Upload
rajah-decker
View
103
Download
4
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
In the name of God. Summer School. Influenza Unit, Pasteur Institute of Iran summer 2011. SDS-PAGE Western Blotting. Summer School. و کاربردها SDS-PAGE. بررسی میزان خلوص پروتئین تعیین وزن مولکولی پروتئین شناسایی پروتئین (وسترن بلاتینگ) - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
In the name of
God
Summer School
Influenza Unit,Pasteur Institute of Iran
summer 2011
SDS-PAGE Western Blotting
Summer School
کاربردها SDS-PAGEو
پروتئین • خلوص میزان بررسیپروتئین • مولکولی وزن تعیین•) بالتینگ ) وسترن پروتئین شناساییسولفیدی • دی باندهای حضور وتایید شناساییپروتئین • کمی مقدار تخمینپروتئینها • ای ترجمه از پس تغییرات تعیینغیره ......• و
Summer School
SDS-PAGESodium Dodecyl Sulphate _
Polyacryl Amide Gel Electrophoresis
Summer School
ElectrophoresisElectro + Phoresis
( باردار مولکولهای در پروتئینها(حرکتجداسازی به منجر که الکتریکی میدان
گردد می آنهاSummer School
الکتروفورز فرآیند بر موثر عوامل
مولکولها • فیزیکوشیمیایی خصوصیاتمولکولها • اطراف محیط شرایطالکتریکی • میدان های مولفه
Summer School
مولکولها فیزیکوشیمیایی خصوصیات
شکل •اندازه•بارالکتریکی•
Summer School
مولکول اطراف محیط شرایط
•) ( غلظت و نوع الکتروفورز محیط بستریاو) • بافری ،ظرفیت یونی قدرت ، نوع (pHبافر
محیط • حرارت درجه
Summer School
الکتروفورز بسترهای
اندود) • کاغذ،ورقه جامدسیلیکاژل، به شده
) وسلولز آلومینا• ( آکریل پلی جامد نیمه
) آگارز و آمیدمایع•
Summer School
PAGEPolyacryl Amid Gel Electerophoresis
Summer School
برای آمید آکریل بسترپلی چراشود؟ می استفاده پروتئینها
Summer School
آمید آکریل پلی ویژگیهای
دماها، • در شیمیایی نظر یونی pHاز وقدرتهای هااست پایدار مختلف
است • غیرفعال و بار بدون ترکیبیاست • شفافدارد • را منافذ از وسیعی دامنه ایجاد قابلیتهستند • خالص بسیار آن مونومرهای• ... غیره و
Summer School
پلی در دخیل اجزا و آمید آکریل پلی ژل ترکیبمریزاسیون
Summer School
آکریل پلی ژل پلیمریزاسیون واکنشآمید
شیمیایی • پلیمریزاسیون- آمونیوم) (TEMEDپرسولفات
پلیمریزاسیون •فوتوشیمیایی
- (TEMEDریبوفالوین)
پلیمریزاسیون بر موثر عوامل
•) کننده ) شروع آمونیوم پرسولفات•TEMED) کاتالیزور)•) مهارکننده ) هوا اکسیژن(ºC30-20دما )•
زمان ) • بهترین (20-60زمان دقیقه
آکریل پلی ژل فیزیکی خصوصیاتآمید
منافذ • اندازهاالستیسیتی•ژل • چگالیمکانیکی • قوام
ژل دهنده تشکیل جز دو غلظت از متاثر اینهااست آمید آکریل بیس و آمید آکریل یعنی
Optimal Resolution Range
Acrylamide Percentage Separating Resolution 15.0% Gel 15- 45 Kd 12.5% Gel 15- 60Kd 10.0% Gel 18- 75Kd 7.5% Gel 30-120Kd 5.0% Gel 60-212Kd
Summer School
) تانک) و نمونه ژلها، بافرها
نوع •یونی • قدرتزیاد - جریان برقراری در نمونه یونهای نقش تا باشد کم
باشدتوان - افزایش بافر یونی غلظت بردن باال
گرما و الکتریکی• ( تغییر برابر در مقاومت بافری (pHظرفیت•pH (می پروتئین در تغییراتی باعث نباشد مناسب اگر
) است مهم الکتروفورز در که گردد
Summer School
ژل در بافری سیستمهای
پیوسته•و یونی است pHترکیب ثابت ژل سراسر و ها قسمت تمام بافردر
•) قسمتی) چند ناپیوستهو یونی سراسر pHترکیب و ها قسمت تمام ژل بافردر( Stacking &Resolving) است یکدیگرمتفاوت با
Summer School
Stacking & Separating Gels
SDS-protein
Glycin
Cl
Stacking gel height =2 well height
Summer School
: ناپیوسته سیستم مزیت
و • نیست نمونه حجم از متاثر الکتروفورز کاراییروش این با رقیق های نمونه از باالیی حجم
باشند می تفکیک قابلکننده • متراکم یا باال ژل در حرکت طی در پروتئینها
(Stacking) صورت نازکی به های سپس الیه و آمده درجداکننده یا پایین ژل ( Separating =Resolving)در
شوند می تفکیک خود اجزای به
Summer School
نمونه (sample buffer)بافر
Sample buffer component
• SDS )Sodium Dodecyl Sulfate( detergent
– solubilizes and denatures proteins
– negative charge to proteins
• 2-ME reduce disulphid bounds
• Glycerol
• Bromophenol Blue
• Tris bufferSummer School
تانک بافر
چیست؟ تانک بافر در گالیسین نقش
SDS-PAGE
Summer School
SDS
Summer School
SDSجایگاه
بافرها • ترکیب در( Separatingو Stackingبافرژلها)-(Sample bufferبافرنمونه)-بافرتانک-
Summer School
پروتئین SDSاثر ساختار بر
Levels of Protein Organization
• Primary structure = linear chain of amino acids
• • Secondary structure = domains of repeating structures, such as β-pleated
• sheets and α-helices
• • Tertiary structure = 3-dimensional shape of a folded polypeptide, maintained by disulfide bonds, electrostatic interactions, hydrophobic effects
• • Quaternary structure = several polypeptide chains associated together to form a functional protein
Summer School
SDS-PAGEانواع
-Denature SDS-PAGE-Non Denature SDS-PAGE
Summer School
ویروس همآگلوتینین واحدهای زیردی پیوندهای ومکان آنفلوآنزا
آن ساختار در سولفیدی
کار ایمنی
آمید • آکریل بیس و آمید آکریل•TEMED•2-ME•SDSو ...•
Summer School
MSDS
Material Safety Data Sheet
Summer School
Biosafety ofAcrylamide & Acrylamide-Bis
Summer School
71.1: وزن مولكوليcH2=cHcoNH2 فرمول شيميايي :
جامد كريستالي وضعيت ظاهري:سفيد و بي بو
Summer School
گير ،سمي کننده آتش محيط وآلودهزيست
است • نوروتوكسين شدت به ماده اينمي • جذب سرعت به تنفس و پوست راه از
است. ممكن و دارد سوء اثر باروری بر شود . شود جنين در ناهنجاريهايي بروز سبب
است • سرطانزااز • عبارتند آميد آكريل با مسموميت عاليم
ضعف، شدن، سوزن سوزن گيجي، و منگي. ولرز تكلم اختالل رفتن، راه در تعادل عدم
Summer School
ایمنی اقدامات : اس�تفاده از عين�ك ب�ا حف�اظ كن�اري تم7اس ب7ا چش7م•
ال�زامي ا�س�ت. اين� م�اده در� ص�ورت تم�اس ب�ا �چش�م �مي تو�اند باعث �سوز�ش چشم� و ورم� ملتحمه شود.
� چش�م را ب�ه م�دت • � ب�از ك�رده و س�ريعا پل�ك چش�م را ك�امالص�ورت �مش�اهده 15 د�ر ده�ي�د. شستش�و �آب �ب�ا دقيق�ه
پزش�ك �مراجع�ه ب�ه داده �و اد�ام�ه را شس�تش�و ع�و�ارض نمائيد.
�اظتي تم77اس ب77ا پوس77ت•��تكش حف��تفاده از دس�: اس. ب�ه�تر اس�ت از دو �جفت دس�تكش من�اس�ب ال�ز�امي ا�س�ت
� وارد �ا�س�تفاده �ش�و�د. اي�ن م�اد�ه از� طر�ي�ق ز�خم �ب�از س�ري�عا�پو�س�ته �پو�س�ته ب�اعث م�اده �ا�ين ب�ا ب�دن مي ش�ود�.تم�اس
شدن پوست مي شوددر ص�ورت تم�اس محل�ول ي�ا پ�ودر آكري�ل آمي�د ب�ا پوس�ت، •
� دقيق�ه 15مح�ل� تم�اس� را �ب�ا آب ف�راوان �و ص�ابون ب�ه م�دت �و مس ئ�ول ايمني را �در جريا�ن قرا�ر ده�يد �.ش�ستش�و داده
Summer School
اقدامات ایمنی در موارد زیر
: در ص�ورتكه ف�رد حجم زي�ادي بلعي7دن-خوردن•�ا�ز� م�اده را� ب�لعي�ده �باش�د ف�رد �را �وادا�ر ب�ه� اس�تف�راغ كن�ي�د �اين �ك�ا�ر� ب�ا ق�ر�ار د�ادن� ان�گش�ت ي�ا قاش�ق �د�ر �پزش�ك �� ب�ه پش�ت� زب�ان� ا�مك�ان� پ�ذي�ر �اس�ت.� ف�ور�امرا�جع�ه �كني�د.� ت�ذ�كر ب�ه� ف�رد�ي� ك�ه هوش�يار ن�يس�ت
هرگز از راه خوراكي چيزي ندهيد.: از طري�ق استنش�اق بس�يار س�مي اس�ت. تنفس •
�ر تنف�س ��د. اگ��ل كني��ازه م�نتق��وا�ي ت��ه ه��ر�د را� ب�فقطع شده� بو�د به� وي �تنفس مصنوعي �بدهيد
نگهداری و ذخیره سازی
در محيطي با تهويه مناسب و خنك نگهداري •شود.
در صورت بروز حريق از كپسول هاي پودر •خشك شيميايي ؛ دي اكسيد كربن يا آب جهت
استفاده نماييداطفاء حريق
Summer School
اثرات زيست محيطي و رفع آلودگي�ت •��ط زيس��ان و محي��راي آبزي��اده ب�اين م
آنها بسيار خطرناك است. در حيوان�ات ب�اعث ايج�اد توم�ور در ري�ه؛•
مي شود .و ... آدرنال ،غده تيروئيد
Summer School
دفع پسماندهاي آكريل آميد:•اد زائ�د آكري�ل آمي�د ش�امل ژل و حول�ه كاغ�ذي آل�وده باي�د در ي�ك م�و
ك�يسه ز�يپ دار قرار� داده شود �و براي� سوزا�ندن ارسال �گردد.رفع آلودگي سطوح :•
: آل�ودگي را ب�ا م�واد خن�ثي آل�ودگی در ص7ورت كم ب7ودن حجم- م�ث�ل خ�اك�؛ش�ن�؛� ما�س�ه� و �ي�ا �ه�ر �م�ا�د�ه ج�اذ�بي �ك�ه ب�ا �آن �واكنش نم�ي ده�د جم�ع آوري� ن�ما�يي�د) �از خ�اك �ار�ه اس�ت�فاده �نكني�د�(. س�پ�س مح�ل
�% و� ب�ع�د �ب�ا م�حل�و�ل س�ديم 1/6آ�ل�ود�ه �را �ب�ا م�ح�ل�ول �س�دي�م پ�ر �س�ولفا�ت�دقيق�ه ب�ا� حجم زي�اد %30� پوش�ا�ن�ده �و بع�د �از �1/6ب�ت�ا بي س�ولفات
آب شستشو دهيد.آل7ودگیدر ص7ورت زي7اد ب7ودن حجم- : اف�راد را ب�ا زدن عالمت
.��نش�ت م�اده� ش�يميايي ازخط�ر ب�ر ر�وي �درب آزمايش�گاه مط�ل�ع كني�د � آ�زمايش�گاه ج�لوگ�یر�ی کنی�د ؛ تهو�ي�ه مناس�ب را رو�ش�ن نم�و�ده و ف�ور�ا
�نم�ودن �آب م�ي تو�اني�د غ�لظت� بخ�ارات آن را �ر�ا �ت�رك �كني�د�. ب�ا� اس�پريدر هوا كم كنيد.
Summer School
• � براي محل�ول س�ازي و ت�وزين پ�ودر آكري�ل آمي�د باي�د حتم�ااز �هود شيم�يايي�، دستكش و �ماسك استف�اده �کنید.
در ص�ورت ريختن ژل، م�يز ك�ار را ب�ا حول�ه كاغ�ذي، كاغ�ذ •خشك كن يا اليه جذب كننده ديگر بپوشانيد.
سيس�تم • ج�انبي ل�وازم س�اير و ه�ا شيش�ه ه�ا، گيره � بشوييد. الكتروفورز را بعد از استفاده كامال
ژل اس�تفاده ش�ده و اض�افي را بع�د از بس�تن كام�ل، ب�ا •ا�س�تفا�ده از دس�تكش� در كيس�ه ا�ي جداگان�ه ق�رارداده و � بس�ته ش�ده �د�ور بريزي�د)آكري�ل آمي�د بص�ور�ت ژل �ك�امال
اثر سمي كمتري دارد.(به�تر اس�ت بج�اي پ�ودر آكري�ل آمي�د، محل�ول ه�اي آم�اده •
خريداري و مصرف شود. Summer School
اين م�اده ب�اعث آس�يب ب�ه چش�م، پوس�ت و سيس�تم گوارش�ي •
و ب�ه سي�س�تم� عص�بي� مرك�ز�ي ميگ�رد�د. هم�چ�نین مي �توان�د
محي�طي آس�يب رس�اند�ه و �در ص�ورت تم�اس� ط�والن�ي م�دت
ب�ا �تجم�ع �در �ا�رگ�ا�ن �ه�اي م�ختل�ف ب�د�ن س�الم�ت� ف�ر�د ر�ا� ب�ه� خط�ر
.اندازد
اقدامات ایمنی
در تم�اس ب�ا چش�م وپوس�ت و تنفس مانن�د آكري�ل آمي�د رفت�ار مي ك�نيم •مح�ل آل�ودگي را ب�ا آب و دس�تمال تم�يز ك�رده و آن را در س�طل زبال�ه •
م�خص�و�ص بر�ي�زي�د.� در �ص�ورت� ري�ختن �مق�ادير ز�ي�اد �از �اين محل�ول ب�ه آن �آن� آ�ب نريزي�د و� ب�راي� تم�ي�ز �ك�رد�ن� مح�ل �ا�ز م�س�ئول �دس�ت� ن�زد�ه� و روي
.�ايمني� كمك �بگيريددر مواق�ع اس�تفاده از دس�تكش و ماس�ك و لب�اس مخص�وص اس�تفاده •
.شود
شخصي • :محافظت
به�تر اس�ت ك�اربر در موق�ع اس�تفاده در ات�اقي ب�ا تهوي�ه مناس�ب ك�ه در آن ذ�رات� معل�ق پ�راكن�ده �از� اين م�ا�ده� ب�ه ا�س�تان�ه خط�ر� ن�مي رس�ند ك�ار
كند در اين ات�اق مي بايس�تي وس�ايل ايم�ني ب�راي شستش�و چش�م و ب�دن
وجود داشته باشد
Summer School
نگهداري بیس آکریل آمید
اين م�اده مي بايس�تي در محي�ط ب�ا تهوي�ه خ�وب
درج�ه س�انتی گ�راد نگه�داري 25و دم�ای زي�ر
شود
TEMED
Summer School
TEMED
Tetramethylethylenediamineنام شيميايي:
آميني شديدمشخصات ظاهري: محلول شفاف ، بي رنگ با بوي
- در حالت مايع و بخار به شدت آتش گيراست.
- در صورت تنفس يا بلعيدن سوزاننده است.
در مدت طوالني نوعي تاري ديد ایجاد می کند.TEMED- تماس با مقادير كم
بوده است به سرعت به فضاي آزاد TEMED اگر فردي كه در معرض بخار
منتقل شود اين تاثير موقتي خواهد بود.
Summer School
SDS-PAGEاجرای
Summer School
الکتروفورز عملی اجرای مراحلSDS-PAGE
آماده سازی ژل•آماده سازی نمونه•سوارکردن ژل •نمونه گذاری•راندن نمونه در ژل•تثبیت و رنگ آمیزی نمونه ها•نگهداری ژل• تحلیل نتایج•
Summer School
ژل سازی آماده
Summer School
قالب سازی آماده
Summer School
(resolving) اول ژل ریختن
Summer School
دوم ژل (Stacking)ریختن
Summer School
(Comb) شانه قراردادن
Summer School
تانک در ژل قالب قراردادن
Summer School
گذاری نمونه و نمونه سازی آماده
Summer School
Summer School
SDS-Protein
Glycine < SDS-Protein < Cl
Electrophoretic Migration of Glycine, SDS-Protein and chloride in electrical field
Summer School
How does an SDS-PAGE gel work?
• Negatively charged proteins move to positive electrode
• Smaller proteins move faster
• Proteins separate by size
Summer School
آمیزی رنگ
Summer School
SDS-PAGE آمیزی رنگ انواع
پذیر • برگشتایمیدازول با آمیزی رنگ
ناپذیر • برگشت - Coomassie staining - Silver staining
ژل نگهداری
Summer School
نتایج آنالیز
Summer School
Dot & Western-Blotting
Summer School
Western-Blotting
اساس: • که است ایمونوشیمیایی تکنیک تعریفباشد می بادی وآنتی ژن آنتی واکنش آن
کاربرد:•تحقیقات-تشخیص-
Summer School
Blotting
) ( پلی ژل از پروتئینها مولکولها انتقالغشا به آمید آکریل
Summer School
Kind of Blotting
• Kind of Molecule- Western Blotting(protein)- Eastern Blotting(lipid)- Southern Blotting(DNA)- Northern Blotting(RNA)
Summer School
غشا به مولکول انتقال راههای
مستقیم••) ژل ) از مستقیم غیر
غشا به ژل از مولکولها انتقال راههای
برق • جریان از استفاده ( Electro Blotting)با
از • استفاده برق بدون Non Electro)جریانBlotting )
انتشار-موئینگی - خاصیتخال - کمک (Vacum)با
Summer School
برق جریان با انتقال روشهایتانک • در (Wet/Tank transfer)انتقال
بافر حاوی
خشک انتقال• (Semidry transfer)نیمه
Summer School
تانک در (Wet/Tank transfer)انتقالبافر حاوی
Semidry transformationانتقال نیمه خشک
Summer School
الکترود دو بین ژل و غشا گرفتن قرار ترتیبWestern-Blotting
W. Blotting Procedure
Summer School
Western-Blottingمراحل
الکتروفورز از استفاده با پروتئینها مخلوط از پروتئین SDS-PAGEتفکیک
غشا روی بر پروتئین (Transferring)انتقال غشا کردن (Blocking)مسدود
) غشا ) در پروتئینها اختصاصی تشخیص منظور به لیگاند بادی آنتی با نمودن مجاور
Blotآشکارسازی
Summer School
Summer School
تفکیک پروتئین از مخلوط پروتئینها با استفاده از SDS-PAGEالکتروفورز
غشا به پروتئین انتقال
Summer School
(Membrane)غشا
Summer School
غشا (membrane)انواعنیتروسلولز-سلولز - اتیل آمینو اتیل دیسلولز - متیل کربوکسی-PVDF) فلوراید) دی وینیلیدن پلی-DBM) متیل) اکسی آزوبنزل دی-DPT) تیواتر) فنیل آزو دینایلون--Summer School
غشا انتخاب بر موثر عوامل
بالتینگ • هدفقیمت•
Summer School
سلولز نیترو ویژگیهای
منافذ • میکرومتر 0/45تا 0/05اندازهپروتئین • به اتصال باالی ظرفیتقیمت • ارزان
انتقال (Transfer Buffer)بافر
Summer School
انتقال بافر موثربرانتخاب عوامل
)برای گلیکوپروتئینها از بافر بورات سدیم نوع پروتئین •استفاده می شود(
نوع غشا•نوع الکتروفورز• CAPSمانند تعیین توالی پروتئین که از بافر هدف بالتینگ)•
(استفاده می گردد
Summer School
غشا به انتقال تایید راههای
یا ) • سلولز نیترو غشا آمیزی ( PVDFرنگ- - ( بلک آمیدو اس، پانسو مانند پذیر درصد(0/01برگشت- ( آمیدوبلک آبی، کووماسی ناپذیر (0/5برگشت اسیدی درصد
تجاری • خاص پروتئینی مارکرهای از استفاده
Summer School
غشا به انتقال از بعد مراحل سایر
Summer School
Membrane Blocking(Quenching)
Blocker must be inert protein(BSA, hemoglobin, Skim milk,Gelatin,…)
Summer School
تشخیص اختصاصی پروتئینها در غشا با استفاده ازلیگاندها
مستقیم • تشخیصغیرمستقیم • تشخیص
) ثانویه ) لیگاند به متصل ها رادیواکتیو،فلورسانس،آنزیم مواد از استفاده با
: لیگاندها انواعمی ) - قرار استفاده مورد پژوهشی یا تشخیصی اهداف با که بادیها آنتی
گیرند(لکتینها-و ...-
Summer School
) بالتینگ) وسترن ایمونوبالتینگ
Summer School
Blot Detection & Evaluation
Summer School
Thanks