Implication des hémolysines de Staphylococcus aureus … · Listeria monocytogenes . and . ... = régulateur positif du facteur σ B • σσ B = facteur de transcription ... Module

Implication des hémolysines de Implication des hémolysines de Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus dans le dans le développement de l'infection développement de l'infection

intracellulaire dans une lignée de intracellulaire dans une lignée de cellules phagocytairescellules phagocytaires

Aurélie OLIVIERUniversité Catholique de Louvain

Unité de pharmacologie cellulaire et moléculaire

24-septembre-2006

IntroductionIntroduction

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus••

CocciCocci

Gram +Gram +

••

CCoagulaseoagulase

+ + ((vsvs. . coagulasecoagulase

--

: : S. S. epidermidisepidermidis, , S. S. saprophyticussaprophyticus ))

••

Réservoir : homme et animaux à sang chaudRéservoir : homme et animaux à sang chaud--

colonise les muqueuses nasales et la peaucolonise les muqueuses nasales et la peau

(colonisation permanente ~ 20% de la population; intermittente 6(colonisation permanente ~ 20% de la population; intermittente 60%)0%)


Infection de la peau et des tissus Infection de la peau et des tissus mous (furoncle, impétigo,…)mous (furoncle, impétigo,…)OstéomyélitesOstéomyélitesEndocarditesEndocarditesSyndrome du choc toxiqueSyndrome du choc toxiqueEmpoisonnement alimentaireEmpoisonnement alimentaire……

Infections à StaphylocoquesInfections à Staphylocoques

Infections récurrentes Infections récurrentes et difficiles à traiteret difficiles à traiter


Scandinavian Journal of Immunology.Volume 61

Issue 6

Page 536

-

June 2005

Infection of Human Endothelial Cells with Staphylococcus aureus Induces Transcription of Genes Encoding an Innate Immunity Response.A. Matussek, J. Strindhall, L. Stark

, M. Rohde, R. Geffers, J. Buer, E. Kihlström, P.-E. Lindgren &

S.Löfgren

Clin

Infect Dis. 2001 Jun 1;32(11):1643-7.

Epub

2001 Apr 30.

Intracellular persistence of Staphylococcus aureus small-colony variants within keratinocytes: a cause for antibiotic treatment failure in a patient with

darier's

disease.

von Eiff C., Becker K., Metze D., Lubritz G., Hockmann J., Schwarz T., Peter G.

Molecular Microbiology. Volume 49

Issue 4

Page 919

-

August 2003

Biphasic intracellular expression of Staphylococcus aureus virulence factors and evidence for

Agr-

mediated diffusion sensingSankale Shompole, Kim T.

Henon, Linda E.

Liou,

Katarzyna Dziewanowska, Gregory A.

Bohach

and Kenneth W.

Bayles*

FEMS Microbiology letter. Vol. 193 Issue 1 Pages 57-62 -

December 2000Demonstration of intracellular Staphylococcus aureus in bovine mastitis alveolar cells and macrophages isolated from naturally infected cow milkAlexandre Hébert,

Khampoune Sayasith, Serge Sénéchal, Pascal Dubreuil

and Jacqueline Lagacé

S. aureus S. aureus intracellulairesintracellulaires

Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005 55(6):897-904 Activity of three ß-lactams

(ertapenem,

meropenem

and

ampicillin) against

intraphagocytic Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureusSandrine Lemaire, Françoise Van

Bambeke, Marie-Paule Mingeot-Leclercq

and Paul M.

Tulkens*


Paroi

S. aureus

cellule eucaryote

Adhésines: Fibronectin binding proteins

Protéine A

IgG

Exoprotéines:protéases lipases collagénase coagulase … toxines:-

entérotoxines -TSST -

exfoliating toxins -

hémolysines - …

Facteurs de virulencesFacteurs de virulences


Hémolysine-α

• 293 aa heptamère•

Forme des pores dans les membranes•

GR, LyC. , cell. épithéliales, plaquettes, …

Hémolysine-β

• 330 aa• Sphingomyélinase• Monocytes, (GR)

Hémolysine-γ

• HlgA (281 aa) + HlgB (300 aa) ou HlgB + HlgC (286 aa)• Forme des pores• MΦ, monocytes, lyC., (GR),…

Hémolysine-δ

• 26 aa• Perturbe les membranes

HémolysinesHémolysines IntroductionIntroduction

EEtudiertudier

l'implication des hémolysines de l'implication des hémolysines de S. aureusS. aureus dans le développement de l'infection dans le développement de l'infection

intracellulaire dans un modèle de cellules intracellulaire dans un modèle de cellules phagocytairesphagocytaires

•• Localisation des Localisation des S. aureusS. aureus intracellulairesintracellulaires

ObjectifsObjectifs

••

Cinétique de multiplication intracellulaire de Cinétique de multiplication intracellulaire de mutants mutants S. aureusS. aureus

•• 83258325--44: : --

souche de laboratoire dsouche de laboratoire déérivrivéée de NCTC 8325 e de NCTC 8325

--

ssééquencquencééee, , souchesouche

de de rrééfféérencerence

pour les pour les éétudes gtudes géénnéétiquestiques

--

hlhlαα+, +, hlhlββ+, +, hlhlγγ+, +, hlhlδδ+, rsbU+, rsbU--

8325-4

1090 hlα*

5719 hlβ*

5942 hlγ*

SH 1000W. T.

Mutants

hlα* hlβ* hlγ*

5938

Souches Souches WT et mutants WT et mutants hémolysineshémolysines

Matériel et méthodesMatériel et méthodes

RésultatsRésultats

8325

-4DU

1090

DU57

19DU

5942

SH 10

00

Ctrl

-

2351

951DU

5938

S.L.

2592

3

Vérification des souches Vérification des souches ––

hémolysine hémolysine αα


EmRhla

2351 pb

1.4 kbhla

259238325-4

DU5938 (α-, β-, γ-)

DU1090 (α-)

DU5719 (β-)

SH1000

H2

O (ctrl -)

DU5942 ( γ-)

Vérification des souches Vérification des souches --

hémolysine hémolysine ββ


SH 10

00

8325

-4DU

1090

DU57

19DU

5942

DU59

38S.

L.

2592

3

985

Φ42Ehlb

~ 40 kbhlb

Mise au point de l'infectionMise au point de l'infection


Infection S. aureus/THP-1: variations de la conc. en gentamicine

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Genta 0.009Genta 0.03Genta 0.05Genta 0.1Genta 0.15Genta 0.2 = CMIGenta 0.25Genta 0.3Genta 0.5Genta 0.95Genta 3Genta 6Genta 18

Genta 0.003

Cro

issa

nce

intr

acel

lula

ire

à 24

h( Δ

log

CFU

/mg

prot

. 24h

- 0h

)

Mise au point de l'infection Mise au point de l'infection


*

Infection S. aureus/THP-1: Effet du nombre de bactéries par macrophage

0 6 12 18 24 30 36 42 481.0×105

1.0×106

1.0×107

1.0×108

1.0×109

SH1000 0.5B/THP-1SH1000 2B/THP-1SH1000 4B/THP-1

Temps (h)

CFU

/mg

prot

.

*

* Acidification des milieux de culture à

48h

*

Croissance intracellulaire des mutantsCroissance intracellulaire des mutants

log [CFU/mg à

24h / CFU à

0h] avec n=3

Analyse statistique (ANOVA par rapport à

la souche parent 8325-4): * p < 0.001

In fection in trace llu la ire de m acroph ag es T HP -1 p ar S . aureus (24h )

ATCC 2592

3

8325

-4 -)α

DU1090

(

-)β

DU5719

(

-)γ

DU5942

(

SH1000 -)γ- β- α

DU5938

(

-1

0

1

2

35h24h

souches de S . aureus

croi

ssan

ce in

trac

ellu

lair

e (d

iflog

)

*

*


Influence du pH sur la croissanceInfluence du pH sur la croissance


pH 5,5

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 601.0×1005

1.0×1006

1.0×1007

1.0×1008

1.0×1009

1.0×1010

25923 ctrl (pH 7.2)259238325-4DU1090

DU5719DU5942SH1000DU5938

Temps (h)

CFU

/ml

Croissance de S. aureus en milieu Müeller-Hinton

pH 7,2

0 6 12 18 24 30 36 42 48 541.0×1005

1.0×1006

1.0×1007

1.0×1008

1.0×1009

1.0×1010

259238325-4DU1090DU5719DU5942

Temps (h)

CFU

/ml

Localisation Localisation subcellulairesubcellulaire

2 µm2 µm

ATCC 25923 (24h)ATCC 25923 (24h) DU5942 (24h)DU5942 (24h)


Conclusion et Conclusion et perspectivesperspectives

••

S. aureusS. aureus capable de se multiplier dans capable de se multiplier dans des cellules des cellules phagocytairesphagocytaires

••

S. aureusS. aureus confinconfinéé

dans des vacuoles dans des vacuoles àà

24h24h

••

Croissance intracellulaire:Croissance intracellulaire:••

ÀÀ

5h : 5h : pas de variation de l'inoculum intracellulairepas de variation de l'inoculum intracellulaire

••

ÀÀ

24h: 24h: croissance identique pour les souches ATCC 25923, 8325croissance identique pour les souches ATCC 25923, 8325--4, 4, DU1090DU1090

((αα--) et ) et DU5719DU5719

((ββ--))DU5942DU5942

((γγ--) ) (2 log) (2 log) >>> 8325>>> 8325--4 4 (0.2 log)(0.2 log)

SH1000SH1000

(1 log)(1 log)

>> 8325>> 8325--4 4 (0.2 log)(0.2 log)

ConclusionsConclusions

Conclusion et perspectivesConclusion et perspectives

SH1000 8325-4


ConclusionsConclusions

••

Impact de rsbU dans l'infection intracellulaire Impact de rsbU dans l'infection intracellulaire ………… liliéé

àà

la production du pigment?la production du pigment?

Endosomes larges? Endosomes larges? Microscopie électronique avec 8325Microscopie électronique avec 8325--4 et microscopie confocale4 et microscopie confocale

Croissance SH1000?Croissance SH1000?EExpression du pigment chez 8325xpression du pigment chez 8325--4 et ATCC259234 et ATCC25923

Implications des hémolysines Implications des hémolysines in vivoin vivo??souches cliniques : prsouches cliniques : préésence des gsence des gèènes des hnes des héémolysines; production molysines; production

des hdes héémolysines, croissance intracellulairemolysines, croissance intracellulaire

Infection intracellulaire dans des cellules endothInfection intracellulaire dans des cellules endothééliales?liales?implication des hémolysines, localisation subcellulaireimplication des hémolysines, localisation subcellulaire

PerspectivesPerspectives


33èmeème Colloque Francophone de Bactériologie Vétérinaire Colloque Francophone de Bactériologie Vétérinaire (Liège 11/07/06 (Liège 11/07/06 –– 13/07/06)13/07/06)

1212thth

International Symposium on Staphylococci International Symposium on Staphylococci & & StaphylococcalStaphylococcal

infections (Maastricht infections (Maastricht

03/09/06 03/09/06 ––

06/09/06)06/09/06)

P. P. TulkensTulkens, F. Van , F. Van BambekeBambeke, B. , B. HalletHallet, M, M--P P MingeotMingeot

Dr T. Foster (Dr T. Foster (MoyneMoyne InsituteInsitute, Trinity , Trinity CollegeCollege, Dublin, Ireland) et Dr. , Dublin, Ireland) et Dr. S. Foster (S. Foster (UniversityUniversity of Sheffield, Sheffield, of Sheffield, Sheffield, EnglandEngland) pour) pour les souches les souches de de S. aureusS. aureus

Pr. P. Pr. P. CourtoyCourtoy et et P.VanP.Van Der Der SmissenSmissen (CELL) microscopie(CELL) microscopie

F. F. RenoirdRenoird, M.C. , M.C. CambierCambier, M. , M. VergauwenVergauwen

Tous les Tous les FACMistesFACMistes……

Merci à ….Merci à ….

Résistance aux antibiotiquesRésistance aux antibiotiques1940s: utilisation de la pénicilline1940s: utilisation de la pénicilline

19421942 S. aureusS. aureus rréésistant sistant àà la pla péénicillinenicilline

Aujourd'hui 90% des souches produisent une Aujourd'hui 90% des souches produisent une ßß--lactamaselactamase

1960s: penicillines semi1960s: penicillines semi--synthsynthéétiques : mtiques : mééthicillinethicilline

MRSA MRSA (methicillin resistant (methicillin resistant S. aureusS. aureus))

Traitement des glycopetidesTraitement des glycopetides

1997 : 1997 : VISAVISA et et VRSAVRSA (2002)(2002)

2003 : CA2003 : CA--MRSA MRSA isolisoléé chez des joueurs de footballchez des joueurs de football

VISAVISA

F.D. Lowy, 2003

VRSAVRSA

F.D. Lowy, 2003

Locus Locus agragr

R.P.

Novick

, 2003

Agr DAgr A Agr BAgr CRNA III

Structure RNA IIIStructure RNA III

R.P.

Novick

, 2003

HHéémolysinemolysine--δδ

A. Pokorny, 2004

••

83258325--4 porte une d4 porte une déélléétion dans le gtion dans le gèène ne rsbUrsbU

••

rsbUrsbU

= r= réégulateur positif du facteur gulateur positif du facteur σσBB

•• σσBB

= facteur de transcription = facteur de transcription ••

Module l'expression des facteurs de virulence et la Module l'expression des facteurs de virulence et la rrééponse au stressponse au stress

••

Influence la production de Influence la production de staphyloxantinestaphyloxantine

(pigment)(pigment)

••

SH 1000 = 8325SH 1000 = 8325--

4 4 rsbUrsbU+ (2002)+ (2002)

Souches WT et mutants hémolysinesSouches WT et mutants hémolysines

DU5942 =DU5942 =

hlhlαα+,+,

hlhlββ+, +, hlhlγγ++, , hlhlδδ+, +, rsbUrsbU--

(1998)(1998)

Tetracycline resistant Tetracycline resistant

hlgBhlgChlgA

hlgB'hlgA' TetR

~ 2000 pb


hémolysine hémolysine γγ


SH 10

00

S.L.

8325

-4DU

1090

DU57

19DU

5942

Ctrl

-

1146

SH 10

00

8325

-4DU

1090

DU57

19DU

5942

S.L.

DU59

38Ct

rl -

1950 ~ 2150



hémolysine hémolysine γγ

hlgA

1950 pb

1146 pb

hlgC hlgB hlgA'TetR

~ 2000 pb

~ 2150 pb

hlgB'

SH 10

0083

25-4

1090

5719

5942

S.L.

5938

Ctrl

-

2592

3

372



hémolysine hémolysine δδ

372 pb

hld

Modèle d'infection intracellulaireModèle d'infection intracellulaire

Barcia-Macay

M.,

Seral

C.,

Mingeot-Leclercq

M.P.,

Tulkens

P.M. and Van

Bambeke

F. (2006).

Pharmacodynamic

evaluation of the intracellular activity of antibiotics against

Staphylococcus aureus in a model of THP-1 macrophages.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(3):841-851

Lemaire

S., Van

Bambeke

F.,

Mingeot-Leclercq

M.P. and

Tulkens

P.M.

(2005). Activity of 3 beta-lactams

(ertapenem,

meropenem, and

ampicillin) against

intraphagocytic

L. monocytogenes and S. aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 55:897–904

•• Macrophages THPMacrophages THP--1 : 1 : --

LignLignééee

cellulaire immortellecellulaire immortelle

-- MacrophagesMacrophages

humains humains


1. Phagocytose1. Phagocytose1h à 37°C 5% CO1h à 37°C 5% CO22

2. Elimination des bactéries 2. Elimination des bactéries extracellulairesextracellulaires

PBS + gentamicine 100 xCMIPBS + gentamicine 100 xCMI

45 min à 37°C45 min à 37°C

3. Lavages PBS3. Lavages PBS

S. aureus THP-1


4. Incubation4. Incubation24h à 37°C, 5% CO24h à 37°C, 5% CO2 2 + gentamicine 1x CMI+ gentamicine 1x CMI

5. Lavage PBS et lyse5. Lavage PBS et lyse

6. CFU + dosage de protéines6. CFU + dosage de protéines

CFU Protéines

bactéries dans le dernier lavage lavage

Genta

0.003

lavag

e G 0.

003

Genta

0.009

lavag

e G 0.

009

Genta

0.03

lavag

e G 0.

03Gen

ta 0.0

5

lavag

e G 0.

05Gen

ta 0.1

lavag

e G 0.

1Gen

ta 0.1

5

lavag

e G 0.

15Gen

ta 0.2

lavag

e G 0.

2Gen

ta 0.2

5

lavag

e G 0.

25Gen

ta 0.3

lavag

e G 0.

3Gen

ta 0.5

lavag

e G 0.

5Gen

ta 0.9

5

lavag

e G 0.

95Gen

ta 3

lavag

e G 3

Genta

6lav

age G

6Gen

ta 18

lavag

e G 18

1.0×104

1.0×105

1.0×106

1.0×107

1.0×108

1.0×109

CFU

/ml

26%

28%

25%

27%

69%

27%

CMI

3% 5%

Cc de gentamicine Cc de gentamicine ––

bactéries dans le dernier lavagebactéries dans le dernier lavage

Documents

Implication des hémolysines de Staphylococcus aureus … · Listeria monocytogenes . and . ... = régulateur positif du facteur σ B • σσ B = facteur de transcription ... Module