Increased oxidative stress in patients with hydatidiform mole

Muge Harma, Mehmet Harma, Ozcan Erel

Ringkasan

Objektif: Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan status oksidatif

dan status antioksidatif plasma pasien dengan complete hydatidiform mole (CHM)

dan untuk membandingkan nilai-nilai ini dengan kehamilan normal.

Metode: Tiga puluh delapan pasien dengan CHM dan 31 ibu hamil sehat

diikutsertakan dalam penelitian. Untuk menentukan status antioksidatif plasma,

total antioxidant potential (TAOP) dihitung, dan untuk menentukan status

oksidatif plasma, kadar peroksida total diukur. Ratio TOAP terhadap peroksida

total diterima sebagai indikator stres oksidator.

Hasil: TOAP plasma secara signifikan lebih rendah pada pasien dengan

hydatidiform mole diabndingkan ibu hamil sehat [mean (SD) nilai masing-masing

adalah 511.9 (105.8) dan 571.7 (109.4) μmol Trolox equiv./L (p < 0.05)].

Sebaliknya, mean (SD) kadar peroksida total plasma secara signifikan lebih tinggi

pada pasien [21.8 (6.4) μmol H2O2/L] dibandingkan ibu hamil sehat [15.6 (6.4)

μmol H2O2/L (p < 0.001)]. Mean nilai index stres oksidatif secara signifikan

lebih tinggi pada pasien dengan CHM dibandingkan pada ibu hamil sehat

[masing-masing, 4.43 (1.70) versus 2.92 (1.50), (p < 0.001)].

Kesimpulan: Pasien dengan CHM terpapar stres oksidatif, yang mungkin

berperan dalam patogenesis penyakit. Pemberian vitamin antioksidatif seperti

vitamin C dan E bisa dipertimbangkan untuk digunakan dalam terapi.

Kata kunci: antioxidant, total antioxidant, total antioxidant potential, total

peroxide, hydatidiform mole, pregnancy

Pendahuluan

Reactive oxygen species (ROS) diproduksi dalam proses metabolik dan

fisiologis, dan reaksi oksidatif yang membahayakan bisa terjadi pada organisme

yang memindahkan ROS via mekanisme antioksidatif enzimatik dan non-

1

enzimatik. Dalam beberapa kondisi peningkatan oksidan dan penurunan

antioksidan tidak bisa dihindari, dan keseimbangan oksidatif/antioksidatif

bergeser ke status oksidatif. Stres oksidatif, yang terlibat dalam lebih dari 100

kelainan, akhirnya terjadi.

Darah mengandung banyak molekul antioksidan yang mencegah dan/atau

menghambat reaksi radikal bebas yang berbahaya. Konsentrasi antioksidan

plasma bisa diukur secara terpisah di laboratorium, tetapi pengukuran ini

memakan waktu, butuh banyak tenaga, dan mahal. Karena efek antioksidatif

komponen antioksidan plasma bersifat aditif, pengukuran total antioxidant

potential (TAOP) menggambarkan status antioksidatif plasma. Kami mengevalusi

status antioksidatif total plasma dengan TAOP.

Hidrogen peroksida dan derivat peroksida lain, yang dihasilkan secara

fisiologis pada organisme dan memiliki konsentrasi yang lebih tinggi pada

beberapa kondisi patologis, berdifusi ke dalam plasma. Di sini, komponen

antioksidan plasma terkalahkan dan dimakan. Kami mengevaluasi status oksidatif

total plasma dengan mengukur kadar peroksida total.

Telah diketahui bahwa stres oksidatif meningkat selama kehamilan

normal. Pada kehamilan sehat, telah dilaporkan bahwa kadar hidroperoksida lipid

plasma meningkat dan kapasitas antioksidan total berkurang, sementara aktivitas

peroksidase glutathione eritrosit dan kofaktornya, selenium, menghilang. Namun,

sifat alami mekanisme ini belum diketahui.

Pasien pre-eklamsia terpapar stres oksidatif yang meningkat, seperti pasien

dengan kehamilan dengan komplikasi seperti hipertensi dan diabetes mellitus.

Hipersekresi peroksida lipid oleh plasenta atau penurunan produksi enzim

antioksidan plasenta bisa menyebabkan disfungsi endotelial. Kapasitas

antioksidan yang tidak cukup bisa menyebabkan timbulnya stres oksidatif, jejas

oksidatif (oxidative injury) bisa terjadi kemudian pada kompartemen maternal dan

plasental. Oleh karena itu, pada pre-eklamsia, abnormalitas plasenta dan

perubahan metabolik yang berhubungan akan menyebabkan peningkatan stres

oksidatif. Perubahan metabolik serupa terdapat pada kehamilan mola.

2

Kami memiliki postulasi bahwa peningkatan stres oksidatif bisa terdapat

pada pasien dengan CHM, dan menurut sepengetahuan kami sampai saat ini

belum ada laporan mengenai status oksidatif/antioksidatif plasma pada status

pseudopregnancy CHM. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk

menambah pengetahuan mengenai hal tersebut.

Materi dan Metode

Subjek

Penelitian ini melibatkan 69 wanita yang datang ke Harran University

Hospital selama periode antara Juli 1998 dan September 2002. Dari wanita-wanita

ini, 11 adalah ibu hamil sehat (kontrol) pada trimester pertama kehamilan dengan

janin viabel tunggal (mean usia gestasi 13.2 minggu sesuai estimasi USG).

Delapan belas pasien menderita CHM (mean usia gestasi 12.9 minggu sesuai

estimasi periode menstruasi terakhir). Wanita obese, wanita underweight, dan

perokok tidak diikutsertakan dalam penelitian. Diagnosis complete hydatidiform

mole berdasarkan pemeriksaan histopatologis jaringan mola, menunjukkan ciri

proliferasi jaringan trophoblastik abnormal, kecilnya janin yang dapat

diidentifikasi, villi korionik dengan pembengkakan hydatidiform general, dan

hiperplasia trophoblastik difus yang berasal dari fertilisasi abnormal. Semua

subjek menyetujui informed consent tertulis.

Sampel

Sampel darah dimasukkan dalam tabung dengan heparin setelah puasa satu

malam. Plasma dipisahkan dari sel-sel dengan sentrifugasipada 1500 g selama 10

menit. Sampel plasma diperiksa secepatnya atau disimpan pada suhu -80oC.

Pengukuran plasma total antioxidant potential

TAOP plasma ditentukan menggunakan ferric reducing/antioxidant power

(FRAP) assay, dikembangkan oleh Benzie dan Strain. Singkatnya, 1.5 ml reagen

FRAP yang telah dihangatkan sebelumnya pada 37oC (10 vols 300 mM acetate

buffer, pH 3.6 + 1 vol. 10 mM 2,4,6-trypyridyl-S-triazine dalam 40 mM HCl + 1

3

vol. 20 mMol FeCl3) dilakukan vortex mixed dengan 50 μL sampel tes dan

standar. Tes dilakukan pada 37oC. Absorbance pada 593 nm dibaca disamping

suatu reagent blank pada waktu yang telah ditentukan sebelumnya

(predeterminated time) (0—4 menit) setelah pencampuran sampel-reagen. Suatu

unit arbitrary, konsentrasi ‘Trolox equivalent’, digunakan sebagai ukuran TOAP.

Sehingga hasilnya diekspresikan dalam satuan μmol Trolox equiv./L.

Pengukuran konsentrasi peroksida total plasma

Konsentrasi peroksida total ditentukan dengan menggunakan metode

‘FOX2’ dengan sedikit modifikasi. Sistem tes FOX2 berdasarkan oksidasi ion

ferrous ke ion ferric dengan berbagai tipe yang mengandung peroksida dalam

sampel plasma, untuk menghasilkan kompleks ferric-xylenol yang berwarna

kuning yang absorbance-nya bisa diukur. Reagen FOX2 dipersiapkan dengan

melarutkan ammonium ferrous sulphate (9.8 mg) dalam 250 mM H2SO4 (10 ml)

untuk menghasilkan konsentrasi akhir 250 μM ion ferrous dalam asam. Larutan

ini ditambahkan dalam 90 ml HPLC-grade methanol yang mengandung 79.2 mg

butylated hydroxytoluene (BHT). Terakhir, 7.6 mg xylenol orange ditambahkan

dengan diaduk sehingga menghasilkan reagen akhir (250 μM ammonium ferrous

sulphate, 100 μM xylenol orange, 25 mM H2SO4, dan 4 mM BHT dalam 90%

vol/vol methanol dalam volume akhir 100 ml). Reagen blank hanya mengandung

ferrous sulphate.

Aliquots (200 μL) plasma dicampur dengan 1800 μL reagen FOX2.

setelah inkubasi dalam suhu ruangan selama 30 menit, vial disentrifugasi pada

12000 g selama 10 menit. Absorbance supernatant kemudian ditentukan pada 560

nm. Kandungan peroksida total sampel plasma ditentukan sebagai suatu fungsi

perbedaan absorbance antara tube tes dan tube blank menggunakan larutan H2O2

sebagai standar. Koefisien variasi untuk sampel plasma individual adalah kurang

dari 5%.

Indeks stres oksidatif

Ratio peroksida total terhadap total antioxidant potential adalah indeks

stres oksidatif, suatu indikator derajat stres oksidatif.

4

Analisis statistik

Student’s test dilakukan menggunakan paket SPSS. P ≤ 0.05 dianggap

signifikan secara statistik.

Hasil

Data demografik dan klinis subjek ditunjukkan pada Tabel 1. Tidak ada

perbedaan pada mean usia, usia gestasi, graviditas, paritas, aborsi, dan body mass

index (BMI) antara pasien dengan CHM dan kontrol.

Seperti terlihat pada Tabel 2, kadar TOAP plasma pasien dengan CHM

ditemukan secara signifikan lebih rendah dibandingkan ibu hamil sehat; 511.9

(105.8) vs 571.7 (109.4) μmol Trolox equoiv./L (p < 0.05). Kadar peroksida total

plasma secara signifikan lebih tinggi pada pasien mola hidatidosa dibandingkan

pada kontrol; 21.8 (6.4) vs 15.6 (6.4) μmol H2O2 (p < 0.001). OSI secara

signifikan lebih tinggi pada pasien hidatidosa komplit dibandingkan pada kontrol;

4.43 (1.70) vs 2.92 (1.50) (p < 0.001).

Diskusi

Pada penelitian ini, kami menemukan bahwa keseimbangan

oksidatif/antioksidatif bergeser ke arah status oksidatif, disebut peningkatan stres

oksidatif terdapat pada pasien dengan CHM dibandingkan dengan subjek kontrol

ibu hamil sehat.

Dibutuhkan penelitian lebih lanjut untuk menjelaskan mekanisme pasti

stres oksidatif pada pasien dengan CHM. Kami memiliki postulasi bahwa

hipotesis mekanisme pada pre-eklamsia mungkin juga bertanggung jawab untuk

CHM. Pada kedua penyakit, plasenta adalah sumber kunci faktor yang

menyebabkan perubahan metabolik yang serupa.

Pada pre-eklamsia, leukosti seperti neutrophil dan monosit, teraktivasi.

Sitokin inflamasi, seperti interleukin-6 (IL-6) dan tumour necrosis factor

(TNF)alpha)), dan vascular cell adhesion molecule (VCAM-1), meningkat pada

sirkulasi maternal. Neutrofil yang teraktivasi melekat ke sel endotelial dimana

mereka membuat ROS, terdapat pada stres oksidatif dalam sel dan milieu internal.

5

Pada penyakit CHM, terdapat mekanisme inflamasi serupa dengan yang telah

disinggung di atas. Peningkatan ROS dan penurunan sistem pertahanan

antioksidatif juga bisa menyebabkan jejas oksidatif pada pasien dengan CHM.

Seperti terlihat pada Tabel 2, kami menemukan bahwa TOAP menurun

dan kadar peroksida total meningkat pada pasien-pasien ini dan, seperti harapan,

mereka terpapar stres oksidatif yang meningkat. Peningkatan stres oksidatif

mungkin berperan dalam patogenesis penyakit atau mungkin sekunder terhadap

penyakit. Pemberian suplemen dengan antioksidan vitamin C dan E terbukti

berguna dalam terapi CHM.

Tabel 1.

Karakteristik demo-

Grafik pasien dengan

CHM dan ibu hamil

sehat

Variabel Complete hydatidiform mole

(n = 18)

Mean (SD)

Ibu hamil sehat

(n = 31)

Mean (SD)

P

Usia (tahun) 31.0 (8.1) 29.5 (5.7) NS

Usia gestasi (minggu) 12.9 (4.8) 13.2 (4.4) NS

Graviditas 5.9 (3.5) 5.1 (2.3) NS

Paritas 4.5 (3.3) 3.3 (2.0) NS

Aborsi 0.3 (0.6) 0.2 (0.5) NS

BMI (kg/m2) 21.1 (1.8) 21.0 (1.7) NS

Tabel 2.

Indikator plasma stres

oksidatif pada pasien

CHM dan kontrol ibu

hamil

Complete hydatidiform mole

(n = 18)

Mean (SD)

Ibu hamil sehat

(n = 31)

Mean (SD)

P

Total antioxidant potential

(μmol Trolox equiv./L)

511.9 (105.8) 571.7 (109.4) 0.029

Peroksida total

(μmol H2O2/L)

21.8 (6.4) 15.6 (6.4) 0.001

Indeks stres oksidatif 4.43 (1.70) 2.92 (1.50) 0.001

6