Improving the production of transgenic fish germlines: In vivo evaluation of

mosaicism in zebrafish (Danio rerio) using a green fluorescent protein (GFP)

and growth hormone cDNA transgene co-injection strategy.

Amanda Swari Prasepti1, Claudya Larisha

1, Endah Permata Sari

1, Shafa Imanda

1

1Jurusan Biologi (Bioteknologi), Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Al Azhar Indonesia

Jl. Sisingamangaraja, Kebayoran Baru, Jakarta Selatan 12110

ABSTRAK

Metode mikroinjeksi pada ikan biasanya digunakan untuk mentransfer

gen. Tetapi hasil terekspresinya gen akan beragam karena integrasi transgen

yang terlambat. Jika tidak terintegrasi ke dalam sel bakteri maka gen tidak dapat

terekspresi dengan baik pada keturunannya. Maka dari itu tujuan dilakukannya

penelitian ini adalah untuk mengevaluasi in vivo mosaikisme sampai pada tahap

tertentu dalam mengekspresikan gen. Ketika ikan tersebut diberi reporter gen

berupa GFP dan growth hormone cDNA, maka akan terlihat mosaikisme dari

germline dan ukuran tubuh pada hewan model. Pada penelitian ini menghasilkan

keturunan dari ikan transgenik dengan gen yang terekspresi secara stabil.

Kata kunci : Transgenesis, ikan transgenik, mikroinjeksi, growth hormone cDNA.

PENDAHULUAN

Transgenesis merupakan proses

mengintroduksi satu atau lebih gen ke

dalam embrio suatu organisme yang

selanjutnya gen tersebut dapat

ditransmisikan pada generasi berikutnya.

Gen asing yang diintroduksikan tersebut

biasanya berkaitan dengan karakter

fenotipe penting dalam suatu budidaya,

sehingga dapat menghasilkan organisme

yang lebih unggul dari pada oraganisme

aslinya. Dan dengan adanya metode ini

kita dapat mengaplikasikannya ke

organisme vertebrata rendah dengan

menyajikan reproduksi dan karakteristik

biologis yang memungkinkan mudah

untuk di manipulasi proses genetik

maupun fisiologis pada tahap awal

ontogenesis dan salah satu contoh hewan

yang akan ditransgenik adalah ikan jenis

Danio rerio atau yang lebih dikenal zebra

fish.

Transfer gen pada ikan ini

bertujuan sebagai model eksperimetal

dalam hal penelitan dibidang medis

khususnya dalam penelitian yang

melibatkan embriogenesis dan

organogenesis, serta dalam mempelajari

penyakit penyakit yang menyerang

manusia, serta dalam memproduksi protein

rekombinan. Salah satu cara untuk transfer

gen ini adalah dengan mikroinjeksi.

Penggunaan mikroinjeksi dalam transgenik

ikan didukung oleh hal-hal seperti jumlah

telur yang relatif banyak dan fertilisasinya

terjadi secara eksternal yangmemudahkan

introduksi gen asing pengkode target.

Dengan mikroinjeksi pada ikan

zebra ini yang dapat memungkinkan

mengevaluasi motif dan potensi induk

dalam menghasilkan organisme yang

diingkinkan. Penggunaan gen reporter

yang memungkinkan evaluasi derajat di

mosaicism vivo pada ikan transgenik dapat

memfasilitasi identifikasi pendiri. Gen

yang digunakan untuk motif pada ikan

zebra menggunakan gen coding untuk

green fluorescent protein (GFP) dari ubur-

ubur ubur yang telah banyak digunakan

sebagai gen pelapor.

Penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui hasil dari proses transgenesis

pada zebra fish dengan menonjolkan

ekspresi sifat pertumbuhannya (msGH)

dan mozaikisme (GFP).

METODOLOGI

Untuk memproduksi ikan

transgenic maka diperlukan ikan dewasa

dari spesies zebra fish (Danio rerio) wild

type. Lalu ikan dipelihara dalam sistem

perairan tertutup bersuhu 28 C dengan

penyinaran dibawah 14 h light/10 h. Lalu

telur yang terbuahi dari ikan tadi diambil

dan akan di mikroinjeksi dengan dua

transgen. Transgen yang satu diambil dari

ikan mas (Cyprinus carpio) - aktin

promotor mendorong ekspresi baik A.

Victoria GFP gen (pcA / GFP plasmid)

atau ikan silverside laut (Odonthestes

argentinensis) untuk diambil hormon

pertumbuhannya yaitu (msGH) cDNA

(pcA / msGH plasmid). Yang kedua

disediakan oleh Dr. Suzanne Brooks

(Universitas Southampton, Inggris) yaitu

plasmid pcA / GFP untuk menghasilkan

pcA /msGH plasmid dan menggantinya

dengan gen GFP dengan msGH cDNA

(Marins et al., 2002). Kedua gen ini

dilinierisasi dengan Spe I enzim yang

terekstriksi dan disuntikkan pada

perbandingan 1 : 1 ke dalam embrio ikan

tersebut dengan konsentrasi DNA total 35

ng uL-1. Setelah itu proses mikroinjeksi

menggunakan protocol yang sama dari

Vielkind (1992) menggunakan IM-30

bermotor picoinjector (Narishige, Jepang).

Sebanyak 1872 embrio disuntikkan

dan diinkubasi dengan suhu 28 C sampai

telur-telur menetas. Satu minggu setelah

pembuahan, ikan dianalisa kembali dengan

mikroskop epifluorescence (eksitasi = 485

nm; emisi = 520 nm). Lalu diklasifikasikan

menurut terekspresinya GFP embrio yang

tertetasi dengan pola ekspresi

mosaikismenya(Gibbs dan Schmale, 2000;

Thermes et. al, 2002). Jika lemah maka

hanya ada beberapa sel yang terkspresi.

Jika moderat maka kurang dari 50%

terekspresi dan yang terkuat akan lebih

dari 50% terekspresi GFP-nya. Lalu gen

akan dievaluasi keberadaannya dengan

(RT-PCR). Ikan transgenic ini diberikan

nama G0 yang membawa gen GFP.

Lalu ikan G0 dan ikan non-

transgenik sama-sama dibesarkan untuk

dilihat skala pertumbuhannya. Mereka

diberi makan sehari dua kali dengan kadar

protein 47.5 %. Dan data ukuran serta

berat tubuh dianalisa menggunakan t-test

variasi heterogenus statistic program v.06

(statsoft, USA). Delapan G0 yang terpilih

dengan ekspresi GFP yang terkuat

dipisahkan di akuarium yan g berbeda dari

teman-temannya dan dipasangkan dengan

ikan non-transgenik. Hanya enam yang

memilki hasrat untuk kawin dengan ikan

non-transgenik (wild type) dan membuahi

G1 dengan GFP yang terekspresi. Dari

semua ketrurunan G0, G1, dan seterusnya

diekstrak DNA-nya dengan PCR untuk

dilihat apakah GFP dapat terekspresi

dengan baik di setiap keturunannya.

HASIL

Transgenik yang dilakukan pada

ikan zebra menghasilkan 1872 embrio

pada satu sel.dengan penggunaan cA /

GFP dan cA / msGH dengan rasio

equimolar (1:1). Dan setelah seminggu

pengamatan didapatkan embrio yang atau

telur yang masih bertahan sebanyak 1414

yang diamati dibawah mikroskop

epifluorescence, satu minggu setelah

pembuahan, tingkat kelangsungan hidup

untuk ikan yang tidak diobati embrio

adalah 1414 dari 1872 (75,5%), sedangkan

kelangsungan hidup tingkat embrio

microinjected adalah 877 dari 1872

(46,8%), dimana 275 dari 877 (31,4%)

digolongkan sebagai GFP negatif (tidak

ada ekspresi), 315 dari 877 (35,9%)

sebagai lemah GFP positif, 198 dari 877

(22,6%) sebagai moderat GFP positif dan

89 dari 877 (10,1%) sekuat GFP positif.

Jumlah dari tiga kelas ekspresi GFP adalah

602 dari 877 ikan (68,6%).

Dan setelah 12 bulan didapatkan

hasil ikan positif untuk ekspresi msGH

oleh RT-PCR msGH transgen. Dan analisa

untuk berat rata rata menunjukan

peningkatan yang signifikan (p

transgenik tidak menunjukan perilaku

reproduksi yang dikembangkan namun

terdapat dua jantan (M0104 dan M0204)

dan empat betina (F0104, F0204, F0304

dan F0404) yang direproduksi, empat di

antaranya (M0104, F0104, F0204 dan

F0304) ditransmisikan gen GFP ke G1

dalam persentase yang bervariasi dari

2,2% menjadi 42%. Ekspresi GFP diamati

dalam keturunan G1 menunjukkan ikan

mengekspresikan gen ditransfer di semua

sel tubuh.

Namun, gen msGH hanya dapat

dideteksi dalam keturunan G1 yang

diperoleh dari induk ikan M0104 dan

F0104 . Hanya setengah keturunan GFP-

positif dari orangtua M0104 yang dapat

membawa gen msGH tetapi untuk induk

F0104 semuanya membawa gen tersebut.

Keturunan GFP-positif juga positif untuk

eksogen-nous GH gen (Tabel 1). Tidak ada

ekspresi gen GFP dideteksi dalam

keturunan dari orang tua M0204 dan

F0404.

Keturunan G1 dari M0104 dan

F0104 G0 mosaik orang tua yang positif

untuk kedua transgen yang dipelihara

sampai pematangan seksual dan enam G1

ikan dari masing-masing induk

dikawinkan dengan jenis ikan liar untuk

menghasilkan keturunan G2. Sebanyak

466 anak G2 dihasilkan dari perkawinan

M0104 sementara 588 anak G2 diperoleh

dari perkawinan F0104.

Gambar 1. Ikan Zebra (Danio rerio) a.Ikan

non-transgenik berumur 1 tahun (bobot =

0.68g 0.13 g) b. Ikan transgenik G0

berumur 1 tahun (bobot = 1.79 g 0.37 g)

PEMBAHASAN

Proses yang paling sulit pada

transgenic adalah saat menghasilkan

germline yang dapat membawa transgen

dalam keadaan stabil. Hal ini bertujuan

untuk menghasilkan ikan transgenik yang

membawan transgen aktif (cA/msGH)

namun juga transgen reporter (cA/GFP)

yang mampu mengevaluasi mozaik yang

terdapat disemua generasi G0 ikan

transgenik.

Seminggu setelah 68,6% embrio

ikan diinjeksi, maka menghasilkan ikan

transgenik. Bila dibandingan dengan ikan

zebra transgenik 1,95% yang diperoleh

Morales et al. (2011) dan 10% ikan

transgenik yang diperoleh Rahman dkk.

(1997) yang menggunakan transgen

reporter yang sama dengan startegi co-

injeksi.

Mereka menemukan bahwa 10%

dari ikan yang dianalisis olehnya

menghasilkan ekspresi gen reporter GFP

yang kuat, lebih dari 5% ekspresi GFP

lebih kuat dripada yang diperoleh oleh

Gibbs dan Schmale (2000) untuk ikan

zebra transgenik G0 dan 3% lebih kuat

yang diperoleh Thermes et al. (2002)

untuk G0 ikan transgenik. Kondisi yang

digunakan oleh para peneliti sebelumnya

mirip dan mereka juga menggunakan

transgen linierisasi di mana gen GFP

dikendalikan oleh promotor ( dan -

aktin).

Analisis RT-PCR menunjukkan

bahwa 100% dari G0 ikan transgenik GFP

positif mengekspresikan gen msGH namun

tidak semua ikan tersebut membawa

transgen msGH dalam sel dan bisa saja

menurunkan transgen msGH ke generasi

berikutnya, ini akan terlihat jelas ketika G0

dan ikan wildtype disilangkan. Data

percobaan pertumbuhan didukung hasil

RT-PCR dan menunjukkan bahwa

kelompok transgenik meningkat berat 2,6

kali lebih banyak dari kelompok

nontransgenic. Hasil ini menunjukkan

bahwa cA / msGH transgen

menghasilkan hormon aktif. Semakin berat

ikan transgenik itu memungkin terkaitnya

dengan peningkatan msGH yang beredar

dan tidak dapat dikontrol oleh mekanisme

umpan balik negatif yang mengatur

ekspresi gen GH endogen (Peter dan

Marchant, 1995).

Konsekuensi negatif dari produksi

mozaik germline ikan transgenik

kenyataan adalah bahwa sel ikan G0 hanya

dapat menerima sedikit atau tidak ada

sama sekali salinan transgen yang

membuat transmisi transgen ke generasi

berikutnya namun hal ini dapat

diminimalkan dengan mengevaluasi

mozaik dengan penggunaan strategi co

injeksi reporter. Hal ini dapat didukung

dengan adanya penelitian yang

menunjukan adanya iakn yang positif GFP

ke generasi G1.

Presentasi dari GFP menujukan

bahwa ikan G1 memiliki tingkat mozaik

yangs ama pada germ line ikan G0. Namun

pada penelitian ini menunjukan terdapat

dua ikan yang tidak menghasilkan

keturunan transgen, sementara empat ikan

yang ditransmisikan dengan cA / GFP

dari 2,2% menjadi 42% yang positif

menunjukan adanya GFP. Pada penelitian

ini dalam mengidentifikasi ikan G1

sangatlah berhubungan dengan adanya gen

reporter GFP dan penggunaan mikroskop

epifluorescence. Ikan G1 ini berasal dari

betina F0104 dan jantan M0104yang

disilangkan dengan jenis ikan wild yang

memverifikasi bagaimana transgen

tersebut di integrasi pada genom ikan G2.

Dalam G2 diproduksi dari keturunan

M0104 sejumlah ikan GFP-positif tidak

membawa eksogen GH transgen sementara

beberapa ikan GFP-negatif membawanya.

Hal ini menunjukkan bahwa cA / GFP

dan cA / msGH transgen terpisah di G2,

sejak diamati rasio genotipe (Tabel 1)

sesuai dengangen terletak pada kromosom

yang berbeda. Namun, untuk F0104

keturunan G2 keturunan semua individu

GFP-positif yang membawa cA / msGH

transgen serta cA / GFP transgenik,

menunjukkan bahwa kedua transgen

memiliki telah terintegrasi pada kromosom

yang sama.

Dengan adanya metode ini dapat

memungkinkan mengidentifikasi ikan G0

dan dapat pula mengidentifikasi ikan

transgen pada generasi berikutnya. Selain

itu, metode ini juga dapat digunakan untuk

mengetahui proses integrasi transgen

genomik serta mengidentifikasi keturunan

yang ditransmisikan transgen pada

kromosom yang sama.

KESIMPULAN

Transgenik merupakan teknik

memindahkan gen dari satu makhluk hidup

ke makhluk hidup lainnya, baik dari satu

hewan ke hewan lainnya ataupun dari satu

tanaman ke tanaman lainnya. Salah contoh

dari teknologi transgenetik ini yaitu ikan

transgenik yang mampu menghasilkan

benih ikan unggul, melalui perbaikan

mutu genetik ikan yang dibudidayakan.

DNA rekombinan ikan yang telah

dikendalikan dimasukkan ke dalam

genom, sehingga DNA ikan yang

dimasukkan dapat mengembangkan salah

satu aspek dari produktivitas, juga efeknya

dapat diturunkan kepada keturunannya. Ini

bermanfaat untuk meningkatkan produksi

dan produktivitas ikan. Keunggulan dari

rekayasa ini yaitu pertumbuhan cepat,

tahan terhadap serangan penyakit, dan

tahan terhadap lingkungan yang cukup

ekstrem. Dalam transgenik ikan

menggunaan mikroinjeksi yang didukung

oleh hal-hal seperti jumlah telur yang

relatif banyak dan fertilisasinya terjadi

secara eksternal yang memudahkan

introduksi gen asing pengkode target, yang

dapat memungkinkan mengevaluasi motif

dan potensi induk dalam menghasilkan

organisme yang diingkinkan.

DAFTAR PUSTAKA

Figueiredo, Mrcio de Azevedo., Lanes,

Carlos Frederico Ceccon., Almeida,

Daniela Volcan., and Marins, Luis

Fernando. 2007. Improving the production

of transgenic fish germlines: In vivo

evaluation of mosaicism in zebrafish

(Danio rerio) using a green fluorescent

protein (GFP) and growth hormone cDNA

transgene co-injection strategy. Genetics

and Molecular Biology. Vol 30 (1):31-36.