we r e g r o w n a t 21 ° C r a t h e r t h a n a t 37 ° C a n d b y m e c h a n i c a l s h e a r i n g .

Th i s d e m o n s t r a t e s a r e l a t i o n s h i p be t we e n t h e h y d r o p h o b i c i t y a n d s e x p i l i

( T e w a r i et^ a l . , 1 9 8 5 ) .

1 . 5 . 3 . 2 . A u t o a g g l u t i n a t i o n a n d m o t i l i t y i n h i b i t i o n :

T h e p r e s e n c e o f v i r u l e n c e p l a s m i d s C o l V , I - K 9 4 o r C o l V - K 3 0 i n E . c o l i

p r o d u c e s some e n v e l o p e c h a n g e s . T e w a r i e t a l . , ( 1986 ) d e m o n s t r a t e d t h a t

i n t r o d u c t i o n of C o l V , I - K 9 4 o r Co l V- K3 0 i n t o E . c o l i s t r a i n s p r o d u c e d

- 62 -

d e r i v a t i v e s w h i c h h a d a m o t i l i t y l e s i o n i f g r o w n w i t h o u t s h a k i n g a t

37 °C. A l t h o u g h mos t Col V+ o r g a n i s m s f r o m s h a k e n c u l t u r e s w e r e m o t i l e ,

80 - 90% of f r e e unc l umpe d o r g a n i s m s f r o m s t a t i c c u l t u r e s w e r e f l a g e l l a t e

b u t n o n - m o t i l e . Th i s p l a s mi d e f f e c t w a s t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t w i t h o n l y

ColV+ o r g a n i s m s g r o w n a t 37 ° C b e i n g a f f e c t e d ; Co l V+ o r g a n i s m s g r o w n

a t 30 ° C o r b e l o w w e r e p r e d o m i n a n t l y m o t i l e . A s i m i l a r p h e n o m e n o n of

a u t o a g g l u t i n a t i o n / c l u m p i n g was o b s e r v e d by R o w b u r y e t a l . , ( 1 9 8 5 ) w h e r e

C o l V p l a s m i d i n d u c e s c l u m p i n g f o r s t a t i c c u l t u r e s a t 37 ° C .

A u t o a g g l u t i n a t i o n a n d m o t i l i t y i n h i b i t i o n may b e p o t e n t i a l v i r u l e n c e

f a c t o r s . In t h e i n t e s t i n e , t h e o r g a n i s m s o v e r c o m e t h e c l e a r i n g m e c h a n i s m

of p e r i s t a l t i c m o v e m e n t s a n d t h e i n h i b i t o r y a c t i o n o f m u c u s , b y

c o l o n i z a t i o n ; i n t h i s s i t u a t i o n , m o t i l i t y a n d h y d r o p h o b i c i t y a r e

a d v a n t a g e o u s . However , on r e a c h i n g t h e b l o o d s t r e a m t h e m o t i l i t y may b e

d i s a d v a n t a g e o u s f o r a m o t i l e p a t h o g e n i c G r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m ( T o m i t a

e t a l . , 1981) . I t i s p r e s u m e d t h a t Co l V+ o r g a n i s m s m i g h t l o s e m o t i l i t y

a n d a u t o a g g l u t i n a t e ( c l u m p ) i n t h i s s t a t i c c o n d i t i o n t h u s r e d u c i n g

s u s c e p t i b i l i t y t o p h a g o c y t o s i s .

A u t o a g g l u t i n a t i o n and m o t i l i t y i n h i b i t i o n seem t o be g o v e r n e d by t h e s a me

f a c t o r s . O r g a n i s m s r e g a i n e d t h e i r m o t i l i t y on i n c u b a t i o n w i t h b u f f e r e d

d e t e r g e n t s o l u t i o n s u g g e s t i n g t h a t e n v e l o p e c h a n g e s m i g h t b e r e s p o n s i b l e

f o r t h i s a l t e r e d b e h a v i o u r . The m o t i l i t y l e s i o n o c c u r s i n t h e p r e s e n c e o f

t r a n s f e r f a c t o r a n d c o l i c i n c o m p o n e n t s ( T e w a r i e t a l . , 1 9 8 6 ) .

1 . 5 . 3 . 3 . I n c r e a s e d s e r u m r e s i s t a n c e :

P a t h o g e n i c e n t e r i c b a c t e r i a on g a i n i n g a c c e s s t o t h e b l ood , by o v e r c o m i n g

63 -

t h e n u m e r o u s d e f e n s e m e c h a n i s m s , c o n f r o n t t h e b a c t e r i o s t a t i c a n d

b a c t e r i o c i d a l a c t i v i t i e s o f s e r u m . I m m u n o g l o b u l i n s a n d n o n - s p e c i f i c

f a c t o r s l i k e l y s o z y m e a n d c o m p l e m e n t c a n l e a d t o p h a g o c y t o s i s a n d / o r

b a c t e r i a l k i l l i n g ( W a t e r s a n d C r o s a , 1991) . B a c t e r i a l k i l l i n g by s e r u m

o c c u r s w h e n t h e f i v e t e r m i n a l p r o t e i n s o f t h e c o m p l e m e n t c a s c a d e ,

o r g a n i z e d a s a m a c r o m o l e c u l a r a s s e m b l y k n o w n a s t h e m e m b r a n e a t t a c k

c ompl e x (MAC), a r e d e p o s i t e d on a n d i n s e r t e d i n t o t h e b a c t e r i a l o u t e r

m e m b r a n e , d e s t r o y i n g i t s i n t e g r i t y .

R e s i s t a n c e t o s e r u m k i l l i n g i s m u l t i f a c t o r i a l a n d c o m p l e x a n d h a s b e e n

a t t r i b u t e d t o d i f f e r e n t s u r f a c e c o m p o n e n t s , s u c h a s 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s ,

c a p s u l e s a nd s u r f a c e p r o t e i n s , mos t of wh i ch a r e a r e ch r omos oma l l y e n c o d e d

( W a t e r s a n d C r o s a , 1991) . P l a s m i d - m e d i a t e d f a c t o r s h a v e a l s o b e e n

i d e n t i f i e d a s r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d s e r u m r e s i s t a n c e ( B i n n s e t a l . ,

1 9 7 9 ) .

E a r l i e r f i n d i n g s o f S m i t h ( 1 9 7 4 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a C o l V + s t r a i n

s u r v i v e s b e t t e r t h a n i t s c o u n t e r p a r t Co l V in a n i m a l s e r a . L a t e r o n

B i n n s e t a l . , (1979) o b s e r v e d 1 0 0 - f o l d r e d u c t i o n in L D CA o f c h i c k s a f t e r b 0

i n j e c t i n g s t r a i n s c a r r y i n g p l a s m i d d e r i v a t i v e s c o n t a i n i n g a c l o n e d

B a m H I - g e n e r a t e d f r a g m e n t o f C o l V , I - K 9 4 ; t h e ( i s s ) l o c u s w a s r e s p o n s i b l e

f o r i n c r e a s e d s u r v i v a l in s e r u m . P l a s m i d d e r i v a t i v e s h a v i n g i s s g e n e t i c

d e t e r m i n a n t s e n h a n c e d t h e p a t h o g e n i c i t y o f t h e o r g a n i s m s in c h i c k e n s

i n d i c a t i n g t h a t i n c r e a s e d s u r v i v a l in s e r u m i s a s s o c i a t e d w i t h v i r u l e n c e .

The i s s g e n e maps we l l o u t s i d e t h e t r a o p e r o n and d o e s n o t h y b r i d i z e w i t h

t h e t r a T g e n e ( t h e p r o d u c t o f t h i s g e n e f r o m s e v e r a l p l a s m i d s a l s o

e n h a n c e s s e r u m r e s i s t a n c e ) so t h e t wo g e n e s a r e d i s t i n c t ; t h e t w o g e n e

64 -

p r o d u c t s a r e a l s o a n t i g e n i c a l l y d i f f e r e n t ( B i n n s e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e t r a T

g e n e p r o d u c t i s a 25 kDa o u t e r membr ane p r o t e i n , w h e r e a s t h e i d e n t i t y of

i_ss g e n e p r o d u c t i s unknown b u t i t may be, l i k e TraT, an e n v e l o p e p r o t e i n .

I t i s p r o b a b l e t h a t i s s a n d t r a T g e n e p r o d u c t s f u n c t i o n i n t h e s a m e

m a n n e r , b u t t h e m e c h a n i s m i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . B i n n s e t a l . , ( 1982)

p r o p o s e d t h a t t h e t e r m i n a l compl ement compl ex i s n o t b l o c k e d b y b o t h t h e

g e n e p r o d u c t s , b u t t h e a c t i o n o f t h i s c o m p l e x on b a c t e r i a l s u r f a c e s i s

a b o l i s h e d i n t h e p r e s e n c e o f i s s a n d t r a T g e n e s .

1 . 5 . 3 . 4 . E n h a n c e d i r o n u p t a k e :

A v a i l a b i l i t y o f f r e e i r o n i n n a t u r e i s v e r y l ow, b e c a u s e i t o c c u r s i n

i n s o l u b l e fo rms . In t h e a n i ma l b o d y , i r o n o c c u r s i n b o u n d f o r m w i t h t h e

r ed bl ood c o r p u s c l e s ( i n t r a c e l l u l a r l y ) . In t h e s e r u m a n d o t h e r b o d y f l u i d s

i t i s f o u n d ( e x t r a c e l l u l a r l y ) i n b o u n d s t a t e i n i r o n b i n d i n g p r o t e i n s

l i k e t r a n s f e r r i n a n d l a c t o f e r r i n r e s p e c t i v e l y .

A b i l i t y o f i n v a s i v e o r g a n i s m s t o m u l t i p l y i n h o s t t i s s u e s i s g r e a t l y

i n f l u e n c e d by t h e a v a i l a b l i t y o f i r o n . E . c o l i s y n t h e s i z e a l ow m o l e c u l a r

w e i g h t s i d e r o p h o r e , c a p a b l e of c o mp e t i n g w i t h h o s t i r o n - b i n d i n g p r o t e i n s

f o r i r o n , c a l l e d e n t e r o c h e l i n . E n t e r o c h e l i n i s p r o d u c e d e n d o g e n o u s l y a n d

s e c r e t e d i n t o t h e med i um w h e r e i t b i n d s i r o n a n d t r a n s p o r t s i t b a c k i n t o

t h e b a c t e r i a l c e l l t h r o u g h s p e c i f i c r e c e p t o r s on t h e o u t e r m e m b r a n e .

I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t s t r a i n s of E. co l i c a r r y i n g ColV p l a s m i d s a r e

mor e h i g h l y p a t h o g e n i c t h a n t h e i r c o u n t e r p a r t p l a s m i d f r e e s t r a i n s . T h i s

- 65 -

i s a t t r i b u t e d t o t h e i r a b i l i t y t o s u r v i v e i n t h e h o s t t i s s u e s ( S m i t h a n d

H u g g i n s , 1 9 7 6 ) .

In 1979, Wi l l i ams d e s i g n e d a c l a s s i c a l e x p e r i m e n t w h e r e s t r a i n s w i t h a n d

w i t h o u t pColV-K30 w e r e i n o c u l a t e d i n t o p a i r s o f m i c e i n t r a p e r i t o n e a l l y .

One animal of e a c h p a i r r e c e i v e d i r o n . W i t h o u t t h e c o i n j e c t i o n o f i r o n ,

t h e ColV s t r a i n was r e c o v e r e d a t a much h i g h e r p r o p o r t i o n t h a n t h a t i n

t h e a d m i n i s t e r e d dos e . H o w e v e r , w i t h a d d e d i r o n , t h e r e w a s n o e n h a n c e d

r e c o v e r y of ColV b e a r i n g E . co l i . He d e m o n s t r a t e d t h a t s o me Col V p l a s m i d s

e n c o d e an i r o n - s e q u e s t e r i n g s y s t e m whi ch p l a y s a k e y r o l e i n s u r v i v a l of

t h e b a c t e r i a u n d e r i r o n - l i m i t e d c o n d i t i o n s . T h i s m e c h a n i s m w a s e n c o d e d b y

pColV-K30 and a l l t e s t e d ColV p l a s m i d s f r o m b a c t e r a e m i c s t r a i n s b u t n o t b y

ColV, I -K94 p l a s mi d . He a l s o r e p o r t e d t h a t s o me c o l i c i n V - p r o d u c i n g c e l l s

( bu t no t Col V, I -K94+ o n e s ) g r e w n o r m a l l y d e s p i t e a d d i t i o n o f t h e s e r u m

i r o n - b i n d i n g p r o t e i n t r a n s f e r r i n t o med i a , w h e r e a s c e l l s l a c k i n g t h e Co l V

p l a s mi d had a s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d g r o w t h d u e t o c o n v e r s i o n of t h e f r e e

i r on t o an u n a v a i l a b l e form. Th i s i n h i b i t o r y e f f e c t c o u l d b e r e v e r s e d b y

a d d i t i o n o f e x c e s s i r o n .

The ColV p l a s m i d - m e d i a t e d i r o n - s e q u e s t e r i n g m e c h a n i s m i n v o l v e s p r o d u c t i o n

of a s i d e r o p h o r e c a l l e d a e r o b a c t i n , a n d a n o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n t h a t

f o rms a t l e a s t p a r t of t h e f e r r i c - a e r o b a c t i n r e c e p t o r . T h i s r e c e p t o r h a s a

m o l e c u l a r w e i g h t of 74 kDa and i s o b s e r v e d in c i r m u t a n t s w h i c h l a c k t h e

74 kDa C i r p r o t e i n ( B i n d e r e i f e t a l . , 1982) . T h e p r o p e r t y o f s y n t h e s i z i n g

a e r o b a c t i n i s an a dde d a d v a n t a g e t o a b a c t e r i a l s t r a i n w h i c h i s a l r e a d y

c a p a b l e of s y n t h e s i z i n g e n t e r o c h e l i n ; s i n c e t h e e n t e r o c h e l i n i r o n - u p t a k e

s y s t e m i s e n e r g e t i c a l l y e x p e n s i v e a s e n t e r o c h e l i n c a n n o t b e r e c y l e d , on

- 66 -

t h e o t h e r h a n d a e r o b a c t i n c a n b e r e c y c l e d . M o r e o v e r , t h e p r o d u c t i o n of

a n t i - e n t e r o c h e l i n a n d a n t i - r e c e p t o r a n t i b o d i e s i n s e r u m o f a n i m a l s ma y

l i mi t t h e e f f e c t i v e n e s s of e n t e r o c h e l i n - m e d i a t e d i r o n - s e q u e s t e r i n g s y s t e m

a n d f a v o u r s t h e a e r o b a c t i n - m e d i a t e d i r o n t r a n s p o r t ( G r i f f i t h s , 1 9 8 5 ) .

1 . 5 . 3 . 5 . C o l i c i n p r o d u c t i o n :

E. coH h a r b o u r i n g ColV, I -K94 c o d e f o r t h e s y n t h e s i s o f b o t h c o l i c i n V a n d

l a and i r rmuni ty f a c t o r s wh i c h c o n f e r i m m u n i t y t o t h e b a c t e r i a l c e l l f o r

t h e i r own a c t i o n . The m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n a s s o c i a t e d w i t h t h i s i m m u n i t y

becomes t h e b a s i s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f s u b t y p e s . A l t h o u g h , c o l i c i n s l a

and lb a d s o r b t o t h e s a m e r e c e p t o r a n d s h a r e h o m o l o g y i n p h y s i c a l a n d

c he mi ca l p r o p e r t i e s y e t t h e s t r a i n s h a v i n g t h e C o l l a p l a s m i d s a r e i mmune

t o t h e c o l i c i n l a b u t n o t t o c o l i c i n l b a nd v i c e v e r s a . As f a r a s i m m u n i t y

t o c o l i c i n l a i s c o n c e r n e d , i t i s m e d i a t e d b y p l a s m i d c o d e d i m m u n i t y

p r o t e i n o f 14 .5 kDa l o c a t e d i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e t o w h i c h t h e

c o l i c i n l a i n t e r a c t s a n d t h i s r e n d e r s t h e b a c t e r i a l c e l l i mmu n e t o i t s

a c t i o n ( K o n i s k y , 1 9 8 2 ) .

The c o l i c i n V i s s y n t h e s i z e d in low a m o u n t w i t h i n t h e b a c t e r i a l c e l l a n d

i s n o t r e l e a s e d f r o m t h e c e l l s b y m e a n s o f c e l l l y s i s ( t h e t y p i c a l

m e c h a n i s m f o r m o s t c o l i c i n s ) b u t r a t h e r a p p e a r s t o b e e x p o r t e d ( G i l s o n

e t a l . , 1987). F o u r p l a s mi d g e n e s r e q u i r e d f o r c o l i c i n V s y n t h e s i s , e x p o r t

a nd i mmuni ty , h a v e be e n d e f i n e d w i t h i n a 4 . 2 - k b r e g i o n of DNA c l o n e d f r o m

p C o l V - K 3 0 b y G i l s o n e t a l . , ( 1 9 8 7 ) . T h e y d e s i g n a t e d t h e i m m u n i t y

d e t e r m i n a n t c v i , t h e g e n e s r e q u i r e d f o r c o l i c i n V e x p o r t cvaA a nd cv_a_B a n d

t h e s t r u c t u r a l g e n e f o r t h e s y n t h e s i s of c o l i c i n V cvaC. M u t a t i o n i n c v a A

67 -

a nd cvaB p r e v e n t s any d e t e c t a b l e a c t i v i t y in t h e s u p e r n a t a n t s of b a c t e r i a l

c e l l s w h e r e a s c o l i c i n V a c t i v i t y c a n b e o b s e r v e d i n l y s e d c e l l s .

On t h e o t h e r h a n d , a n y m u t a t i o n i n c v a C g e n e r e s u l t s i n a b o l i s h i n g o f

c o l i c i n V a c t i v i t y in b o t h t h e s u p e r n a t a n t s a n d t h e c e l l s ( G i l s o n e t a l . ,

1 9 8 7 ) .

Smi th (1974) showed 67% of E . c o l i s t r a i n s c a u s i n g b a c t e r a e m i c i n f e c t i o n s

in p o u l t r y p r o d u c e d c o l i c i n V. I t w a s t h e r e f o r e t h o u g h t t h a t t h e c o l i c i n

m o l e c u l e i t s e l f m i g h t h a v e s ome r o l e i n p a t h o g e n i c i t y o f t h e C o l V

o r g a n i s m. However , in 1979, Q u a c k e n b u s h a n d F a l k o w u s e d t r a n s p o s o n T n l

m u t a g e n e s i s t o show t h a t b a c t e r i a c a r r y i n g a Co l V p l a s m i d w i t h a m u t a t e d

c o l i c i n V s t r u c t u r a l g e n e ( c v a C ) w e r e m o r e l e t h a l t o m i c e ( t h a n C o l

s t r a i n s ) when i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n i a l l y s u g g e s t i n g t h a t c o l i c i n V i s n o t

e s s e n t i a l f o r i n c r e a s e d v i r u l e n c e .

Co l i c i n V a c t i o n i s i n i t i a t e d b y i t s a d s o p t i o n t o s p e c i f i c r e c e p t o r s on

t h e s u r f a c e s of s e n s i t i v e b a c t e r i a whi ch a l l ow t h e c o l i c i n t o o v e r c o m e t h e

b a r r i e r p r o p e r t i e s o f o u t e r m e m b r a n e . C o l i c i n s v a r y i n t h e i r m o d e o f

a c t i o n wh i ch i s s ummar i zed in T a b l e 4. The p r i m a r y t a r g e t o f c o l i c i n V i s

t h e c y t o p l a s m i c membr ane . I t h a s be e n d e m o n s t r a t e d t h a t p a r t i a l l y p u r i f i e d

c o l i c i n V i n h i b i t e d t h e a c t i v e t r a n s p o r t a c r o s s t h e m e m b r a n e s o f c o l i c i n V

s e n s i t i v e c e l l s b u t n o t i n c o l i c i n r e s i s t a n t c e l l s ( Yang a n d K o n i s k y ,

1984). T h i s i n h i b i t i o n o f a c t i v e t r a n s p o r t w a s n o t a r e s u l t o f g e n e r a l

l e a k i n e s s o f t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e b u t d u e t o c o l l a p s i n g o f t h e

m e m b r a n e p o t e n t i a l of t h e t r e a t e d c e l l s . In t h e s a m e w a y , c o l i c i n l a

i n d u c e s f o r m a t i o n of i o n - p e r m e a b l e c h a n n e l s in t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ,

r e s u l t i n g i n d i s s i p a t i o n o f m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d l e a k a g e o f l o w

- 68 -

T a b l e 4: C o l i c i n s w i t h known mode of a c t i o n .

C o l i c i n Mode o f a c t i o nF r a n SDS-PA3E

Mo 1. w t .

El Membrane d e p o l a r i z a t i o n

A Membrane d e p o l a r i z a t i o n

K Membrane d e p o l a r i z a t i o n 69 kDa

la Membrane d e p o l a r i z a t i o n 79 kDa

lb Membrane d e p o l a r i z a t i o n 80 kDa

E2 e n d o n u c l e a s e

E3 Riboscme i n a c t i v a t i o n 60 kDa

EF13 Riboscme i n a c t i v a t i o n

V p r e v e n t membrane p o t e n t i a l of t r e a t e d s e n s i t i v e c e l l s

4 kDa

Adapt ed f r om L u r i a and S u i t , 1987.

- 69 -

m o l e c u l a r w e i g h t s u b s t a n c e s .

1 . 5 . 3 . 6 . VmpA p r o t e i n :

Most Col s t r a i n s p r o d u c e VmpA, a ma j o r o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n ( R o w b u r y

e t a l . , 1985). C h a n g e s in c e l l e n v e l o p e d u e t o p r o d u c t i o n o f t h i s p l a s m i d

s p e c i f i e d p r o t e i n ma y c a u s e i n c r e a s e d v i r u l e n c e ( M o o r e s a n d R o w b u r y ,

1982). The VmpA p r o t e i n i s s y n t h e s i z e d f r o m a p r e c u r s o r of a p p r o x i m a t e

m o l e c u l a r w e i g h t 34.5 kDa a n d s h a r e s h o m o l o g y w i t h OmpA p r o t e i n ( 1 )

i r r muno l og i c a l l y ( D e e n e y e t a l . , 198 6 ) , a n d i n b e i n g (2) a t r a n s m e m b r a n e

c o m p o n e n t of t h e o u t e r m e m b r a n e , (3) t r y p s i n s e n s i t i v e i n m e m b r a n e

p r e p a r a t i o n , ( 4 ) n o t m u r e i n a s s o c i a t e d , (5 ) s o l u b l e i n 2% SDS a t

60 °C, (6) m o l e c u l a r w e i g h t 33 k D a . H o w e v e r , t h e y d i f f e r i n c e r t a i n

r e s p e c t s s u c h a s VmpA c a n n o t r e p l a c e GmpA a s r e c e p t o r f o r p h a g e s K3 a n d *

T u l l a n d a s a c o m p o n e n t i n c o l i c i n L s e n s i t i v i t y b u t n e v e r t h e l e s s i t

w e a k l y r e p l a c e s OmpA p r o t e i n i n s t a b i l i s a t i o n o f c o n j u g a l a g g r e g a t e s

( Mo o r e s a n d R o w b u r y , 1982) . I t s s y n t h e s i s i s d e p e n d e n t u p o n c u l t u r a l

c o n d i t i o n s . VmpA i s p r o d u c e d by C o l V+ s t r a i n s w h e n g r o w n a t 37 ° C w i t h

s h a k i n g r a t h e r t h a n s t a t i c a l l y . I n c o r p o r a t i o n o f m a g n e s i u m a n d c a l c i u m

(0.005 - 0.05 M) in t h e g r o w t h m e d i a i n h i b i t t h e s y n t h e s i s o f t h e p r o t e i n

( D e e n e y e t a l . , 1 9 8 6 ) .

70 -

1 . 6 . A d a p t i v e r e s p o n s e s t o s t r e s s :

1 . 6 . 1 . A d a p t i v e r e s p o n s e t o a l k y l a t i n g a g e n t s :

The p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e t h r o u g h w h i c h m i c r o b i a l c e l l s o v e r c o m e t h ei i

t h r e a t of a l k y l a t i n g a g e n t s l i k e N - m e t h y l - N - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e

(MNNG), (a t o x i c a g e n t c a p a b l e o f p r o d u c i n g O ^ - m e t h y l g u a n i n e ( O^-meG)

whi ch can be r e a d a s a d e n i n e d u r i n g DNA r e p l i c a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n

t h e r e f o r e c a u s i n g GC - AT t r a n s i t i o n s ) , i n v o l v e s i n d u c t i o n o f a r e p a i r

s y s t e m h e n c e d e v e l o p i n g r e s i s t a n c e in t h e s t r e s s e d c e l l s . T h i s i s r e f e r r e d

t o a s a n a d a p t i v e r e s p o n s e .

L o w l e v e l s o f a l k y l a t i n g a g e n t s l i k et t

N - m e t h y l - N - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e (MNNG) o r e t h y l m e t h a n e s u I f o n a t e

(EMS) i n d u c e r e s i s t a n c e in E . c o l i a g a i n s t t h e m u t a g e n i c a n d l e t h a l e f f e c t s

of h i g h e r d o s e s of t h e s e a g e n t s ( S a ms o n a n d C a i r n s , 1977) . T h e a d a p t i v e

r e s p o n s e i s c h l o r a m p h e n i c o l s e n s i t i v e i . e r e q u i r e s d e n o v o p r o t e i n

s y n t h e s i s . The a d a p t e d c e l l s t e n d t o r e m o v e e n z y m a t i c a l l y ( O^ - me G) f r o m

t h e i r DNA b y - a l k y l g u a n i n e - D N A a l k y l t r a n s f e r s e ( M i t r a e t__al . , 1982)

t h a t i s a n a d a g e n e p r o d u c t . T h e a d a g r o u p o f g e n e s a l s o c o d e f o r

3 - m e t h y l a d e n i n e - D N A g l y c o l a s e c a p a b l e o f r e l e a s i n g 3 - m e t h y l g u a n i n e ,

7 - m e t h y l g u a n i n e a nd 7 - m e t h y l a d e n i n e f r o m m e t h y l a t e d DNA ( K a r r a n e t a l . ,

1 9 8 2 ) , i n p o l y m e r a s e I d e p e n d e n t m a n n e r .

1 . 6 . 2 . A d a p t i v e r e s p o n s e t o o x i d a t i v e s t r e s s :

Oxygen i s v e r y t o x i c t o a n a e r o b i c o r g a n i s m s a n d i t s m e t a b o l i c p r o d u c t s

l i k e s u p e r o x i d e a n i o n , h y d r o g e n p e r o x i d e , s i n g l e t o x y g e n a n d h y d r o x y l

r a d i c a l s a r e t o x i c t o a e r o b e s a s w e l l ( F r i d o v i c h , 1 9 7 8 ) . I t w o u l d b e

71 -

e x p e c t e d t h a t f a c u l t a t i v e o r g a n i s m s s u c h a s E s c h e r i c h i a c o l i a n d

S . t y p h i m u r i u m whi ch u n d e r g o s h i f t s f r o m a n a e r o b i c t o a e r o b i c c o n d i t i o n s

m i g h t p o s s e s s a n a d a p t i v e r e s p o n s e t o o v e r c o m e o x i d a t i v e s t r e s s .

Hydr o g e n p e r o x i d e a d a p t a t i o n by E . c o l i a n d S . t y p h i m u r i u m i n c r e a s e s t h e

c h a n c e s of t h e i r s u r v i v a l in r e s p o n s e t o t h e r e s p i r a t o r y b u r s t c o m p o n e n t s

a n d s u p e r o x i d e a n i o n a s s o c i a t e d w i t h p h a g o c y t o s i s b y a c t i v a t e d

g r a n u l o c y t e s . T h e r e s p i r a t o r y b u r s t s a r e r e s p o n s i b l e f o r g e n e r a t i n g

mi l l i mo l a r c o n c e n t r a t i o n s of h y d r o g e n p e r o x i d e a m e a n s o f e l i m i n a t i o n o f

t h e p o t e n t i a l p a t h o g e n s ( R o o t a n d C o h e n , 1 9 8 1 ) .

Sa l mone l l a t y p h i m u r i u m becomes r e s i s t a n t t o k i l l i n g b y h y d r o g e n p e r o x i d e

and o t h e r o x i d a n t s w h e n p r e t r e a t e d w i t h a n o n - l e t h a l c o n c e n t r a t i o n of

h y d r o g e n p e r o x i d e . D u r i n g t h i s p r o c e s s of a d a p t a t i o n t o h y d r o g e n p e r o x i d e ,

30 p r o t e i n s a r e i n d u c e d ( C h r i s t m a n e t a l . , 1 9 8 5 ) . O u t o f t h e s e 30

p r o t e i n s , 9 a r e c o n s t i t u t i v e l y o v e r e x p r e s s e d i n d o m i n a n t h y d r o g e n

p e r o x i d e - r e s i s t a n t oxyR m u t a n t s . M u t a n t o x y R l i s r e s i s t a n t t o d i f f e r e n t

o x i d i z i n g a g e n t s and o v e r e x p r e s s e s a t l e a s t 5 e n z y m e a c t i v i t i e s i n v o l v e d

i n d e f e n c e s a g a i n s t o x i d a t i v e d a m a g e .

A n o t h e r s t u d y a l s o r e v e a l s t h a t h y d r o g e n p e r o x i d e i n d u c e s 30 d i f f e r e n t

s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s i n S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ( M o r g a n e t a l . , 1986) .

F i v e of t h e s e p r o t e i n s a r e a l s o s y n t h e s i s e d b y h e a t s h o c k , i n c l u d i n g t h e

v e r y c o n s e r v e d DnaK p r o t e i n . T h e s y n t h e s i s o f o n e o f t h e s e h e a t s h o c k

p r o t e i n s i s d e p e n d e n t o n o x y R , a p o s i t i v e r e g u l a t o r o f h y d r o g e n

p e r o x i d e - i n d u c i b l e g e n e s , w h i l e t h e r e s t a r e i n d u c e d i n d e p e n d e n t o f ox y R.

S i m i l a r l y , p r e t r e a t e d E s c h e r i c h i a c o l i , w i t h 30 uM f o r 30 m i n ,

72 -

s u r v i v e d 20 mM h y d r o g e n p e r o x i d e c h a l l e n g e . C o n s i s t e n t l y 10 - 20 f o l d

i n c r e a s e in r e s i s t a n c e was o b s e r v e d in E. co l i K-12 s t r a i n a l r e a d y e x p o s e d

t o h y d r o g e n p e r o x i d e i n d i f f e r e n t g r o w t h m e d i a ( D e mp l e a n d H a l b r o o k ,

1983). I n d u c t i o n of p e r o x i d e r e s i s t a n c e f a i l e d t o i n c r e a s e t h e s u r v i v a l ofi

E s c h e r i c h i a c o l i e x p o s ed t o t o N - m e t h y l - N - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n id i n e a n d

UV l i g h t , d i s t i n g u i s h i n g t h i s p h e n o m e n o n f r o m t h e a d a a n d t h e

r e c A + - d e p e n d e n t SOS r e s p o n s e s .

O t h e r o x i d a t i v e s t r e s s e s i n d u c e d s ome p r o t e i n s i n E . c o l i a s s t u d i e d

t h r o u g h t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( W a l k u p a n d Kogoma , 1989) .

N i n e p r o t e i n s a r e c o n s t i t u t i v e l y p r o d u c e d o v e r w i l d - t y p e l e v e l s i n

s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( so d A , s o d B ) d o u b l e m u t a n t s . E x p o s u r e t o r e d o x

c y c l i n g a g e n t s l i k e p a r a q u a t a nd p l umb a g i n a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s l e d

t o s y n t h e s i s o f 13 p r o t e i n s i n w i l d - t y p e o r g a n i s m s . O u t o f t h e s e 13

p r o t e i n s , 5 w e r e a l s o c o n s t i t u t i v e l y i n d u c e d i n t h e s o d A a n d s o d B d o u b l e

m u t a n t s . A d d i t i o n of mi c r o mo l a r c o n c e n t r a t i o n s o f p a r a q u a t a n d p l u m b a g i n

t o t h e m e d i a of s u p e r o x i d e d i s m u t a s e m u t a n t s l e d t o t h e s y n t h e s i s o f a n

a d d i t i o n a l 14 p r o t e i n s , o u t o f w h i c h 5 a r e a s s o c i a t e d w i t h s t r e s s

r e s p o n s e s , c o n s i s t i n g o f e n d o n u c l e a s e IV (Nf o) , t h r e e o x y R r e g u l a t e d

p r o t e i n s a n d o n e h e a t s h o c k p r o t e i n .

1 . 6 . 3 . A d a p t i v e r e s p o n s e t o s t a r v a t i o n s t r e s s :

B a c t e r i a f r e q u e n t l y go f r o m a f e a s t s i t u a t i o n , of l i v i n g i n a h o s t , t o a

p e r i o d of f ami ne , of l i v i n g in n a t u r a l e n v i r o n m e n t s l i k e o p e n o c e a n s w h e r e

t h e s t a r v a t i o n c o n d i t i o n s ma y l a s t f o r m o n t h s a t a t i m e . T h e b a c t e r i a

s u r v i v e d u r i n g t h e h a r s h c o n d i t i o n s o f s t a r v a t i o n b y p r o d u c t i o n o f s ome

p r o t e i n s w h i c h s p e c i f i c a l l y i n c r e a s e t h e i r s t a r v a t i o n r e s i s t a n c e .

73 -

S t a r v a t i o n s t r e s s i n d u c e s t h e s y n t h e s i s of c e r t a i n p e p t i d a s e s w h i c h r e n d e r

t h e m i c r o b i a l c e l l m o r e a b l e t o o v e r c o m e t h e s t r e s s . T h e s u r v i v a l of

E s c h e r i c h i a c o l i a n d S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m d e p e n d s u p o n p e p t i d a s e

a c t i v i t i e s d u r i n g c a r b o n s t a r v a t i o n ( R e e v e e t a l . , 1984) . A m u t a n t o f

E s c h e r i c h i a c o l i K - 1 2 , CM89 w h i c h l a c k s f i v e d i s t i n c t p e p t i d a s e

a c t i v i t i e s , on s t a r v a t i o n f o r g l u c o s e l o s e s i t s v i a b i l i t y v e r y r a p i d l y

c ompar ed w i t h t h e wi l d t y p e . S i mi l a r r e s u l t s a r e o b t a i n e d f o r Salm<^ne_l_la

t y p h i m u r i u m LT2 a n d LT2 d e r i v e d m u t a n t s l a c k i n g d i f f e r e n t p e p t i d a s e

f u n c t i o n s . E s c h e r i c h i a c o l i s y n t h e s i s e s n e w p o l y p e p t i d e s i n r e s p o n s e t o

p h o s p h a t e o r n i t r o g e n s t a r v a t i o n ( G r o a t e t a l . , 1 9 8 6 ) . S o m e o f t h e s e

p o l y p e p t i d e s a r e u n i q u e t o a g i v e n s t a r v a t i o n r e g i m e n , b u t a t l e a s t 13

a p p e a r t o be s y n t h e s i s e d r e g a r d l e s s o f t h e t y p e o f n u t r i e n t d e p r i v a t i o n

c a u s i n g t h e s t a r v a t i o n .

T h e i n d u c t i o n o f n e w p o l y p e p t i d e s f o l l o w i n g a s t a r v a t i o n t h r e a t i s

i m p o r t a n t a n d c r o s s p r o t e c t s t h e b a c t e r i a l c e l l s a g a i n s t t h e r m a l a n d

o x i d a t i v e s t r e s s e s ; i n d u c t i o n can b e i n h i b i t e d by c h l o r a m p h e n i c o l . G l u c o s e

o r n i t r o g e n - s t a r v e d c u l t u r e s of E s c h e r i c h i a c o l i d e m o n s t r a t e r e s i s t a n c e t o

h e a t (57 °C) or h y d r o g e n p e r o x i d e (15 mM) c h a l l e n g e , i n c o m p a r i s o n w i t h

l o g a r i t h m i c a l l y g r o w n c o u n t e r p a r t c o n t r o l s ( J e n k i n s £t__al*» 198 8 ) . T h e

e x t e n t of r e s i s t a n c e i s e n h a n c e d w i t h t h e t ime f o r w h i c h t h e c u l t u r e s a r e

s t a r v e d b e f o r e t h e c h a l l e n g e . M a x i m a l r e s i s t a n c e i s o f f e r e d b y c u l t u r e s

s t a r v e d f o r 4 h r .

74 -

1 . 6 . 4 . H e a t - s h o c k r e s p o n s e :

T h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e i s a n i n d u c i b l e , c e l l u l a r r e s p o n s e t o s u d d e n

t e m p e r a t u r e u p s h i f t o r o t h e r e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s b y s t r o n g l y a n d

r a p i d l y i n d u c i n g t h e s y n t h e s i s o f a s m a l l s e t o f p r o t e i n s c a l l e d h e a t

shock p r o t e i n s and i s e x h i b i t e d by a l m o s t a l l l i v i n g o r g a n i s m s . T h e r a t e

of p r o t e i n s y n t h e s i s i n c r e a s e s t r a n s i e n t l y w i t h i n a f e w m i n u t e s a f t e r a

t h e r m a l u p s h i f t a nd r e a c h e s a n e w s t e a d y s t a t e v a l u e w i t h i n 30 m i n u t e s

( Y a m a m o r i e t _ a l . , 1 9 7 8 ) .

When D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r l a r v a e o r c u l t u r e d c e l l s a r e t r a n s i e n t l y

e x p o s e d t o h i g h t e m p e r a t u r e a n u m b e r o f h e a t - s h o c k p o l y p e p t i d e s a r e

i n d u c e d ( T i s s i e r e s e t a l . , 1974) . T h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e h a s b e e n v e r y

w i d e l y s t u d i e d i n e u c a r y o t e s a n d p r o c a r y o t e s s u c h a s ; h u m a n b e i n g s ,

h a m s t e r , c h i c k e n , D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r , t o b a c c o , n e m a t o d e s , c h i c k

e m b r y o f i b r o b l a s t , E s c h e r i c h i a c o l i , S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ,

B a c i l l u s s u b t i l i s , S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m , P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ,

Y e r s i n i a en t e r o c o l i t i c a , S t a p h y l o c o c c u s , My c o p l a s m a c a p £ £ C o Dim. T h e

phenomenon of h e a t - s h o c k r e s p o n s e i s n o t o n l y h i g h l y c o n s e r v e d d u r i n g

e v o l u t i o n b u t i n d i v i d u a l c omp o n e n t s of t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e b e l o n g t o

f a m i l i e s o f p r o t e i n s w h i c h a r e v e r y c o n s e r v e d i n n a t u r e .

T h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e i s c o n t r o l l e d by a p o s i t i v e r e g u l a t o r y l o c u s

c a l l e d h t p R o r h i n o r r p o H a n d t h i s c o n t r o l s t h e i n d u c t i o n o f o v e r 13

h e a t - s h o c k p r o t e i n s upon t e m p e r a t u r e u p s h i f t . Such p r o t e i n s a r e membe r s o f

t h e HTP ( h i gh t e m p e r a t u r e p r o d u c t i o n ) r e g u l o n ( N e i d h a r d t £t__a_l*» 1983) .

Both e u c a r y o t i c and p r o c a r y o t i c c e l l s a r e e q u a l l y c a p a b l e o f r e s p o n d i n g t o

- 75 -

e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s by s y n t h e s i s of h e a t - s h o c k p r o t e i n s . M y c o p l a s m a s

whi ch a r e t h e s m a l l e s t f r e e l i v i n g c e l l s ( a b o u t 1 / 6 t o 1 / 3 t h e g e n e t i c

c a p a c i t y of E s c h e r i c h i a c o l i ) h a v e t h e c a p a c i t y t o s y n t h e s i s e h e a t s h o c k

p r o t e i n s . The r e s e m b l a n c e o f t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e o f m y c o p l a s m a s t o

t h a t of o t h e r o r g a n i s m s s u g g e s t s t h a t t h e r e h a s b e e n s e l e c t i v e p r e s s u r e

f o r r e t e n t i o n of t h e h e a t - s h o c k s y s t e m d u r i n g a m a j o r d e c r e a s e i n g e n o m i c

c o mp l e x i t y i n v o l v e d in mycop l a s ma e v o l u t i o n . The c o n s e r v a t i o n o f t h e h e a t

s hock s y s t e m d u r i n g myc op l a s ma p h y l o g e n y s u g g e s t s t h a t t h e r e s p o n s e i s

v i t a l f o r c e l l p h y s i o l o g y ( D a s c h e r e t a l . , 1 9 9 0 ) .

1 . 6 . 4 . 1 . H e a t - s h o c k g e n e s :

At l e a s t n i n e h e a t - s h o c k g e n e s h a v e been mappe d , t h e y a r e s c a t t e r e d a r o u n d

t h e o r i C p r o x i m a l h a l f of t h e E s c h e r i c h i a c o l i c h r o m o s o me ( F i g . 10) . T h e r e

a r e two b i c i s t r o n i c o p e r o n s i . e d n a K J a n d g r o E S L , w h e r e a s t h e r e m a i n i n g

f i v e g e n e s a r e s e p a r a t e f r o m e a c h o t h e r w h i l e r poD l i e s b e t w e e n t h o s e f o r

r i bos c ma l p r o t e i n s S21 ( rpsU) a nd DNA p r i m a s e (dnaG). N u c l e o t i d e s e q u e n c e s

of a f e w o f t h e s e g e n e s s h o w c o n s e n s u s a mo n g t h e i r p r o m o t e r r e g i o n s

( N e i d h a r d t a n d V a n B o g e l e n , 1 9 8 7 ) .

1 . 6 . 4 . 2 . E f f e c t o r s :

The h t p R g e n e c o d e s f o r a s i n g l e p r o t e i n , Ht pR o r s i g m a - 3 2 , wh i c h s h a r e s a

s i m i l a r i t y f o r a m i n o a c i d s e q u e n c e s w i t h t h e r p o D g e n e p r o d u c t i . e

s i gma - 70 . D u r i n g a h e a t - s h o c k r e s p o n s e , somehow, t h e a c t i v i t y o r l e v e l o r

b o t h o f t h e p o s i t i v e e f f e c t o r , H t p R ( s i g m a - 3 2 ) m u s t b e r a i s e d f o r t h e

t r a n s c r i p t i o n of h e a t - s h o c k g e n e s . U n f o r t u n a t e l y t h e p r e c i s e m e c h a n i s m i s

n o t c l e a r y e t .

- 76 -

—dnaKJgroESL-

lysU- IonhtpG

4oO9 0oriC'

2080

htpR-----

3 0-70

rpoD 40,,605 0

grpE

Fi g . 10. L o c a t i on of h e a t - s h o c k g e n e s on t h e E s c h e r i c h i a c o l i l i n k a g e m a p .

T h e p o s i t i o n o f o r i C i s s h o w n f o r r e f e r e n c e o n l y .

- 77 -

C o n d i t i o n s t h a t i n c r e a s e t h e amoun t s of s i g m a - 3 2 r e l a t i v e t o s i g m a - 7 0 in

t h e c e l l c a u s e t h e i n d u c t i o n o f h e a t - s h o c k r e s p o n s e . W h e n t h e

c o n c e n t r a t i o n o f s i g m a - 7 0 i s l o w e r e d t h i s c a u s e s t h e i n d u c t i o n o f

h e a t - s h o c k p r o t e i n s . C o n v e r s e l y , a m u t a n t t h a t o v e r p r o d u c e s s i g m a - 7 0

s y n t h e s i s e s l o w e r e d l e v e l s o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s w h i c h s u g g e s t s a

c o m p e t i t i v e i n t e r a c t i o n a t s ome l e v e l b e t w e e n t h e t wo s i g m a f a c t o r s .

1 . 6 . 4 . 3 . R e g u l a t i o n o f h e a t - s h o c k r e s p o n s e :

T h e i n d u c t i o n o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s i s c o n t r o l l e d b y a p o s i t i v e

r e g u l a t o r y l o c u s known a s h t p R o r h i n ( Yamamor i a n d Y u r a , 19 8 2 ) , l o c a t e d

a t 76 min on t h e E. co l i chromosome ( N e i d h a r d t e t a l . , 1983) . T h e h i n g e n e

c o d e s f o r a p o s i t i v e r e g u l a t o r y p r o t e i n whi ch i n d u c e s t h e t r a n s c r i p t i o n o f

many h e a t - s h o c k g e n e s f o l l o w i n g a t h e r m a l s hoc k . Fo r e x a m p l e , f o l l o w i n g a

s t i m u l u s t h e r e i s an i n c r e a s e d s y n t h e s i s of g r o E mRNA in a c e l l w h i c h i s

a c compa n i e d by an i n c r e a s e d s y n t h e s i s of g r o E p r o t e i n s ; s y n t h e s i s of b o t h

can be i n h i b i t e d b y r i f a m p i c i n ( Ya ma mor i a n d Y u r a , 1980) . T h e r a t e a n d

e x t e n t o f h e a t - s h o c k i n d u c t i o n i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o h i n g e n e

e x p r e s s i o n a nd t h e amount of h i n g e n e p r o d u c t d e t e r m i n e s b o t h t h e r a t e a nd

e x t e n t o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s ( Y a m a m o r i a n d Y u r a , 1 9 8 2 ) .

Amino a c i d c o m p o s i t i o n s and s e c o n d a r y s t r u c t u r e s of Ht pR a nd s igma f a c t o r s

show a c e r t a i n d e g r e e of homology ( Ne i d h a r d t a n d V a n B o g e l e n , 1987) . I t i s

now t h o u g h t t h a t t h e g e n e p r o d u c t o f h t p R i s a s i g m a f a c t o r w h i c h

r e c o g n i s e s t h e p r o m o t o r s of h e a t - s h o c k g e n e s . I t i s t e r m e d s i g m a - 3 2 a n d

t h e g e n e h a s be e n c a l l e d r p o H in r e c o g n i t i o n o f i t s i n v o l v e m e n t i n t h e

s y n t h e s i s o f a s i g m a f a c t o r .

- 78 -

1 . 6 . 5 . I n d u c t i o n o f t h e h e a t - s h o c k o r r e l a t e d s t r e s s s y s t e m :

A wi de v a r i e t y of a g e n t s o r a g e n c i e s c a n t r i g g e r t h e s y n t h e s i s o f h e a t

shock p r o t e i n s o r s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s i n a n u m b e r o f o r g a n i s m s f r o m

human b e i n g s t o D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r . Among s u c h a g e n t s a r e h e a t s h i f t ,

e t h a n o l , v i r a l i n f e c t i o n , U.V. t r e a t m e n t a n d a l k a l i n e o r a c i d i c s h i f t

whi ch a r e c a p a b l e of i n d u c t i o n of s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s i n p r o c a r y o t e s .

1 . 6 . 5 . 1 . I n d u c t i o n b y t e m p e r a t u r e u p s h i f t a n d b y e t h a n o l :

Two g r o u p s o f p r o t e i n s i n d u c e d by t e m p e r a t u r e u p s h i f t h a v e m o l e c u l a r

w e i g h t s of a p p r o x i m a t e l y 70 a nd 90 kDa ( a l s o known a s h s p 7 0 a n d h s p 90)

and a r e among t h e mos t h i g h l y c o n s e r v e d p r o t e i n s in n a t u r e . The i m p o r t a n c e

of some h e a t - s h o c k p r o t e i n s i s o b v i o u s in E s c h e r i c h i a c o l i , s i n c e i t s d n a K

n u l l m u t a n t s g r o w m o r e s l o w l y t h a n t h e w i l d t y p e a t l ow t e m p e r a t u r e s ,

p r o d u c e f i l a m e n t s a f t e r a s h i f t t o 42 °C, a r e u n a b l e t o s y n t h e s i s e d n a K

p r o t e i n a n d l o s e t h e i r v i a b i l i t y o n i n c u b a t i o n f o r 2 h r a t 42 ° C .

I n t r o d u c t i o n o f a p l a s m i d c a r r y i n g t h e d n a K + g e n e i n t o t h e s e m u t a n t s

r e s t o r e s nor ma l c e l l g r o w t h , s y n t h e s i s o f d n a K p r o t e i n a n d c e l l d i v i s i o n

a t 42 ° C ( P a e k a n d W a l k e r , 1 9 8 7 ) .

P r o c a r y o t i c c e l l s r e s p o n d t o t e m p e r a t u r e u p s h i f t a n d e x p o s u r e t o e t h a n o l

by i n d u c i n g a s p e c i f i c s e t of p r o t e i n s . Two ma j o r h e a t - s h o c k p r o t e i n s w i t h

a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s o f 76 a n d 61 kDa a r e r e c o r d e d a m o n g t h e 17

p r o t e i n s s y n t h e s i s e d a t 45 ° C b y P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w h i c h s h o w

i mmunolog i ca l c r o s s r e a c t i v i t y w i t h t h e E . co l i DnaK a nd Gr oEL p r o t e i n s . In

c o n t r a s t , s ev e n p r o t e i n s a r e s y n t h e s i s e d on e x p o s u r e t o e t h a n o l , t h r e e o f

- 79 -

w h i c h a r e h e a t - s h o c k p r o t e i n s ( A l l a n e t a l . , 1 9 8 8 ) .

S i m i l a r l y t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e o f B a c i l l u s s u b t i l i s i s s t u d i e d a t

50 °C, whi ch i s c h a r a c t e r i s e d b y i n d u c t i o n o f 26 p r o t e i n s , a f t e r 3 m i n ,

w h e r e a s a s i m i l a r s e t o f p r o t e i n s a r e s y n t h e s i s e d on t r e a t m e n t w i t h

e t h a n o l b u t r a t h e r s l owl y . Among t h e m a r e 3 ma j o r h e a t - s h o c k p r o t e i n s a n d

t h e y a r e i r r muno l og i ca l l y r e l a t e d t o E s c h e r i c h i a c o l i DnaK, Lon a n d g r o E L

( A r n o s t i e t _ a l . , 1 9 8 6 ) .

1 . 6 . 5 . 2 . I n d u c t i o n o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s b y v i r a l i n f e c t i o n :

B a c t e r i o p h a g e l a m b d a i n f e c t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i t r i g g e r s a c o m p l e x

r e s p o n s e in t h e c e l l , in wh i ch t h e r a t e o f s y n t h e s i s o f m o s t , i f n o t a l l ,

h o s t p r o t e i n s a r e a f f e c t e d . T h i s l e a d s t o t h e i n d u c t i o n o f 21 s t r e s s

r e l a t e d p o l y p e p t i d e s a n d a n i n c r e a s e i n r a t e o f s y n t h e s i s t o a b o v e t h e

p r e i n f e c t i o n r a t e s a s o b s e r v e wi t h g r o E , dnaK a n d S S P p r o t e i n s . M o r e o v e r

t h e p a t t e r n of p r o t e i n s y n t h e s i s i s s i m i l a r wi t h amino a c i d s t a r v a t i o n b u t

d i f f e r e n t f r o m h e a t s h o c k ( D r a h o s a n d H e n d r i x , 1982 ) . T h e i n d u c t i o n of

s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s a f t e r l a m b d a i n f e c t i o n c o n t r a d i c t s a n e a r l i e r

f i n d i n g o f C o h e n a n d C h a n g , ( 1970) w h i c h c l a i m e d t h a t t h e i n f e c t i o n

r e s u l t e d i n d e p r e s s i o n o f h o s t DNA, RNA a n d p r o t e i n s y n t h e s i s ; t h e i r

i n v e s t i g a t i o n was c o n f i n e d t o s y n t h e s i s o f ] 3 - g a l a c t o s i d a s e w h i c h i n f a c t

d e c r e a s e d f i v e f o l d .

S u b s e q u e n t l y t h e i n d u c t i o n of s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s f o l l o w i n g t h e l a m b d a

i n f e c t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i w a s c o n f i r m e d b y r e c o r d i n g t w o f o l d

s t i m u l a t i o n in r a t e of s y n t h e s i s o f o n e o f t h e p r o d u c t s o f g £ o E ( Ko c h a n

a n d M u r i a l d o , 1 9 8 2 ) .

- 80 -

1 . 6 . 5 . 3 . I n d u c t i o n o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s b y a l k a l i n e a n d a c i d i c

s h i f t :

A l k a l i n e s h i f t l i k e m a n y o t h e r e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s i n d u c e s t h e

s y n t h e s i s o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s i n E . c o l i ; a s i x f o l d i n c r e a s e i n

p r o d u c t i o n of dnaK and g r o E g e n e p r o d u c t s i s o b s e r v e d w i t h i n 5 t o 10 m i n ,

whi ch i s h t p R d e p e n d e n t , w h e r e a s a c i d i c s h i f t f r o m pH 8.0 t o pH 6.0 i s n o t

e f f e c t i v e in i n d u c i n g any s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n ( T a g l i c h t e t a l . , 1987) .

A l k a l i n i z a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p H ( p H i ) c a u s e s a n i n c r e a s e i n U.V

r e s i s t a n c e i n E . c o l i ( S c h u l d i n e r e t a l . , 1 9 8 6 ) .

S u b s e q u e n t l y an i m p o r t a n t d i s c o v e r y r e v e a l s t h a t an a c i d i c s h i f t t o pH 5.0

r e s u l t s in i n c r e a s e d s y n t h e s i s o f 13 s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s t o 1.5 - 4

f o l d a nd 19 s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s w e r e i n c r e a s e d 2 t o 14 t i m e in E . c o l i

and Sa l mo n e l l a t y p h i m u r i u m r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s in E . c o l i 7 p o l y p e p t i d e s

a r e s y n t h e s i s e d o n l y a t l ow pH ( H i c k e y a n d H i r s h f i e l d , 1 9 9 0 ) w h i c h

c o n t r a d i c t s t h e e a r l i e r f i n d i n g s of T a g l i c h t and c o w o r k e r s p e r h a p s b e c a u s e

t h e r e s p o n s e was s t u d i e d a t pH 6.0. A n o t h e r s t u d y c o n f i r m e d t h e i n d u c t i o n

of 20 s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s in E . c o l i , i n c l u d i n g 9 p o l y p e p t i d e s w h i c h

a r e e x c l u s i v e l y p r o d u c e d by an a c i d s h o c k , 30 - 45 m i n , a t pH 4 . 3 , c a l l e d

a c i d s hock p r o t e i n s (ASP) a nd c o n c o m i t a n t l y 4 we l l k n o w n p r o t e i n s , G r o E L ,

DnaK, Ht pG and HtpM ( H e y d e a n d P o r t a l i e r , 1990) . T h e s y n t h e s i s o f o n e

p o l y p e p t i d e o u t o f n i n e a c i d s h o c k p r o t e i n s i s h t p R (RpoH) d e p e n d e n t .

1 . 6 . 5 . 4 . I n d u c t i o n o f s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s b y UV l i g h t :

The SOS r e s p o n s e w h i c h l o o k s v e r y c o m p l e x i s i n d u c e d b y a g e n t s a n d

81 -

c o n d i t i o n s t h a t e i t h e r d a m a g e DNA o r i n t e r f e r e w i t h DNA r e p l i c a t i o n .

T h u s , UV l i g h t , n a l i d i x i c a c i d a n d m i t o m y c i n C, c a n s w i t c h on t h e SOS

n e t w o r k wh i c h i s c o n t r o l l e d by two r e g u l a t o r y p r o t e i n s , t h e l e x A a n d r e c A

p r o t e i n s ( L i t t l e and Mount , 1982) . T h e r e s p o n s e s e e m s e v e n m o r e c o m p l e x

s i n c e a g e n t s l i k e UV l i g h t a nd n a l i d i x i c a c i d i n d u c e GroEL, DnaK a n d o t h e r

h e a t s h o c k p r o t e i n s i n E s c h e r i c h i a c o l i i n a h t p R d e p e n d e n t m a n n e r

( K r u e g e r a n d W a l k e r , 1 9 8 4 ) .

1 . 6 . 6 . T h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e a n d t h e r m o t o l e r a n c e :

I n t r o d u c t i o n of mo s t s t r e s s r e s p o n s e s l e a d s t o r e s i s t a n c e t o h i g h e r l e v e l s

of t h e s t r e s s f o r e xa mpl e in t h e a d a p t i v e r e s p o n s e t o a l k y l a t i n g a g e n t s

(Samson a nd C a i r n s , 1977) a nd t o h y d r o g e n p e r o x i d e ( D e mp l e a n d H a l b r o o k ,

1983) . H e a t - s h o c k e d o r g a n i s m s a l s o g a i n i n c r e a s e d t h e r m o t o l e r a n c e

(Yamamori a nd Yur a , 1982; Mackey and D e r r i c k , 1986 ; M a c k e y a n d D e r r i c k ,

1 9 8 7 ) .

M a c k e y a n d D e r r i c k , ( 1 9 8 7 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e d e v e l o p m e n t o f

t h e r m o t o l e r a n c e in Sa l mo n e l l a t y p h i m u r i u m w a s r a p i d a n d r e m a i n e d a t i t s

maximum l e v e l f o r a t l e a s t 10 h r . T h i s d i f f e r s f r o m t h e e a r l i e r r e p o r t of

Yamamori a nd Yur a , (1982), whe r e t r a n s i e n t l y i n d u c e d t h e r m o r e s i s t a n c e of

E s c h e r i c h i a c o l i , l a s t e d f o r 60 min . T h e r e a s o n o f t h i s d i f f e r e n c e i s n o t

known, p e r h a p s i t i s r e l a t e d t o d i f f e r e n c e s i n g r o w t h m e d i a o r p h a s e o f

g r o w t h b e f o r e h e a t s h o c k .

A d d i t i o n a l l y , an a l k a l i n e s h i f t i n S . e n t e r i t i d i s i n d u c e s t h e r m o t o l e r a n c e .

1 . 6 . 7 . B i o c h e m i s t r y o f s t r e s s r e l a t e d r e s p o n s e :

S e v e r a l s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s a r e i n d u c e d by m i c r o o r g a n i s m s , u n d e r t h e

82 -

i n f l u e n c e o f a s p e c i f i c t h r e a t l i k e s t a r v a t i o n , v i r a l i n f e c t i o n , u . v

t r e a t m e n t , a l k a l i n i z a t i o n a n d a c i d i f i c a t i o n . Some o f t h e s e p r o t e i n s a r e

s i m i l a r in f u n c t i o n and i mmuno l og i c a l l y r e l a t e d t o h e a t - s h o c k p r o t e i n s of

E . co l i w h i l e o t h e r s a r e l e s s wel l u n d e r s t o o d . E x t e n s i v e wor k h a s b e e n d o n e

on m a p p i n g of E. co l i h e a t shock r e s p o n s e g e n e s a nd some of t h e i r l o c a t i o n s

h a v e be e n wor ke d o u t ( Ne i d h a r d t a nd VanBogel en , 1987). Th u s 17 h e a t - s h o c k

p r o t e i n s of E s c h e r i c h i a c o l i i n d u c e d f o l l o w i n g a t h e r m a l s t r e s s a r e s h o w n

i n T a b l e 5 a n d F i g u r e 1 0 .

1 . 6 . 7 . 1 . C h a r a c t e r i s t i c s o f L o n p r o t e i n :

The Lon p r o t e i n , 94 kDa, a l s o known a s p r o t e a s e La h a s a n A T P - d e p e n d e n t

p r o t e a s e a c t i v i t y . I t can h y d r o l y s e o^-case i n a n d g l o b i n i n v i _ t ro . T h e Lon

p r o t e i n i s e n c o d e d by t h e Ion g e n e w h o s e f u n c t i o n i s r e g u l a t e d b y h t p R

g e n e p r o d u c t a nd t h i s p r o t e i n i s i n d u c e d u n d e r s t r e s s f u l c o n d i t i o n s l i k e

e l e v a t e d n o n - p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e o r e x p o s u r e t o e t h a n o l ( G o f f £t__a_L»

1984). The h t p R m u t a n t s h a v e low r a t e o f I on t r a n s c r i p t i o n a t p e r m i s s i v e

t e m p e r a t u r e s , l o w e r l e v e l o f A T P - d e p e n d e n t p r o t e a s e a c t i v i t y h e n c e

d e c r e a s e d c a p a c i t y f o r h y d r o l y s i s a n d c l e a v i n g o f a b n o r m a l p r o t e i n s

( P h i l l i p s e t a l . , 1 9 8 4 ) .

In E s c h e r i c h i a c o l i a b e r r a n t p r o t e i n s , a r e r a p i d l y d e g r a d e d b y t h e Lon

p r o t e i n in an A T P - d e p e n d e n t f a s h i o n . The r a t e s of h y d r o l y s i s o f a n o m o l o u s

p r o t e i n s by t h e Ion m u t a n t s a r e 2 - 3 t i me s s l o w e r t h a n i n t h e w i l d - t y p e

c e l l s . On t h e o t h e r h a n d , i f c e l l s h a r b o u r m u l t i c o p y p l a s m i d s c a r r y i n g t h e

Ion g e n e , t h e n t h e y p r o d u c e p r o t e a s e La in s e v e r a l t i me s m o r e t h a n n o r m a l

l eve l a n d a b n o r m a l p r o t e i n d e g r a d a t i o n b y t h o s e c e l l s i s v e r y r a p i d .

83 -

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

12

13

14

15

16

17

Seme h e a t - s h o c k p r o t e i n s of E s c h e r i c h i a c o l i .

P r o t e i n Gene M o l e c u l a r

name w e i g h t

GrpE §£P? 23 , 300

GroEL mopA (groEL) 62 , 883

DnaK dnaK 69 , 121

S i g r a - 7 0 £poD 70 , 263

h t p E 14 , 700

GroES mopB (groES) 10 , 670

h t pG 71 , 000

h t p l 48 , 5 0 0

Lysyl-tRNA. l_ysU 60 , 000S y n t h e t a s e f o r m I I

h t pK 10 , 100

h t p L 21 , 500

htpM 84 , 100

h t pN 13 , 500

h t pO 21 , 000

Lon Ion 94 , 000

DnaJ d n a J 40 , 975

- 84 -

1 . 6 . 7 . 2 . C h a r a c t e r i s t i c s o f D n a K p r o t e i n :

DnaK, a m a j o r h e a t - s h o c k p r o t e i n in E . c o l i , i s h o m o l o g o u s t o t h e h s p 7 0 of

Drosophi_la m e l a n o g a s t e r a nd humans and i s ca . 70 kDa in m o l e c u l a r w e i g h t .

The DnaK p r o t e i n i s c o d e d b y t h e d n a K g e n e , l o c a t e d a t 0.3 min on t h e

g e n e t i c map; s y n t h e s i s i s c o n t r o l l e d by h t p R g e n e p r o d u c t and on i n d u c t i o n

c o m p r i s e s u p t o 4.3% of t o t a l c e l l u l a r p r o t e i n s a f t e r t e m p e r a t u r e u p s h i f t

and o t h e r e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s . The n u l l m u t a n t s of E. co l i w h i c h p r o d u c e

dnaK p r o t e i n a t b a s a l l ev e l a t low t e m p e r a t u r e a r e u n a b l e t o f o r m c o l o n i e s

a t 42 ° C a n d s h o w f i l a m e n t a t i o n b u t c a n r e v e r t t o h a v e t h e n o r m a l

f u n c t i o n s on i n t r o d u c t i o n o f a p l a s m i d c a r r y i n g d n a K g e n e ( P a e k a n d

Wal ke r , 1987). Th i s g e n e p r o d u c t i s e s s e n t i a l f o r l a m b d a a n d M13 i n v i t r o

ENA r e p l i c a t i o n s y s t e m, a u t o p h o s p h o r y l a t e s a t a t h r e o n i n e r e s i d u e a n d h a s

a w e a k D N A - d e p e n d e n t A T P a s e a c t i v i t y .

1 . 6 . 7 . 3 . C h a r a c t e r i s t i c s o f G r o E p r o t e i n :

T h e g r o E g e n e , l o c a t e d on 94 m i n o f E . c o l i c h r o m o s o m e , c o n t a i n t w o

f u n c t i o n a l l y r e l a t e d g e n e s g r oEL a nd g r o ES , c o d i n g f o r c a . 63 a n d 11 k Da

p o l y p e p t i d e s r e s p e c t i v e l y ( T i l l y e t a l . , 1981 ) , m u t a t i o n i n b o t h o f t h e s e

g e n e s e x e r t s i m i l a r e f f e c t s on a s s e m b l y of p h a g e a n d m i c r o b i a l g r o w t h a t

n on p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e s ( W a d a a n d I t i k a w a , 1 9 8 4 ) .

85 -

1 . 6 . 8 . DNA r e p a i r :

DNA r e p a i r i s a c o r r e c t i v e m e c h a n i s m of a l l l i v i n g o r g a n i s m s a n d s e r v e s t o

r e d u c e t h e l e v e l o f s p o n t a n e o u s a n d i n d u c e d m u t a t i o n ; a b a l a n c e i s s e t

b e t we en g e n e t i c c h a n g e a nd a d a p t a t i o n a n d s t r i c t m a i n t e n a n c e o f e x i s t i n g

g e n o t y p e s . C e l l s l a c k i n g r e p a i r me c h a n i s m s a r e l i a b l e t o u n d e r g o m u t a t i o n o r

d i e when l e s i o n s o c c u r in t h e i r DNA. The ENA damage in E . co l i i s c a t e g o r i s e d

in t wo m a i n c l a s s e s on t h e b a s i s o f t h e p r o c e s s i n g n e c e s s a r y t o c a u s e

m u t a t i o n : 1 ; t h i s c l a s s i n c l u d e s m u t a t i o n s w h i c h t a k e p l a c e d u e t o

m i s p a i r i n g d u r i n g DNA r e p l i c a t i o n f o l l o w i n g t h e a c t i o n o f m e t h y l a t i n g

a g e n t s ; i t i s c a u s e d b y t h e p r o d u c t i o n o f a d d u c t s l i k e O ^ - m e t h y l g u a n i n e ,

2; t h i s c l a s s r e q u i r e s t h e i n v o l v e me n t of s p e c i a l i n d u c i b l e " S O S ” p r o c e s s i n g

( r e f e r r e d t o a l s o a s " e r r o r - p r o n e r e p a i r " , "SOS r e p a i r " , o r " m i s r e p a i r " ) t o

c a u s e m u t a t i o n , e x e m p l i f i e d b y UV m u t a g e n e s i s ( W a l k e r , 1 9 8 4 ) .

1 . 6 . 8 . 1 . a . C l a s s 1. A d a p t i v e r e s p o n s e :

T h i s a d a p t i v e r e s p o n s e f a l l s i n t o t h e f i r s t c l a s s , i s r e c A i n d e p e n d e n t a n dr /

i s i n d u c e d by a l k y l a t i n g a g e n t s l i k e N - m e t h y l - N - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e

and N- m e t h y 1 - N - n i t r o s o u r e a . T h i s i s g o v e r n e d by t h e a d a g e n e p r o d u c t , a

37 kDa p r o t e i n wh i ch a c t s a s a p o s i t i v e r e g u l a t o r y e l e m e n t a s w e l l a s a n

O ^ - m e t h y l g u a n i n e - D N A m e t h y I t r a n s f e r a s e . T h e p r o d u c t i o n o f O ^ - m e G b y

a l k y l a t i n g a g e n t s s w i t c h e s on t r a n s c r i p t i o n o f a t l e a s t f o u r g e n e s ; a d a ,

a l k A , a l k B , a n d a i d B ( V o l k e r t a n d N g u y e n , 1 9 8 4 ) .

T h e a l k A g e n e c o d e s f o r a b r o a d - s p e c t r u m DNA g l y c o l a s e k n o w n a s

3 - m e t h y l a d e n i n e - D N A g l y c o s y l a s e II h a v i n g an a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t of

- 86 -

I"- g ly c o s y lo s e

CHO O O O

> I ' M - J - ' J - f ’ f ’

1A purin ic /A pyrim id in ic

E ndonuclease

p T P p P J p >

DNA l igase

p\/ vh DNA p o ly m e ra s e I

o s ~ s Exonuclease

5'

"P I P | OH P J P^l p>

Fi g . 11. ENA r e p a i r by N - g l y c o s y l a s e . A p o r t i o n of genome shown; R a l t e r e d n i t r o g e n o u s b a s e . N - g 1y c o s y 1 a s e r e c o g n i s e t h e a l t e r e d b a s e a n d a p u r i n e / a p y r i m i d i n i c s i t e i s c l e a v e d by a p u r i n e / a p y r i m i d i n i c e n d o n u c l e a s e . The s u g a r p h o s p h a t e i s r emoved by a 5*-3' e x o n u c l e a s e by DNA p o l y m e r a s e I. DNA p o l y m e r a s e I s y n t h e s i s e t h e c r o s s - h a t c h e d n u c l e o t i d e s a n d DNA l i g a s e f o r m s t h e f i n a l p h o s p h o d i e s t e r b o n d ( a d a p t e d f r o m K u s h n e r , 1 9 8 7 ) .

30 kDa a nd i s i n d u c e d 20 f o l d d u r i n g a n a d a p t i v e r e s p o n s e . T h e e n z y m e i s

c a p a b l e o f e x c i s i n g s e v e r a l m e t h y l a t e d b a s e s .

1 . 6 . 8 . 1 . b . M e c h a n i s m o f a d a p t i v e r e s p o n s e :

The a l t e r e d n i t r o g e n o u s b a s e s o f DNA c a u s e d b y t h e a l k y l a t i n g a g e n t s a r e

r e c o g n i s e d by N - g l y c o s y l a s e a nd a p u r i n i c / a p y r i m i d i n i c s i t e s a r e c l e a v e d by

a p u r i n i c / a p y r i m i d i n i c e n d o n u c l e a s e e i t h e r a t t h e 5' o r 3 ' e n d a s d i a g r a m m e d

s c h e m a t i c a l l y i n F i g . 11. T h e s u g a r p h o s p h a t e i s r e m o v e d b y a 5 1 - 3 1

e x o n u c l e a s e and DNA p o l y m e r a s e 1 r e p l a c e s t h e d a ma g e d DNA n u c l e o t i d e s a n d

s u b s e q u e n t l y DNA l i g a s e c o n n e c t s t h e new n u c l e o t i d e s w i t h t h e p r e e x i s t i n g

o l d s t r a n d t o c o m p l e t e t h e r e p a i r p r o c e s s ( K a r r a n e t a l . , 1 9 8 2 ) .

1 . 6 . 8 . 2 . C l a s s 2. E r r o r - p r o n e ( i n d u c i b l e ) r e p a i r :

The e r r o r - p r o n e r e p a i r , m o s t c o mmo n l y c a l l e d "SOS" r e p a i r , i s o p e r a t i v e

when t h e DNA i s e i t h e r d a m a g e d o r i t s r e p l i c a t i o n i s t h r e a t e n e d b y s ome

m u t a g e n i c a g e n t s o r s o me c o n d i t i o n s . T h e SOS r e s p o n s e r e s u l t s i n a n

i n c r e a s e d c a p a c i t y f o r DNA r e p a i r , c e s s a t i o n o f r e s p i r a t i o n , DNA

d e g r a d a t i o n , i n d u c t i o n of s t a b l e ENA r e p l i c a t i o n , and i n d u c t i o n o f p r o p h a g e s

(Ku s h n e r , 1 9 8 7 ) .

1 . 6 . 8 . 2 . a . M o d e l f o r SOS r e g u l a t i o n :

The SOS r e g u l a t o r y n e t w o r k i s c o n t r o l l e d by t h e i n v o l v e me n t of RecA and LexA

p r o t e i n s . In t h e no r ma l s t a t e of t h e c e l l , t h e l e x A g e n e p r o d u c t a c t s a s a

r e p r e s s o r of a c o n s i d e r a b l e number of u n l i n k e d g e n e s i n c l u d i n g l exA and r ec A

88

a n d b i n d s w i t h t h e o p e r a t o r r e g i o n s o f e a c h g e n e ( W a l k e r , 1 9 8 4 ) .

On i n d u c t i o n o f t h e SOS s y s t e m , a s i g n a l i s g e n e r a t e d w h i c h r e v e r s i b l y

a c t i v a t e s t h e R e c A p r o t e i n . T h e R e c A p r o t e i n p r o t e o l y t i c a l l y c l e a v e s (1)

LexA p r o t e i n , a t an - A l a - G l y - p e p t i d e n e a r t h e m i d d l e o f t h e p r o t e i n , a n d

(2) r e p r e s s o r s of b a c t e r i o p h a g e s ; l a m b d a , P 2 2 , a n d 434 ( W a l k e r , 1984) a n d

o t h e r r e p r e s s o r s , h e n c e i n c r e a s i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f a n u m b e r of g e n e s

i n c l u d i n g u v r A , u v r B , u v r D , r e c A , l e x A , s s b , r u v , r e c N , umuC, umuD a n d

p r o b a b l y u v r C ( K u s h n e r , 1 9 8 7 ) .

If t h e i n d u c i n g s i g n a l i s p r e t t y s t r o n g , mor e m o l e c u l e s o f R e c A p r o t e i n a r e

a c t i v a t e d r e s u l t i n g i n a d e c l i n i n g l e v e l o f L e x p r o t e i n w h i c h l e a d s t o

max i mi s ed t r a n s c r i p t i o n o f e v e n t h o s e g e n e s w h o s e o p e r a t o r s a r e t i g h t l y

bound wi t h LexA. When t h e c e l l s t a r t s t o r e c o v e r f r o m t h e e f f e c t of DNA

d a m a g i n g a g e n t s , R e c A m o l e c u l e s b e g i n t o d e c l i n e i n c o n c e n t r a t i o n t h u s

e n h a n c i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f Le xA. T h e r e f o r e , t h e l e v e l o f L e x A r i s e s

which s h u t s o f f SOS s y s t e m a nd t h e c e l l r e t u r n s t o t h e r e p r e s s e d s t a t e i n a n

u n i n d u c e d c o n d i t i o n .

1 . 6 . 8 . 2 . b . L e x A c l e a v a g e :

The m o l e c u l a r m e c h a n i s m by wh i c h a c t i v a t e d RecA, c l e a v e s L e x A a n d l a m b d a

r e p r e s s o r i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . I t i s p r o p o s e d t h a t a c t i v a t e d R e c A a f t e r

i n t e r a c t i n g w i t h LexA may c o n f o r m t h e L e x A m o l e c u l e i n s u c h a wa y w h i c h

e n h a n c e s t h e s u s c e p t i b i l i t y o f - a l a - g l y - b o n d e i t h e r t o h y d r o l y s i s o r t o

a u t o d i g e s t i o n . L i t t l e , (1984), s u g g e s t e d t h a t R e c A may n o t b e n e c e s s a r y f o r

t h e c l e a v a g e o f L e x A s i n c e i t c a n t a k e p l a c e , i n t h e a b s e n c e

- 89 -

of Re c A, u n d e r m i l d a l k a l i n e c o n d i t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f d i v a l e n t

c a t i o n .

I . 6 . 8 . 2 . C . B i o c h e m i c a l a s p e c t s o f SOS r e g u l a t i o n :

G e n e t i c a l a n a l y s i s o f t h e SOS f a m i l y o f g e n e s s h o w s t h a t t h e y s h a r e

s e q u e n c e homology in t h e i r o p e r a t o r r e g i o n s . The s t r e n g t h w i t h w h i c h L e x A

b i n d s w i t h t h e o p e r a t o r r e g i o n s o f t h e SOS g e n e s d e t e r m i n e s t h e

e x p r e s s i o n s o f SOS g e n e s , a t a b a s a l l e v e l , i n u n i n d u c e d s t a t e o f t h e

c e l l . LexA s h a r e s a f u n c t i o n a l s i m i l a r i t y w i t h l a m b d a r e p r e s s o r a n d b o t h

t h e m o l e c u l e s a r e c l e a v e d a t - a l a - g l y - r e g i o n .

1.6.9. Compa r i s on of t h e SOS, h e a t - s h o c k a nd a d a p t i v e r e g u l a t o r y s y s t e m s :

The r e s p o n s e s e x h i b i t e d by E s c h e r i c h i a c o l i t o some DNA d a m a g i n g a g e n t s

a r e s ummar i zed in F i g . 12. T h e r e a r e t h r e e i n d e p e n d e n t r e g u l a t o r y s y s t e m s ,

i n d u c i b l e by t h e i r own i n d u c e r s . Some i n d u c e r s of SOS s y s t e m , l i k e UV a n d

n a l i d i x i c a c i d , can i n d u c e t h e g r o EL a n d d n a K h e a t s h o c k g e n e s ( K r u e g e r

and Wa l ke r , 1984) a nd on t h e o t h e r h a n d some a g e n t s i n d u c i n g t h e a d a p t i v e

r e s p o n s e l i k e MNNG (low d o s e s ) s w i t c h on t h e s y n t h e s i s o f SOS p r o t e i n s a t

h i g h e r r a t e .

T h e s e t h r e e n e t w o r k s a r e p o s i t i v e l y c o n t r o l l e d b y t h e i r own r e g u l a t o r y

e l e m e n t s ; RecA, HtpR a nd Ada r e s p e c t i v e l y . T h e Ad a e l e m e n t d i f f e r s f r o m

t h e RecA in a s e n s e t h a t i t s o v e r p r o d u c t i o n can i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f

a d a p t i v e r e s p o n s e b u t on t h e o t h e r h a n d o v e r p r o d u c t i o n o f R e c A d o e s n o t

i n d u c e SOS r e s p o n s e .

90 -

H eat

EtCH

UV,nal

Agent s

h t pR11 H eat Shock " R esp o n se

■> a t l e a s t 13 genes

(dnaK, groEL, groES, e t c . )

u v , n a l

SOS Re s pons erecA

-> a t l e a s t 15 ge ne sSOS- i nduc i nglexA

(uvrA, umuC, sulA, e t c . )Agen t s

A d a p t i v e Re s pons eada

^ a t l e a s t 2 ge ne sIvfethy l a t i n g

(a l kA, gene f o r m e t h y l t r a n s f e r a s e )

F i g . 12. Thr e e r e g u l a t o r y ne t wo r k s o f E . c o l i t h a t can be i nduce d by a g e n t s t h a t damage ENA.

- 91 -

1 . 7 . T h e p H h o m e o s t a s i s o f t h e b a c t e r i a l c e l l :

In n a t u r e , t h e r e a r e a wi de r a n g e of pH l e v e l s , e x t e n d i n g f r o m pH 1 - 2 in

a c i d i c s u l p h u r s p r i n g s t o pH 11 i n s o d a l a k e s . M i c r o o r g a n i s m s l i v e a n d

g r ow in a l l t h e s e pH v a l u e s , t h o u g h s a n e s p e c i e s h a v e e v o l v e d t o g r o w in

e x t r e m e a c i d i c e n v i r o n m e n t s ( a c i d o p h i l i c ) a n d s ome i n e x t r e m e a l k a l i n e

c o n d i t i o n s ( a l k a l o p h i l i c ) w h i l e o t h e r s w h i c h t o l e r a t e o n l y m i d r a n g e pH

v a l u e s o f 6 - 8 , a r e r e f e r r e d t o a s n e u t r o p h i l i c ; E . c o l i i s a

r e p r e s e n t a t i v e o f t h i s c l a s s . P r o t o n c o n c e n t r a t i o n i s a n i m p o r t a n t

p a r a m e t e r in g o v e r n i n g a number o f b i o l o g i c a l r e a c t i o n s l i k e s o l v o l y s i s ,

i o n i z a t i o n a nd o x i d o r e d u c t i o n ; a s a r e s u l t , b i o l o g i c a l m o l e c u l e s f u n c t i o n

o p t i m a l l y a t a n a r r o w p H r a n g e , m o s t l y c l o s e t o n e u t r a l i t y .

Al l b a c t e r i a h a v e e vo l v e d an e f f e c t i v e m e c h a n i s m of c o p i n g w i t h c h a n g e in

e x t e r n a l pH ( pHQ); by a m e c h a n i s m p o o r l y u n d e r s t o o d t h e y m a i n t a i n

c o n s t a n t i n t e r n a l pH ( p H . ) v a l u e s : 6.5 - 7.0 f o r a c i d o p h i l e s , 7.5 - 8.0

f o r n e u t r o p h i l e s a n d 8 . 4 - 9 . 0 f o r a l k a l o p h i l e s ( I n g r a h a m , 1 9 8 7 ) .

E s c h e r i c h i a c o l i , l i k e o t h e r n e u t r o p h i l e s , h a s e v o l v e d a m e c h a n i s m o f

m a i n t a i n i n g c o n s t a n t i n t e r n a l pH. T h i s was s t u d i e d b y S l o n c z e w s k i et_ a l . ,

31(1981), in a c l a s s i c a l e x p e r i m e n t u s i n g P n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e .

They m e a s u r e d pH^ of n o n - g r o w i n g c e l l s when e x t e r n a l pH was l o w e r e d f r o m

7.55 t o 5.6 f o r a t ime p e r i o d o f 45 m i n a n d t h e n i n c r e a s e d t o 8 . 7 o v e r a

p e r i o d o f 70 m i n . D u r i n g t h e s e c h a n g e s , pH^ r e m a i n e d c l o s e t o t n e pH

c r o s s o v e r (p H cq ) t h e p H a t w n i c h p H Q = p H . v a l u e , v a r y i n g b y t h e

r e l a t i o n s h i p ( p H . - p H ) = k ( p H - p H ). T h e p H . c h a n g e sr r 1 r C O O 1 C O 1

o n l y s l i g h t l y b y t h e l o w e r i n g o r r a i s i n g o f e x t e r n a l p H .

92 -

M a i n t e n a n c e of i n t e r n a l pH i s e s s e n t i a l f o r g r o w t h o f E s c h e r i c h i a c o l i .

When, d u e t o a n e n v i r o n m e n t a l s t r e s s , pH. d r o p s t o 7 . 2 , g r o w t h r a t e i s

r e d u c e d by a f a c t o r of 2 ; g r o w t h s t o p s c o m p l e t e l y on f u r t h e r d e c r e a s i n g

t h e i n t e r n a l p H t o 6 . 6 - 6 . 8 ( B o o t h , 1 9 8 5 ) .

1 . 7 . 1 . P e r t u r b a t i o n o f p H . :

G e n e r a l l y t h e i n t e r n a l pH i s q u i t e s t a b l e and r e m a i n s u n p e r t u r b e d d u e t o

t h e p r o p e r t i e s of t h e c y t o p l a s m i c membr ane whi ch i s i mpe r me a b l e t o p r o t o n s

and o f f e r s low p e r m e a b i l i t y t o c a t i o n s . E v e n w n e n t h e d r i v i n g f o r c e i s

l a r g e , n e t i n f l u x o f p r o t o n s i s l i m i t e d b y t h e c a p a c i t y f o r c a t i o n

e x t r u s i o n .

The m a j o r s o u r c e s o f c y t o p l a s m i c pH p e r t u r b a t i o n a r e : 1. t h e v a l u e of

p HQ, 2. t h e a c i d i c o r b a s i c e n d p r o d u c t s o f m e t a b o l i c p r o c e s s e s a n d

g r o w t h , a n d 3 . t h e s e l e c t i v e u t i l i z a t i o n b y t n e c e l l o f t h e c a t i o n o r

a n i o n c o m p o n e n t o f t h e s a l t p r e s e n t i n t h e m e d i u m a s f o r i n s t a n c e ,

u t i l i z a t i o n o f t h e n i t r a t e a n i o n f r o m t h e m e d i u m c a u s e s pH t o b e c o m er o

m o r e a l k a l i n e ( I n g r a h a m , 1 9 8 7 ; B o o t h , 1 9 8 5 ) .

I n f e r m e n t a t i v e o r g a n i s m s , t h e p r o d u c t i o n a n d a c c u m u l a t i o n o f a c i d i c

f e r m e n t a t i v e p r o d u c t s l e a d s t o p e r t u r b a t i o n of i n t e r n a l pH o e c a u s e p H.

doe s n o t r emain c o n s t a n t i f pHQ i s r e d u c e d in t n e p r e s e n c e o f w e a k a c i d s

( B a r o n o f s k y e t a l . , 1984). Th i s p r o b l e m may b e so a c u t e t h a t t h e o r g a n i s m s

h a v e t o e v o l v e some m e c h a n i s m t o c o n v e r t t h e a c i d i c p r o d u c t s i n t o n e u t r a l

compounds t o o v e r c a n e t h e t o x i c e f f e c t s o f w e a k a c i d s i n t h e c y t o p l a s m .

- 93 -

1 . 7 . 2 . B u f f e r i n g c a p a c i t y o f t h e c e l l :

T h e b u f f e r i n g c a p a c i t y o f t h e b a c t e r i a l c e l l i s c l a s s i f i e d i n t o t w o

c o m p o n e n t s ; Bq , o p e r a t i v e o n t h e s u r f a c e o f t h e i n t a c t c e l l i n

s u s p e n s i o n and B. i s a d e r i v a t i v e v a l u e t h a t i s t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n

t o t a l b u f f e r i n g c a p a c i t y (B^.) of p e r m e a b i 1 i z e d c e l l s ( t r e a t e d , e . g . ,

w i t h 5% n - b u t a n o l o r 10% T r i t o n X - 1 0 0 ) a n d B q ( I n g r a h a m , 1 9 8 7 ) .

1 . 7 . 3 . C o m p o n e n t s o f p H h o m e o s t a s i s s y s t e m :

P o s s i b l e c o m p o n e n t s o f t h e c y t o p l a s m i c pH r e g u l a t i o n s y s t e m i n c l u d e

p r e e x i s t i n g c y t o p l a s m i c b u f f e r s a n d b i o c h e m i c a l p r o d u c t i o n o f H+ o r

OH . The c y t o p l a s m i c b u f f e r s can a v e r t a l i m i t e d a m o u n t o f a c i d i f i c a t i o n

o r a l k a l in i z a t i o n , on t h e c o n t r a r y t h e p r o d u c t i o n o f H + o r OH f r o m

m e t a b o l i s m i s a n e g l e c t e d a r e a , m o r e o v e r t h e r e i s v e r y l i t t l e e v i d e n c e

t h a t t h e y c o n s t i t u t e c o m p o n e n t s o f p H h o m e o s t a s i s s y s t e m .

1 . 7 . 4 . M e c h a n i s m o f m a i n t a i n i n g p H h o m e o s t a s i s :

The p r e c i s e m e c h a n i s m by wh i c h t h e c e l l m a i n t a i n s i t s pH h o m e o s t a s i s i s

no t f u l l y u n d e r s t o o d b u t p o s s i b l y a number of f a c t o r s a r e r e s p o n s i b l e f o r

s e t t i n g t h e p H ^ . Among t h e s e a r e t h e b u f f e r c a p a c i t y o f t h e c e l l , t h e

o u t w a r d t r a n s p o r t of p r o t o n s a s s o c i a t e d w i t h r e s p i r a t i o n o r h y d r o l y s i s of

ATP, and e l e c t r o n e u t r a l a n t i p o r t s y s t e m s t h a t e x c n a n g e p r o t o n s f o r c e r t a i n

c a t i o n s , p a r t i c u l a r l y N a + a n d K + .

94 -

1 . 7 . 4 . a . A N a + / H + a n t i p o r t e r i n r e g u l a t i o n o f i n t e r n a l p H :

An e l e c t r o n e u t r a l Na / H a n t i p o r t e r (NHA) w i l l b e d r i v e n b y t h e

ApH (ApH = pH. - p H Q) i n i t i a l l y f o r m e d b y t h e p r o t o n p u m p s : Na +

w i l l b e e x t r u d e d a n d H+ w i l l b e r e t u r n e d t o t h e c e l l . I f t h e r a t e o f

suc h an a n t i p o r t e r i n c r e a s e s w i t h pH i t c ou l d a c c o u n t f o r t h e d e c r e a s e in

t h e ApH o b s e r v e d . At e x t e r n a l pH 7.6, i t c a n e x p l a i n t h e z e r o ApH, i f t h e

b a c k l e a k o f p r o t o n s v i a t h e a n t i p o r t e r e q u a t e s t h e p r i m a r y p r o t o n

e x t r u s i o n r a t e ( P a d a n e t a l . , 1 9 7 6 ) .

1 . 7 . 4 . b . A K + / H + a n t i p o r t e r i n r e g u l a t i o n o f c y t o p l a s m i c p H :

T h e K / H a n t i p o r t (KHA) a p p e a r s e l e c t r o n e u t r a l o v e r p H 7 - 9 a n d i s

l e s s s p e c i f i c t h a n t h e N a + / H + a n t i p o r t e r s i n c e i t a n t i p o r t s K + ,

N a + , L i + , R b + a n d T I + . T h e a c t i v i t y o f KHA i s o p t i m a l a t p H 8

( Brey e t a l . , 1980). I t h a s be e n s u g g e s t e d t h a t t h e p r o n o u n c e d a l k a l i n e pH

o p t i m u m o f KHA w i l l r e g u l a t e i t s f u n c t i o n i n a c c o r d a n c e w i t h t h e

e x t e r n a l p H.

T h e NHA a n d KHA a r e t h e m a j o r c a n d i d a t e s f o r a f f e c t i n g c o n t r o l l e d

a c i d i f i c a t i o n of c y t o p l a s m and t h e r e b y h o m e o s t a s i s of pH i n E . c o l i . T h o u g h

t h e r e i s i n d i r e c t e v i d e n c e t h a t e a c h o f t h e s e s y s t e m p a r t i c i p a t e i n

c o n t r o l l i n g c y t o p l a s m i c pH (Booth , 1985), t h e r e i s n o p r o o f t h a t e i t h e r of

t h e m i s t h e c o n t r o l l i n g m e c h a n i s m ( I n g r a h a m , 1 9 8 7 ) .

1 . 7 . 5 . S e n s i t i v i t y o f En t e r o b a c t e r i a a t a c i d i c p H :

E n t e r o b a c t e r i a , s u c h a s E s c h e r i c h i a c o l i , f a c e many p h y s i c a l a n d c h e m i c a l

95 -

e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s a nd a c i d i t y i s a m o n g s t t h e m . In t h e b o d y , g a s t r i c

a c i d ( ca pH 2 - 3 ) r e d u c e s t h e number of i n g e s t e d b a c t e r i a b o t h h a r m l e s s

a n d p o t e n t i a l l y p a t h o g e n s . S e c o n d l y , t h e u p p e r i n t e s t i n a l t r a c t i s

g e n e r a l l y m i l d l y a c i d a nd t h i s i n c o n j u n c t i o n w i t h w e a k f a t t y a c i d s c a n

k i l l e n t e r o b a c t e r i a (Lee a nd Gerrmel l , 1972). T h i r d l y , t h e o r g a n i s m s c a n b e

d a m a g e d o r p r o b a b l y k i l l e d b y a c i d , i n t h e r a n g e o f 3 . 5 - 5 . 0 , o f t h e

p h a g o l y s o s o m e (Mims 1 9 7 2 ; J e n s e n a n d B a i n t o n , 1973 ) . F i n a l l y , p o t e n t i a l

p a t h o g e n s h a v e t o r e s i s t a c i d i n t h e v a g i n a , w h e r e p H v a l u e s o f

a p p r o x i m a t e l y 5.0 - 5.5 a r e p r o d u c e d b y c o m m e n s a l L a c t o b a c i l l i , a n d in

u r i n e , w h e r e s i m i l a r p H v a l u e s a r e f o u n d .

O u t s i d e t h e an imal body , b a c t e r i a a r e e x p o s ed t o a c i d i c c o n d i t i o n s i n a c i d

m i n e w a t e r , i n r i v e r s a n d l a k e s a f f e c t e d b y a c i d r a i n ( D o u b l e a n d

B i s s o n e t t e , 1 9 8 0 ) , a n d i n s e w a g e p l a n t s r e c e i v i n g c e r t a i n w a s t e s . S u c h

e x p o s u r e s c a n a l s o o c c u r i n s ome f o o d p r o c e s s i n g t r e a t m e n t s ( O k r e n d

e t a l . , 1 986 ; R o t h a n d K e e n a n , 1971 ; F r e e s e e t a l . , 1973 ; E k l u n d , 1980)

a n d , f o r s o m e o r g a n i s m s , i n a c i d f o o d s ( M i n o r a n d M a r t h , 1 9 7 2 ) .

I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t Col V b e a r i n g s t r a i n s o f E . c o l i w e r e m o r e

s e n s i t i v e t o a c i d pHs o f 2.5 - 3.5 t h a n t h e i r c o u n t e r p a r t Col V c e l l s

( C o o p e r a n d R o w b u r y , 1986) . M o r e o v e r , w h e n t h e o r g a n i s m s ( Co l V a n d

ColV ) we r e a d h e r i n g t o g l a s s b e a d s , t h e y s h o w e d g r e a t e r r e s i s t a n c e t o

t h e k i l l i n g e f f e c t of pHs 2.5 - 3.5 t h a n t h e i r c o r r e s p o n d i n g u n a t t a c h e d

c e l l s ( P o y n t e r e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e i n c r e a s e d r e s i s t a n c e o f a t t a c h e d

o r g a n i s m s t o pH 2.5 may a l l ow t h e s u r v i v a l o f o r g a n i s m s a t t a c h e d t o t h e

f o o d i n g a s t r i c a c i d .

96 -

1 . 7 . 6 . S e n s i t i v i t y t o o r g a n i c a c i d s / p r e s e r v a t i v e s :

Chemica l food p r e s e r v a t i v e s ( s o r b a t e , b e n z o a t e , p r o p i o n a t e , a c e t a t e , a n d

l a c t a t e ) h a v e be e n u s e d w i d e l y d u r i n g t h e g r e a t e r p a r t o f t h i s c e n t u r y .

Most of t h e s e food a d d i t i v e s i n h i b i t t h e g r o w t h o f u n w a n t e d o r g a n i s m s ,

u s u a l l y w i t h o u t k i l l i n g t h e m a n d a r e i n g e s t e d b y h u m a n s w i t h o u t a n y

a p p a r e n t t o x i c i t y ( F r e e s e e t a l . , 1 9 7 3 ) .

In b a c t e r i a , t h e we a k a c i d t r a v e r s e s t h e m e m b r a n e i n i t s u n d i s s o c i a t e d

f o r m and d i s s o c i a t e s in a c c o r d a n c e w i t h t h e i n t r a c e l l u l a r pH, l i b e r a t i n g a

p r o t o n i n t h e c y t o p l a s m . W h e n ApH i s l a r g e , t h e a m o u n t o f a c i d

d i s s o c i a t i n g in t h e c y t o p l a s m i s c o r r e s p o n d i n g l y l a r g e r . C o n s e q u e n t l y , t h e

p o t e n t i a l e f f e c t o f t h e w e a k a c i d a c c u m u l a t i o n o n i n t r a c e l l u l a r p H

i n c r e a s e s a s p H i s l o w e r e d ( S a l m o n d e t a l . , 1 9 8 4 ) .o --------

T o x i c i t y o f o r g a n i c a c i d s w a s s t u d i e d b y S i n h a , ( 19 8 6 ) , w h e r e t h e w i l d

t y p e s t r a i n a nd f o u r r e p a i r - d e f i c i e n t s t r a i n s ( u v r A 6 , u v r B 5 , anc*

p o l A l ) o f E . c o l i , i n t h e i r s t a t i o n a r y g r o w t h p h a s e , w e r e e x p o s e d t o

o r g a n i c a c i d s ( a c e t i c a c i d , l a c t i c a c i d a n d p - a m i n o b e n z o i c a c i d ) a t pH

3.5. The s e n s i t i v i t y e x h i b i t e d by t h e po l A s t r a i n was much h i g h e r t h a n i t s

i s o g e n i c p o l + d e r i v a t i v e s .

1 . 7 . 7 . M e c h a n i s m o f i n h i b i t i o n :

E x p o s u r e t o l e t h a l a c i d i t y , in t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f w e a k a c i d s , m a y

damage o r k i l l by a f f e c t i n g s e v e r a l s i t e s in t h e b a c t e r i a l c e l l . S h e u a n d

F r e e s e ( 19 7 2 ) , s h o w e d t h a t b a c t e r i a l o x y g e n u p t a k e a n d g r o w t h w e r e

97 -

i n h i b i t e d by weak a c i d s . In 1973 , F r e e s e e t a l . , d e m o n s t r a t e d t h a t w e a k

a c i d a t low pH i n h i b i t s m i c r o b i a l g r o w t h a nd t h e y t r a c e d t h e i n h i b i t i o n t o

a f a i l u r e of a c t i v e t r a n s p o r t . S e c o n d l y , e n t e r o b a c t e r i a l c e l l s e x p o s e d t o

i n o r g a n i c a c i d o r t o a r a n g e o f w e a k o r g a n i c a c i d s a t l ow pH a p p e a r t o

s u f f e r o u t e r m e m b r a n e d a m a g e , b e c o m i n g s e n s i t i v e t o a r a n g e o f a g e n t s

w h i c h f a i l t o c r o s s t h e o u t e r m e m b r a n e o f u n t r e a t e d c e l l s ( R o t h a n d

K e e n a n , 1971 ; P r z y b y l s k i a n d W i t t e r , 1 9 7 9 ) . A t h i r d m a j o r f a c t o r i n

k i l l i n g by a c i d pH, in t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f w e a k a c i d s , a p p e a r s t o

b e d a m a g e t o DNA ( S i n h a , 1 9 8 6 ; R a j a e t a l . , 1 9 9 1 b ) .

1 . 7 . 8 . S e n s i t i v i t y t o h y d r o g e n p e r o x i d e :

H y d r o g e n p e r o x i d e i s a s t r o n g o x i d i z i n g a g e n t and i s a b l e t o i n a c t i v a t e a

w i d e v a r i e t y o f m i c r o - o r g a n i s m s . B r i e f e x p o s u r e ( 1 0 m i n ) o f

E s c h e r i c h i a c o l i t o low c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n p e r o x i d e ( 0 .01 M), a t

25 °C r e s u l t s i n i n d u c t i o n o f a s u b s t a n t i a l n u m b e r o f s i n g l e s t r a n d e d

(SS) d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d b r e a k s ( A n a n t h a s w a m y a n d E i s e n s t a r k , 1977) .

S u b s e q u e n t l y , H a g e n s e e a nd Moses , ( 1986 ) , r e p o r t e d DNA d a m a g e o f i n t a c t

E s c h e r i c h i a c o l i b y h y d r o g e n p e r o x i d e .

1 . 7 . 9 . R e c o v e r y o f i n j u r e d c e l l s :

P r e s e n t l y , f r e q u e n t u s a g e o f o r g a n i c a c i d s a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h

o t h e r p h y s i c a l a nd c he mi c a l a g e n t s in f ood i n d u s t r y , c a u s e e i t h e r d a m a g e

t o t h e e x i s t i n g m i c r o b i a l p o p u l a t i o n o r m a k e c o n d i t i o n s u n s u i t a b l e f o r

u n w a n t e d m i c r o - o r g a n i s m s . In a s i t u a t i o n whe n s u b l e t h a l ( a c i d ) s t r e s s i s

a p p l i e d t o a b a c t e r i a l p o p u l a t i o n , t h i s m a y c a u s e i n j u r y t o t h e

98 -

m i c r o b i a l c e l l s . The i n j u r e d o r g a n i s m s ma y r e c o v e r , i f t h e a c i d - s t r e s s i s

removed, a nd t h e y may f o r m c o l o n i e s on low s t r e s s - m e d i a b u t b e u n a b l e t o

f o r m c o l o n i e s o n s t r e s s i n g - m e d i a ( P r z y b y l s k i a n d W i t t e r , 1 9 7 9 ) .

When E s c h e r i c h i a c o l i K-12 c u l t u r e s w e r e t r e a t e d w i t h a c i d i c 0.3 M s o d i u m

a c e t a t e b u f f e r , t h e e x t e n t of b o t h d e a t h a nd i n j u r y o f a c i d - t r e a t e d c e l l s

i n c r e a s e d w i t h d e c r e a s i n g pH. I n j u r e d c e l l s w e r e a b l e t o r e c o v e r t h e i r

c o l o n y - f o r m i n g a b i l i t y i n t h e r e c o v e r y m e d i u m . T h e r e c o v e r y w a s n o t

a f f e c t e d by t h e p r e s e n c e of i n h i b i t o r s o f p r o t e i n , c e l l w a l l , DNA, o r RNA

s y n t h e s i s ( P r z y b y l s k i a n d W i t t e r , 1 9 7 9 ) .

A l k a l i - i n j u r e d c e l l s w e r e f o u n d t o r e c o v e r w h e n i n c u b a t e d a t 37 ° C f o r

2 h r in 0.05 M p h o s p h a t e b u f f e r of pH 8.0, w h e r e a s no s u c h l i q u i d h o l d i n g

r e c o v e r y was o b s e r v e d in r e c A a n d l e x A m u t a n t s . R e c o v e r y i n p h o s p h a t e

b u f f e r w a s n o t a f f e c t e d b y m e t a b o l i c i n h i b i t o r s ( M u s a r r a t a n d Ah m a d ,

1 9 8 8 ) .

1 . 7 . 1 0 . R e p a i r r e s p o n s e o f a c i d / H^O^ - d a m a g e d E . c o l i :

The l e s i o n s i n d u c e d in c e r t a i n r e p a i r m u t a n t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i ,

c a u s e d by o r g a n i c a c i d s , w e r e n o t e f f i c i e n t l y r e p a i r e d , w h i c h r e s u l t e d in

g r e a t e r k i l l i n g o f c e l l s i n c o n t r a s t w i t h t h e w i l d t y p e . M o r e o v e r , t h e

i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f t h e p o l A m u t a n t c o m p a r e d w i t h w i l d - t y p e

E s c h e r i c h i a c o l i s u g g e s t e d t h a t po l A g e n e p r o d u c t was n e c e s s a r y f o r r e p a i r

r e s p o n s e ( S i n h a , 1 9 8 6 ) .

The h y d r o g e n p e r o x i d e i n d u c e d s i n g l e s t r a n d e d b r e a k s in E s c h e r i c h i a c o l i

99 -

w e r e r e p a i r e d on l y t o a smal l e x t e n t in p o l Al , r ec A r e c B a nd r e c A m u t a n t s .

The r e p a i r i s pol_A+ a nd r e c A + d e p e n d e n t ( A n a n t h a s w a m y a n d E i s e n s t a r k ,

1 9 7 7 ) .

The r e p a i r of E s c h e r i c h i a c o l i DNA, d a m a g e b y h y d r o g e n p e r o x i d e , t a k e s

p l a c e b y a n i n c i s i o n r e p a i r p a t h w a y t h a t r e q u i r e s DNA p o l y m e r a s e I

( H a g e n s e e a n d M o s e s , 1 9 8 6 ) .

1 . 7 . 1 1 . H a b i t u a t i o n t o a c i d s t r e s s :

E x p o s u r e t o c e r t a i n s t r e s s e s a t a s u b - l e t h a l l e v e l ( a n a d a p t i v e d o s e )

h a b i t u a t e s t h e o r g a n i s m a l l o w i n g i t s u b s e q u e n t l y t o w i t h s t a n d l e t h a l

l e v e l s of t h e s t r e s s ( t h e c h a l l e n g e dose ) . S u c h p h e n o m e n a h a v e b e e n b e s t

s t u d i e d w i t h r e s p e c t t o o x i d a t i v e s t r e s s ( De m p l e a n d H a l b r o o k , 1983) a n d

h e a t s t r e s s (Yamamori a nd Yur a , 1982; M a c k e y a n d D e r r i c k , 1987) a l t h o u g h

s i m i l a r phe nome na may o c c u r f o r e t h a n o l a nd m e t a l ion s t r e s s ( K h a z a e l i a n d

M i t r a , 1 9 8 1 ; M i c h e l a n d S t a r k a , 1 9 8 6 ) .

E n t e r o b a c t e r i a can f a c e e x p o s u r e t o e x t r e m e s of a c i d i t y in many s i t u a t i o n s

in t h e n a t u r a l e n v i r o n m e n t , in food o r in t h e a n i m a l b o d y . In t h e n a t u r a l

e n v i r o n m e n t , e x p o s u r e t o a c i d i t y f r o m i n d u s t r i a l o r a g r i c u l t u r a l s o u r c e s

i s common a n d c a n o c c u r i n w a t e r o r i n s o i l ( R o w b u r y e t a l . , 1 9 8 9 ) .

B e c a u s e s u c h e x p o s u r e s u s u a l l y i n v o l v e t h e p e r i o d i c r e l e a s e o f w a s t e s o r

s l u r r i e s , o r g a n i s m s f r e q u e n t l y f a c e a c i d i t y wh i c h g r a d u a l l y i n c r e a s e s t o a

p o t e n t i a l l y l e t h a l ma x i mu m . T h e g r a d u a l i n c r e a s e i n a c i d i t y c a n a l l o w

i n d u c e d a c i d r e s i s t a n c e ( h a b i t u a t i o n t o a c i d ) t o o c c u r w h i c h p e r m i t s

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s t o s u r v i v e s u b s e q u e n t e x p o s u r e s wh i c h a r e l e t h a l t o

100

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s (Rowbury e t a l . , 1989) . P r e - e x p o s u r e t o m i l d a c i d i t y

in w a t e r o r s o i l may a l l ow o r g a n i s m s t o s u b s e q u e n t l y s u r v i v e in a c i d f o o d s

o r i n a n i m a l b o d y .

H a b i t u a t i o n i n v o l v e s a p h e n o t y p i c c h a n g e i n o r g a n i s m s e x p o s e d t o m i l d

a c i d i t y wh i c h g a i n a c i d r e s i s t a n c e a f t e r a f ew m i n u t e s e x p o s u r e t o pH 5.0

(Raja e t a l . , 1 9 9 1 a ) . S u c h i n d u c t i o n o f a c i d r e s i s t a n c e i s d e p e n d e n t on

p r o t e i n s y n t h e s i s a n d a t l e a s t 14 p r o t e i n s a r e i n d u c e d a t p H 5 . 0

( R a j a e t a l . , 1 9 9 1 a ) .

101 -

1 . 8 . A i m s o f t h i s s t u d y :

E s c h e r i c h i a c o l i i s a m u l t i p o t e n t p a t h o g e n t h a t h a s e v o l v e d t h e a b i l i t y t o

c a u s e no t on l y g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t i n f e c t i o n s b u t a l s o e x t r a i n t e s t i n a l

i n f e c t i o n o f h u m a n s ( s e e s e c t i o n s 1 . 5 . 1 . 1 a n d 1 . 5 . 2 ) . T h e o r g a n i s m s c a n

c a u s e P u b l i c He a l t h p r o b l e m s on e n t e r i n g i n t o food c h a i n a s a c o n t a m i n a n t .

T h e s i g n i f i c a n c e o f s u c h f o o d c o n t a m i n a t i o n d e p e n d s u p o n b a c t e r i a l

p a t h o g e n i c i t y a nd a ma j o r f a c t o r wh i ch i n c r e a s e s p a t h o g e n i c i t y i s p l a s m i d

c a r r i a g e (Smi th , 1974). The p r e s e n c e of weak a c i d a t low pH i n h i b i t g r o w t h

and s u r v i v a l of e n t e r o b a c t e r i a a n d a c c o r d i n g l y , n a t u r a l l y a c i d f o o d s o r

a c i d u l a t e d o n e s s h o u l d b e f r e e f r o m p a t h o g e n s .

T h e r e f o r e , t h i s p r o j e c t w a s u n d e r t a k e n t o i n v e s t i g a t e t h e f o l l o w i n g :

a . S u s c e p t i b i l i t y o f C o l V + a n d C o l V s t r a i n s t o a c i d i n h i b i t o r s .

b. Acid s e n s i t i v i t y of ED1829ColV, I -K94 h a b i t u a t e d o r g a n i s m s c o m p a r e d w i t h

t h a t o f n o n - h a b i t u a t e d c e l l s .

c . P o s s i b l e f a c t o r r e s p o n s i b l e i n d e v e l o p m e n t o f a c i d - r e s i s t a n c e o f

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s .

d . A c i d - s e n s i t i v i t y o f DNA f r o m h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d c e l l s .

e . I n h i b i t i o n o f a c i d - h a b i t u a t i o n .

102 -

2. M a t e r i a l s a n d M e t h o d s

2 . 1 . B a c t e r i a l s t r a i n s :

The g e n o t y p e s of b a c t e r i a l s t r a i n s a nd p l a s m i d s u s e d d u r i n g t h e s t u d y a r e

p r e s e n t e d in T a b l e s 6 and 7. The c u l t u r e s w e r e m a i n t a i n e d on n u t r i e n t a g a r

(NA) a t 4 ° C a n d s u b c u l t u r e d a t m o n t h l y i n t e r v a l s .

2 . 2 . M e d i a :

Gxoid N u t r i e n t B r o t h No.2 (NB) was u s e d a t 25 g / 1 a s a g r o w t h m e d i u m i n

mos t of t h e e x p e r i m e n t s . I t s pH w a s a d j u s t e d b y t h e a d d i t i o n o f HC1, t o

r e q u i r e d v a l u e s , w h e r e n e e d e d . In scxne c a s e s , t h i s m e d i u m w a s m a d e u p i n

0.1 M pH 7.5 p h o s p h a t e b u f f e r , f o r s t u d i e s o f r e c o v e r y o f i n j u r e d

o r g a n i s m s .

S o l i d med i um was p r e p a r e d by t h e a d d i t i o n o f 2% D i f c o B a c t o A g a r t o t h e

NB. Where a p p r o p r i a t e , s o d i u m d e o x y c h o l a t e w a s a d d e d t o NA a t 0.5% f o r

s e l e c t i o n o f u n d a m a g e d o r g a n i s m s . M e d i u m s e l e c t i v e f o r a n t i b i o t i c

r e s i s t a n t o r g a n i s m s was made by t h e a d d i t i o n of 2 0 jug/ml t e t r a c y c l i n e a n d

150 ^ g / m l a m p i c i l l i n ; t h e s e a d d i t i o n s w e r e m a d e t o t h e m o l t e n s t e r i l i z e d

a g a r a f t e r c o o l i n g t o 55 ° C .

2 . 3 . G r o w t h c o n d i t i o n s :

O v e r n i g h t c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d by g r o w i n g t h e b a c t e r i a l c e l l s i n NB of

r e q u i r e d p H , a t 37 ° C u n d e r s h a k i n g c o n d i t i o n s . F o r e x p o n e n t i a l

c u l t u r e s , t h e o v e r n i g h t g r own c e l l s w e r e d i l u t e d i n t o f r e s h NB o f r e q u i r e d

p H a n d i n c u b a t e d w i t h s h a k i n g , a t 37 ° C , f o r 2 - 3 h r .

1 0 3 -

T a b le 6 : C h a r a c t e r i s t i c s o f E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s .

S t r a i n G e n o t y p e / p r o p e r t i e s R e f e r e n c e o r s o u r c e

AB1157r

t h r , l e u , t h i , a r a , s t r a r g , x y l , l ac Y , h i s

Bachmann (1987)

EDI 82 9 ILP F i n n e g a n and W i l l e t t s (1971)

DP1152 t r p , r h a , l a c Z , s t r p o l A l .

Dr . R . P i n n e y

AB2463 t h r , l e u , p r o , h i s , t h i , a r g , r e c - 1 3 .

H o w a r d - F l a n d e r s , P . (1968)

P678-54 t h r , l e u , t h i , l a c Y,a r a , x y l , m i n i c e l l p r o d u c e r

A d l e r e t a l . , (1967)

P678-54 cmpA 2101 (RJR. 200)

cmpA m u t a n t o f P678-54 Th i s l a b o r a t o r y .

GW1000 r ecA441 , s u l A l l , l a c U 1 6 9 , t h r - 1 , l e u - 6 , h i s - 4 , a r g E 3 , i 1v ( t s ) , g a l K 2 , rpsL31

Kenyon and Walker ( 1980 ) .

GW1060 As GW1000, b u t u v r A 2 1 5 : : , M i d ( Ap , l a c )

Kenyon and Walke r ( 1981 ) .

s t r ; s t r e p t o m y c i n ,a r a ; a r a b i n o s e , a r g ; a r g i n i n e , g a l ; g a l a c t o s e , h i s ; h i s t i d i n e ,l a c ; l a c t o s e , l e u ; l e u c i n e , l y s ; l y s i n e , t h i ; t h i a m i n e , t r p ; t r y p t o p h a n ,r h a ; r hamnose , x y l ; x y l o s e

- 104 -

aip: am

piciilin

, cap:

chloramphenicol,

kan: kanarnycin,

str: strep

tomycin,

suf :

sulphat’urazo

]e, tet

: tetracy

cline

< OO CO » i v ro —i so ro I I* 3£

v

SVjc\>tv

0)3a

S5 S’o —

^ cui-» 3vO Q- ■v]vO

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C I O + 3 C w 0 r+- C‘-* '1 r+ » 0 CO C M- •-«<• * i—1 • • ■ p+- U3 CO o c «-+■

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C I « * 3 r+ -s o COr-M C 1 P r+ ft) o P 1-T-, •

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ft) 1 CO * P3 1 P *■*> < B- i 3 C 3

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CO

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FCD•-*»0)*"SO3O0)O

Hcr

0)a

3CL

3"0)

2 . 4 . M e a s u r e m e n t o f o p t i c a l d e n s i t y :

O p t i c a l d e n s i t y o f t h e c u l t u r e s i n NB w a s m e a s u r e d w i t h a H i l g e r

p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r u s i n g a 5 50 n m f i l t e r . A r e a d i n g o f 0 . 1

c o r r e s p o n d e d t o c a . 1 0 0 ju g d r y w e i g h t o r g a n i s m s / m l .

2 . 5 . M e a s u r e m e n t o f v i a b l e c o u n t :

The v i a b l e c e l l n u mb e r w a s d e t e r m i n e d b y p l a t i n g 0.1 ml o f a p p r o p r i a t e

d i l u t i o n of a s a m p l e , p r e p a r e d b y s e r i a l d i l u t i o n i n 0.85% ( w / v ) s a l i n e ,

o n a s u i t a b l e m e d i u m s u r f a c e . T h e c o l o n i e s w e r e c o u n t e d a f t e r

24 - 48 h r i n c u b a t i o n a t 37 ° C . P e r c e n t a g e s u r v i v a l o f t h e c e l l

p o p u l a t i o n t r e a t e d w i t h t h e i n h i b i t o r y a g e n t s was d e t e r m i n e d by u s i n g t h e

f o r m u l a b e l o w ;

% s u r v i v a l = V i a b l e c e l l n u m b e r s o f t r e a t e d p o p u l a t i o n x 1 0 0

V i a b l e c e l l c o u n t s f o r u n t r e a t e d p o p u l a t i o n

2 . 6 . H a b i t u a t i o n o f E . c o l i t o a c i d p H :

ED1829ColV, I -K94 c e l l s , g r o w n o v e r n i g h t i n NB o f p Hs 7.0 a n d 5 . 0 , w e r e

d i l u t e d r e s p e c t i v e l y i n t o f r e s h NB o f p Hs 7.0 a n d 5 . 0 , a n d g r o w n t o

l o g a r i t h m i c p h a s e f o r a p e r i o d o f 2 - 3 h r a t 37 ° C , u n d e r s h a k i n g

c o n d i t i o n s , t i l l t h e i r O.D r e a c h e d b e t w e e n 0.2 - 0 . 3 . T h e m i l d a c i d pH l e d

1 0 6 -

t o h a b i t u a t i o n , t h e r e f o r e , p H 5 . 0 g r o w n c e l l s w e r e r e f e r r e d t o a s

h a b i t u a t e d and pH 7.0 c e l l s a s n o n - h a b i t u a t e d . T h e s e o r g a n i s m s w e r e u s e d

l a t e r on f o r u n d e r t a k i n g f u r t h e r e x p e r i m e n t a t i o n f o r i n v e s t i g a t i o n of

v a r i o u s a s p e c t s o f t h i s p h e n o t y p i c a 11 y e x p r e s s e d p h e n o m e n o n .

2 . 7 . E f f e c t o f h a b i t u a t i o n o n r e s i s t a n c e o f E . c o l i t o a c i d p H :

The h a b i t u a t e d a nd n o n - h a b i t u a t e d c e l l s ( s e e a b o v e 2.6) w e r e e x p o s e d t o a n

a p p r o p r i a t e a c i d pH v a l u e , wi t h ( whe r e r e q u i r e d ) a s u i t a b l e c o n c e n t r a t i o n

of an i n h i b i t o r , i n NB, w i t h a e r a t i o n a t 37 °C. S a m p l e s w e r e w i t h d r a w n

a t i n t e r v a l s a nd a t t h e e n d o f t h e t r e a t m e n t t i m e , n e u t r a l i z e d i n 0 .02M

T r i s - H C l b u f f e r pH 7.0, a nd p l a t e d on NA, a f t e r s e r i a l d i l u t i o n o f s a m p l e s

in 0.85% ( w / v ) N a C l . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 37 ° C f o r 24 h r a n d

t h e v i a b l e c o u n t was u s e d f o r e s t i m a t i o n o f p e r c e n t a g e s u r v i v a l o f a c i d

t r e a t e d p o p u l a t i o n s c o m p a r e d w i t h u n t r e a t e d c o n t r o l s a s e x p l a i n e d i n

s e c t i o n 2 . 5 .

2 . 8 . C o l i c i n p r o d u c t i o n t e s t :

The s t r a i n s t o be t e s t e d f o r c o l i c i n p r o d u c t i o n w e r e s t r e a k e d on NA p l a t e s

c o n t a i n i n g 0.065 M p h o s p h a t e (pH 7.4) f o l l o w i n g t h e m e t h o d o f R o w b u r y a n d

Hi cks (1987) a nd i n c u b a t e d a t 37 ° C o v e r n i g h t . T h e p l a t e s w e r e e x p o s e d

t o c h l o r o f o r m v a p o u r f o r 15 min a nd t h e v a p o u r w a s a l l o w e d t o e v a p o r a t e

f o r 15 min. A f t e r o v e r l a y i n g w i t h 5 ml o f s o f t a g a r c o n t a i n i n g 0.2 ml of

1 0 7 -

o v e r n i g h t c u l t u r e of s e n s i t i v e c e l l s , p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 18 - 24 h r

b e f o r e e x a m i n i n g z o n e s f o r g r o w t h i n h i b i t i o n ( F i g u r e 13) b y t h e Co l V+

s t r a i n .

2 . 9 . S e n s i t i v i t y o f t h e o r g a n i s m s t o p u t a t i v e i n h i b i t o r y a g e n t s :

ED1829 a nd ED1829ColV, I -K94 we r e g r own e x p o n e n t i a l l y f o r 2 - 3 h r and t he n

t r e a t e d w i t h v a r i o u s i n h i b i t o r y a g e n t s a t a r e q u i r e d pH f o r an a p p r o p r i a t e

l e n g t h o f t i m e w i t h s h a k i n g , a t 37 ° C . T h e t r e a t e d c u l t u r e s w e r e

n e u t r a l i z e d i n t o f r e s h NB a n d p e r c e n t a g e s u r v i v a l w a s e s t i m a t e d a s

e x p l a i n e d i n s e c t i o n 2 . 5 .

2 . 1 0 . S e n s i t i v i t y t o h y d r o g e n p e r o x i d e :

Acid h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d c e l l s of e x p o n e n t i a l p h a s e ( s e e s e c t i o n

2.6) w e r e s u b j e c t e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n p e r o x i d e , a t

37 °C w i t h a e r a t i o n f o r an a p p r o p r i a t e l e n g t h o f t i m e . In t h e s a m e w a y ,

t h e p a n d p o r g a n i s m s w e r e e x p o s e d t o t h e p u t a t i v e a g e n t . T h e

t r e a t e d c u l t u r e s w e r e n e u t r a l i z e d w i t h f r e s h NB c o n t a i n i n g 10 yUg/ml

c a t a l a s e a n d p e r c e n t a g e s u r v i v a l w a s e s t i m a t e d a s d e s c r i b e d i n

s e c t i o n 2 . 5 .

2 . 1 1 . S e n s i t i v i t y t o u r e a :

ColV+ a nd ColV s t r a i n s o f e x p o n e n t i a l p h a s e w e r e t r e a t e d w i t h u r e a a t

37 ° C i n NB w i t h a e r a t i o n f o r d i f f e r e n t t i m e l e n g t h s a n d p e r c e n t a g e

s u r v i v a l w a s d e t e r m i n e d ( s e e s e c t i o n 2 . 5 ) .

1 0 8 -

Fle. o , o .14 C o l V s t r a i n w h e r e a s i t s m u t a n t s e n s i t i v e c e l l s .

1 0 9

2 . 1 2 . S e n s i t i v i t y t o w e a k a c i d s :

P e r c e n t a g e s u r v i v a l of t h e a c i d h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d a n d o f t h e

C o l V + , v e r s u s C o l V o r g a n i s m s w a s s t u d i e d a f t e r t r e a t i n g t h e

e x p o n e n t i a l l y g r own c e l l s w i t h 50 mM c o n c e n t r a t i o n o f t h e f o l l o w i n g f a t t y

a c i d s ; b u t y r i c a c i d , a c e t i c a c i d , l a c t i c a c i d a n d s u c c i n i c a c i d i n NB, a t

p H 4 . 5 , f o r 2 . 5 a n d 3 . 5 h r , a t 37 ° C , w i t h s h a k i n g . E x p o s u r e t o

p r o p i o n i c a n d f o r m i c a c i d s w a s d o n e i n t h e s a m e w a y e x c e p t t h a t

c o n c e n t r a t i o n s w e r e 60 a n d 65 mM r e s p e c t i v e l y . T h e t r e a t e d c e l l s w e r e

n e u t r a l i z e d b y d i l u t i n g w i t h f r e s h NA f o r e s t i m a t i o n o f p e r c e n t a g e

s u r v i v a l o n NA a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 2 . 5 .

2 . 1 3 . M o t i 1 i t y :

T h e m o t i l i t y o f e x p o n e n t i a l l y g r o w n h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

o r g a n i s m s was s t u d i e d in m i c r o s l i d e c a p i l l a r i e s (Cam l a b . , C a m b r i d g e ) . T h e

e x p o n e n t i a l c u l t u r e s o f E D I 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 w e r e o b t a i n e d a s d e s c r i b e d in

s e c t i o n 2.6, wh i l e t h e pHs of t h e o r g a n i s m s w e r e a d j u s t e d t o 3 . 0 , 3.5 a n d

4.0 by a p p r o p r i a t e a d d i t i o n of NB of l ower ed pH v a l u e s . The o r g a n i s m s w e r e

d r a wn i n t o t h e m i c r o s l i d e of p a t h l e n g t h 0.2 mm, t h r o u g h c a p i l l a r y a c t i o n

and m o t i l i t y was o b s e r v e d a t i n t e r v a l s a t t h e l i q u i d / a i r i n t e r f a c e , u n d e r

X40 o b j e c t i v e u s i n g t h e p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e , a t r o o m t e m p e r a t u r e ,

f o r b o t h t y p e s of c u l t u r e . P e r c e n t a g e m o t i l i t y was c h e c k e d by c o u n t i n g t h e

m o t i l e b a c t e r i a o u t o f a t l e a s t 1 0 0 c e l l s .

2 . 1 4 . N e g a t i v e c h e m o t a x i s :

| The n e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e , of e x p o n e n t i a l l y g r o w n h a b i t u a t e d a n di

- 1 1 0 -

n o n - h a b i t u a t e d ED1829ColV,I-K94, wa s d e t e r m i n e d a f t e r t h e c u l t u r e s w e r e

p r e p a r e d by t h e me t h o d e x p l a i n e d i n s e c t i o n 2 .6 . T h e c e l l s w e r e w a s h e d

t w i ce w i t h 0.85% (w/v) NaCl a t room t e m p e r a t u r e , s u s p e n d e d e v e n l y i n a g a r

a t 50 ° q (0.3% in p h o s p h a t e b u f f e r pH 7.0 + 10 mM EDTA) a c c o r d i n g t o T s o

a nd A d l e r , (1974). P e t r i d i s h e s w e r e p o u r e d a n d a f t e r s e t t i n g , w e l l s w e r e

dug in t h e a g a r w i t h a c o r k b o r e r a t a n e q u a l d i s t a n c e . P l u g s , c u t f r o m

Gi l s o n f i l t e r t i p s t o a t h i c k n e s s of t h e p o u r e d m e d i u m , w e r e s o a k e d w i t h

b u f f e r pHs 3.0, 3.5 a nd 4.0 f o r t r e a t m e n t s a n d 7 .0 f o r u n t r e a t e d c o n t r o l s .

T h e s e p l u g s w e r e p l a c e d in t h e w e l l s o f 2 s e t s o f p l a t e s f o r h a b i t u a t e d

and n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s . T h e p l a t e s w e r e l e f t u n d i s t u r b e d a t r o o m

t e m p e r a t u r e f o r 1.5 h r t o o b s e r v e t h e z one of c l e a r a n c e a r o u n d t h e p l u g s

a n d w e r e p h o t o g r a p h e d u s i n g I l f o r d F P 4 f i l m .

2 . 15 . R e s p i r a t i o n o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d E D I 8 2 9 Co 1V, I - K 9 4

c e l l s :

A C l a r k - t y p e o x y g e n e l e c t r o d e of R a n k B r o t h e r s , C a m b r i d g e , E n g l a n d w a s

u s e d t o d e t e r m i n e t h e r a t e o f r e s p i r a t i o n o f e x p o n e n t i a l l y g r o w n

h a b i t u a t e d a nd n o n - h a b i t u a t e d E D 1 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 c e l l s , w i t h t h e c u l t u r e s

b e i n g p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e me t h o d d e s c r i b e d in s e c t i o n 2 .6 . T h e r a t e

of r e s p i r a t i o n o f b o t h c u l t u r e s w a s s t u d i e d a t p H 3 . 0 , f o r v a r i o u s

t e m p e r a t u r e s , by i n c o r p o r a t i n g 2 ml of e a c h c u l t u r e ( a p p r o x i m a t e l y o f s ame

O.D) in t h e i n c u b a t i o n cha mbe r , t a k i n g c a r e n o t t o t r a p a n y a i r b u b b l e s a t

t h e t i me of p l a c i n g t h e p e r s p e x d i s c . The s t u d y was c a r r i e d o u t a t 10 mV,

36 uA and a c h a r t s pe e d of 1 cm/min, wh i ch r e m a i n e d c o n s t a n t t h r o u g h o u t

- I l l -

t h e e x p e r i m e n t s .

The s t a n d a r d c u r v e shown in F i g u r e 14 r e p r e s e n t s t h e amount o f p r e s e n t

in f u l l y - s a t u r a t e d w a t e r a t a p a r t i c u l a r t e m p e r a t u r e . T h e r a t e o f

c o n s u m p t i o n w a s c a l c u l a t e d b y t h e e q u a t i o n g i v e n b e l o w ;

X . V. / t i m e , w h e r e X = /Umol/ml a t a p a r t i c u l a r t e m p e r a t u r e i n ° C ,

V= v o l u m e o f t h e s a m p l e , a n d t h e u n i t s w e r e e x p r e s s e d i n p m o l e s o f

/ m l / mi n .

2 . 1 6 . R e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s :

H a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d c e l l s of ED1829ColV,I -K94 (ca . s a me C.D) f r o m

s t a t i o n a r y a n d e x p o n e n t i a l p h a s e s w e r e h a r v e s t e d , t r e a t e d w i t h pH 3 .0

s a l i n e 0.75% ( w / v ) o r p H 7 . 0 s a l i n e w i t h a e r a t i o n a t 37 ° C a n d t h e

u n t r e a t e d a n d a c i d t r e a t e d s a m p l e s w i t h d r a w n a t 5, 10 a n d 15 m i n t i m e

i n t e r v a l s s p u n down a t 16000 r e v / m i n and s u p e r n a t a n t s r e a d a t 260 nm f o r

a n y p o s s i b l e a b s o r b a n c e .

2 . 1 7 . R e c o v e r y o f i n j u r e d o r g a n i s m s :

The b r o t h g r own ED1829Col V, I -K94 o r g a n i s m s f r o m e x p o n e n t i a l p h a s e w e r e

t r e a t e d w i t h p u t a t i v e i n h i b i t o r y a g e n t s f o r a s e t t i m e , w i t h a e r a t i o n a t

37 °C. S a m p l e s (1 ml ) w e r e w i t h d r a w n a n d d i l u t e d i n t o 99 ml o f t h e

r e c o v e r y m e d i u m w i t h a n d w i t h o u t 0.1 M p h o s p h a t e b u f f e r o f p H 7.5 a s

e x p l a i n e d i n s e c t i o n 2 . 2 , a n d t h e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d s t a t i c a l l y a t

room t e m p e r a t u r e o r 37 °C f o r 2 h r p r i o r t o p l a t i n g 0.1 ml of a p p r o p r i a t e

d i l u t i o n s o n NA p l a t e s t o d e t e r m i n e p e r c e n t a g e r e c o v e r y .

1 1 2 -

:!iIii

4 5 0

4 0 0

3 5 0

3 0 0o

2 0 0

1 5 045

T (°C)

Fi g . 14. To t a l amount o f d i s s o l v e d i n a q u e o u s s o l u t i o n ( a d a p t e d f r o m

W i s e a n d N a y l o r , 1 9 8 5 ) .

- 113 -

2 . 1 8 . I n d u c t i o n o f s t r e s s - r e 1 a t e d p r o t e i n s :

2 . 1 8 . 1 . P r o t e i n a n a l y s i s o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d c e l l s :

2 . 1 8 . 1 . 1 . S a m p l e p r e p a r a t i o n :

P r o t e i n a n a l y s i s of h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d b r o t h g r o w n c e l l s o f

E D 1 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 f r o m l a t e e x p o n e n t i a l a n d e a r l y s t a t i o n a r y p h a s e w a s

s t u d i e d b y o n e d i m e n s i o n a l a n d t w o d i m e n s i o n a l SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l

e l e c t r o p h o r e s i s . The o r g a n i s m s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h 0.85% ( w/ v ) s a l i n e ,

s u s p e n d e d in s o n i c a t i o n b u f f e r f o l l o w i n g t h e m e t h o d o f O ' F a r r e l l , 1975 ,

f r o z e n in l i q u i d n i t r o g e n a n d t h a w e d ( f r e e z i n g - t h a w i n g w a s r e p e a t e d s i x

t i mes ) a nd t h e n s o n i c a t e d f o r 16x15 S, a t 1.5 A i n a n M.S.E u I t r a s o n i c a t o r

w h i l e s a m p l e s w e r e k e p t a t 0 ° C in a n i c e b a t h . T h e s u p e r n a t a n t f l u i d s

a f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 , 0 0 0 r e v / mi n in a S o r v a l R C - 5 B f o r 20 m i n a t

4 °C w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d i n d i a l y s i s t u b i n g w i t h p o l y e t h y l e n e g l y c o l

15-20 K m o l e c u l a r w e i g h t a t 4 ° C f o r 2 h r . To t h i s c o n c e n t r a t e , 9 m o l a r

( d ry) u r e a was a d d e d , d i s s o l v e d a t room t e m p e r a t u r e a n d t h e s a m p l e s w e r e

t h e n p r e p a r e d f o r one d i me n s i o n a l a nd two d i me n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s .

2 . 1 8 . 1 . 2 . P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s :

The c o m p a r a t i v e p o l y p e p t i d e c o mp o s i t i o n o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

c e l l s was e xa mi ned b y p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s u s i n g v e r t i c a l

s l a b s of 12.5 % SDS p o l y a c r y l a m i d e r u n n i n g in one d i me n s i o n , by t h e m e t h o d

- 1 1 4 -

of Laerrmli (1970) a nd Chua a nd B e n n o u n ( 1 9 7 5 ) . T h e t w o d i m e n s i o n a l g e l s

w e r e r u n f o l l o w i n g t h e m e t h o d o f O ' F a r r e l l ( 1 9 7 5 ) .

2 . 1 8 . 1 . 3 . O n e d i m e n s i o n a l SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s :

2 . 1 8 . 1 . 3 . a . P o u r i n g o f g e l :

T h e s e p a r a t i n g g e l w a s a 12 . 5% ( w / v ) a c r y l a m i d e , 0 . 32% ( w / v ) b i s

a c r y l a m i d e s l a b g e l c o n t a i n i n g 0.4% ( w/ v ) SDS a n d 0 . 3 7 5 M T r i s - H C l ,

pH 8 . 8 , p o l y m e r i s e d w i t h 0.06% (w/v) f r e s h l y made ammonium p e r s u l p h a t e a n d

100 1 N, N, N' N ' - 1 e t r a m e t h y l e t h l e n e d i a m i n e (TEMED). A 1 - 2 c m 6 % ( w / v )

a c r y l a m i d e s t a c k i n g g e l , c o n t a i n i n g 0.16% ( w / v ) b i s a c r y l a m i d e , 0.4% ( w / v )

SDS a nd 0.125 M T r i s - H C l , pH 6 . 8 was p o l y m e r i s e d in t h e s a m e m a n n e r o n t o

t h e s e p a r a t i n g g e l .

2 . 1 8 . 1 . 3 . b . L o a d i n g o f g e l :

Sample was a d d e d (1:1) t o l y s i s b u f f e r and t h e m i x t u r e was i n c u b a t e d i n a n

i c e b a t h f o r 10 min a nd t h e n s a mp l e s we r e s o l u b i l i s e d i n 4% ( w/ v ) SDS, 5%

m e r c a p t o e t h a n o l , 5% g l y c e r o l , 0.2% b r o m o p h e n o l b l u e a n d h e a t e d a t 90 ° C

f o r 10 m i n . T h e s e t r e a t e d s a m p l e s ( 4 0 j u l ) w e r e l o a d e d o n g e l s a n d

e l e c t r o p h o r e s e d . The r u n n i n g b u f f e r u s e d c o n s i s t e d of 0.375 M T r i s - H C L , 2IA

g l y c i n e and 0.1% (w/v) SDS pH 8.3. The g e l s w e r e r u n a t 25 mA f o r 5.5 h r

and w e r e s t a i n e d w i t h Cooi nas s i e B r i l l i a n t B l u e R250 o v e r n i g h t f o l l o w i n g

t h e me t hod of Deeney e t a l . , 1986 ; d e s t a i n i n g w a s w i t h 1 0 % m e t h a n o l a n d

1 0 % a c e t i c a c i d .

115 -

2 . 1 8 . 2 . 1 . Two d i m e n s i o n a l SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s :

P r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d , b a s e d u p o n t h e i r i s o e l e c t r i c p o i n t , b y

i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ( I E F ) i n t h e f i r s t d i x n e n s i o n u s i n g a d i s c

e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s f o r 2 D g e l s of S ha ndon , E n g l a n d , a n d , a c c o r d i n g

t o t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t s , b y 12 . 5% SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l

e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n .

2 . 1 8 . 2 . 2 . S a m p l e p r e p a r a t i o n :

Sampl es w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n t h e s e c t i o n 2 . 1 8 . 1 . 1 . To 1 p a r t

sampl e was a d d e d 1 p a r t l y s i s b u f f e r , w i t h o u t m e r c a p t o e t h a n o l a c c o r d i n g t o

t h e me t hod of O ' F a r r e l l , 1975; t h e m i x t u r e was i n c u b a t e d in a n i c e b a t h f o r

10 m i n , t h e n h e a t e d a t 90 ° C f o r 10 m i n a n d l o a d e d o n t o t h e

e 1 e c t r o f o c u s i n g g e l .

2 . 1 3 . 2 . 3 . S e t t i n g u p a n d r u n n i n g o f I s o E l e c t r i c F o c u s i n g :

Gl a s s t u b e s (120 x 1.5 mm i n t e r n a l d i a m e t e r ) w e r e s o a k e d i n c h r o m i c a c i d

f o r 2 n r , r i n s e d w i t h d o u b l e d i s t i l l e d w a t e r (D H^O) t h e n l e f t i n 50%

EtOH: 50% 0.1 M KOH f o r 30 m i n , w e r e f u r t h e r r i n s e d w i t h D H^ O a n d

d r i e d . T h e i r b a s e s were s e a l e d w i t h t wo l a y e r s o f p a r a f i l m a n d t h e y w e r e

f i l l e d w i t h I EF g e l mix f r o m t h e b o t t o m t o 110 mm u s i n g a l o n g n e c k p a s t e u r

p i p e t t e . The I EF g e l mix c o n t a i n e d ; u r e a 5.5 g, 1 .33 ml o f 30% a c r y l a m i d e ,

2 ml o f 10% n o n i d e t P 4 0 , 3 0 0 ju 1 o f a m p h o l i n e p H 3 . 5 - 10 , 2 0 0 1 o f

a mp h o l i n e pH 5 .0 - 7 . 0 , 2 ml o f D H^O, 20 ju 1 o f 10% a mm o n i u m p e r s u l p h a t e

( f r e s h l y p r e p a r e d ) a nd 10 jul TEMED. The t op was o v e r l a y e r e d w i t h D H^O

116 -

a n d t h e g e l was a l l owed t o p o l y m e r i s e f o r 1 h r . T h e b o t t o m r e s e r v o i r of

t h e I E F t a n k w a s f i l l e d w i t h l o w e r e l e c t r o d e b u f f e r , w h i c h c o n t a i n e d

1.11 ml of 85% p h o s p h o r i c a c i d / 1 of d e g a s s e d D H^O. T h e o v e r l a y a n d t h e

p a r a f i l m w e r e removed f r o m t h e t u b e s and t h e y w e r e l o a d e d i n t o t h e I E F

t a n k , s e a l i n g t h e j o i n t s w i t h 4% a g a r o s e . T h e t o p r e s e r v o i r w a s f i l l e d

w i t h u p p e r e l e c t r o d e b u f f e r , NaOH 800 mg / 1 D H^O a n d t h e g e l s w e r e

p r e f o c u s e d a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g s c h e d u l e : a) 200 V f o r 15 m i n ; b)

300V f o r 30 min ; c) 400 V f o r 30 m i n . T h e n t h e s a m p l e s w e r e l o a d e d a n d

o v e r l a y e d w i t h 10 u l of s a m p l e o v e r l a y (1 p a r t s o l u t i o n A + 2 p a r t D

H^O). T h e s o l u t i o n A w a s c o m p o s e d o f 20 mM T r i s - H C l p H 7 .6 , 2% ( w / v )

n o n i d e t P40, 2% (w/v) a mp h o l i n e ( 60% pH 3 - 10 a nd 40% pH 5 - 7 ) , 9.5 M u r e a ,

5% (w/v) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . T h e s a m p l e s w e r e r u n f o r I E F a t a c o n s t a n t

2 mA and 400 V f o r 16.5 h r a nd 800 V f o r 3 h r . The g e l s w e r e r e m o v e d f r o m

t h e t u b e s u s i n g a h i g h p r e s s u r e a i r l i n e a n d s t a i n e d i n L a e m l l i (1970)

s a m p l e b u f f e r f o r 25 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e .

2.18.2.4. S e t t i n g u p a n d r u n n i n g t h e p r o t e i n s i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n :

Fo r e l e c t r o p h o r e s i s in t h e s e c o n d d i m e n s i o n , a 12.5% S D S - P A G E g e l ( s e e

2.18.1.3.a ) was p o u r e d a n d t h e s t a i n e d g e l t h e n a p p l i e d t o i t s t o p a n d

t h e j o i n s e a l e d w i t h 1% a g a r o s e . T h e g e l w a s r u n f o r 6.5 h r a t 25 mA,

s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R250 a n d p r o c e s s e d a s d e s c r i b e d

e a r l i e r i n t h e s e c t i o n 2 . 1 8 . 1 . 3 . b .

117 -

2.19. I n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s s t u d i e d b y p u l s e l a b e l l i n g :

2.19.1. Time c o u r s e s t u d y f o r t h e i n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s :

P678- 54 a nd P 6 78 - 54 ompA we r e u s e d in t h e p u l s e l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s . The

o r g a n i s m s w e r e g r own o v e r n i g h t in NB of pH 7.0, d i l u t e d 1/25 i n t o f r e s h NB

o f pH 7.0 a n d i n c u b a t e d w i t h a e r a t i o n a t 37 ° C f o r 2.5 h r , t o o b t a i n

e x p o n e n t i a l p h a s e c u l t u r e s . The c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t

r oom t e m p e r a t u r e a n d r e s u s p e n d e d i n NB of pH 7.0 a n d pH 4.3 a n d t h e

c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r a f u r t h e r 5 m i n a t 37 ° C , w i t h a e r a t i o n

3 5b e f o r e t h e a d d i t i o n o f S m e t h i o n i n e . T h e r a d i o a c t i v e 1 y l a b e l l e d

m e t h i o n i n e , f r o m A m e r s h a m I n t e r n a t i o n a l w a s a d d e d a s f o l l o w s :

3 ^iCi /ml a nd 30 ^iCi/ml f o r e x p o n e n t i a l l y g r own c u l t u r e s o f P 6 7 8 - 5 4 in NB

of pH 7.0 a nd pH 4.3. S i m i l a r l y t o P678 - 54 ompA, 3 ,uCi /ml a n d 45 j uCi / ml of

35 S l a b e l l e d m e t h i o n i n e w a s a d d e d t o t h e NB o f pH 7.0 a n d p H 4 .3 . T h e

c e l l s w e r e l a b e l l e d f o r 1 0 m i n a n d t h e n n e u t r a l i z e d a n d h a r v e s t e d f o r

s o n i c a t i o n . The c e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d in

s e c t i o n 2 . 1 8 . 1 . 1 . a n d s a m p l e s e 1 e c t r o p h o r e s e d u n i d i m e n s i o n a 1 l y o n

12.5% SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l s f o l l o w e d b y a u t o r a d i o g r a p h y .

2.19.2. I n h i b i t i o n of h a b i t u a t i o n b y E . c o l i a t pH 4.3 b y t h e a d d i t i o n of

p h o s p h a t e :

E x p o n e n t i a l p h a s e c u l t u r e s of P 6 78 - 54 a nd i t s ompA m u t a n t w e r e p r e p a r e d

a s f o r 2 . 1 9 . 1 . T h e c e l l s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d a n d p e l l e t s w e r e

r e s u s p e n d e d i n NB o f pH 7 .0 , pH 4.3 o r pH 4.3 + 1 0 - 2 5 mM p h o s p h a t e

b u f f e r a nd t h e c u l t u r e s w e r e a g a i n i n c u b a t e d a t 37 ° C f o r 5 m i n , w i t h

- 1 18 -

a e r a t i o n b e f o r e a d d i n g o f S m e t h i o n i n e a s p e r f o l l o w i n g s c h e d u l e :

3 juCi /ml , 30 juCi/ml a nd 15 j uCi / ml f o r l o g a r i t h m i c a l l y g r o w n c u l t u r e s o f

P 6 78 - 54 in t h e NB of pH 7 . 0 , 4.3 a n d 4.3 + 1 0 - 2 5 mM p h o s p h a t e b u f f e r

r e s p e c t i v e l y . S i m i l a r l y f o r P 6 7 8 - 54 o m p A , 3 ^ l C i / m l , 45 / i C i / m l a n d

3525 juCi/ml of S r a d i o a c t i v e l y l a b e l l e d m e t h i o n i n e wa s a d d e d t o t h e NB

of pH 7.0, 4.3 and 4.3 + 1 0 - 2 5 mM p h o s p h a t e b u f f e r . T h e o r g a n i s m s w e r e

l a b e l l e d f o r 1 0 m i n a n d t h e n h a r v e s t e d f o r s o n i c a t i o n t o p r e p a r e c e l l

e x t r a c t s e s s e n t i a l l y f o l l o w i n g t h e m e t h o d i n s e c t i o n 2 . 1 8 . 1 . 1 . T h e c e l l

e x t r a c t s w e r e r u n on 1 D p o l y a c r y l a m i d e g e l s f o l l owe d by a u t o r a d i o g r a p h y .

2 . 2 0 . D r y i n g t h e p o l y a c r y l a m i d e g e l s f o r a u t o r a d i o g r a p h y :

T h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R2 5 0 , d e s t a i n e d ,

a c e t i c a c i d r e m o v e d in D H^O f o r 30 m i n b e f o r e i n t e n s i f y i n g w i t h 1 M

s od i um s a l i c y l a t e pH 6.0 f o r 30 min a s d e s c r i b e d by C h a m b e r l a i n , 1979 . T h e

g e l s w e r e p l a c e d on 3 rrm Whatmann f i l t e r p a p e r , c o v e r e d w i t h s a r a n a n d

d r i e d i n a B i o R a d s l a b d r y e r m o d e l 4 8 3 f o r 3 h r a t 60 ° C .

2 . 2 1 . A u t o r a d i o g r a p h y :

The d r i e d g e l s w e r e p l a c e d in a S ' ^ I O " c a s s e t t e w i t h 7 ,,x 9 . 5 " F u j i X - r a y

f i l m a n d s t o r e d i n a f r e e z e r a t - 7 0 ° C f o r a n a p p r o p r i a t e t i m e . T h e

X - r a y f i l m w a s p r o c e s s e d a n d d e v e l o p e d w i t h X - o g r a p h C o m p a c t X2.

2 . 2 2 . S i z i n g o f p l a s m i d :

O v e r n i g h t c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d f r o m E D I 8 2 9 C o l V , I - X 9 4 , E . c o l i m a r k e r

- 1 1 9 -

(39R 861) a n d 14 Co l V+ s t r a i n s i n NB w i t h s h a k i n g a t 37 °C. T h e n e x t

da y , p l a s m i d s w e r e i s o l a t e d e s s e n t i a l l y b y t h e m e t h o d o f K a d o a n d L i u ,

1981; The c e l l s w e r e l y s e d w i t h l y s i s s o l u t i o n pH 12.52 - 12 . 56 a n d b r i e f

mi x i n g was f o l l o w e d b y h e a t i n g f o r 45 m i n a t 55 °C, b e f o r e a d d i t i o n of

f r e s h l y p r e p a r e d p h e n o l / c h l o r o f o r m . Sampl es (50 ,ul) w e r e l oade d on a g a r o s e

ge l f o r e l e c t r o p h o r e s i s ( s ee s e c t i o n 2.26). T h e s i z i n g o f t h e p l a s m i d s wa s

c a r r i e d o u t b y f o l l o w i n g t h e f o r m u l a b e l o w :

M o b i l i t y o f p l a s m i d = D i s t a n c e t r a v e l l e d b y a p l a s m i dD i s t a n c e t r a v e l l e d b y s t a n d a r d p l a s m i d

X m o b i l i t y o f s t a n d a r d p l a s m i d

The m a r k e r s t r a i n c a r r i e d 4 p l a s m i d s w i t h t h e f o l l o w i n g s p e c i f i c a t i o n .

T a b l e 8 : S p e c i f i c a t i o n o f m a r k e r p l a s m i d s .

M.W. Mob i 1i t y . R e s i s t a n c e

9 8 x l 0 6 5 . 9 c a p , s u f , t e t

4 2 x l 0 6 8 . 6

2 3 . 9 x 1 0 ^ 1 0 . 0 c a p , k a n , s t r , s u f

4 . 2 x l 0 6 1 7 . 6 s u f , t e t

Then t h e s i z e of e a c h ColV was d e t e r m i n e d by c a l c u l a t i n g i t s m o b i l i t y a n d

c h e c k i n g t h e m o b i l i t y X - a x i s a g a i n s t m o l e c u l a r w e i g h t on Y - a x i s f r o m t h e

c u r v e d r a w n f o r t h e m a r k e r s t r a i n , s h o w n i n F i g u r e 15 .

The e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n o f Co l V p l a s m i d s ( F i g . 16) i s s h o w n i n t h e

l an e s 2, 4 and 9. The d i s t a n c e t r a v e l l e d by ColV p l a s m i d was a p p r o x i m a t e l y

5.5 mm w h i l e t h e d i s t a n c e t r a v e l l e d b y s t a n d a r d p l a s m i d w a s c a . 6 . 0 mm.

The c a l c u l a t e d m o l e c u l a r w e i g h t of ColV p l a s m i d a s p e r f o r m u l a c omes t o b e

94 x 1 0 6 .

- 1 2 0 -

1 0

42 x 10

23

10 -

100

F i g . 1 5 . S t a n d a r d c u r v e f o r s i z i n g o f Ml p l a s m i d s .c u r v

- 121 -

1 2 3 4 5 S 7 3 9 10 11

cnso

TJc

oJTJJD£nj tig

ColV p lasm id ItjT ̂ DNA

Chromosomal DNA

Ml marker p lasm id DNA

_ N

F i g . 16. S i z i n g o f Co l V p l a s m i d . T r a c k s 1 a n d 1 1 , l a m b d a H i n d I I I d i g e s t ; t r a c k s 3, 7 a n d 1 0 , M l ; t r a c k s 2 a n d 4 , E D I 8 2 9 C o 1V, I - K9 4 ; t r a c k 9 , 14 C o l V + ; t r a c k 5 , E D 1 82 9 ; t r a c k s 6 a n d 8 , E D I 8 2 9 C o 1V, I - K9 4 a n d 14 C o l V , r e s p e c t i v e l y , t r e a t e d w i t h S D S a n d f u r t h e r i n c u b a t e d a t 4 4 ° C , f o r 4 8 h r .

122

2 . 2 3 . C u r i n g o f p l a s m i d s :

The p l a s m i d b e a r i n g s t r a i n s w e r e g r o w n o v e r n i g h t a t 37 ° C w i t h s h a k i n g

t o s t a t i o n a r y p h a s e . T h e o v e r n i g h t c u l t u r e s w e r e t h e n d i l u t e d 1 / 1 0 in

f r e s h NB c o n t a i n i n g 0.5% SDS, f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 48 h r , a t 37 ° C w i t h

s h a k i n g . T h e s e c u l t u r e s w e r e t h e n d i l u t e d 1 /100 in f r e s h NB a n d i n c u b a t e d

s t a t i c a l l y a t 44 ° C f o r 48 h r . D i l u t i o n s w e r e p l a t e d on NA p l a t e s a n d

c o l o n i e s w e r e t e s t e d f o r c o l i c i n p r o d u c t i o n .

T h i s was c o n f i r m e d by r u n n i n g on a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( F i g u r e 16)

a f t e r p l a s mi d e x t r a c t i o n . The t r a c k s 6 and 8 r e p r e s e n t e d t h e c e l l e x t r a c t s

f r o m E D 1 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 a n d 14 Co l V+ c e l l s t r e a t e d w i t h 0.5 % SDS a n d

i n c u b a t e d 44 °C f o r 48 h r , and d i d n o t i n d i c a t e a n y s i g n o f Co l V p l a s m i d

s i n c e t h e SDS a n d h i g h t e m p e r a t u r e c u r e d t h e C o l V p l a s m i d s .

2 . 2 4 . P r e p a r a t i o n o f c o m p e t e n t c e l l s a n d t h e i r t r a n s f o r m a t i o n :

C u l t u r e s of EDI829ColV, I -K94 grown o v e r n i g h t i n NB, pH 7.0 w e r e d i l u t e d

1 / 1 0 0 in f r e s h NB o f p H 7.0 a n d g r o w n w i t h a e r a t i o n a t 37 ° C t o a n

o p t i c a l d e n s i t y o f 0 . 6 a t 6 0 0 n m. T h e c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h

0.1 M Ca Cl^ t o make t h e m r e c e p t i v e f o r t h e u p t a k e of f o r e i g n DNA b y t h e

met hod of L e d e r b e r g a n d Cohen, 1974. The c o m p e t e n t c e l l s w e r e d i s p e n s e d

in 0.5 ml l o t s i n 0.1 M C a C l ^ + 16 % g l y c e r o l a n d s t o r e d a t - 20 ° C .

J u s t b e f o r e t r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e n t s , t h e c o m p e t e n t c e l l s w e r e q u i c k l y

t h a w e d o u t , s p u n b r i e f l y t o f r e e t h e m o f a n y e n d o n u c l e a s e f r o m t h e

s u p e r n a t a n t a s d e s c r i b e d by B a l t z a nd M a t s u s h i m a , 1981, r e s u s p e n d e d i n 0.1

M CaCl^ a nd a d d e d t o p l a s m i d ENA (pBR 322 f r o m Sigma, UK) i n TEN b u f f e r ,

1 2 3 -

[0.02M T r i s ( h y d r o x / m e t h y 1) a m i n o m e t h a n e (pH 8.0) -1 mid EDTA (pH 8.0)

-0 .02 M NaCl]. The c o m p e t e n t c e l l s a l o n g w i t h pBR 322 DNA w e r e i n c u b a t e d

on i c e f o r 60 mi n t h e n g i v e n a t e m p e r a t u r e s h o c k b y t r a n s f e r r i n g t o

37 C f o r 10 min. The c e l l s w e r e c oo l ed i n a n i c e b a t h f o r 2 mi n a n d t h e n

d i l u t e d i n f r e s h p r e w a r m e d NB o f pH 7.0 a n d i n c u b a t e d a t 37 ° C w i t h

a e r a t i o n o v e r n i g h t . T h e t r a n s f o r m a n t s , s e l e c t e d f o r g r o w t h o n NA

c o n t a i n i n g 20 j ug/ml t e t r a c y c l i n e a n d 150 j i g / m l a m p i c i l l i n a t 37 °G f o r

48 h r , w e r e l a t e r u s e d i n f u r t h e r e x p e r i m e n t s .

C o x n p e t e n t c e l l s f r o m h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d c u l t u r e s o f

ED1829ColV,I -K94 w e r e p r e p a r e d i n t h e s a m e m a n n e r a s d e s c r i b e d a b o v e .

S i n c e t h e ED1829ColV,I -K94 c e l l s g r ew s l o w e r a t pH 5.0 , t h e y w e r e p o o l e d

t o g e t an a p p r o x i m a t e o p t i c a l d e n s i t y of 0 . 6 a t 600 nm, b e f o r e m a k i n g t h e m

c o m p e t e n t f o r a c c e p t i n g t h e f o r e i g n DNA. T h e r e c i p i e n t c e l l s w e r e

t r a n s f o r m e d wi t h pBR 322 DMA (80 jul) i s o l a t e d f r o m t r e a t e d a n d u n t r e a t e d

h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s ( s e e s e c t i o n 2 . 2 5 ) a n d t h e

t r a n s f o r m a t i o n w a s c a r r i e d o u t a s m e n t i o n e d a b o v e .

S i m i l a r l y c o m p e t e n t c e l l s f r o m pH 7.0 b r o t h c u l t u r e s o f s t r a i n s ; GW1000,

GW1060, AB1157 , DP1152 a n d AB2463 , w e r e t r a n s f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e

p r o b a b l e g e n e p r o d u c t s r e s p o n s i b l e f o r DNA r e p a i r a f t e r a c i d t r e a t m e n t .

2 . 2 5 . S e n s i t i v i t y o f E D 1 8 2 9 C o l V, I - K9 4 - p B R 3 2 2 t o p H 3 . 0 :

H a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d 37 ° C b r o t h - g r o w n c e l l s o f

ED1829ColV, I -K94-pBR 322, f r o m e x p o n e n t i a l p h a s e w e r e t r e a t e d a t p H 3.0 in

NB, a t 37 °C, wi t h v i g o r o u s s h a k i n g f o r a n a p p r o p r i a t e p e r i o d o f t i m e .

1 2 4 -

The s e n s i t i v i t y of t r e a t e d a nd u n t r e a t e d c u l t u r e s was s t u d i e d b y i s o l a t i n g

t h e i r DNA a nd m e a s u r i n g i t s b i o l o g i c a l a c t i v i t y ( i n t r a n s f o r m a t i o n ) a n d

i t s b e h a v i o u r o n a g a r o s e g e l s .

2.26. I s o l a t i o n of pBR 322 p l a s m i d DNA f o r a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s :

A c o m p a r a t i v e s t u d y w a s p e r f o r m e d t o c h e c k t h e e x t e n t o f d a m a g e t o

p B R 3 2 2 p l a s m i d DNA i s o l a t e d f r o m e x p o n e n t i a l l y g r o w n

ED1829ColV, I -X94-pBR 322, h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s a f t e r

a c i d t r e a t m e n t . The pBR 322 ENA was i s o l a t e d f r o m (1) o r g a n i s m s wh i c h w e r e

grown in NB of pH 7.0 a nd pH 5.0 and t h e n t r e a t e d in b r o t h a t pH 3.0 , a n d

37 °C, w i t h v i g o r o u s s h a k i n g , f o r v a r i o u s t i m e p e r i o d s a n d ( 2 ) f r o m

u n t r e a t e d c o n t r o l s f o l l o w i n g t h e m e t h o d o f K a d o a n d L i u , 1 9 8 1 .

C e l l s w e r e h a r v e s t e d b y u s i n g 0.2 jum, 47 mm ( d i a m e t e r ) P a l l m e m b r a n e

f i l t e r s a nd w e r e wa s h e d o f f t h e f i l t e r s u s i n g 10 mM T r i s - H C l b u f f e r pH 7.0

t o n e u t r a l i s e t h e e f f e c t o f a c i d . T h e n t h e t r e a t e d c e l l s a n d u n t r e a t e d

c o n t r o l s w e r e s pun down in t h e MSE 21 c e n t r i f u g e a t 4 ° C f o r 15 m i n . T h e

p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n TE b u f f e r f o r i s o l a t i o n o f p l a s m i d u s i n g

e s s e n t i a l l y t h e m e t h o d o f K a d o a n d L i u , 1931 , w i t h t h e e x c e p t i o n t h a t

50 p g / ml p r e h e a t e d RNAse was i n c o r p o r a t e d in TE b u f f e r and a l k a l i n e l y s i s

was c a r r i e d o u t a t 70 ° C f o r 12 m i n ( K i e s e r , 1984 ) . A f t e r t h e a d d i t i o n

of f r e s h l y p r e p a r e d p h e n o l c h l o r o f o r m , v o r t e x i n g a n d c e n t r i f u g a t i o n g a v e

r i s e t o two c l e a r p h a s e s . P l a s mi d ENA s a m p l e s o b t a i n e d f r o m t h e a q u e o u s

p h a s e of t h e t r e a t e d a nd t h e i r c o u n t e r p a r t u n t r e a t e d c o n t r o l s w e r e l o a d e d

on 0.7% a g a r o s e g e l s , e l e c t r o p h o r e s e d i n T B E b u f f e r p H 7 . 9 h a v i n g

89 mM T r i s - H C l , 89 mM b o r i c a c i d a n d 2.5 mM EDTA f o r 3.5 t o 4 h r , a t

140 V. T h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h 700 ju l /ml o f e t h i d i u m b r o m i d e f o r

- 125 -

30 - 40 min, r i n s e d w i t h D H^O a nd o b s e r v e d w i t h a C - 6 3 t r a n s i l l u m i n a t o r

of U l t r a v i o l e t P r o d u c t s Inc , USA. P h o t o g r a p h s w e r e t a k e n on P o l a r o i d 665

f i lm.

2.27. I s o l a t i o n of p l a s m i d DNA f r o m h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d c e l l s

f o r t r a n s f o r m a t i o n p u r p o s e s :

P l a s m i d DNA w a s i s o l a t e d f r o m e x p o n e n t i a l l y g r o w n h a b i t u a t e d a n d

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s o f E D I 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 - p B R 322 w h i c h h a d b e e n a c i d

t r e a t e d o r u n t r e a t e d . T h e i s o l a t i o n w a s a s i n 2 . 26 e x c e p t t h a t DNA w a s

s u b j e c t e d t o mor e p u r i f i c a t i o n t o g e t r i d o f t o x i c t r a c e s o f p h e n o l a n d

c h l o r o f o r m w h i c h m i g h t h a v e i n h i b i t e d t h e c o m p e t e n t c e l l s , i n t h e

t r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e n t s . P u r i f i c a t i o n was a s f o l l ows : a d d e d 10 % v o l u m e

of s od i um a c e t a t e (4 M, pH 6.0) and 1 vol ume of i s o p r o p a n o l t o t h e a q u e o u s

s u p e r n a t a n t o f s e c t i o n 2 . 2 6 , m i x e d b y i n v e r t i o n a n d k e p t a t r o o m

t e m p e r a t u r e f o r 5 min. C e n t r i f u g e d t h e c o n t e n t s , d e c a n t e d t h e s u p e r n a t a n t

a n d p e l l e t w a s w a s h e d b y 70 % a l c o h o l b y g e n t l e i n v e r t i o n w h i c h w a s

f o l l owed by a n o t h e r w a s h i n g w i t h a b s o l u t e a l c o h o l . T h e p e l l e t w a s d r i e d

a n d t h e n r e d i s s o l v e d i n T . E b u f f e r t o b e u s e d f o r t r a n s f o r m a t i o n

e x p e r i m e n t s .

1 26 -

3. R e s u I t s :

3.1. S t u d i e s o n a c i d - s e n s i t i v i t y o f n on - h a b i t u a t e d C o l V + a n d C o l V

c e l l s :

3 . 1 . 1 . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e s e n s i t i v i t y o f n on - h a b i t u a t e d C o l V +

a n d C o l V c e l l s t o f a t t y a c i d s .

E n t e r o b a c t e r i a can c a u s e P u b l i c H e a l t h p r o b l e m s d u e t o t h e i r i n t r o d u c t i o n

i n t o food f o r e xa mpl e f r o m c o n t a m i n a t e d w a t e r , f r u i t s o r v e g e t a b l e s u s e d

in m a n u f a c t u r e o r f r o m a n i m a l p r o d u c t s u s e d a s f o o d c o n s t i t u e n t s . The

s i g n i f i c a n c e of s u c h f ood c o n t a m i n a t i o n d e p e n d s on b a c t e r i a l p a t h o g e n i c i t y

a n d a m a j o r f a c t o r w h i c h i n c r e a s e s p a t h o g e n i c i t y i s p l a s m i d c a r r i a g e

( S m i t h , 1 9 7 4 ) .

T h e p r e s e n c e o f w e a k a c i d s , e s p e c i a l l y a t a c i d p H , i s a n i m p o r t a n t

i n h i b i t o r y i n f l u e n c e o n g r o w t h a n d s u r v i v a l o f e n t e r o b a c t e r i a a n d

a c c o r d i n g l y , n a t u r a l l y a c i d f o o d s o r a c i d u l a t e d o n e s s h o u l d b e f r e e of

p u t a t i v e p a t h o g e n s . P r e v i o u s w o r k c o n d u c t e d i n t h i s l a b o r a t o r y

d e m o n s t r a t e d t h a t c e r t a i n s t r a i n s of E . c o l i w e r e v e r y s e n s i t i v e t o a c i d i c

pH w h e n t h e y h a r b o u r e d Co l V p l a s m i d s ( C o o p e r a n d R o w b u r y , 1 9 8 6 ) .

A c o m p a r a t i v e s t u d y was p e r f o r m e d t o e xa mi ne t h e d e g r e e of s e n s i t i v i t y of

n o n - h a b i t u a t e d ED 1 8 2 9 C o l V, I - K 9 4 a n d i t s i s o g e n i c s t r a i n ED1829* a Col V

p l a s mi d b e a r i n g a nd ColV n o n - p l a s m i d c o n t a i n i n g s t r a i n r e s p e c t i v e l y , t o

v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s of weak o r g a n i c a c i d s a t pH 4.5 i n NB; t h e r e s u l t s

a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 9.

127 -

The r e s u l t s shown in T a b l e 9 i l l u s t r a t e t h a t a l l t h e f a t t y a c i d s k i l l e d

b o t h p a n d p o r g a n i s m s b u t t h e e x t e n t o f k i l l i n g i n p + c e l l s w a s

much m o r e p r o n o u n c e d t h a n in t h e c o r r e s p o n d i n g p s t r a i n , a t t h e t e s t e d

t ime p e r i o d s . Among t h e f a t t y a c i d s t e s t e d , b u t y r i c a c i d was t h e s t r o n g e s t

i n h i b i t o r f o r p + a n d p o r g a n i s m s w h e r e a s p r o p i o n i c a n d l a c t i c a c i d s

w e r e t h e m i l d e s t .

In ED1829 t h e ColV, I -K94 p l a s mi d c a u s e d 12 a nd 26 f o l d f u r t h e r d e c r e a s e in

s u r v i v a l , a f t e r 2.5 a n d 3.5 h r r e s p e c t i v e l y , on t r e a t m e n t w i t h b u t y r i c

a c i d c ompa r ed t o p l a s m i d - f r e e o r g a n i s m s a n d 6 a nd 15 t i m e s l e s s s u r v i v a l ,

a f t e r 2.5 a nd 3.5 h r r e s p e c t i v e l y , when t r e a t e d w i t h a c e t i c a c i d c o m p a r e d

w i t h t h e Co l V o r g a n i s m s . S u r v i v a l p e r c e n t a g e of t h e p s t r a i n w a s 5

and 24 f o l d down c ompar ed w i t h t h e i r c o u n t e r p a r t p s t r a i n w h e n e x p o s e d

t o l a c t i c a c i d f o r 2.5 a n d 3.5 h r . L e s s s u r v i v a l o f 12 a n d 17 t i m e s wa s

o b s e r v e d f o r t h e Co l V+ o r g a n i s m s c o m p a r e d w i t h t h e C o l V c e l l s o n

e x p o s u r e t o s u c c i n i c a c i d . P r o p i o n i c a c i d t r e a t m e n t y i e l d e d s u r v i v a l d o wn

5 a n d 9 f o l d f o r t h e C o l V , I - K 9 4 b e a r i n g s t r a i n i n c o n t r a s t w i t h t h e

i s o g e n i c C o l V s t r a i n f o r t h e t i m e 2 . 5 a n d 3 . 5 h r , r e s p e c t i v e l y .

S i m i l a r l y , t h e C o l V , I - K 9 4 + o r g a n i s m s s h o w e d 5 a n d 13 t i m e s d e c r e a s e in

s u r v i v a l c o m p a r e d w i t h C o l V c e l l s , f o r t h e s t a t e d t i m e p e r i o d s

r e s p e c t i v e l y , o n t r e a t m e n t w i t h f o r m i c a c i d .

The r e s u l t s m e n t i o n e d a b o v e show t h a t t h e p l a s m i d - b e a r i n g o r g a n i s m s a r e

m a r k e d l y m o r e s e n s i t i v e t o o r g a n i c a c i d s t h a n t h e p l a s m i d - f r e e c e l l s . T h i s

may s u g g e s t t h a t p r e s e n c e of p l a s m i d i n c r e a s e s t h e p e r m e a b i l i t y o f c e l l

w a l l w h i c h m i g h t e n h a n c e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e C o l V + o r g a n i s m s .

1 2 8 -

3CfDao3

3a>x

cuOQa>

T3 TJ T) + +

►O T3 T> + +

T3

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Table 9

contin

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3.1.2. C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d C o l V + a n d

C o l V c e l l s t o h y d r o g e n p e r o x i d e .

S e n s i t i v i t y o f n on - h a b i t u a t e d C o l V + a n d C o l V o r g a n i s m s w a s a l s o

c h e c k e d wi t h h y d r o g e n p e r o x i d e . P l a s mi d c o n t a i n i n g a nd p l a s m i d - f r e e c e l l s

w e r e s u b j e c t e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n p e r o x i d e f o r

t r e a t m e n t p e r i o d s o f 10 a n d 20 m i n , a t pH 7.0 , w i t h a e r a t i o n a t 37 ° C

f o r e n u m e r a t i o n of p e r c e n t a g e s u r v i v a l of t h e c e l l s on b o t h NA a n d NA +

0.5 % s o d i u m d e o x y c h o l a t e . Any d a m a g e d c e l l s n o r m a l l y f a i l e d t o f o r m

c o l o n i e s o n NA + 0.5% s o d i u m d e o x y c h o l a t e m e d i u m .

The r e s u l t s p r e s e n t e d in T a b l e 10 i n d i c a t e t h a t , i n g e n e r a l , t h e d e a t h

r a t e of p l a s mi d c o n t a i n i n g o r g a n i s m s was much f a s t e r t h a n t h e n o n - p l a s m i d

b e a r i n g s t r a i n . The ColV, I -K94 p l a s m i d b e a r i n g s t r a i n w a s m a r k e d l y m o r e

s e n s i t i v e t o t h e h y d r o g e n p e r o x i d e , c ompa r ed w i t h t h e p l a s m i d - f r e e s t r a i n ,

i n t e r m s o f t h e i r v i a b i l i t y o n NA.

The t r e a t e d o r g a n i s m s w e r e a l s o p l a t e d on NA + 0.5% s o d i u m d e o x y c h o l a t e

f o r d e t e r m i n a t i o n of i n j u r e d c e l l s ; d a t a s h o w n i n T a b l e 10 r e v e a l s a l s o

t h e p e r c e n t a g e i n j u r y o f b o t h t h e c e l l s .

B a c t e r i o c i d a l a c t i v i t y of 7.5 mM c o n c e n t r a t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e w a s

a l s o t e s t e d f o r d e t e r m i n i n g t h e s e n s i t i v i t y o f t h e C o l V + a n d C o l V

s t r a i n s a t pH 4.5 ( T a b l e 11) . T h e p l a s m i d b e a r i n g s t r a i n , p l a t e d on NA,

showed 3 and 6 f o l d r e d u c e d v i a b i l i t y c ompa r ed t o t h e p l a s m i d f r e e p a r e n t

1 3 1 -

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Ta b l e l l : E f f e c t o f hydr ogen p e r o x i d e on E . c o l i s t r a i n s f r c m e x p o n e n t i a l

pha s e when t r e a t e d i n NB o f pH 4 . 5 w i t h a e r a t i o n a t 37 °C.

E . c o l i Concen- * fvfean % s u r v i v a l ont r a t i o n NA

s t r a i n o f T r e a t e d f o rhydr ogen -----------------------------------p e r o x i d e 8 min 16 min

P- 7 . 5 mM 69 47

P+ 7 . 5 rrM 24

p+ ; ED1329ColV, I -K94, p ; ED1829, NA; n u t r i e n t a g a r

* Msan % s u r v i v a l ; v a l u e s r e p r e s e n t t h e % o f i n i t i a l c e l l number s .

The e x p e r i me n t was p e r f o r me d f o u r t i me s w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 133 -

f o r t h e e x p o s u r e t i m e s o f 8 a n d 16 m i n , r e s p e c t i v e l y .

T h e d a t a p r e s e n t e d a b o v e c l e a r l y s h o w s t h a t t h e C o l V , I - K 9 4 b e a r i n g

o r g a n i s m s a r e much mor e s e n s i t i v e t h a n t h e i r c o r r e s p o n d i n g Co l V c e l l s

t o h y d r o g e n p e r o x i d e . T h e p r e s e n c e o f C o l V , I - K 9 4 p l a s m i d ma y i n c r e a s e

p e r m e a t i o n t h r o u g h c e l l w a l l o f w h i c h i n t u r n e n h a n c e s t h e

s e n s i t i v i t y o f o r g a n i s m s .

3 . 1 . 3 . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d C o l V +

a n d C o l V o r g a n i s m s t o u r e a :

A n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y of 10 and 25 mM c o n c e n t r a t i o n o f u r e a w a s c h e c k e d

a g a i n s t l o g a r i t h m i c a l l y g r o w n C o l V + a n d Co l V o r g a n i s m s , i n NB a t pH

5.0 f o r t h e t i m e p e r i o d s o f 120 a n d 180 m i n ( T a b l e 12) . T h e s u r v i v a l

p e r c e n t a g e on NA f o r t h e t r e a t e d o r g a n i s m s b e l o n g i n g t o b o t n s t r a i n s d i d

no t m a n i f e s t a n y r e m a r k a b l e d i f f e r e n c e i n s e n s i t i v i t y t o e i t h e r of t n e

c o n c e n t r a t i o n s o f u r e a .

3 . 2 . R e c o v e r y o f n o n - h a b i t u a t e d i n j u r e d c e l l s :

The p r e s e n c e of p h o s p h a t e in t h e r e c o v e r y med i a , a s e x p l a i n e d in M a t e r i a l s

and Me t h o d s , e n h a n c e d t h e r e c o v e r y of t h e i n j u r e d E D 1 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 c e l l s

whi ch w e r e t r e a t e d w i t h h y d r o g e n p e r o x i d e a n d weak a c i d s l i k e a c e t i c a n d

f o r m i c a c i d s .

The r e c o v e r y of o r g a n i s m s , i n j u r e d by e x p o s u r e to 10 mM c o n c e n t r a t i o n of

hyd r ogen p e r o x i d e , was 4 t imes mor e in t n e r e c o v e r y med i um w i t h p h o s p h a t e

1 3 4 -

T a b l e 12: E f f e c t o f u r e a on E . c o l i s t r a i n s f r c m e x p o n e n t i a l p h a se when

t r e a t e d i n NB w i t h a e r a t i o n a t 37 °C.

E . c o l i s t r a i n

Ct oncen t r a t ion o f u r e a

*Nfean % s u r v i v a l on NA. T r e a t e d f o r (min)

1 2 0 180

P 10 rrM 81 N.D

P 25 rrM 76 71

+P 10 rrM 80 59

+P 25 rrM 6 6 53

p ; ED1829, p + ; ED1829ColV, I -K94, N.D; n o t d e t e r m i n e d .

*Nfean % s u r v i v a l ; v a l u e s r e p r e s e n t p e r c e n t a g e o f i n i t i a l c e l l number s .

The e x p e r i m e n t was r e p e a t e d t h r i c e w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 135 -

t h a n i n m e d i u m w i t h o u t p h o s p h a t e , a t r o o m t e m p e r a t u r e ( T a b l e 1 3 ) .

S i mi l a r l y t h e o r g a n i s m s i n j u r e d by a c e t i c a c i d r e c o v e r e d t w i c e a s w e l l , a t

room t e m p e r a t u r e , p l u s p h o s p h a t e t h a n t h o s e of c e l l s f r o m m e d i u m w i t h o u t

s u p p l e m e n t a t i o n w i t h p h o s p h a t e ( Tab le 14) . A s i m i l a r t r e n d w a s e x h i b i t e d

b y f o r m i c a c i d i n j u r e d o r g a n i s m s ( T a b l e 1 5 ) .

T h e r e s u l t s g a v e a c l e a r i n d i c a t i o n t h a t p h o s p h a t e m i g h t h a v e s o m e

s t i m u l a t o r y e f f e c t s o n t h e r e c o v e r y o f i n j u r e d o r g a n i s m s .

3.3. S t u d i e s o n t h e a c i d s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

E D I 8 2 9 Co IV, I - K 9 4 c e l l s .

3 . 3 . 1 . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e d a n d

n o n - h a b i t u t e d o r g a n i s m s t o f a t t y a c i d s .

I t h a s p r e v i o u s l y b e e n d e m o n s t r a t e d i n t h i s l a b o r a t o r y t h a t

a c i d - h a b i t u a t e d E s c h e r i c h i a c o l i C o l V , I - K 9 4 c e l l s r e s i s t e d t h e

a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f i n o r g a n i c a c i d (HC1, pH 3.0) c o m p a r e d w i t h i t s

c o n t r o l non - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s ( G o o d s o n a n d R o w b u r y , 1989 ; R o w b u r y

e t _ a l . , 1 9 8 9 ) .

L o g a r i t h m i c a l l y grown ED1829ColV,I -K94 o r g a n i s m s whi ch w e r e h a b i t u a t e d b y

g r owi ng t h e m a t s u b o p t i ma l pH o f 5.0 a n d n o n - h a b i t u a t e d c e l l s g r o w n a t

op t imal pH v a l u e o f 7 . 0 , w e r e s u b j e c t e d t o 50 - 65 mM o f t h e f o l l o w i n g

f a t t y a c i d s ; b u t y r i c a c i d , a c e t i c a c i d , l a c t i c a c i d , s u c c i n i c a c i d ,

p r o p i o n i c a c i d and f o r mi c a c i d f o r c h e c k i n g t h e s e n s i t i v i t y o f b o t h t y p e s

of o r g a n i s m s , in t e r m s of p e r c e n t a g e s u r v i v a l on NA. B o t h t y p e s o f c e l l s

1 3 6 -

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t h e d e a t h r a t e s of pH 7.0 g r own c e l l s w e r e f a r m o r e r a p i d t h a n t h e d e a t h

r a t e s o f p H 5 . 0 g r o w n o r g a n i s m s .

The n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s d e m o n s t r a t e d 19 a nd 70 f o l d r e d u c e d v i a b i l i t y

a g a i n s t t h e b a c t e r i o c i d a l a c t i v i t y of b u t y r i c a c i d f o r t h e t r e a t m e n t t i m e s

of 2.5 and 3.5 h r r e s p e c t i v e l y , c omp a r e d w i t h t h e v i a b i l i t y o f h a b i t u a t e d

o r g a n i s m s ( T a b l e 16) a n d 7 a n d 26 t i m e s l e s s s u r v i v a l w h e n e x p o s e d t o

a c e t i c a c i d t h a n t h e i r h a b i t u a t e d c o u n t e r p a r t c e l l s a t t h e s a me t r e a t m e n t

t i mes . L i k e wi se t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s showed 5 a nd 13 f o l d r e d u c t i o n i n

s u r v i v a l on t r e a t m e n t w i t h l a c t i c a c i d i n c o n t r a s t w i t h t h e c o n t r o l

h a b i t u a t e d c e l l s a n d 26 a n d 42 f o l d l e s s v i a b i l i t y f o r n o n - h a b i t u a t e d

o r g a n i s m s in c o m p a r i s o n wi t h c o r r e s p o n d i n g h a b i t u a t e d c e l l s on e x p o s u r e t o

s u c c i n i c a c i d . T h e p r o p i o n i c a c i d t r e a t m e n t y i e l d e d 4 a n d 7 t i m e s l e s s

v i a b i l i t y f o r n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s c o m p a r e d w i t h h a b i t u a t e d c e l l s a t

2.5 a n d 3.5 h r t i m e i n t e r v a l s , r e s p e c t i v e l y . S i m i l a r l y t h e l o s s i n

v i a b i l i t y shown by pH 7.0 g r own o r g a n i s m s a g a i n s t f o r m i c a c i d was 5 a nd 14

f o l d m o r e t h a n t h e l o s s e x h i b i t e d by t h e pH 5.0 g r o w n o r g a n i s m s f o r t h e

e x p o s u r e t i m e o f 2 . 5 a n d 3 . 5 h r r e s p e c t i v e l y .

A l l t h e a b o v e m e n t i o n e d r e s u l t s c l e a r l y c o n f i r m e d t h a t p H 5 . 0 g r o w n

o r g a n i s m s a c q u i r e d p h e n o t y p i c a l l y s o m e r e s i s t a n c e a g a i n s t t h e

a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f t h e i n h i b i t o r s l i k e w e a k o r g a n i c a c i d s i n

c o n t r a s t w i t h t h e pH 7.0 g r o w n o r g a n i s m s , t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s

( T a b l e 1 6 ) .

- 1 4 0 -

Continued

on next

page

Ln Ln -0 -x] Ln Ln -xj Ln Ln -0 -0 n I f TD O• • • . • . . . . • . . fD 3" X 3o o o o o 0 o o o o o o *—' fD o

1—• 0 3cn t-H r+

3*

t"1 tp > > to W c $ft> ft) 0 0 c c cn ft)o o 0) <D p+ p+ fD H-r+ 1 <“*■ 1 r+ r+ Q, ft-I-*- 1 1 i no 0 o i 0 1 (-<• h-*>

1 a 1 0 1 ft)ft) ft) ft) ft) 1 1 0o o o o tu ft) M*Ht I—* • I—' • o o aU a a a H- ■ »-* •

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M* rf 03 "t o

Ln 1 Ln 1 Ln i Ln 1 Ln 1 Ln 1 tm. ft) 3O 1 o 1 o i o 1 o 1 o 1 H «-*• O5̂ * fD

0 33 i

TJtLl

►< Kj k ! k ; Kj KjfD fD ft) n fD (D *CO CO CO CO Oj CO Ln

003r+

0I—.

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O' i c+i fD o\oi ai cni ci •-si t-n <i 0i n <i ft)i i—t

—0 OJ o OJ 0J 0J o i-» o h-» O 0Ji

OJ 1 S ' 0. M . o . o . oo . xO . (-» *1, 3lh OJ o l-» o OJ o o 0J o o Ln i

Ln 00 1—* o i 2O J i

i

Table 16:

Effect

of fatty

acids on

ED

1829ColV

,I-K94,

habituated and

non-habituated c

ells

in NB

at pH

4.5, at

37 C,

with

aeration

.

(-» o h-*Ol NO • 00• ~0 o- vX5

00O'

1—* o COO ' v O • o• O J v OU 1 OO

o CO o I—1• o • N O> 0 O J o 0 0O '

0 0

Table 16

continued

3.3.2. Compa r i s on b e t w e e n t h e s e n s i t i v i t y of h a b i t u a t e d a nd n o n - h a b i t u a t e d

c e l l s t o h y d r o g e n p e r o x i d e .

A c o m p a r a t i v e s t u d y was p e r f o r m e d t o c he c k t h e s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e d

v e r s u s n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s t o h y d r o g e n p e r o x i d e . T h e r e s u l t s in

T a b l e 17 s h o w t h a t t h e h a b i t u a t e d c e l l s r e s i s t e d t h e a n t i b a c t e r i a l

a c t i v i t y of h y d r o g e n p e r o x i d e b e t t e r , t h e r e f o r e , t h e d e a t h r a t e of t h e

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s w a s f a r s l o w e r t h a n t h e d e a t h r a t e o f t h e

n o n - h a b i t u a t e d one s . The pH 7.0 g r own o r g a n i s m s e x h i b i t e d 4 a n d 11 f o l d

g r e a t e r d e c r e a s e in p e r c e n t a g e s u r v i v a l t h a n t h a t o f pH 5.0 o r g a n i s m s ,

when e x p o s e d f o r 12 a nd 18 min, r e s p e c t i v e l y . The r e s i s t a n c e showed b y t h e

h a b i t u a t e d c e l l s a g a i n s t t h e b a c t e r i o c i d a l a c t i v i t y o f h y d r o g e n p e r o x i d e

was f a r mor e a t t h e e x p o s u r e p e r i o d of 18 m i n i n c o m p a r i s o n w i t h 1 2 m i n

t r e a t m e n t t i m e .

A n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f h y d r o g e n p e r o x i d e w a s a l s o s t u d i e d a t pH 3.0,

w h e r e 10 mM c o n c e n t r a t i o n of t h e a g e n t was t e s t e d a g a i n s t t h e h a b i t u a t e d

a nd n o n - h a b i t u a t e d c e l l s , a t 37 °C, w i t h a e r a t i o n f o r t i m e p e r i o d s o f 5

min a nd 10 min. The r e s u l t s p r e s e n t e d in T a b l e 18 show t h a t t h e h a b i t u a t e d

c e l l s e x h i b i t e d 3 a n d 8 t i m e s m o r e p e r c e n t a g e s u r v i v a l v e r s u s t h e

p e r c e n t a g e s u r v i v a l o f t h e i r c o r r e s p o n d i n g n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s .

T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s a c q u i r e d s o m e

r e s i s t a n c e i n c o n t r a s t w i t h n o n - h a b i t u a t e d c o u n t e r p a r t s a g a i n s t t h e

a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f h y d r o g e n p e r o x i d e .

1 4 3 -

T a b l e 17: E f f e c t o f hyd rogen p e r o x i d e on ED1829GolV, I -K94, h a b i t u a t e d and

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s in NB o f pH 7 . 0 w i t h a e r a t i o n a t 37 °C.

Growth pH of t he c e l Is

G o n c e n t r a t ion o f

hydr ogen p e r o x i d e

*Mean p e r c e n t a g e s u r v i v a l on NA.

T r e a t e d f o r

1 2 mi n 18 min

pH 7 . 0 15 rrM 8 0 . 2

pH 5 . 0 15 itM 30 2 . 1

NA; n u t r i e n t a g a r

* Msan % s u r v i v a l ; v a l u e s r e p r e s e n t % of i n i t i a l c e l l numbers .

The e x p e r i me n t was p e r f o r me d t h r i c e w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 144 -

T a b l e 18: E f f e c t o f hydrogen p e r o x i d e on ED1829ColV,I -K94, h a b i t u a t e d and

n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s in NB o f pH 3 .0 w i t h a e r a t i o n a t 37 °C.

Growth pH of E . c o l i s t r a i n

C o n c e n t r a t ion o f

H2 ° 2

pH 3 . 0 c o n t r o l

* Ivfean % s u r v i v a l on NA

T r e a t e d f o r

5 min 10 min

pH 7 . 0 Yes 38 5

pH 7 . 0 1 0 mM - - 23 0 . 9

pH 5 . 0 Yes 74 41

pH 5 . 0 10 mM 65 7

NA.; n u t r i e n t a g a r .

* Ivfean % s u r v i v a l ; v a l u e s r e p r e s e n t t h e % o f i n i t i a l c e l l numbers .

Expe r i men t was r e p e a t e d t h r i c e w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 145 -

3.3.3. Compa r i s on be t we e n t h e a c i d s e n s i t i v i t y o f E D I 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 c e l l s

g r o w n a t 44 ° C a n d 37 ° C .

B a c t e r i o c i d a l r e s p o n s e t o f a t t y a c i d s , w a s c h e c k e d . T h e r e s u l t s a r e

p r e s e n t e d in T a b l e 19 w h i c h d e m o n s t r a t e s t h a t t h e d e a t h r a t e o f 44 ° C

grown o r g a n i s m s was r e l a t i v e l y s l owe r t h a n t h e d e a t h r a t e o f 37 ° C g r o w n

c e l l s , a t t n e i r e x p o s u r e t o s u c h a c i d s .

C e l l s grown a t 37 °C d e m o n s t r a t e d 9 a nd 42 t i m e s l e s s s u r v i v a l t h a n t h a t

e x h i b i t e d by 44 °C g r o w n c e l l s a t t h e e x p o s u r e t i m e s o f 2.5 a n d 3.5 h r

r e s p e c t i v e l y , on t r e a t m e n t w i t h b u t y r i c a c i d ( T a b l e 19) a n d 4 a n d 10 f o l d

d e c r e a s e i n v i a b i l i t y c o m p a r e d w i t h t h a t o f 44 ° C g r o w n c e l l s o n

t r e a t m e n t w i t h a c e t i c a c i d . S i m i l a r l y on e x p o s u r e t o l a c t i c a c i d , t h e

37 °C o r g a n i s m s e x h i b i t e d 3 a n d 6 t i m e s r e d u c e d v i a b i l i t y c o m p a r e d t o

44 °C g r own c e l l s a t t h e e x p o s u r e t i m e s of 2.5 a n d 3.5 h r r e s p e c t i v e l y .

T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t some s o r t o f r e s i s t a n c e w a s a c q u i r e d a t

44 °C a g a i n s t e x p o s u r e t o weak a c i d s w h i c h m a d e t h e m l e s s p r o n e t o t h e

b a c t e r i o c i d a l a c t i v i t y o f t h e i n h i b i t o r c o m p a r e d w i t h t h e s e n s i t i v i t y

m a n i f e s t e d b y t h e 37 ° C g r o w n c e l l s .

3.4. E f f e c t of a c i d on t h e r e s p i r a t i o n of h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d ,

E D I 8 2 9 Co 1V, I - K9 4 c e l l s a t p H 3 . 0 :

The r a t e of r e s p i r a t i o n f o r t h e h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d c e l l s a t pH

3.0 was d e t e r m i n e d by u s i n g an o x y g e n e l e c t r o d e t o m e a s u r e t h e a m o u n t of

d i s s o l v e d o x y g e n i n t h e NB. R e s p i r a t i o n r a t e s f o r t h e n o n - h a b i t u a t e d

1 4 6 -

NA.; nutrient

agar.

Each experim

ent was

performed

thrice w

ith consistent

results.

*Msan

% su

rviv

al; values

represent the

% of

initial

cell num

bers.

4*4̂

o

tr1o

uno

co-O

O

fft)o

cno

4*4*

n

sra>

cno

CO-o

O

JffD

a

cno

4>4*

o

Wcp+

*$

cno

CO

n

wcc+n

cno

ro h-1 *0 00 (-» CO cn 0. . . . . . CO00

1

30 54 08 ro 0 cn H ft) n D fDft) o\o «■+■fD cn

" j <J

0 -■h-1 ro CO 0 0 0 <. . . . . . CO ft)0 0 CO CO vO 0 . cr —0 vO 4> CO ro

rocn n

0ah J

cW ft) fD r+ Cl r+

ft)oa

9D0D fD

- 3

aCO

1c-Uo*

Table 19:

Effect

of grow

th tem

peratures on

sensitiv

ity

of ED

1829ColV

,I-K94

organisms

to

(pH 7.0 g r own) c e l l s a nd h a b i t u a t e d (pH 5.0 g r o w n ) o r g a n i s m s w e r e 0 . 272

/ j mo l e s / ml / mi n a nd 0.252 j u m o l e s / m l / m i n , r e s p e c t i v e l y , a t t h e i r r e s p e c t i v e

g r o w t h pHs. The c o n s u mp t i o n of o x y g e n f e l l f o r b o t h t y p e s ( n o n - h a b i t u a t e d

and h a b i t u a t e d ) a t a c i d pH. A l t h o u g h t h i s was so , t h e e x t e n t in r e d u c t i o n

of o x y g e n c o n s u m p t i o n was m a r k e d l y mo r e p r o n o u n c e d in t h e n o n - h a b i t u a t e d

c e l l s c ompa r e d w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g a c i d - h ab i t u a t ed o n e s ( T a b l e 20) .

Th e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t s t r o n g l y t h a t r e s p i r a t i o n i s a n a c i d - s e n s i t i v e

p r o c e s s a nd t h e o x y g e n u p t a k e by n o n - h a b i t u a t e d c e l l s i s mor e s u s c e p t i b l e

t o a c i d in c o n t r a s t w i t h t h a t o f a ci d - h ab i t u a t e d o r g a n i s m s . I t m i g h t b e

c o r r e l a t e d w i t h t h e s e n s i t i v i t y t o a c i d k i l l i n g e x h i b i t e d b y b o t h t y p e s of

o r g a n i sm.

3.5. E f f e c t o f a c i d o n m o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s o f h a b i t u a t e d a n d

n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s :

The Co l V, I - K94+ E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s a r e m o t i l e i n s h a k e n c u l t u r e s

a t 37 ° C o r a t 21 - 30 ° C i n s t a t i c o r s h a k e n c o n d i t i o n

( Te wa r i e t a l . , 1986 ) . S t u d y w a s u n d e r t a k e n t o e s t a b l i s h t h e e f f e c t of

a c i d o n m o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s .

3.5.1. E f f e c t o f a c i d on t h e m o t i l i t y o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d ,

E D I 8 2 9Co 1V, I - K9 4 o r g a n i s m s .

A c o m p a r a t i v e s t u d y on t h e e f f e c t o f a c i d p H ( 3 . 0 , 3 . 5 , 4 . 0 ) o n t h e

p e r c e n t a g e m o t i l i t y o f l o g a r i t h m i c a l l y g r o w n , o r g a n i s m s o f

ED1829ColV,I -K94, was u n d e r t a k e n . The r e s u l t s a r e p r e s e n t e d in T a b l e 21

1 4 8 -

T a b l e 20: E f f e c t o f a c i d on r e s p i r a t i o n o f ED1829Col V, I -K94 , h a b i t u a t e d

and n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s .

Growth pH R a t e o f oxygen R a t e o f oxygenof c ons umpt i on in cons umpt i on in

c e l Is ( p mo 1 e s /ml / m i n ) (p mo 1 es /ml /mi n )b e f o r e a d d i t i o n a f t e r a d d i t i o no f a c i d of a c i d

pH 7 . 0 0 .272 0. 027

pH 5 . 0 0 . 252 0 . 066

Expe r i men t was pe r f o r me d s i x t i m e s w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 149 -

a nd show t h a t b o t h t y p e s of c e l l s e x p o s e d t o a c i d i c pH l o s t t h e i r m o t i l i t y

v e r y r a p i d l y . G e n e r a l l y t h e l ower t h e pH v a l u e t h e f a s t e r t h e o r g a n i s m s

l o s t t h e i r mo t i 1 i t y .

When t h e m o t i l i t y of h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s was t e s t e d a t

pH 3.0 , b o t h l o s t t h e i r m o t i l i t y r e a d i l y . A t t h i s p H t h e p e r c e n t a g e

m o t i l i t y of h a b i t u a t e d c e l l s was 3 t i mes mo r e t h a n t h a t o f n o n - h a b i t u a t e d

o r g a n i s m s a t 2 min , a nd a t 3 min t h e p e r c e n t a g e m o t i l i t y o f pH 5.0 g r o w n

c e l l s was 7 t ime s h i g h e r ( as i n d i c a t e d i n T a b l e 21) t h a n t h e m o t i l i t y of

p H 7 . 0 g r o w n o r g a n i s m s .

When t h e m o t i l i t y o f b o t h t y p e s o f c e l l s w a s c h e c k e d a t pH 3 . 5 , b o t h

showed a r e l a t i v e l y h i g h e r p e r c e n t a g e m o t i l i t y t h a n t h a t e x h i b i t e d b y t h e

o r g a n i s m s e x p o s e d t o p H 3.0. T h e p r o p o r t i o n of h a b i t u a t e d o r g a n i s m s

r e m a i n i n g m o t i l e was t w i c e a s g r e a t a s t h a t f o r n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s .

The c e l l s we r e e v e n l e s s s e n s i t i v e a t pH 4.0, w i t h t h e p e r c e n t a g e m o t i l i t y

of h a b i t u a t e d c e l l s b e i n g a g a i n t w i ce a s g r e a t a s t h a t o f n o n - h a b i t u a t e d

o r g a n i s m s .

3 . 5 . 2 . E f f e c t o f a c i d o n c h e m o t a x i s o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

E D I 8 2 9 Co IV, I - K 9 4 c e l l s :

E x p o n e n t i a l l y g r own , h a b i t u a t e d a nd n o n - h a b i t u a t e d , o r g a n i s m s r e s p o n d e d

d i f f e r e n t l y w i t h r e s p e c t t o c h e m o t a x i s f r o m p l u g s c o n t a i n i n g a c i d .

Both t y p e s of o r g a n i s m s (pH 7.0 a nd pH 5.0 gr own) w h e n e x p o s e d t o pH 4.0

d i d n o t e x h i b i t a ny n e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e a nd r e m a i n e d u n a f f e c t e d

a t t h a t pH v a l u e a t room t e m p e r a t u r e . S i mi l a r b e h a v i o u r w a s s h o w n b y t h e

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s w h e n t r e a t e d a t pH 3 . 5 ; on t h e o t h e r h a n d t h e

1 5 0 -

T a b l e 2 1 : E f f e c t o f a c i d on m o t i l i t y of h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d

ED1829ColV, I-K94 c e l l s , a t rocm t e m p e r a t u r e .

Growth pH of t he c e l Is

Ac i dt r e a t m e n t a t pH

p e r

1

c e n a t

2

t a g < t ime in

3

e m o t i m i n u t e s

5

1 i t y

7 1 0

pH 7 . 0 pH 3 . 0 N.D 1 0 . 3 0 . 0

pH 5 . 0 pH 3 . 0 N.D 3 2 . 0 0 . 3

pH 7 . 0 pH 3 . 5 9 7 5 3 1 1

pH 5 . 0 pH 3 . 5 16 13 9 6 3 2

pH 7 . 0 pH 4 . 0 N.D 16 16 19 17 13

pH 5 . 0 pH 4 . 0 N.D 38 34 32 30 24

I n i t i a l m o t i l i t y of b o t h c e l l s ; 100 %

N.D; n o t d e t e r m i n e d

- 151 -

n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s d e m o n s t r a t e d s l i g h t r e p u l s i o n i n d i c a t e d i n t e r m s

of a smal l z o n e of c l e a r a n c e on t r e a t m e n t a t p H 3.5 w h i c h i s i l l u s t r a t e d

in t h e F i g u r e 17 a a n d 17 b . When t h e o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7.0 a n d

pH 5.0 w e r e t r e a t e d a t pH 3.0 , a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e r e w a s a z o n e o f

c l e a r a n c e s e e n o n l y f o r pH 7.0 g r o w n c e l l s i n a l l t h e e x p e r i m e n t s w h i l e

c o m p a r i n g wi t h t h e c o r r e s p o n d i n g pH 5.0 g r own c e l l s a s d e p i c t e d i n F i g u r e

17 c a n d 17 d . T h i s m i g h t imply t h a t t h e n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s h a d t h e

t e n d e n c y t o show n e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e a t a c i d pH v a l u e s w h e r e a s

pH 5.0 g r own c e l l s r em a i n e d u n a f f e c t e d a t t h a t pH v a l u e i n c o n t r a s t w i t h

t h e u n t r e a t e d o r g a n i s m s a t n e u t r a l p H v a l u e . N e g a t i v e c h e m o t a x i s was

p o o r l y e x h i b i t e d by ED1829ColV, I -K94 c e l l s when t r e a t e d w i t h 0.1 % s o d i u m

s u l p h i d e , a s t r o n g r e p e l l e n t , a t r oom t e m p e r a t u r e i n c o m p a r i s o n w i t h t h e

P s e u d o mo n a s a e r u g i n o s a when t r e a t e d u n d e r t h e s i m i l a r c o n d i t i o n s a s s h o w n

i n f i g u r e 17 e a n d 17 f .

The a b o v e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e e f f e c t o f a c i d on b a c t e r i a l m o t i l i t y

a nd n e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e i s i n f l u e n c e d b y g r o w t h pH. O r g a n i s m s

g r own a t pH 7.0 s h o w e d g r e a t e r s e n s i t i v i t y i n t h e i r m o t i l i t y a n d m o r e

n e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e t o a c i d c o m p a r e d w i t h t h a t o f

a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s .

3 . 6 . E f f e c t o f a c i d o n r e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s :

L e a k a g e o f s o m e c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s , a b s o r b a n c e 2 6 0 n m , f r o m

ED1829ColV, I -K94 c e l l s i n t o t h e t r e a t m e n t m e d i u m a f t e r e x p o s u r e t o a c i d

wa s o b s e r v e d . S u c h r e l e a s e f r o m s t a t i o n a r y a n d e x p o n e n t i a l l y g r o w n ,

1 5 2 -

b

F i g . 17. N e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d , ED182 9 C o l V , I - K 9 4 , c e l l s t o a c i d i c v a l u e s , a , p H 7 . 0 g r o w n c e l l s t r e a t e d a t p H 3 . 5 ; b , p H 5 . 0 g r o w n c e l l s t r e a t e d a t p H 3 . 5 .

1 5 3

c

d

F i g . 17. N e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t s d * E D I 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 , c e l l s t o a c i d i c v a l u e s , c , p H 7 . 0 g r o w n c e l l s t r e a t e d a t p H 3 . 0 ; d , p H 5 . 0 g r o w n c e l l s t r e a t e d a t p H 3 . 0 .

1 5 4 -

f

Control

F i g . 17. N e g a t i v e c h e m o t a c t i c r e s p o n s e , e , E D I 82 9 C o l V, I - K 9 4 t r e a t e d w i t h 0.1 % s o d i u m s u l p h i d e ; f , P . a e r u g i n o s a t r e a t e d w i t h 0 . 1 % s o d i u m s u l p h i d e .

1 5 5

h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s w a s s t u d i e d .

3 . 6 . 1 . L e a k a g e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s f r o m s t a t i o n a r y p h a s e c e l l s .

A c i d t r e a t m e n t of s t a t i o n a r y p h a s e c e l l s c a u s e d t h e r e l e a s e o f s o m e

c o mp o n e n t s wh i ch a b s o r b e d a t 260 nm. Bot h h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

c e l l s l e a k e d c o m p o u n d s i n t o t h e e n v i r o n m e n t b u t t h e d i f f e r e n c e i n t h e

e x t e n t of l e a k a g e b e t w e e n t h e h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d c e l l s w a s

r e m a r k a b l e . T a b l e 22 i n d i c a t e s t h a t t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s l e a k e d 10

t i m e s a s m u c h i n t e r m s o f a b s o r b a n c e a t 260 nm a s t h e i r c o u n t e r p a r t

h a b i t u a t e d c e l l s w h e n a c i d e x p o s e d f o r 5 m i n . T h e a m o u n t o f l e a k e d

m a t e r i a l s wa s 7 t i m e s h i g h e r f r o m n o n - h a b i t u a t e d c e l l s t h a n f r o m

h a b i t u a t e d c e l l s a t t h e t r e a t m e n t p e r i o d o f 1 0 m i n w h e r e a s o n f u r t h e r

p r o l o n g i n g t h e t r e a t m e n t t o 15 min, 6 t i m e s m o r e r e l e a s e d m a t e r i a l s w e r e

o b s e r v e d f r o m t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s t h a n t h e i r c o r r e s p o n d i n g h a b i t u a t e d

c e l l s .

3 . 6 . 2 . L e a k a g e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s f r o m e x p o n e n t i a l p h a s e c e l l s .

When e x p o n e n t i a l l y g r own, h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d , o r g a n i s m s w e r e

t r e a t e d w i t h a c i d a t pH 3.0 , c e l l u l a r l e a k a g e w a s o b s e r v e d ( T a b l e 23) .

The n o n - h a b i t u a t e d c e l l s showed mor e l e a k a g e t h a n t h e h a b i t u a t e d c e l l s a t

a t r e a t m e n t t i me of 5 min w h e r e a s a t a t r e a t m e n t t i me of 1 0 m i n t h e r e wa s

o n l y a s l i g h t d i f f e r e n c e i n t h e a m o u n t o f t h e r e l e a s e d c e l l u l a r

c o n s t i t u e n t s f r o m t h e n o n - h a b i t u a t e d a nd h a b i t u a t e d c e l l s . On p r o l o n g i n g

t h e t r e a t m e n t t o 15 m i n , t h e a m o u n t o f r e l e a s e d m a t e r i a l s f r o m t h e

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s was a l m o s t t w i c e h i g h e r t h a n f r o m t h e h a b i t u a t e d

156 -

T a b l e 22: E f f e c t o f a c i d on s t a t i o n a r y p h a s e ED1829ColV, I -K94 c e l l s ;

r e l e a s e of c e l l u l a r co.-ist i t u e n t s .

Growth pH of t h e c e l Is

Time of a c i d t r e a t m e n t a t pH 3 . 0 i n mi n

Med i n na b s o r b a n c e a t 260 nm

pH 7 . 0 5 0 . 204

pH 5 . 0 5 0 . 0 2 1

pH 7 . 0 1 0 0 . 217

pH 5 . 0 1 0 0 . 033

pH 7 . 0 15 0.181

pH 5 . 0 15 0 . 028

Expe r i men t was p e r f o r me d t h r i c e w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 157 -

T a b l e 23: E f f e c t o f a c i d on e x p o n e n t i a l p h a s e ED1829ColV, I -K94 c e l l s ;

r e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s .

Growt h pH o f t h e c e l I s

Time o f a c i d t r e a t m e n t a t pH 3 . 0 i n mi n

Msdiuma b s o r b a n c e a t 260 nm

pH 7 . 0 5 0 . 1 6 3

pH 5 . 0 5 0 . 1 0 8

pH 7 . 0 1 0 0 . 0 9 7

pH 5 . 0 1 0 0 . 0 7 9

pH 7 . 0 15 0 . 1 4 6

pH 5 . 0 15 0 . 0 8 7

E x p e r i m e n t was p e r f o r m e d t h r i c e w i t h c o n s i s t e n t r e s u l t s .

- 158 -

c e l l s .

3 . 7 . I n d u c t i o n o f s t r e s s - r e 1 a t e d p r o t e i n s a t p H 5 . 0 :

3 . 7 . 1 . P r o t e i n s y n t h e s i s a t 37 ° C f o r c e l l s g r o w n a t p H 7 . 0 a n d

p H 5 . 0 .

R e s i s t a n c e e x h i b i t e d by pH 5.0 g r own c e l l s a g a i n s t k i l l i n g b y a c i d m i g h t

b e d u e t o t h e i n d u c t i o n o f s ome s t r e s s p r o t e i n s . T h i s w a s s t u d i e d b y

o n e - d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . The o r g a n i s m s g r o w n a t

37 °C, pH 5.0 s h o w e d i n c r e a s e d l e v e l s o f s e v e r a l c y t o p l a s m i c p r o t e i n s

( Tab le 24 a nd F i g u r e 18) c ompar ed t o pH 7.0. A d d i t i o n a l l y , o n e p r o t e i n a t

l e a s t (K, c a 63 k Da ) a p p e a r e d t o b e i n d u c e d o n l y a t p H 5 . 0 a n d o n e

(L, c a 35 k D a ) w a s r e p r e s s e d a t t h i s p H.

S u b s e q u e n t l y i n d u c t i o n a t 37 ° C o f c y t o p l a s m i c p r o t e i n s i n pH 5.0 c e l l s

w a s r e c o n f i r m e d w h e n t h e c e l l e x t r a c t s f r o m pH 5.0 a n d pH 7 .0 , g r o w n

o r g a n i s m s w e r e s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s b y 2 d i m e n s i o n a l

S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s . T h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 25 a n d

F i g u r e 19 w h i c h i l l u s t r a t e s t h a t pH 5.0 g r o w n o r g a n i s m s , a t 37 ° C ,

showed i n c r e a s e d s y n t h e s i s of s e v e r a l c y t o p l a s m i c p r o t e i n s c o m p a r e d w i t h

p H 7 . 0 g r o w n o r g a n i s m s .

3.7.2. P r o t e i n s y n t h e s i s o f 24 ° C g r o w n pH 7.0 v e r s u s pH 5.0 o r g a n i s m s .

A c o m p a r a t i v e s t u d y o f t h e s y n t h e s i s o f c y t o p l a s m i c p r o t e i n s a t 24 ° C

was p e r f o r m e d by e l e c t r o p h o r e s i n g t h e c e l l e x t r a c t s , o f pH 7.0 a n d pH 5.0

- 1 5 9 -

T a b l e 24. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d i n ED1829GolV,I-K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0

and pH 5 . 0 , a t 37 °C, s t u d i e d by un i d i m e n s i o n a l g e l .

P o l y p e p t i d e s c a M.W i n kDa

S y n t h e s i s a t pH 5 . 0

S y n t h e s i s a t pH 7 . 0

A 95 ++ +

B 82 ++ +

C 73 ++ +

D 6 8 ++ +

E 60 ++ +

F 51 ++ +

G 40 ++ +

H 37 ++ +

I 18 ++ +

J 16 ++ +

K 63 + -

L 35 + ++

R e p r e s e n t a t i v e o f f o u r g e l s . +; 1 ow 1 e v e 1

++; h i g h l e v e l - ; n o t p r e s e n t

- 160 -

F i g . 1 8 . P r o t e i n s i n d u c e d i n E D I 8 2 9 C o 1V, I - K9 4 a t p H 5 . 0 a n d 3 7 ° C , s t u d i e d b y u n i d i m e n s i o n a l g e l . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i h t s : 66 k D a , n o . l ; 4 5 k D a , n o . 2 ; 36 k D a , n o . 3; 29 k D a , n o . 4; 24 k D a , n o . 5; 19 k D a , n o . 6. L a n e s 1 a n d 3, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5 . 0; l a n e s 2 a n d 4, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

T a b l e 25. P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in ED1829GolV,I-K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0

and pH 5 . 0 , a t 37 ° ( j t s t u d i e d by b i d i m e n s i o n a l g e l .

P o l y p e p t i d e s ca M.W in kDa

S y n t h e s i s a t pH 5 . 0

S y n t h e s i s a t pH 7 . 0

A 95 ++ +

B 82 ++ +

C 73 ++ +

D 6 8 ++ +

E 60 ++ +

F 51 ++ +

G 40 ++ +

H 37 ++ +

1 18

J 16 ++ +

K 63 + -

L 32 + + +

M 49 ++ +

N 45 ++ +

O 38 ++ +

P 57 ++ +

Q 50 + + +

R e p r e s e n t a t i v e o f t h r e e g e l s . +; 1 ow 1 e v e 1

++; h i g h 1 e v e l n o t p r e s e n t .

- 162 -

A

BAo

0 o C

D oE oQ ° M o °r

0 H -

G Hof 0

o K

° P

o + O

:LO

J

23U

5G

B

A M 0

B o o CD ° o K 1

E °o ° P

q o h o F ; Jp ~

° N n 2G o o - 0 1

< — 3< — A

— 5 < — 6

PI o L

ooJ

F i g . 19. P r o t e i n s i n d u c e d i n E D I 8 2 9 C o l V, I - f C9 4 a t p H 5 . 0 , 3 7 C s t u d y b y b i d i m e n s i o n a l g e l . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k D a , n o . l ; 45 k D a , n o . 2 ; 36 k D a , n o . 3; 29 k D a , n o . 4 ; 24 k D a , m o . 5; 19 k D a , n o . 6 . A, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5 . 0 ; B, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

1 6 3

F i g . 19. P r o t e i n s i n d u c e d i n E D I 82 9 C o 1V, 1 - K9 4 a t p H 5 . 0 , 37 C s t u d y b y b i d i m e n s i o n a l g e l . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k D a , n o . l ; 45 k D a , n o . 2; 3 6 k D a , n o . 3 ; 2 9 k D a , n o . 4; 2 4 k D a , n o . 5; 19 k D a , n o . 6. A, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5 . 0 ; B, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

1 6 3

o r g a n i s m s . O r g a n i s m s g r o w n a t pH 7.0 h a d i n c r e a s e d l e v e l s o f c e r t a i n

p r o t e i n s ( Tab l e 26 and F i g u r e 20), c o mp a r e d w i t h pH 5.0 g r own o r g a n i s m s a t

24 °C. In some e x p e r i m e n t s , p r o t e i n A, c a 95 k D a w a s i n d u c e d o n l y i n pH

7 . 0 g r o wn c e l l s .

When t h e c e l l e x t r a c t s of pH 7.0 and pH 5.0 g r own o r g a n i s m s we r e s u b j e c t e d

t o p o l y a c r y l a m i d e 2 d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s , t h e pH 7.0 g r o w n

o r g a n i s m s s h o w e d i n c r e a s e d s y n t h e s i s o f s o me p r o t e i n s ( T a b l e 27 a n d

F i g u r e 21). A d d i t i o n a l l y p r o t e i n A ( in s a n e e x p e r i m e n t s b u t n o t a l l ) , w i t h

a n a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t o f 92 - 95 k D a , w h i c h w a s e i t h e r

e x c l u s i v e l y s y n t h e s i s e d by pH 7.0 g r own c e l l s o r i n d u c e d in v e r y v e r y l ow

q u a n t i t y i n p H 5 . 0 o r g a n i s m s , w a s c o m p a r a b l e t o L o n p r o t e i n .

3 . 7 . 3 . P r o t e i n s y n t h e s i s o f o r g a n i s m s g r o w n a t 44 ° C a n d p H 7 . 0

o r p H 5 . 0 .

When t h e c e l l e x t r a c t s w e r e s u b j e c t e d t o u n i d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s on

S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l , pH 7.0 g r own o r g a n i s m s showed i n c r e a s e d s y n t h e s i s

of s ome p r o t e i n s ( c o m p a r e d w i t h p H 5 . 0 , 44 ° C g r o w n o r g a n i s m s ) a s

i n d i c a t e d i n T a b l e 28 a n d F i g u r e 22. T h e r e w a s a n a d d i t i o n a l p r o t e i n

(C, ca . 72 - 73 kDa) wh i ch seemed t o b e i n d u c e d on l y in o r g a n i s m s g r o wn a t

p H 7 . 0 , 44 ° C .

3 . 7 . 4 . T i me c o u r s e f o r i n d u c t i o n o f s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s a t 37 ° C

b y p H 7 . 0 g r o w n v e r s u s p H 4 . 3 t r a n s f e r r e d o r g a n i s m s .

Though i n d u c t i o n of a c i d - r e s i s t a n c e ( h a b i t u a t i o n ) o c c u r r e d in NB pH 5.0

- 1 6 4 -

T a b le 26. P o l y p e p t i d e s induce d in ED1829CblV, I-K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0

and pH 5 . 0 , a t 24 °C, s t u d y t h r o u g h uni d i m e n s io n a l g e l .

P o l y p e p t i d e ca M.W in kDa

S y n t h e s i s a t pH 5 . 0

S y n t h e s i s a t pH 7 . 0

A 95 - + / -

B 82 - +

C 73 + + +

D 6 8 + ++

Z 79 - / + +

Ta b l e 27: P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d i n ED1829ColV, I -K94 c e l l s grown a t pH 7 . 0

and pH 5 . 0 , a t 24 °C, s t u d y by b i d i m e n s i o n a l g e l .

Po l y p e p t i d e s ca M.W S y n t h e s i s S y n t h e s i sin kDa a t pH 5 . 0 a t pH 7 . 0

A 95 _ _

B 82 + ++

C 73 + ++

D 6 8 + ++

Z 79 + / - ++

R 65 +

R e p r e s e n t a t i v e o f f o u r g e l s .+/- ; no t o v e r y low l e v e l + ; low l e v e l ++ ; h i g h 1 eve l

- 165 -

23U

nr f M

B

D

1 2

F i g . 20. P r o t e i n s i n d u c e d i n E D I 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 a t p H 5 . 0 , 2 4 ° C s t u d y b y u n i d i m e n s i o n a l g e l . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s ; 66 k D a , n o . l ; 45 k D a , n o . 2 ; 36 k D a , n o . 3 ; 2 9 k D a , n o . 4 ; 2 4 k D a , n o . 5; 19 k D a , n o . 6. L a n e 1, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5 . 0 ; l a n e 2 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

1 6 6 -

z®A

° DoR

o C1

2h

56

B

o Do

R

□ C

B

2 3

456

F i g . 21. P r o t e i n s i n d u c e d i n E D l h b i d i m e n s i o n a l g e l . P r o t e i n s t a n d a r :• 66 k Da , n o . l ; 45 k D a , n o . 2; 36 « D a , 19 k Da , n o . 6. A, p r o t e i n s f r o m o r g f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0

V , l - K 9 4 a t p H 5 . 0 , 24 ° C s t u d y b y r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : >. i ; 29 k D a , n o . 4; 24 k D a , n o . 5; isms g r o w n a t p H 5 . 0 ; B, p r o t e i n s

F i g . 21. P r o t e i n s i n d u c e d i n E D I 82 9 C o 1V, I - K 9 4 a t p H 5 . 0 , 24 ° C s t u d y b y b i d i m e n s i o n a l g e l . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k Da , n o . l ; 45 k D a , n o . 2; 36 k D a , n o . 3; 29 k D a , n o . 4; 24 k D a , n o . 5; 19 k Da , n o . 6. A, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5 . 0 ; B, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

T a b l e 28: P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d i n ED1829GolV, I-K94 c e l l grown a t pH 7 . 0

and pH 5 . 0 , a t 44 °C, s t u d i e d by uni d i m e n s i o n a l g e l .

P o l y p e p t i d e s ca M.W in kDa

S y n t h e s i s a t pH 5 . 0

S y n t h e s i s a t pH 7 . 0

A 95 + +

B 82 + +

C 73 - -

D 6 8 + + ++

E 60 ++ ++

F 51 + + ++

G 40 ++ ++

H 37 + ++

I 18 + + ++

X 2 1 ++ ++

K 63 + + ++

L 35 - -

V 72 - +

W 47 + ++

R e p r e s e n t a t i v e o f f o u r g e l s . + / - ; no t o v e r y low l eve l +; low l e v e l ++; h i g h l e v e l

- 168 -

AB

~

.K:

C D E

F — >W , ----------►

H G

L

IP -

1 2 3 A 5

— 2

— 3< — A

5— 6

F i g . 22. P r o t e i n s i n d u c e d i n E D I 8 2 9 C o l V, I - K 9 4 a t p H 5 . 0 , 44 ° C . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k D a , n o . l ; 45 k D a , n o . 2;36 k D a , n o . 3; 2 9 k D a , n o . 4 ; 2 4 k D a , n o . 5 ; 1 9 k D a , n o . 6 . L a n e 1 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5 . 0 , 44 C; l a n e 2, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 , 44 C; l a n e 3 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m g r o w n a t p H 5 . 0 , 37 C; l a n e 4 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m g r o w n a t p H 7 . 0 ,3 7 C ; l a n e 5 , p r o t e i n s t a n d a r d m a r k e r s .

169

w i t h i n 5 t o 10 min (Raja e t 1 99 1 a ; T a b l e 1) y e t p r e v i o u s l y s y n t h e s i s

of a c i d - i n d u c e d p r o t e i n s was s t u d i e d , t h r o u g h PAGE, f r o m t h e c e l l s o f l a t e

e x p o n e n t i a l t o e a r l y s t a t i o n a r y p h a s e ( R a j a e t a l . , 1 9 9 1 a ) . T h e r e f o r e ,

t ime c o u r s e f o r i n d u c t i o n of s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s w a s c a r r i e d o u t b y

a u t o r a d i o g r a p h y .

Ce l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d f r o m pH 7.0 g r o w n a n d pH 4.3 t r a n s f e r r e d

3 5o r g a n i s m s whi ch had b e e n p u l s e l a b e l l e d f o r 10 m i n w i t h S m e t h i o n i n e .

T h e s e w e r e t h e n s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s b y u n i d i m e n s i o n a 1

p o l y a c r y l a m i d e g e l . A c i d - s h o c k (pH 4.3) c e l l s f r o m b o t h t h e s t r a i n s

i n d u c e d t h e s y n t h e s i s o f s ome p r o t e i n s w h i c h w e r e e i t h e r m i s s i n g o r

p r o d u c e d in r e d u c e d a m o u n t i n pH 7.0 g r o w n o r g a n i s m s a n d t h e r e s u l t s

a r e i l l u s t r a t e d i n T a b l e 29 a n d F i g u r e s 23 a n d 2 4 . P r o t e i n

T, c a 20 - 22 k D a , w a s o b s e r v e d i n s o m e e x p e r i m e n t s .

3.8. P h o s p h a t e e f f e c t on n e w p r o t e i n s y n t h e s i s b y E . c o l i a t p H 4 . 3 .

H a b i t u a t i o n i n v o l v e s t h e s y n t h e s i s of s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s i n NB of pH

5.0 a t 37 ° C ( R a j a e t a l . , 1 9 9 1 a ) . T h i s s t u d y w a s c o n d u c t e d t o o b s e r v e

any impac t of p h o s p h a t e on s y n t h e s i s of s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s a t pH 4.3 .

The c e l l e x t r a c t s p r e p a r e d f r o m P 6 7 8 - 5 4 a n d P 6 7 8 - 5 4 ompA s t r a i n s , ( a s

e x p l a i n e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) w e r e s u b j e c t e d t o p o l y a c r y l a m i d e

u n i d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s f o r a u t o r a d i o g r a p h y . S e v e r a l p r o t e i n s

a r e s y n t h e s i s e d in much l a r g e r a m o u n t s i n t h e f i r s t f e w m i n u t e s a f t e r a

s h i f t t o pH 4.3 t h a n a t p H 7 . 0 p r i o r t o s h i f t b y b o t h t h e s t r a i n s

( T a b l e 29 a n d F i g u r e 23 a n d 24) . M o s t o f t h e s e i n d u c e d p r o t e i n s a r e

p r o d u c e d a t pH 4.3 + 1 0 - 2 5 mM p h o s p h a t e b u t i n r e d u c e d a m o u n t i n

P678- 54 ompA ( Fig . 25), b u t n o t i n P 6 7 8 - 5 4 ( F i g . 26) . T h i s s u g g e s t s t h a t

- 1 7 0 -

T a b l e 29: P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d i n P678-54 and P678-54 crnpA a t pH s h i f t

f r a n pH 7 . 0 t o 4 . 3 , a t 37 °C, s t u d i e d by a u t o r a d i o g r a p h y of

uni d i me n s i o n a l g e l .

P o l y p e p t i d e s ca M.W in kDa

Syn t he s i s a t pH 4 . 3

S y n t h e s i s a t pH 7 . 0

C 73 + + +

D 6 8 ++ +

E 60 + v +

F 51 ++ +

L 35 ++ +

S 30 ++ +

T 2 0 ++ +

R e p r e s e n t a t i v e o f f o u r g e l s . + ; 1 ow 1 eve I ++; h i g h l e v e l

- 171 -

J — >

A

D

LS

T

F i g . 2 3. P r o t e i n s i n d u c e d a t a c i d - s h i f t f r o m p H 7 . 0 t o 4 . 3 i n P 6 7 8 - 5 4 . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k D a , n o . 1; 45 k D a , n o . 2 ; 3 6 k D a , n o . 3 ; 2 9 k D a , n o . 4; 2 4 k D a , n o . 5 ; 1 9 k D a , n o . 6 . L a n e 1, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 ; l a n e 2 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s o n a c i d s h i f t a t p H 4 . 3 .

172

1

3 — >

U

< — F

F i g . 2 4 . P r o t e i n s i n d u c e d a i a c i d - s h i f t f r o m p H 7 . 0 t o 4 . 3 i n P 6 7 8 - 5 4 o mp A. P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 6 6 k Da , n o . 1; 45 k D a , n o . 2; 36 k D a , n o . 3; 2 9 k D a , n o . 4 ; 2 4 k D a , n o . 5 ; 1 9 k D a , n o . 6 . L a n e 1 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 ; l a n e 2 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s o n a c i d s h i f t a t p H 4 . 3 .

1 73

Ta b l e 30: P o l y p e p t i d e s s y n t h e s i s e d in P678-54 and P678-54 cmpA on a c i d s h i f t

a t pH 4 . 3 and pH 4 . 3 + 10 rrM p h o s p h a t e s t u d i e d by a u t o r a d i o g r a p h y

of u n i d i m e n s i o n a l g e l .

P o l y p e p t i d e s ca M.W in kDa

I n d u c t i o n in P673-54 anpA a t

I n d u c t i o n i n P678-54 a t

pH 4 . 3 pH 4 . 3+10 irM P pH 4 . 3 PH 4 . 3 + 10 nM P

C 73 + + + ++ + / -

D 6 8 + + ++ + / -

E 60 ++ + ++ + / -

F 51 ++ + ++ + / -

L 35 ++ + ++ ►/-

S 30 + + + ++ + / -

T 2 0 + + + ++ + / -

R e p r e s e n t a t i v e of f o u r g e l s . + / - ; no t o v e r y low l e v e l + ; low l e v e l ++ ; h i g h 1 e ve l

- 174 -

5

6T

1 2 3

F i g . 2 5 . P r o t e i n s i n d u c e d a t a c i d - s h i f t f r o m p H 7 . 0 t o 4 . 3 , i n P 6 7 8 - 5 4 ompA, a n d a t p H 4. 3 + 10 mM p h o s p h a t e . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k D a , n o . 1; 45 k D a , n o . 2 ; 36 k D a , n o . 3; 29 k Da , no . 4; 24 k Da , no . 5; 19 k D a , n o . 6. L a n e 1, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7. 0; l a n e 2, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s o n a c i d s h i f t a t p H 4 . 3 ; l a n e 3 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s o n p H 4 . 3 + 1 0 mM p h o s p h a t e .

2 3 6

F i g . 26. P r o t e i n s i n d u c e d a t a c i d - s h i f t f r o m p H 7 . 0 t o 4 . 3 , i n P 6 7 8 - 54 , a n d a t p H 4 . 3 + 2 5 mM p h o s p h a t e . P r o t e i n s t a n d a r d s ( a r r o w e d ) a r e o f m o l e c u l a r w e i g h t s : 66 k D a , n o . 1; 45 k D a , n o . 2; 36 k D a , n o . 3; 2 9 k D a , no . 4; 24 k Da , n o . 5; 19 k Da , n o . 6. L a n e 1, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7. 0; l a n e 2, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s o n a c i d s h i f t a t p H 4 . 3 ; l a n e 3, p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s on p H 4. 3 + 25 mM p h o s p h a t e ; l a n e 4 , p r o t e i n s f r o m o r g a n i s m s o n a c i d s h i f t a t p H 4 . 3 .

176

a c i d - h a b i t u a t i o n c a n b e i n h i b i t e d b y a d d i t i o n o f p h o s p h a t e a t l ow pH.

3 . 9 . P l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d o r g a n i s m s :

S i n c e b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e DNA c o u l d b e s t u d i e d t h r o u g h

t r a n s f o r m a t i o n , pBR 322 p l a s mi d DMA was u s e d t o s t u d y h o w t r a n s f o r m a t i o n

a b i l i t y was a f f e c t e d by a c i d - e x p o s u r e o f EDI 8 2 9ColV, I - K 9 4 . p B R 322 c e l l s .

DNA d a m a g e , o f a c i d - e x p o s e d c e l l s , w a s a l s o s t u d i e d d i r e c t l y b y

e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n o n a g a r o s e g e l s .

3 . 9 . 1 . a . T r a n s f o r m i n g a b i l i t y o f p BR 322 f r o m a c i d - t r e a t e d o r g a n i s m s :

The h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d d o n o r c e l l s , h a r b o u r i n g pBR 322 p l a s m i d ,

we r e t r e a t e d w i t h a c i d f o r v a r i a b l e l e n g t h s o f t ime a nd t h e i r p l a s m i d DNAs

we r e i s o l a t e d f o r t r a n s f o r m a t i o n p u r p o s e s . T h e p e r c e n t a g e t r a n s f o r m a t i o n

of h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s g a v e a n i n d i c a t i o n o f t h e

e x t e n t o f DNA d a m a g e d o n e b y t h e a c i d .

10 m i n a c i d - t r e a t e d p l a s m i d DNA f r o m h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

o r g a n i s m s d i d n o t t r a n s f o r m pH 7.0 g r own c o m p e t e n t c e l l s a t a l l ( T a b l e 31

and F i g u r e 27) c ompar ed t o t h e u n t r e a t e d c o n t r o l s . T h e s e r e s u l t s a r e in

a c c o r d w i t h t h e r e s u l t s of a g a r o s e g e l w h e r e no c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r

(ccc) o r ope n c i r c u l a r (oc) p l a s m i d DNA was s e e n in t h e e x t r a c t s o f 10 mi n

t r e a t e d h a b i t u a t e d and n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s ( F i g . 27) . T h i s p r o b a b l y

means t h a t 10 min t r e a t m e n t m i g h t b e t o o i n j u r i o u s f o r t h e d o n o r DNA t o

- 1 7 7 -

178

MXX5a>H

B>cn

nCmT!ft)B>c+CDa

0 0 )

1 r+3"

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- a pj CDh- 0Q c+B> V-* -§ ? 0

3

c ►*> c r r+ 503 ’"t *■< "I pjr+ Q PJ r+1 3 'O 3 H.CD t- Cl) oJ ) r t ( ) H ir-r n cn 0CD CD 3 3a 0) 3. 3

r+ CL Pn f t ^ r+cd a n »-•

— >t> 3cn

3r+o0n00BJ3

0Q■nQ

r+

■£-oo

Table

31: B

iological activity

of plasm

id DNA

from acid

-treated

(10 m

in) ce

lls

t r a n s f o r m t h e r e c i p i e n t c e l l s i n c o n t r a s t w i t h t h e u n t r e a t e d c o n t r o l s .

The p l a s mi d ENA f r o m 7 min a c i d - t r e a t e d c e l l s o f b o t h t y p e s t r a n s f o r m e d

pH 7.0 g r own r e c i p i e n t s . The p e r c e n t a g e t r a n s f o r m a t i o n of t h e a c i d - t r e a t e d

p l a s mi d DNA f r o m h a b i t u a t e d c e l l s was m a r k e d l y m o r e t h a n t h a t o f t h e

t r e a t e d n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s ( T a b l e 32) . T h i s s u g g e s t s t h a t p l a s m i d

f ro m pH 5.0 g r own o r g a n i s m s i s l e s s damaged b y a c i d t h a n t h a n t h a t f r o m

o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

T h i s was in a c c o r d w i t h t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s e x h i b i t e d b y t h e 7 m i n

p r e t r e a t e d DNA on a g a r o s e ge l w h e r e t h e h a b i t u a t e d DNA was damaged l e s s in

c o m p a r i s o n w i t h n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s ( F i g . 2 8 ) . T h e r a t i o s o f

t r a n s f o r m a t i o n b y p l a s m i d DNA f r o m t r e a t e d / u n t r e a t e d c e l l s f o r t h e

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s w e r e 3 - 5 f o l d mor e t h a n f o r n o n - h a b i t u a t e d c e l l s a s

d e p i c t e d b y t h e s e r e p r e s e n t a t i v e e x p e r i m e n t s .

3 . 9 . 1 . b . I n c r e a s e d r e p a i r b y h a b i t u a t e d c e l l s :

P l a s mi d i s o l a t e d ( a f t e r a c i d t r e a t m e n t ) f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t pH 5.0 o r

pH 7.0 was u s e d t o t r a n s f o r m r e c i p i e n t s g r own a t t h e t wo pH v a l u e s . B o t h

t y p e s of a c i d - d a m a g e d p l a s m i d ( i . e f r o m o r g a n i s m s g r o w n a t pH 5.0 a n d

pH 7.0 r e s p e c t i v e l y ) p r o d u c e d m o r e t r a n s f o r m a n t s i n h a b i t u a t e d t h a n i n

n o n - h a b i t u a t e d c o mp e t en t o r g a n i s m s ( Ta b l e 33) . T h i s o b s e r v a t i o n s t r o n g l y

s u g g e s t s t h a t a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s can r e p a i r a c i d - d a m a g e d p l a s m i d b e t t e r

t h a n n o n - h a b i t u a t e d o n e s .

- 1 7 9 -

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O ( I f t(v a n!—> J> D

Table 32:

Biological

activity of

plasmid

DNA. from

acid-treated (7

min)

cells transform

ed into

organisms

grown at

pH 7.0

Experim

ent was

repeated five

times

with

consistent resu

lts.

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Table 33:

Increased repair

of acid-dam

aged plasm

id DNA.

in acid-habituated

ce

lls.

3 . 9 . I . e . B i o c h e m i c a l b a s i s o f DNA r e p a i r .

P l a s mi d DNA was i s o l a t e d f r o m 5 min a c i d - t r e a t e d o r g a n i s m s t o t r a n s f o r m

pH 7.0 g r own c o mp e t en t c e l l s b e l o n g e d t o GW1000, GW1060, AB1157 , DP1152

and AB2463 t o know t h e b i oc h e m i c a l b a s i s f o r ENA r e p a i r . T h e r e s u l t s a r e

p r e s e n t e d in T a b l e 34 wh i ch s u g g e s t s t h a t polA, r e c A a n d u v r A a r e r e q u i r e d

f o r DNA r e p a i r .

3 . 9 . 2 . E l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y o f a c i d - t r e a t e d pBR 322 p l a s m i d DNA:

E D 1 8 2 9 C o l V , I - K 9 4 . p B R 322, h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d , c e l l s w e r e

a c i d - t r e a t e d f o r v a r i a b l e p e r i o d s o f t i m e . I s o l a t e d p l a s m i d pBR 322 DNA

was s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s , t o o b s e r v e d i r e c t l y a n y d a m a g e t o i t s

a c i d - t r e a t e d DNA, t h r o u g h a g a r o s e g e l s ( a s e x p l a i n e d e a r l i e r i n t h e

M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) .

T h e e x t e n t o f DNA d a m a g e b y 10 m i n o f a c i d t r e a t m e n t i s s h o w n i n

F i g u r e 27, wh i c h i n d i c a t e s t h a t e x p o s u r e m i g h t b e t o o i n j u r i o u s t o s h o w

any (ccc) o r (oc) DNA b a n d s f r o m t r e a t e d c e l l s c o m p a r e d w i t h u n t r e a t e d

c o n t r o l s .

The ENA damage e x h i b i t e d by a c i d f o r 7 m i n t r e a t m e n t t i m e i s s h o w n in

F i g u r e 28, w h i c h i l l u s t r a t e s t h a t n o c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r ( c c c )

p l a s mi d w a s o b s e r v e d on a g a r o s e g e l s w h e n e x t r a c t s f r o m a c i d t r e a t e d

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s a t pH 3.0 was e xa mi ne d in a l l t h e e x p e r i m e n t s . On t h e

o t h e r h a n d i n s e v e r a l e x p e r i m e n t s ( b u t n o t a l l ) , c o v a l e n t l y c l o s e d

c i r c u l a r (ccc) p l a s mi d was s e e n in e x t r a c t s f r o m a c i d t r e a t e d o r g a n i s m s

grown a t pH 5.0. T r a c e s of open c i r c u l a r (oc) p l a s m i d DNA w e r e a l s o s e e n

1 8 2 -

Experim

ent was

repeated thrice

with

consistent resu

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> £ 3

ffr+*M*0

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Table 34:

Biological

activity of

plasmid

ENA frcm

acid-treated cells

transformed

into

recipients grown

at pH

7.0

1 2 3 A 5 6 7 8

Chromosomal9> DNA

> pBR 322p lasm id DNA

F i g . 2 7 . P l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d ( p H 3 . 0 f o r 1 0 m i n ) p B R 3 2 2 F . c o l i . T r a c k s 1 a n d 4, p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H 5 . 0 c e l l s ; t r a c k s 2 a n d 3, p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 5. 0 c e l l s ; t r a c k s 5 a n d 8 , p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H 7 . 0 c e l l s ; t r a c k s 6 a n d 7 , p l a s r n i d D N A f r o m a c i d - t r e a t e d p H 7 . 0 c e l l s .

- 184 -

1 2 3 A 5 G 7 8

H I

1

■

ChromosomalDNA

pBR 322 p lasm id DNA

F i g . 2 8. P l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d ( p H 3 . 0 f o r 7 m i n ) p B R 3 2 2 + E . c o l i . T r a c k s 1 a n d 4, p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H 5 . 0 c e l l s ; t r a c k s 2 a n d 3, p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 5. 0 c e l l s ; t r a c k s 5 a n d 8 , p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H 7 . 0 c e l l s ; t r a c k s 6 a n d 7 , p l a s m i d D N A f r o m a c i d - t r e a t e d p H 7 . 0 c e i l s .

- 185 -

i n t h e e x t r a c t s f r o m a c i d t r e a t e d o r g a n i s m s g r own a t pH 5.0. W h e r e a s g o o d

p l a s mi d b a n d s w e r e o b s e r v e d i n t h e t r a c k s o f u n t r e a t e d , h a b i t u a t e d a n d

n o n - h a b i t u a t e d , o r g a n i s m s .

When 7 m i n a c i d - t r e a t e d p B R 3 2 2 p l a s m i d b e a r i n g , h a b i t u a t e d a n d

n o n - h a b i t u a t e d , o r g a n i s m s w e r e i n c u b a t e d f o r a p e r i o d o f 30 m i n ( a s

e x p l a i n e d in M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) a f t e r e x p o s u r e f o l l o w e d b y p l a s m i d

e x t r a c t i o n a n d e l e c t r o p h o r e s i s , a s i n d i c a t e d i n F i g u r e 29 , b o t h t y p e s

( h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d ) c o n t a i n e d c c c DNA ( e v e n i f n o n e w e r e

i s o l a t e d i m m e d i a t e l y a f t e r t r e a t m e n t ) b u t t h e r e w a s a l w a y s m o r e i n t h e

c e l l s g r own a t pH 5 .0 . T h i s ma y m e a n t h a t a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s r e p a i r

b e t t e r t h a n n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s .

The damage d o n e by a c i d t o t h e pBR 322 p l a s mi d DNA f o r 5 min t r e a t m e n t i s

p r e s e n t e d in F i g u r e 30, wh i ch d e m o n s t r a t e s t h a t t h e p l a s m i d DNA i n ( c c c )

f o r m was o b s e r v e d in t h e t r a c k s of b o t h t y p e s of t r e a t e d c e l l s i n c o n t r a s t

wi t h u n t r e a t e d c e l l s b u t t h e r e was a l w a y s mor e c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r

(ccc) DNA f r o m t h e t r e a t e d o r g a n i s m s g r o w n a t p H 5.0 c o m p a r e d w i t h t h e

e x t r a c t s o f t h e o r g a n i s m s g r o w n a t p H 7 . 0 .

1 8 6 -

1 2 3 A 5 G 7 8 91011 12

ChromosomalDNA

pBR 322 p lasm id DNA

F i g . 29. R e p a i r o f a c i d - d a m a g e d p l a s m i d a f t e r a c i d - 1 r e a t m e n t o f p BR 3 2 2 E . c o l i . T r a c k s 1 a n d 6, p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H 5 . 0 c e l l s ; t r a c k s 2 a n d 3, p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 5 . 0 c e l l s , g r o w n f u r t h e r f o r 30 m i n p r i o r t o p l a s m i d i s o l a t i o n ; t r a c k s 4 a n d 5 , p l a s m i d D N A f r o m a c i d - t r e a t e d p H 5.0 c e l l s . T r a c k s 7 a n d 12, p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H7. 0 c e l l s ; t r a c k s 8 a n d 9, p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 7 . 0 c e l l s ; t r a c k s 10 a n d 11 p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 7 . 0 c e l l s f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 30 mi n p r i o r t o p l a s m i d i s o l a t i o n ; C C C , c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r p B R 3 2 2.

- 187 -

1 2 3 A 5 6 7 8 91011 12

ChromosomalDNA

pBR 322 p lasm id DNA

l a m b d a H i n d I I I

d i g e s t

+F i g . 3 0 . P l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d ( p H 3 . 0 f o r 5 m i n ) p B R 3 2 2 E . c o l i . T r a c k s 1, 6 a n d 1 2 , l a m b d a H i n d I I I d i g e s t ; t r a c k s 2 a n d 5 , p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H 7. 0 c e l l s ; t r a c k s 3 a n d 4, p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 7. 0 c e l l s ; t r a c k s 7 a n d 11, p l a s m i d DNA f r o m u n t r e a t e d p H5. 0 c e l l s ; t r a c k s 8, 9 a n d 10, p l a s m i d DNA f r o m a c i d - t r e a t e d p H 5 . 0 c e l l s .

- 188 -

4. D i s c u s s i o n

4 . 1 . A c i d e f f e c t o n C o l V, I - K 9 4 + c e l l s :

Th e a c i d s e n s i t i v i t y o f E s c h e r i c h i a c o l i i s i m p o r t a n t f o r s u r v i v a l i n t h e

n a t u r a l e n v i r o n m e n t . In a q u a t i c h a b i t a t s t h e o r g a n i s m s may b e s u b j e c t e d t o

a c i d i c pHs r e s u l t i n g f r o m a c i d r a i n a nd a c i d snow m e l t s ; a c i d r u n - o f f f r o m

f i e l d s ma y a r i s e b e c a u s e o f a g r i c u l t u r a l u s e o f a c i d s l u r r i e s o r a c i d

g e n e r a t i n g f e r t i l i z e r s , w h i l s t chemi ca l p r o c e s s e s p r o d u c e a r a n g e o f a c i d

e f f l u e n t s . O r g a n i s m s i n a q u a t i c e n v i r o n m e n t s ma y a l s o e n c o u n t e r w e a k

o r g a n i c a c i d s s u c h a s b u t y r a t e , p r o p i o n a t e a nd a c e t a t e i n t h e v i c i n i t y of

s e d i m e n t s . Acid e x p o s u r e may a l s o o c c u r i n t h e a n i m a l b o d y . In o r d e r t o

r e a c h a nd m u l t i p l y in t h e i n t e s t i n e , i n g e s t e d m i c r o o r g a n i s m s m u s t s u r v i v e

e x p o s u r e t o g a s t r i c a c i d (ca. pH 2.0 - 3 . 0) a n d t h e y may a l s o b e e x p o s e d

t o a numb e r of weak a c i d s p r e s e n t in i n g e s t e d f ood . Mi ld a c i d pH t o g e t h e r

wi t h weak a c i d s a l s o o c c u r s in t h e u p p e r i n t e s t i n e , i n t h e p h a g o l y s o s o m e s

and in t h e u r i n a r y t r a c t . E x p o s u r e t o a c i d pH a nd weak a c i d may a l s o o c c u r

f o r c o n t a m i n a t i n g o r g a n i s m s i n a c i d f o o d s .

4 . 1 . 1 . A c i d s e n s i t i v i t y o f n o n - h a b i t u a t e d c e l l s :

G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , s u c h a s E s c h e r i c h i a c o l i a r e q u i t e s e n s i t i v e t o

a c i d pH a nd t h e i r s e n s i t i v i t y i s e n h a n c e d by a d d i t i o n of a w e a k o r g a n i c

a c i d . K i l l i n g a nd damage by a c i d may b e g r e a t e r i f p l a s m i d s a r e p r e s e n t .

ColV p l a s m i d s c o n f e r o r e n h a n c e s e v e r a l b a c t e r i a l p r o p e r t i e s t h a t may b e

r e l a t e d t o v i r u l e n c e b u t a l s o i n c r e a s e s e n s i t i v i t y t o s ome a g e n t s . S u c h

i n c r e a s e d k i l l i n g by i n h i b i t o r y a g e n t s ( R o w b u r y e t a l . , 1985) d e p e n d s

- 189 -

m a i n l y u p o n d e r e p r e s s e d t r a n s f e r p r o p e r t i e s . S e v e r a l o b s e r v a t i o n s

s u g g e s t e d t h e i n v o l v e m e n t o f t h e s e c o m p o n e n t s i n a c i d s e n s i t i v i t y . A

d e r i v a t i v e of ED1829 c a r r y i n g a m u t a n t f o r m o f t h e p l a s m i d C o l V , I - K 9 4 ,

n a m e l y C o l V- M 50(1) w h i c h e n c o d e s n o r m a l c o l i c i n c o m p o n e n t s b u t n o

t r a n s f e r c o mp o n e n t s , showed a c i d - s u s c e p t i b i l i t y q u i t e s i m i l a r t o ED1829>

i . e . , l o s s of t r a n s f e r c o m p o n e n t s l e d t o r e s i s t a n c e . On t h e c o n t r a r y , t h e

p r e s e n c e of p l a s mi d ColV-M40(5) , wh i c h c o n f e r s n o r m a l t r a n s f e r p r o p e r t i e s

b u t no c o l i c i n c o m p o n e n t s , m a d e t h e ED1829 s t r a i n a s a c i d - s e n s i t i v e a s

E D I 8 2 9 C o l V, I - K9 4 ( C o o p e r a n d R o w b u r y , 1 9 8 6 ; T a b l e I I I ) .

The r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e ( s e e T a b l e s 9, 10 and 11) d e m o n s t r a t e t h a t Col V

b e a r i n g s t r a i n s a r e s i g n i f i c a n t l y mo r e s e n s i t i v e t o h y d r o g e n p e r o x i d e a n d

weak o r g a n i c a c i d s t h a n t h e i r i s o g e n i c p l a s m i d f r e e s t r a i n s . T h e i n c r e a s e d

a c i d s e n s i t i v i t y o f Co l V+ s t r a i n s m i g h t d e p e n d o n t h e p r e s e n c e o f

t r a n s f e r c o mp o n e n t s . The t r a n s f e r c omp o n e n t s may c o n f e r a c i d s e n s i t i v i t y

by a l l o w i n g h y d r o g e n p e r o x i d e a nd weak a c i d s t o p a s s t h e o u t e r m e m b r a n e

more q u i c k l y . The t i g h t p a c k i n g of t h e l i p o p o l y s a c c h a r i d e (LPS) m o l e c u l e s

m a i n t a i n s t h e i m p e r m e a b i l i t y of t h e o u t e r m e m b r a n e t o m a n y e n v i r o n m e n t a l

a g e n t s and i n s e r t i o n of t r a n s f e r c o mp o n e n t s i n t o t h e o u t e r m e m b r a n e may

weaken LPS-LPS l i n k a g e s , a s h a s be e n s u g g e s t e d f o r c ompounds w i t h s t r o n g

c a t i o n i c r e g i o n s ( H a n c o c k , 1984) a n d a l l o w i n c r e a s e d p e n e t r a t i o n o f e . g

o r g a n i c a c i d s and h y d r o g e n p e r o x i d e . Th i s c o u l d be t e s t e d by e x a mi n i n g t h e

s e n s i t i v i t y of 1829ColV-M40(5) a n d 1 8 2 9 C o l V - M 5 0 ( l ) t o h y d r o g e n p e r o x i d e

and weak a c i d s o r by t e s t i n g s e n s i t i v i t y i n ED1829 d e r i v a t i v e s c a r r y i n g

ColV, I -K94 a nd a n o t h e r p l a s m i d wh i ch r e p r e s s e s t h e t r a n s f e r p r o p e r t i e s of

t h e C o l V .

- 190 -

4 . 1 . 2 . S e n s i t i v i t y o f a c i d - h a b i t u a t e d c e l l s :

Wat e r p o l l u t i o n h a s b e e n an i n c r e a s i n g p r o b l e m in r e c e n t y e a r s a n d m a n y

p o l l u t a n t s a r e r e s p o n s i b l e f o r a c i d i f i c a t i o n o r a l k a l i n i s a t i o n of n a t u r a l

w a t e r s o f r i v e r s , s t r e a m s a n d e s t u a r i e s . A c i d i f i c a t i o n h a s b e c o m e a

p a r t i c u l a r c o n c e r n b e c a u s e i t r e s u l t s f r o m a w i d e r a n g e o f p o l l u t i n g

c o n d i t i o n s ; a c i d r a i n , a c i d s n o w m e l t s , a c i d m i n e a n d c h e m i c a l w a s t e s ,

a c i d s ewage , r u n - o f f s f r o m f i e l d s t r e a t e d w i t h a c i d - g e n e r a t i n g f e r t i l i s e r s

a n d a c i d a g r i c u l t u r a l w a s t e s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n c a u s i n g i t .

A c i d i f i c a t i o n u s u a l l y o c c u r s d u e t o p e r i o d i c d i s c h a r g e s o f e f f l u e n t s o r

w a s t e a t p a r t i c u l a r s i t e s . Wi th d i f f u s i o n f r o m t h e s e s i t e s , t h e r e w i l l b e

g r a d u a l pH c h a n g e s a t n e a r b y l o c a t i o n s f r o m n e u t r a l i t y t o a m a x i m u m

e x t r e m e of pH and b a c k t o n e u t r a l i t y , d u e t o d i l u t i o n a n d n e u t r a l i s a t i o n .

A c i d i f i c a t i o n a f f e c t s t h e a q u a t i c f l o r a a n d f a u n a b u t e x t r e m e a c i d i c pH

may a l s o i n f l u e n c e t h e n a t u r e a n d a b u n d a n c e o f m i c r o - o r g a n i s m s . S u c h

g r a d u a l i n c r e a s e s i n a c i d i t y c a n a l l o w i n d u c e d a c i d r e s i s t a n c e

( h a b i t u a t i o n t o a c i d ) t o o c c u r w h i c h p e r m i t s h a b i t u a t e d o r g a n i s m s t o

s u r v i v e s u b s e q u e n t e x p o s u r e s whi ch a r e l e t h a l t o n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s

( G o o d s o n a n d R o w b u r y , 1 9 8 9 ; R o w b u r y e t _ _ a l , 1 9 8 9 ) .

The phenomenon of h a b i t u a t i o n ( i n d u c e d r e s i s t a n c e ) t o a s t r e s s i s q u i t e

common in p r o c a r y o t e s . When b a c t e r i a a r e e x p o s e d t o a s u b - l e t h a l d o s e ( a n

a d a p t i v e d o s e ) o f a p a r t i c u l a r s t r e s s t h e y a c q u i r e r e s i s t a n c e

p h e n o t y p i c a l l y and r e s i s t damage o r k i l l i n g by a h i g h e r d o s e (a c h a l l e n g e

dose ) of t h a t s t r e s s wh i c h i s n o r m a l l y v e r y d a m a g i n g f o r t h e u n e x p o s e d

o r g a n i s m s . Such i n d u c e d r e s i s t a n c e o c c u r s f o r o r g a n i s m s e x p o s e d t o h e a t

- 191 -

(Mackey a nd D e r r i c k , 1987), o x i d a t i v e s t r e s s ( D e mp l e a n d H a l b r o o k , 1983)

a n d m e t a l i o n s t r e s s ( K h a z a e l i a n d M i t r a , 1 9 8 1 ) .

I t h a s p r e v i o u s l y b e e n d e m o n s t r a t e d i n t h i s l a b o r a t o r y t h a t Col V a n d

C o l V, I - K 9 4 s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i , w h e n g r o w n a t pH 7.0 , f a i l t o

g r ow a f t e r r e l a t i v e l y s h o r t p e r i o d s of e x p o s u r e t o pH 3.0 o r 3 . 5 . H o w e v e r ,

t h e g r o w t h of c e l l s c u l t u r e d a t pH 5.0 was a l m o s t u n a f f e c t e d by e x p o s u r e

t o s u c h a c i d v a l u e s ( G o o d s o n a n d R o w b u r y , 1 9 8 9 ) . S u b s e q u e n t l y

R o w b u r y et^ ( 1 9 8 9 ) o b s e r v e d t h a t t h e C o l V , I - K 9 4 + s t r a i n o f

E s c h e r i c h i a c o l i i n i t i a l l y g r o w n a t p H 4 . 6 o r 5 . 0 ( a c i d - h a b i t u a t e d )

r e s i s t e d l o n g e x p o s u r e s t o pH 3.0 a n d w a s m u c h m o r e r e s i s t a n t t h a n

p H 7 . 0 - g r o w n o r g a n i s m s ( n o n - h a b i t u a t e d ) a t t h i s p H v a l u e .

H a b i t u a t i o n t o a c i d f o r ED1829Col V, I - K 9 4 c e l l s o c c u r r e d i n NB of pH 5.0

d u r i n g i n c u b a t i o n a t 37 ° C a n d h a b i t u a t e d o r g a n i s m s w e r e m u c h m o r e

r e s i s t a n t t o t h e b a c t e r i o c i d a l a c t i v i t y o f o r g a n i c a c i d s s u c h a s b u t y r i c ,

s u c c i n i c , a c e t i c , l a c t i c , f o r m i c a n d p r o p i o n i c a c i d s t h a n pH 7.0 g r o w n

( n o n - h a b i t u a t e d ) o r g a n i s m s , a t a c i d p H 4 . 5 ( s e e T a b l e 1 6 ) .

S i m i l a r l y t h e a c i d - h a b i t u a t e d ( p H 5 . 0 g r o w n ) C o l V , I - K 9 4 s t r a i n o f

E s c h e r i c h i a c o l i d e m o n s t r a t e d s i g n i f i c a n t l y m o r e r e s i s t a n c e a g a i n s t t h e

a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f h y d r o g e n p e r o x i d e c o m p a r e d w i t h t h e i r

C o u n t e r p a r t n o n - h a b i t u a t e d (pH 7.0 g r o w n ) c e l l s , i f e x p o s u r e w a s f o r

r e l a t i v e l y s h o r t p e r i o d s o f t i m e a t b o t h t h e t e s t e d p H s o f 7.0 a n d 3.0

( s e e T a b l e s 17 a n d 1 8 ) .

The r e s u l t s m e n t i o n e d a b o v e ( Ta b l e s 16, 17 and 18) a r e f o r o r g a n i s m s g r o w n

- 192 -

i n NB a t s u b - o p t i m a l pH 5.0 f o r s e v e r a l h o u r s . H o w e v e r , i t h a s b e e n

d e m o n s t r a t e d t h a t h a b i t u a t i o n can o c c u r v e r y r a p i d l y in b r o t h c u l t u r e b u t

m o r e s l o w l y in g l u c o s e m i n i m a l m e d i a a t 37°C. T h e C o l V , I - K 9 4 + s t r a i n

of E. co l i g a i n e d p a r t i a l r e s i s t a n c e in NB of pH 5.0 in 5 m i n a n d w a s f u l l y

r e s i s t a n t in 10 min, w h e r e a s t h e o r g a n i s m s t o o k 30 - 60 mi n t o a c h i e v e

a c i d - r e s i s t a n c e in g l u c o s e minimal m e d i a a t 3 7°C a n d t h i s w a s d e p e n d e n t

on t h e p r e s e n c e of a n i t r o g e n s o u r c e a nd t r y p t o p h a n b u t n o t g l u c o s e ( R a j a

e t _ a l . , 1 9 9 1 a ) . T h e i n d u c t i o n o f a c i d - r e s i s t a n c e w a s d e p e n d e n t o n

c o n t i n u i n g p r o t e i n a nd RNA s y n t h e s i s b u t u n a f f e c t e d i n t h e p r e s e n c e of

n a l i d i x i c a c i d , an i n h i b i t o r f o r ENA s y n t h e s i s . M o r e o v e r , a c i d r e s i s t a n c e

wa s l o n g l a s t i n g ; o r g a n i s m s g r o w n a t pH 5 . 0 r e t a i n e d m o s t o f t h e i r

r e s i s t a n c e a f t e r 2 h r g r o w t h a t p H 7 . 0 .

S i n c e i n d u c t i o n of a c i d - r e s i s t a n c e

r e l a t i v e t o t h e g e n e r a t i o n t i m e s

s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e p r o c e s s

of r e s i s t a n c e t o t h e s t r e s s a n d

m u t a n t s s i n c e t h e s e t i m e p e r i o d s

o u t g r o w a c i d s e n s i t i v e s t r a i n s

in E s c h e r i c h i a c o l i t a k e s p l a c e r a p i d l y

i n NB a n d g l u c o s e m i n i m a l m e d i a , t h i s

of h a b i t u a t i o n i n v o l v e s p h e n o t y p i c g a i n

r u l e s o u t t h e s e l e c t i o n o f r e s i s t a n t

w o u l d n o t a l l o w r e s i s t a n t m u t a n t s t o

The f i n d i n g s t h a t h a b i t u a t i o n i s d e p e n d e n t on p r e s e n c e o f a n i t r o g e n o u s

s o u r c e i n g l u c o s e m i n i m a l m e d i a , a n d u p o n c o n t i n u i n g p r o t e i n a n d RNA

s y n t h e s i s in NB s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t i n d u c t i o n of a c i d - r e s i s t a n c e ma y b e

a s s o c i a t e d w i t h t h e s y n t h e s i s of s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s w h i c h may r e d u c e

damage by t h e s t r e s s c h a l l e n g e d o s e o r a l l o w i n c r e a s e d r e p a i r o f s t r e s s

dam aged c e l l s . Such i n d u c t i o n of s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s i n r e s p o n s e t o a

s t r e s s i s q u i t e a common phenomenon among p r o c a r y o t e s and i s o b s e r v e d wi t h

- 193 -

r e s p e c t t o h e a t s t r e s s ( Ya ma mor i a n d Y u r a , 198 2 ) , a n d m e t a l i o n s t r e s s

( K h a z a e l i a n d M i t r a , 1 9 8 1 ) .

S u b s e q u e n t l y , i n d u c t i o n of a c i d - s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s w a s o b s e r v e d i n

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s ( R a j a e t a l . , 1 9 9 1 a ) w h i c h m i g h t c o n f e r s o m e

p r o t e c t i v e r o l e i n p r e v e n t i n g a c i d d a m a g e i n t h e m .

A c c o r d i n g l y , E s c h e r i c h i a c o l i wh i ch i s a f r e q u e n t w a t e r p o l l u t a n t a n d a n

i n d i c a t o r of w a t e r q u a l i t y , can h a b i t u a t e t o a c i d a n d t h i s ma y a f f e c t i t s

s u r v i v a l a nd a b u n d a n c e in w a t e r s s u b j e c t t o p e r i o d i c e x t r e m e s o f pH. I t

may a l s o a f f e c t i t s a b i l i t y t o r e s i s t a c i d i n o t h e r l o c a t i o n s s u c h a s in

a c i d f o o d s a n d i n t h e a n i m a l b o d y .

4 . 2 . A c i d s e n s i t i v i t y a f t e r t e m p e r a t u r e u p s h i f t ;

I t h a s p r e v i o u s l y been d e m o n s t r a t e d t h a t t h e C o l V , I - K 9 4 p l a s m i d m a r k e d l y

i n c r e a s e d t h e h e a t s e n s i t i v i t y of E s c h e r i c h i a c o l i K12. T h e p l a s m i d e f f e c t

on s t r a i n K-12 a p p e a r e d t o r e s u l t f r o m C o l V - e n c o d e d t r a n s f e r a n d c o l i c i n

c o mp o n e n t s p o s s i b l y d u e t o t h e i r e f f e c t s on membr ane p r o p e r t i e s ( G h a z a l e h

e t a l . , 1989) . S u b s e q u e n t l y , w h e n C o l V , I - K 9 4 + o r g a n i s m s w e r e s u b j e c t e d

t o a g r a d u a l r i s e i n t e m p e r a t u r e f r o m 34 t o 50 ° C , t h e y a c q u i r e d

t h e r m o t o l e r a n c e a n d e x h i b i t e d m a r k e d r e s i s t a n c e t o k i l l i n g ( f a i l u r e t o

f o r m c o l o n i e s o n NA) o n e x p o s u r e t o 60 ° C ( G h a z a l e h , 1 9 9 0 ) .

T h e r m o t o l e r a n c e shown by t h e o r g a n i s m s m i g h t b e a t t r i b u t e d t o i n d u c t i o n of

h e a t - s h o c k p r o t e i n s w h i c h c o n f e r r e s i s t a n c e t o k i l l i n g a t 60 ° C .

Amongs t o t h e r e f f e c t s , t h e r m o t o l e r a n c e r e s u l t s f r o m a b i l i t y o f c e l l s t o

1 9 4 -

r e p a i r h e a t damage b e t t e r . Such r e p a i r a c t i v i t i e s m i g h t a l s o p r o t e c t a c i d

e x p o s e d c e l l s a n d , t h e r e f o r e , t h e t h e r m o t o l e r a n c e a c q u i r e d b y t h e

Col V, I - K94 s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i d u r i n g g r o w t h a t 44 ° C in NB

o f p H 7 . 0 m i g h t b e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e s i s t a n c e a g a i n s t t h e

b a c t e r i o c i d a l a c t i v i t y of some o r g a n i c a c i d s o b s e r v e d a t n e u t r a l pH ( s e e

T a b l e 19) c o m p a r e d w i t h t h e i r c o u n t e r p a r t g r o w n a t 37 ° C i n NB of pH

7.0. S u c h c r o s s r e s i s t a n c e m i g h t b e s i m i l a r t o t h e e a r l i e r f i n d i n g s of

J e n k i n s e t a l . , ( 19 8 8 ) , w h e r e g l u c o s e o r n i t r o g e n s t a r v e d c u l t u r e s o f

E s c h e r i c h i a c o l i e x h i b i t e d i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o h e a t o r h y d r o g e n

p e r o x i d e c h a l l e n g e a n d t h e d e g r e e o f r e s i s t a n c e w a s t i m e d e p e n d e n t .

P r o c a r y o t e s r e s p o n d t o e n v i r o n m e n t a l o r c h e m i c a l s t r e s s e s b y i n d u c i n g

s p e c i f i c s e t s o f p r o t e i n s . In s ome c a s e s , p r o t e i n s a s s o c i a t e d w i t h o n e

s t r e s s - s t i m u l o n can b e i n d u c e d d u r i n g o t h e r s t r e s s e s . F o r e x a mp l e , v a r i o u s

h e a t - s h o c k p r o t e i n s in E . co l i a r e a l s o p r o d u c e d when c e l l s a r e e x p o s e d t o

H^O^ ( V a n B o g e l e n 1987) a n d s t a r v a t i o n ( J e n k i n s et___al . , 1 9 8 8 ).

I n d u c t i o n o f s y n t h e s i s o f s ome s t r e s s p r o t e i n s b y s e v e r a l s t i m u l i i s

c o m m o n i n p r o c a r y o t e s w h i c h l e a d s t o c r o s s p r o t e c t i o n o f t h e

m i c r o - o r g a n i s m s f o r a n u n r e l a t e d s t r e s s . A c c o r d i n g l y , t h e h e a t - s h o c k

p r o t e i n s i n d u c e d a t 44 ° C m i g h t c o n f e r s o me r e s i s t a n c e a g a i n s t t h e

a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y of o r g a n i c a c i d s ( Tab le 19) . T h o u g h h e a t - s h o c k i s a

t r a n s i e n t r e s p o n s e a nd i s l i k e l y t o d e c l i n e a f t e r s o me t i m e ( Ma c k e y a n d

D e r r i c k , 1 9 8 6 ) y e t i t m a y p r o v i d e s o m e c r o s s - p r o t e c t i o n .

C e l l u l a r c omp o n e n t s l i k e o u t e r me m b r a n e , c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , p r o t e i n s ,

ENA, RNA, a nd r i b o s o m e s a r e v u l n e r a b l e t o h e a t . I t m a y b e p o s s i b l e t h a t

1 9 5 -

h e a t - s h o c k p r o t e i n s a r e i n v o l v e d in r e p a i r i n g damage t o s o me o r a l l t h e s e

s i t e s o r s a n e o r a l l may be p r o t e c t e d b y i n d u c e d h e a t - s h o c k p r o t e i n s o r

t h e v u l n e r a b i l i t y of t h e s e s i t e s r e d u c e d wh i c h c o n s e q u e n t l y i n c r e a s e s t h e

s u r v i v a l c h a n c e s of t h e e x p o s e d o r g a n i s m s a t h i g h t e m p e r a t u r e . S o m e

h e a t - s h o c k p r o t e i n s a r e a s s o c i a t e d w i t h r i b o s o m e s ( e . g G r o E L ) ; o n

i n t e r a c t i o n t h e y may p r e v e n t h e a t i n d u c e d u n f o l d i n g of r i b o s o m a l s u b u n i t s

and h e n c e p r o t e c t rRNA m o l e c u l e s f r o m d e g r a d a t i o n ; t h e y m a y a l s o p r o t e c t

o t h e r p r o t e i n s f r o m h e a t - i n a c t i v a t i o n o r r e v e r s e h e a t - d e n a t u r a t i o n . Some

h e a t - s h o c k p r o t e i n s l i k e Gr pE, GroES and DnaK a r e i n v o l v e d in n u c l e i c a c i d

s y n t h e s i s a t h i g h t e m p e r a t u r e ; t h e y may h a v e po l y i n e r a s e a c t i v i t i e s o r DNA

r e p a i r a c t i v i t i e s f o r h e a t i n d u c e d DNA c r e a k s h e n c e e n h a n c i n g DNA

s t a b i l i t y . If a c i d c a u s e d s i m i l a r e f f e c t s t o h e a t t h e n h e a t - s h o c k p r o t e i n s

m i g h t be i n v o l v e d i n r e p a i r o r i n r e d u c i n g t h e e x t e n t o f a c i d d a m a g e .

The DnaJ g e n e p r o d u c t i s l o c a t e d in t h e c e l l e n v e l o p e a n d i s i n d u c e d b y

t e m p e r a t u r e s h i f t ( Ne i d h a r d t a nd VanBogelen, 1987). T h i s p r o t e i n h a s l a r g e

h y d r o p h o b i c r e g i o n s ( Z y l i c z e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d m a y c o n t r i b u t e t o

s t a b i l i s i n g t h e o u t e r m e m b r a n e s t r u c t u r e b y s u b s t i t u t i n g f o r

l i p o p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d by h e a t i n g a t h i g h t e m p e r a t u r e , r e s u l t i n g i n

r e - c r e a t i o n o f h y d r o p h o b i c b i l a y e r s w h i c h m i g h t p r e v e n t t h e e n t r y of

i n h i b i t o r y s u b s t a n c e s t h u s l o w e r i n g t h e s e n s i t i v i t y o f e x p o s e d c e l l s .

S e v e r a l h e a t - s h o c k p r o t e i n s a r e m o l e c u l a r c h a p e r o n e s wh i ch a r e b e l i e v e d t o

c o n t r o l p r o t e i n f o l d i n g ( E l l i s a n d S a s k i a M, 1991) . S u c h c o m p o n e n t s a r e

b e l i e v e d t o b e a b l e t o r e n a t u r e h e a t - i n a c t i v a t e d p r o t e i n s a nd m i g h t p l a y a

s i m i l a r r o l e f o r a c i d - d e n a t u r e d o n e s .

- 196 -

4 . 3 . E f f e c t o f a c i d o n m o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s :

I t was o b s e r v e d t h a t t h e m o t i l i t y o f a c i d - h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

C o l V , I - K 9 4 + o r g a n i s m s w a s a d v e r s e l y a f f e c t e d a t a c i d i c p H

( s e e T a b l e 21) . H o w e v e r , t h e a c i d - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s w e r e r e l a t i v e l y

m o r e m o t i l e a t a c i d i c pHs t h a n t h e i r c o r r e s p o n d i n g n o n - h a b i t u a t e d c e l l s .

T h i s may i n d i c a t e a h i g h e r i n t e r n a l pH f o r h a b i t u a t e d c e l l s a t a c i d i c

p H Q, a l l o w i n g m o t i l i t y t o o c c u r i n a h i g h e r p r o p o r t i o n o f c e l l s .

S i n c e t h e m o t i l i t y o f b o t h t y p e s o f o r g a n i s m i s v e r y s e n s i t i v e t o a n

a c i d i c e n v i r o n m e n t (Table 21), i t i s p o s s i b l e t h a t f l a g e l l a r f i l a m e n t s ma y

be d e p o l y m e r i z e d a t t h e a c i d pHs t e s t e d ( A s a k u r a , 1970) t h e r e f o r e , t h e i r

m o t i l i t y would b e s e n s i t i v e t o a pH r a n g e f r o m 3 - 4 e v e n f o r a v e r y s h o r t

p e r i o d of t i m e . H o w e v e r , t h e h a b i t u a t e d c e l l s s h o w e d r e l a t i v e l y l e s s

s u s c e p t i b i l i t y t o i n h i b i t i o n of m o t i l i t y and t h i s m i g h t b e d u e t o t h e f a c t

t h a t t h e i r v i a b i l i t y i s l e s s s e n s i t i v e t o a c i d i n c o n t r a s t w i t h

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s .

The f a i l u r e of h a b i t u a t e d c e l l s t o b e r e p e l l e d b y a c i d ( F i g . 19, b a n d d)

m a y i n d i c a t e t h a t a t a c i d p H Q , t h e y m a i n t a i n a h i g h e r pH^ t h a n

n o n - h a b i t u a t e d o n e s . I t i s a f a l l i n p H . w h i c h i n d u c e s n e g a t i v e

c h e m o t ax i s f r o m a c i d ( Repaske a nd A d l e r , 1981). A c c o r d i n g l y , i f h a b i t u a t e d

c e l l s ke e p pHj h i g h , c h e m o t a x i s w o u l d n o t b e s w i t c h e d on a n d r e p u l s i o n

w o u l d n o t o c c u r .

1 9 7 -

4 . 4 . E f f e c t s o f a c i d p H o n r e l e a s e o f c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s :

L e a k a g e of 260 nm a b s o r b i n g m a t e r i a l ( such a s amino a c i d s a nd n u c l e o t i d e s )

was o b s e r v e d in t h e a c i d t r e a t e d ColV, I -K94 b e a r i n g s t r a i n o f E . c o l i . B o t h

h a b i t u a t e d a nd n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s f r o m e x p o n e n t i a l a n d s t a t i o n a r y

p h a s e of g r o w t h showed t h e r e l e a s e of s u b s t a n c e s ( s e e T a b l e s 22 a n d 23) .

The a c i d t r e a t e d n o n - h a b i t u a t e d (pH 7.0 g r own) o r g a n i s m s f r o m l o g a r i t h m i c

a n d s t a t i o n a r y g r o w t h p h a s e r e l e a s e d m u c h m o r e m a t e r i a l t h a n t h e i r

c o r r e s p o n d i n g a c i d - h a b i t u a t e d (pH 5.0 g r o w n ) c e l l s s t r o n g l y s u g g e s t i n g

t h a t e n v e l o p e s of t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s a r e m o r e v u l n e r a b l e t o a c i d

t h a n t h e a c i d - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s . I t seems l i k e l y t h a t t h e r e i s g r e a t e r

damage by a c i d t o t h e o u t e r a n d / o r c y t o p l a s m i c me mbr a ne s of n o n - h a b i t u a t e d

c e l l s t h a n h a b i t u a t e d o n e s . I t w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o e x a m i n e a c i d

e f f e c t s s p e c i f i c a l l y on t h e o u t e r m e m b r a n e . T h i s c o u l d b e d o n e by (a)

s t u d y i n g a c i d - i n d u c e d l e a k a g e of p e r i p l a s m i c p r o t e i n s a n d (b) e x a m i n i n g

o u t e r m e m b r a n e d a m a g e b y a c i d b y f o l l o w i n g a b i l i t y t o p l a t e o n

NA + d e o x y c h o l a t e ( v e r s u s NA). O r g a n i s m s w h i c h a r e v i a b l e ( a n d p l a t e on

NA) b u t h a v e d a m a g e d o u t e r m e m b r a n e l e t t h r o u g h d e o x y c h o l a t e a n d ,

t h e r e f o r e , f a i l t o p l a t e o n NA + d e o x y c h o l a t e .

I t h a s p r e v i o u s l y b e e n d e m o n s t r a t e d i n t h i s l a b o r a t o r y t h a t t h e

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s of ED1829ColV, I -K94 , a r e m u c h m o r e s e n s i t i v e t h a n

t h e h a b i t u a t e d c e l l s on e x p o s u r e t o pH 3.0 o r 3.5 f o r s h o r t t i m e b a s e d

upon t h e i r c o l ony f o r mi ng a b i l i t y on c o mp l e t e m e d i a ( Goodson a n d R o w b u r y ,

1989; Rowbury e t a l . , 1989). Mor e ove r , t h e e a r l i e r f i n d i n g s o f C o o p e r a n d

R o w b u r y , ( 1 9 8 6 ) , s u g g e s t t h a t t h e p r e s e n c e o f t r a n s f e r c o m p o n e n t s

i n c r e a s e s p e r m e a b i l i t y o f C o l V , I - K 9 4 o r g a n i s m s f o r a c i d i n h i b i t o r s .

- 198 -

T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t t h e o u t e r m e m b r a n e p l a y s a k e y r o l e i n

d e t e r m i n i n g t h e p e n e t r a t i o n o f a c i d i n h i b i t o r s b u t b y t h i s n o t i o n , t h e

o u t e r m e m b r a n e s o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s m i g h t b e

e q u a l l y p e r m e a b l e t o t h e a c i d i n h i b i t o r s b u t t n i s c o u l d b e s t u d i e d a s

d e s c r i b e d a b o v e . I t i s p o s s i b l e t h a t a c i d i n h i b i t o r s o n l y d a m a g e t h e

c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a n d t h i s c a u s e s t h e l e a k a g e o f 260 nm a b s o r b i n g

m a t e r i a l , a s t h e m o s t c o m m o n o b s e r v a t i o n a f t e r a n y d a m a g e t o t h e

c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i s t h e l o s s o f 260 a n d 280 nm a b s o r b i n g m a t e r i a l

( H u r s t , 1977). The f i n d i n g s , s e e b e l o w , on e f f e c t on r e s p i r a t i o n ma y a l s o

i n d i c a t e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e d a m a g e ( T a b l e 20) . In o t h e r e x p e r i m e n t s

( T a b l e 32) i t w a s o b s e r v e d t h a t a c i d m a y c a u s e l e s s DNA d a m a g e i n

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s t h a n i n t h e n o n - h a b i t u a t e d c e l l s . T h e r e f o r e , i t i s

p o s s i b l e t h a t t h e l e a k a g e o f 2 60 n m a b s o r b i n g m a t e r i a l f r o m t h e

n o n - h a b i t u a t e d c e l l s may be mo r e t h a n t h a t f r o m t h e h a b i t u a t e d c e l l s e v e n

i f t n e r e i s no d i f f e r e n c e i n e n v e l o p e p r o p e r t i e s . T h e r e m a y b e a n o t h e r

p o s s i b i l i t y , n a m e l y t h a t a c i d - s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s i n d u c e d i n t h e

h a b i t u a t e d o r g a n i s m s (Raja e t a l . , 1991a) may h a v e s ome p r o t e c t i v e r o l e in

p r e v e n t i n g a c i d damage t o t h e c e l l o r in DNA r e p a i r . T h e g e n e p r o d u c t of

D n a J i s l o c a t e d i n t h e m e m b r a n e . I t i s i n d u c e d d u r i n g s t r e s s a n d may

c o n f e r s o m e s t a b i l i t y t o t h e m e m b r a n e o f s t r e s s e d o r g a n i s m s

( Z y l i c z e t a l . , 1 9 8 5 ) , r e d u c i n g r e l e a s e o f c e l l c o n s t i t u e n t s f r o m

h a b i t u a t e d c e l l s .

4 . 5 . R e c o v e r y o f i n j u r e d c e l l s :

A s t r e s s may n o t be s e v e r e e n o u g h t o d e s t r o y a l l b a c t e r i a p r e s e n t i n a

s y s t e m b u t may, i n s t e a d , i n f l i c t s u b l e t h a l i n j u r y t o a p r o p o r t i o n o f t h e

- 199 -

p o p u l a t i o n . T h e s e i n j u r e d c e l l s can f o r m c o l o n i e s on l ow s t r e s s m e d i a b u t

no t on s t r e s s i n g med i a . However , i f t h e s e i n j u r e d o r g a n i s m s a r e r e m o v e d

f r o m s t r e s s f u l e n v i r o n m e n t s t h e y may r e v i v e s o a s t o b e a b l e t o f o r m

c o l o n i e s o n a l l m e d i a .

I t h a s p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d by P r z y b l s k i a n d W i t t e r ( 1 9 7 9 ) , t h a t

c e l l s of E s c h e r i c h i a co l i K - 1 2 , i n j u r e d b y s u b - l e t h a l a c i d i f i c a t i o n t e n d

t o r e c o v e r i n t r y p t i c a s e s o y b r o t h a n d in p o t a s s i u m p h o s p l i a t e b u f f e r .

Almost c o mp l e t e r e c o v e r y (95%) was o b t a i n e d a f t e r 120 min of i n c u b a t i o n in

0 . 0 4 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r o f p H 8 . 0 .

S u b s e q u e n t l y , in a r e c e n t s t u d y , M u s a r r a t a nd Ahmad ( 1988) , o b s e r v e d t h a t

a l k a l i - i n ju r e d c e l l s c o u l d r e c o v e r on i n c u b a t i o n i n 0 . 05 M p o t a s s i u m

p h o s p h a t e b u f f e r of pH 8.0, a t 37 °C, a f t e r 2 h r . R e c o v e r y i n p h o s p h a t e

b u f f e r w a s n o t a f f e c t e d b y m e t a b o l i c i n h i b i t o r s .

Re c o v e r y of i n j u r e d C o l V , I - K 9 4 f c e l l s w a s o b s e r v e d , on i n c u b a t i o n , i n a

c o m p l e t e m e d i u m l i k e n u t r i e n t b r o t h t o a s m a l l e x t e n t ; h o w e v e r , t h e

p r o c e s s o f r e c o v e r y of t h e i n j u r e d c e l l s wa s s o m e h o w e x p e d i t e d i n NB

p r e p a r e d in 0.1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r of pH 7.5 ( s e e T a b l e s 13, 14

a n d 15) . T h e r e c o v e r y m e d i u m u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w a s t o t a l l y

s u p p o r t i v e t o g r o w t h a n d c o n t a i n e d a n e n e r g y s o u r c e u n l i k e t h e a b o v e

m e n t i o n e d p r e v i o u s two s t u d i e s . I t a p p e a r s t h a t p h o s p h a t e b u f f e r s o m e h o w

s u p p o r t s t h e r e c o v e r y o f i n j u r e d c e l l s b u t i t s m e c h a n i s m i s n o t c l e a r .

- 200 -

4 . 6 . E f f e c t o f a c i d o n r e s p i r a t i o n :

R e s p i r a t i o n r a t e f o r a c i d - h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d C o l V , I - K 9 4 +

c e l l s was a f f e c t e d a t a c i d i c pH; i t d r o p p e d i n b o t h t y p e s o f c e l l s ( s e e

T a b l e 20) i n d i c a t i n g t h a t r e s p i r a t i o n i s a pH s e n s i t i v e p r o c e s s . H o w e v e r ,

t h e d e c r e a s e in r e s p i r a t i o n r a t e of n o n - h a b i t u a t e d c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y

g r e a t e r t h a n f o r t h e a c i d - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s . T h i s o b s e r v a t i o n m i g h t b e

c o r r e l a t e d w i t h t h e a c i d - s e n s i t i v i t y o f h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d

c e l l s ( co l ony f o r m i n g a b i l i t y on NA) w h i c h s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t f o r m e r

a r e r e s i s t a n t t o t h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f a c i d .

T h e r e s p i r a t o r y s y s t e m o f E s c h e r i c h i a c o l i i s a s s o c i a t e d w i t h t h e

c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a n d s h o w s s e n s i t i v i t y t o a c i d , i n d i c a t e d b y a

d e c r e a s e in o x y g e n c o n s u m p t i o n ( Tab l e 20). T h i s o b s e r v a t i o n w a s a l s o m a d e

in B a c i l l u s s u b t i l i s , an o b l i g a t e l y a e r o b i c o r g a n i s m , b y S h e u a n d F r e e s e ,

in 1972. The y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e o x y g e n u p t a k e r a t e o f w h o l e c e l l s

w i t h o u t a ny a c i d i n h i b i t o r s , a t 37 °C, w a s 293 n m o l e s / m i n w h e r e a s c e l l s

t r e a t e d w i t h f a t t y a c i d s h a d r e d u c e d o x y g e n u p t a k e . Ahme d a n d B o o t h

(1983), r e p o r t e d t h e r e s p i r a t o r y r a t e of E s c h e r i c h i a c o l i r a n g i n g b e t w e e n

- 1 - 1160 t o 2 1 0 n m o l c o n s u m p t i o n (mg d r y w t ) m i n a t p H 6 . 1 .

Though f a t t y a c i d s i n h i b i t e d c e l l u l a r g r o w t h w i t h r e d u c t i o n i n o x y g e n

u p t a k e a n d c o n c e n t r a t i o n of ATP (Sheu a nd F r e e s e , 1972) , y e t t h e y d i d n o t

i n h i b i t NADH o x i d a t i o n by i s o l a t e d m e m b r a n e s ( S h e u e t a l . , 1 972) o r t h e

c y t o c h r o m e - l i n k e d e l e c t r o n t r a n s p o r t s y s t e m . T h e r e d u c t i o n i n o x y g e n

u p t a k e in w h o l e c e l l s c o u l d b e f r o m t h e d e f i c i e n c y o f c o m p o u n d s , e . g . ,

a m i n o a c i d s , e n t e r i n g t h e c e l l d u e t o f a i l u r e o f a c t i v e t r a n s p o r t

- 201 -

( F r e e s e e t _ _ a l . , 1 9 7 3 ) . I t i s m o r e l i k e l y , h o w e v e r , t h a t t h e g r e a t

r e d u c t i o n in o x y g e n u p t a k e o b s e r v e d p l u s a c i d ( Ta b l e 20) , r e f l e c t s d a m a g e

e i t h e r t o t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e o r t o t h e r e s p i r a t o r y c o m p o n e n t s

a t t a c h e d t o i t . The g r e a t e r r e s i s t a n c e of h a b i t u a t e d o r g a n i s m s c o u l d b e

d u e t o s l o w e r p e n e t r a t i o n o f H ( e . g t h r o u g h t h e o u t e r m e m b r a n e ) o r t o

b e t t e r r e p a i r o f a c i d - d a m a g e d s t r u c t u r e s i n t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e .

4 . 7 . E f f e c t o f a c i d p H o n s y n t h e s i s o f s t r e s s - r e 1 a t e d p r o t e i n s :

A p r e v i o u s s t u d y h a s i n d i c a t e d t h a t an a l k a l i n e b u t n o t a n a c i d s h i f t i n

e x t e r n a l pH (pHQ) i n d u c e s a s t r e s s r e l a t e d r e s p o n s e i n E s c h e r i c h i a c o H

and s y n t h e s i s t o o v e r s i x f o l d o f d n a K a n d g r o E g e n e p r o d u c t s ( T a g l i c h t

e t a l . , 1987) . S u b s e q u e n t l y t wo r e p o r t s ( G o o d s o n a n d R o w b u r y , 1 9 8 9 ;

R o w b u r y e t a l . , 1 9 8 9 ) , on a c i d s e n s i t i v i t y o f p H 5 . 0 g r o w n

( a c i d - h a b i t u a t e d ) a n d t h e i r r e s p e c t i v e pH 7.0 g r o w n ( n o n - h a b i t u a t e d )

E . co l i c e l l s , h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t a n a c i d - s h i f t d u r i n g g r o w t h o f t h e

o r g a n i s m s c o n f e r s a c i d - r e s i s t a n c e whi ch m i g h t b e d u e t o i n d u c t i o n o f s ome

s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s . Al so , Heyde a nd P o r t a l i e r ( 1 9 9 0 ) h a v e s h o w n t h a t

s t r e s s r e l a t e d p r o t e i n s , r e f e r r e d t o a s a c i d - s h o c k p r o t e i n s , w e r e i n d u c e d

on a c i d s h i f t f r o m pH 6.9 t o 4.3 i n E s c h e r i c h i a c o l i . Among t h e p r o t e i n s

i n d u c e d by a n a c i d s h i f t , 4 w e r e h e a t - s h o c k p r o t e i n s i n c l u d i n g G r o E L ,

DnaK, HtpG a nd HtpM w h i l e 7 we r e new p r o t e i n s wh i c h ha d n o t b e e n d e s c r i b e d

p r e v i o u s l y t o b e i n d u c e d b y a n y s t r e s s o t h e r t h a n a c i d s h i f t .

T h e s e d i f f e r e n t o b s e r v a t i o n s a r e p e r h a p s a s s o c i a t e d w i t h d i f f e r e n t

e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a s T a g l i c h t e t a l . , ( 1987) u s e d a c i d s h i f t f r o m

pH 8.0 t o pH 6.0 f o r 5 t o 10 m i n , w h e r e a s H e y d e a n d P o r t a l i e r ( 19 9 0 ) ,

- 202 -

o b s e r v e d t h e r e s p o n s e by d r o p p i n g t h e pH f r o m 6.9 t o 4.3 f o r a p e r i o d of

3 0 - 4 5 mi n .

However , a r e p o r t f r o m t h i s l a b o r a t o r y d e m o n s t r a t e s t h a t s t r e s s r e l a t e d

p r o t e i n s a r e s y n t h e s i s e d by l a t e l o g - e a r l y s t a t i o n a r y p h a s e C o l V , I - K 9 4 +

c e l l s a t an a c i d s h i f t f r o m pH 7.0 t o pH 5.0, a t 37 ° C ( F i g u r e 1 o f R a j a

e t _ _ a l . , 1 9 9 1 a ) . T h e p r o c e s s o f h a b i t u a t i o n , a s o b s e r v e d h e r e , i s

a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n s y n t h e s i s a nd a t l e a s t 14 p r o t e i n s a r e i n d u c e d by

a c i d s h i f t ( Ta b l e 24 a n d F i g u r e 18) . T h i s o b s e r v a t i o n w a s s u b s e q u e n t l y

c on f i r me d by t wo d i me n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( F i g u r e 19 a n d T a b l e 25) .

Among t h e p r o t e i n s s y n t h e s i s e d b y a n a c i d s h i f t , s e v e r a l m i g h t b e

h e a t - s h o c k p r o t e i n s i n c l u d i n g Lon, GroEL a n d D n a J ( s e e T a b l e s 24 a n d 25

a n d

F i g u r e s 18 a n d 19) d e p e n d i n g u p o n t h e i r e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t i e s . I f

some of t h e s e p r o t e i n s p r o d u c e d a t pH 5.0 a r e h e a t - s h o c k p r o t e i n s ( h s p s ) ,

t h e y c ou l d p l a y a r o l e i n a c i d r e s i s t a n c e s i n c e b o t h h e a t i n g a t 52 ° C

( Ne i d h a r d t e t a l . , 1984) a nd a c i d t r e a t m e n t ( S i n h a , 1986) c a u s e d a m a g e t o

DNA. P o s s i b l y t h e p r o t e i n A w h i c h i s s y n t h e s i s e d a t p H 5 . 0 , w i t h a n

a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 95 k Da a n d c l e a r s e p a r a t i o n

f r o m t h e o t h e r p r o t e i n s , may b e t h e Lon p r o t e i n . T h i s i s a h e a t - s h o c k

p r o t e a s e whi ch d e s t r o y s a bno r ma l o r damaged p r o t e i n s a n d c o u l d p l a y t h i s

r o l e f o r a c i d - d a m a g e d o n e s . S i m i l a r l y i n d u c t i o n , o f D n a J ( c a . 40 k D a )

whi ch i s l o c a l i z e d in o u t e r m e m b r a n e ma y p l a y a r o l e i n s t a b i l i z i n g t h e

membr ane d u r i n g e x p o s u r e t o a c i d . GroEL may be a s s o c i a t e d w i t h t h e DNA of

E s c h e r i c h i a c o l i a f t e r a b r i e f e x p o s u r e t o h e a t a n d , a c c o r d i n g l y , a f t e r

mi l d s t r e s s i t may p l a y a r o l e in p r e v e n t i n g s u b s e q u e n t DNA d a m a g e o r in

r e p a i r o f a l r e a d y d a m a g e d DNA ( P e l l o n a n d G o m e z , 1 9 8 1 ) .

2 0 3 -

S u b s e q u e n t l y i t h a s be e n o b s e r v e d t h a t some of t h e s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s

i n d u c e d a t 37 °C, pH 5.0 a r e a l s o s y n t h e s i s e d a t 44 ° C ( T a b l e 28 a n d

F i g u r e 22) . T h i s ma y m e a n t h a t s ome o f t h e a c i d - i n d u c e d p r o t e i n s a r e

h e a t - s h o c k p r o t e i n s . In c o n t r a s t , f e w p o l y p e p t i d e s a r e i n d u c e d a t

pH 5.0 , w h e n t h e o r g a n i s m s a r e g r o w n a t 21 ° C ( T a b l e s 26 a n d 27 a n d

F i g u r e s 20 a n d 2 1 ) .

A u t o r a d i o g r a p h i c s t u d i e s ( F i g u r e s 23 a n d 24 a n d T a b l e 2 9 ) h a v e

demoxi s t r a t ed t h a t s e v e r a l p r o t e i n s a r e i n d u c e d i n r e l a t i v e l y m u c h l a r g e r

a moun t s in t h e f i r s t f ew m i n u t e s a f t e r a s h i f t t o pH 4.3 t h a n a t pH 7.0

p r i o r t o t h e s h i f t . Two of t h e s e p o l y p e p t i d e s i . e C a n d D w i t h a p p a r e n t

m o l e c u l a r w e i g h t s of 73 a nd 68 kDa r e s p e c t i v e l y , m i g h t c o r r e s p o n d t o t h e

e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n p a t t e r n s o f H t p G a n d DnaK, t h e w e l l k n o w n

h e a t - s h o c k p r o t e i n s . T h i s c o n f i r m s t n a t n a b i t u a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h

i n d u c t i o n of new s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s i n r e l a t i v e l y s h o r t p e r i o d s o f

t ime (10 m i n ) a n d i s i n a c c o r d w i t h t h e e a r l i e r f i n d i n g s o f H e y d e a n d

P o r t a l i e r , ( 1 9 9 0 ) ; H i c k e y a n d H i r s h f i e l d , ( 1 9 9 0 ) ; R a j a e t a l . , ( 1 9 9 1 a ) .

C o n f i r m a t i o n t h a t t h e 68 kDa p r o t e i n i n d u c e d a t pH 4.3 i s t h e DnaK g e n e

p r o d u c t c o u l d be o b t a i n e d by s h i f t i n g t h e dnaK m u t a n t NRK156 t o pH 4.3 a nd

e x a m i n i n g p r o t e i n s s y n t h e s i s e d .

4.8. E f f e c t of p h o s p h a t e on t h e s y n t h e s i s of p r o t e i n s i n d u c e d a t a c i d pH;

H a b i t u a t i o n r e q u i r e s p r o t e i n s y n t h e s i s w i t h s e v e r a l p r o t e i n s b e i n g i n d u c e d

a t l ow p H Q ( R a j a e t a l . , 1 9 9 1 a ) . A u t o r a d i o g r a p h i c s t u d i e s i n d i c a t e

( Tab l e 29 and F i g u r e s 23 a nd 24) t h a t s e v e r a l p r o t e i n s a r e s y n t h e s i s e d in

much l a r g e r a mo u n t s in t h e f i r s t f ew m i n u t e s a f t e r a s h i f t t o pH 4.3 t h a n

- 204 -

a t pH 7.0 p r i o r t o t h e s n i f t . Most of t h e s e i n d u c e d p r o t e i n s a r e p r o d u c e d

a t pH 4.3 ♦ 10 mM p h o s p h a t e , in r e d u c e d amount in P678 - 54 ompA b u t n o t a t

a l l in P678 - 54 ( Tab le 30 and F i g u r e s 25 a n d 26) . T h i s o o s e r v a t i o n may b e

r e l a t e d t o t h e f a c t t h a t p h o s p h a t e p r e v e n t s h a b i t u a t i o n in P 6 7 8 - 5 4 o u t n a s

xio e f f e c t o n i t s o m p A m u t a n t ( R o w b u r y e t a l . , 1 9 9 2 ) .

The o u t e r me mbr a ne p l a y s an h n p o r t a n t r o l e in p r o t e c t i n g E s c h e r i c h i a c o l i

f r o m e x t r e m e a c i d i t y a nd f a c t o r s wh i ch i n c r e a s e s i t s p e r m e a b i l i t y , s u c h a s

Ips m u t a t i o n s a nd ColV, I -K94 p l a s mi d , e n h a n c e a c i d s e n s i t i v i t y ( C o o p e r a n d

R o w b u r y , 1 9 8 6 ) .

At l ow p H Q, o r g a n i s m s w i t h n o r m a l o u t e r m e m b r a n e m u s t m a i n t a i n a pH

d i f f e r e n t i a l b e t w e e n p e r i p l a s m a nd o u t s i d e w h i c h c o u l d b e d e t e c t e d by a

s e n s o r t o i n i t i a t e t h e h a b i t u a t i o n r e s p o n s e . A l t e r n a t i v e l y , t h e s e n s o r

c o u l d d e t e c t p e r i p l a s m i c p H ( r a t h e r t h a n a d i f f e r e n t i a l ) .

P h o s p h a t e p r e v e n t s h a b i t u a t i o n a t low p H Q m o s t l i k e l y b y c o m p e t i n g w i t h

h y d r o g e n i o n s a t t h e P h o E p o r e a n d p r e v e n t i n g t h e i r r e a c h i n g t h e

h a b i t u a t i o n s e n s o r on t h e c y t o p l a s m i c me mbr a ne o r i n t h e p e r i p l a s m . I t i s

mo s t l i k e l y t h a t h y d r o g e n i o n s u s e t h e P h o E p o r i n a s t h e m a j o r o u t e r

membr ane p e n e t r a t i o n r o u t e . P o l y p h o s p h a t e , p h o s p h a t e s a n d c i t r a t e a r e t h e

m o s t e f f e c t i v e i n h i b i t o r s of h a b i t u a t i o n , p o l y p h o s p h a t e b e i n g m o s t

e f f e c t i v e among t h e m (Rowbury e t a l . , 1992) . S u c h a n i o n s s t r o n g l y i n h i b i t

t h e p a s s a g e o f o t h e r c o m p o u n d s t h r o u g h t h e P h o E p o r e ( O v e r b e e k e a n d

L u g t e n b e r g , 1982). The f a i l u r e of p h o s p h a t e t o i n h i b i t h a b i t u a t i o n o f t h e

P678- 54 ompA m u t a n t a nd t o s t o p s t r e s s p r o t e i n s y n t h e s i s i n t h i s s t r a i n

( Tab le 30 a nd F i g u r e 25) a l s o a g r e e w i t h s u c h a m e c h a n i s m o f a c t i o n f o r

- 205 -

a n i o n s , a nd r u l e s o u t t h e p o s s i b i l i t y of p h o s p h a t e a c t i n g d i r e c t l y on t h e

s e n s o r , b e c a u s e in t h i s s t r a i n ( P 6 7 8 - 5 4 ompA) t h e P h o E p o r e i s n o t t n e

m a j o r r o u t e o f h y d r o g e n i o n p e n e t r a t i o n ( R o w b u r y e t a l . , 1 9 9 2 ) .

If p h o s p h a t e a n d p o l y p h o s p h a t e s t o p H+ f r o m r e a c h i n g t h e h a b i t u a t i o n

s e n s o r , t h e y m a y , a t s u i t a b l e c o n c e n t r a t i o n s a l s o s t o p d a m a g i n g H +

e f f e c t s on pH 7.0 c e l l s e.g on t n e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ( a n d , t h e r e f o r e ,

on o x y g e n u p t a k e ) , on l e a k a g e , on m o t i l i t y a nd on c h e m o t a x i s . I t wo u l d b e

i n t e r e s t i n g t o e x a m i n e p h o s p h a t e a n d p o l y p h o s p h a t e e f f e c t s o n t h e s e

p a r a m e t e r s .

4 . 9 . E f f e c t o f a c i d o n DNA o f h a b i t u a t e d o r g a n i s m s :

The r e s u l t s of t r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e n t s ( s e e T a b l e 32) s u g g e s t t h a t t h e

o r g a n i s m s g r own a t pH 5.0 can r e p a i r a c i d - d a m a g e d DNA b e t t e r t h a n t h o s e

grown a t pH 7.0. The g r e a t e r numb e r of t r a n s f o r m a n t s f o rmed i n h a o i t u a t e d

( compared w i t h n o n - h a b i t u a t e d ) c o m p e t e n t o r g a n i s m s when pBR 322 DNA f r o m

a c i d - d a m a g e d c e l l s w a s u s e d c o n f i r m s t h a t h a b i t u a t e d o r g a n i s m s h a v e

e n h a n c e d a b i l i t y t o r e p a i r a c i d - d a m a g e d DNA. T h e r e p a i r p r o c e s s

r e s p o n s i b l e m a y r e q u i r e t h e g e n e p r o d u c t s o f u v r A, £ £ £ A a n d P£_^A

( T a b l e 3 4 ) .

H a b i t u a t e d o r g a n i s m s a l s o showed l e s s DNA d a m a g e b y a c i d ( T a b l e 32 a n d

F i g u r e s 28, 29 a nd 30). I s o l a t e d pBR 322 DNA was p r e d o m i n a n t l y in t h e f o r m

of c c c DNA a f t e r e x t r a c t i o n f r o m u n t r e a t e d pBR 322 c e l l s w h e t h e r t h e y

w e r e h a b i t u a t e d o r n o t . In c o n t r a s t , e x t r a c t s f r o m h a b i t u a t e d c e l l s

g e n e r a l l y c o n t a i n e d c c c p l a s mi d a f t e r e x p o s u r e t o pH 3.0 f o r 7 min w h e r e a s

- 206 -

n o n e was o b s e r v e d i n e x t r a c t s f r o m n o n - h a b i t u a t e d c e l l s . T r a c e s o f o c

p l a s m i d w e r e a l s o f r e q u e n t l y n o t e d w h e n h a b i t u a t e d p + c e l l s w e r e

a c i d - t r e a t e d . If a c i d t r e a t m e n t c a u s e s s i n g l e s t r a n d e d ( s s ) n i c k s in t h e

ENA, s l i g h t d a m a g e w o u l d l e a d t o oc f o r m b u t f u r t h e r d a m a g e ( i . e w i t h

s e v e r a l s s n i c k s p e r p l a s m i d ) w o u l d g i v e r i s e t o a p l a s m i d f o r m w h i c h

mi g h t be r e p a i r a b l e i n -vivo b u t wh i c h m i g h t b e c o m p l e t e l y d e g r a d e d b y t h e

p l a s mi d i s o l a t i o n p r o c e d u r e s u s e d o r n o t i m m e d i a t e l y r e c o g n i z a b l e a s a

p l a s m i d DNA.

T h e r e a r e s e v e r a l p o s s i b l e m e c h a n i s m s by w h i c h h a b i t u a t e d c e l l s m i g h t

p r o t e c t t h e i r DNA f r o m a c i d - d a m a g e . F i r s t l y , p H. m i g h t b e m a i n t a i n e d

c l o s e r t o n e u t r a l i t y a t v e r y l o w p H Q v a l u e s e i t h e r b y t h e a c t i v e

e x t r u s i o n of p r o t o n s o r by t h e p r o d u c t i o n of b a s i c c ompounds t o n e u t r a l i z e

i n t e r n a l a c i d i t y . A l t e r n a t i v e l y , t h e p H . m i g h t b e h a v e s i m i l a r l y , w i t h

r e s p o n s e t o v e r y low pHQ v a l u e s , i n h a b i t u a t e d a n d n o n - h a b i t u a t e d c e l l s

b u t t h e f o r m e r m i g h t c o n t a i n h i g h l e v e l s of DNA- b i nd i ng p r o t e i n s o r o t h e r

DNA b i n d i n g c ompone n t s wh i c h p r o t e c t t h e a c i d - s u s c e p t i b l e r e g i o n s of DNA.

The p r e v i o u s f i n d i n g s (Raja e t a l . , 1 9 9 1 a ) o f h i g h l e v e l o f a c a 63 k Da

p r o t e i n i n t h e a c i d - h a b i t u a t e d o r g a n i s m s may b e s i g n i f i c a n t h e r e . T h e

GroEL p r o t e i n ( mo l e cu l a r w e i g h t 62883) a p p e a r s t o a s s o c i a t e w i t h t h e DNA

of E s c h e r i c h i a co l i a f t e r a b r i e f e x p o s u r e t o h e a t a n d , a c c o r d i n g l y , a f t e r

mi l d s t r e s s i t may p l a y a r o l e , e i t h e r in p r e v e n t i n g s u b s e q u e n t DNA d a m a g e

o r i n t h e r e p a i r o f a l r e a d y d a m a g e d DNA ( P e l l o n a n d G o m e z , 1 9 8 1 ) .

- 2 0 7 -

Re f e r e n c e s

Ah m e d , S . , a n d I .R. B o o t h . 1983 . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 2 9 : 2 5 2 1 - 2 5 2 9 .

Al l an , B., M. L i ns ema n , L.A. M a c D o n a l d , J . S . La m a n d A.M. K r o p i n s k i . 1988 .

J . B a c t e r i o l . 1 7 0 : 3 6 6 8 - 3 6 7 4 .

Ana n t ha swa my , H.N., a nd A. E i s e n s t a r k . 1977 . J . B a c t e r i o l . 130: 187 - 191.

A r n o s t i , D.N. , V.L. S i n g e r a n d M . J . C h a m b e r l i n . 1 9 8 6 . J . B a c t e r i o l .

1 6 8 : 1 2 4 3 - 1 2 4 9 .

A s a k u r a , S. 1 9 7 0 . A d v . B i o p h y s . 1 : 99 - 1 55.

B a l t z , R.H. , a n d P. M a t s u s h i m a . 1981 . J . Ge n . M i c r o b i o l . 127: 137 - 1 4 6 .

B a r o n o f s k y , J . J . , W. T . A. S c h r e u r s , a n d E . R . K a s h k e t . 1 9 8 4 .

A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 8 : 1 1 3 4 - 1 1 3 9 .

B i n d e r e i f , A . , V. B r a u n , a n d K. H a n t k e . 1 9 8 2 . J . B a c t e r i o l .

1 50 : 1 4 7 2 - 1 4 7 5 .

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- 2 1 8 -

W i l l i a m s , P . H . , M. R o b e r t , a n d G. H i n s o n . 1 9 8 8 . J . A p p l . B a c t e r i o l .

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W i l l e t s , N. , a n d R. S k u r r a y . 1 9 8 0 . A n n . R e v . G e n e t . 14 : 41 -

W i l l e t s , N . , a n d B. W i l k i n s . 1 9 8 4 . M i c r o b i o l . R e v . 4 8 : 24 - 4 1 .

W i s e , R. R. a n d A. W. N a y l o r . 1 9 8 5 . A n a l y t . B i o c h e m . 1 4 6 : 2 6 0 - 2 6 4 .

Y a m a m o r i , T . , K. I t o , Y. N a k a m u r a a n d T. Y u r a . 1 9 7 8 . J . B a c t e r i o l .

1 3 4 : 1 1 3 3 - 1 1 4 0

Y a m a m o r i , T . , a n d T. Y u r a . 1 9 8 0 . J . B a c t e r i o l . 1 4 2 : 843 - 8 51.

Y a m a m o r i , T . , a n d T. Y u r a . 1 9 8 2 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA.

7 9 : 8 6 0 - 8 6 4 .

Y a n g , C . , a n d J . K o n i n s k y . 1 9 8 4 . J . B a c t e r i o l . 1 5 8 : 7 5 7 - 7 5 9 .

Z y l i c z , M., T. Y am am oto , N. M c k i t t r i c k , S. S e l l a n d C. G e o r g o p o l o u l o s .

1 9 8 5 . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 7 5 9 1 - 7 5 9 8 .

2 1 9 -