Impacto do uso de Rhizobium no rendimento

de feijão-caupi• Embrapa Agrobiologia

(Seropédica, RJ)– Norma Gouvêa

Rumjanek – Gustavo Ribeiro Xavier

• UNEB (Juazeiros, BA)– Lindete Miria Vieira

Martins

• UFRPE (Recife, PE)– Carolina Etienne dos

Santos

• UFERSA (Mossoró, RN)– Claudia Miranda Martins

Agrobiologia

CONACMini-curso

Teresina, PI22 a

24/5/2006

Programa

23/5

Introdução à FBN, nodulação, especificidade da simbiose, diversidade do rizóbio – Norma G. Rumjanek

Inoculante, normas técnicas, RELARE – Gustavo R. Xavier

24/5

Como se seleciona uma estirpe de rizóbio para ser utilizada como inoculante – Norma G. Rumjanek

Perspectivas futuras, pesquisa participativa, novos veículos – Gustavo R. Xavier

Fixação Biológica de Nitrogênio

Norma Gouvêa Rumjanek

Uma breve introdução...

Gramíneas: arroz, trigo, milho, sorgo, cevada...

Leguminosas: soja, amendoim, feijão...

Leguminosas alto teor protéico, 2 a 3 vezes maior do que os cereais algumas leguminosas, soja e amendoim, também alto teor

de óleo leguminosas estão dispersas em todo o planeta, porém é

mais comum em áreas tropicais e sub-tropicais

Alimentação humana

teor de proteínaX

disponibilidade de N

Eucariotos: plantas, animais e seres humanos não conseguem fixar o N2

Procariotos: possuem a enzima, nitrogenase que reduz o N2 produzindo amônia

N278%

O221%

CO20,03%

atmosfera

solo

-em pequenas concentrações

-nem sempre prontamente disponível

-exceto quando há alto teor de MO

Fixação Biológica de Nitrogênio

O N2 é a maior fonte de N disponível

produzir N combinado a partir de N2

contribui para o desenvolvimento vegetal e para a fertilidade do solo

Reação de redução do N2 atmosférico

pela nitrogenase

N N

ATP, Mg2NH3 + H2N2 + 8e +

8H+ nitrogenase

hidrogenase

ATP

nitrogenase

N2 NH4+ +

H2

ATP + H2O

Fenótipo em soja

Hup+ maior eficiência simbiótica

menor competitividade

Hup- menor eficiência simbiótica

maior competitividade

Controle do oxigênio

•Nitrogenase é sensível ao oxigênio – dificuldade de purificação

•Aporte de elétrons e ATPs

Presença de leghemoglobina

Produção de exopolissacarídeos

Interior do nódulo

Rizóbio dentro de um nódulo

Cada nódulo tem cerca de 109

células bacterianas

Microscópio de varredura

Nódulos ativos e novos

Presença de leghemoglobina

Lupa

Rizóbio no solo envolto por uma cápsula de exopolissacarídeo, que protege a célula contra a

dessecação. Também facilita a aderência à superfície da raiz.

Microscopia de transmissão: Frank Dazzo (obtida de homepage)

Nódulos em raízes de Vicia faba, de acordo com ilustração de Malpighi

(1679)

Patógeno radicular

?

Identificação do rizóbio - primeiros passos

1888 - Beijerinck: isolamento e purificação da bactéria presente no nódulo

1879 - Frank: mostrou que sementes de leguminosas cultivadas em solos esterilizados não formavam nódulos

1886 a 1888 - Hellriegel: realizou experimentos em áreas com pouco nitrogênio

leguminosas: bom desenvolvimento

outras famílias: desenvolvimento ruimConclusão: as leguminosas poderiam estar aproveitando o N2 da atmosfera1887 - Ward: usou nódulos macerados

para inocular sementes de leguminosas cultivadas em solos esterilizados

Já tem mais de 1

século que este

grupo de bactérias

é conhecido

Simbiose

• relação benéfica para ambos os organismos;

• simbiose leguminosa x rizóbio: é um dos melhores exemplos e também um dos mais bem estudados;

planta: recebe N para o seu crescimento

bacteróide: tem um nicho protegido, rico em nutrientes

(cerca de 30% do C fixado pela fotossíntese é exudado pela raiz).

genes nod

lipoquito oligossacarídeoproteína

Nod D

rizóbio

lipoquitooligossacarídeo

1. encurvamento do pelo radicular

2. formação do cordão de infecção

3. divisão de células do córtex radicular

raiz de leguminosa

exudato radicular

flavonóides

Como é formadoo nódulo…

Formação do nódulo

Efeito rizosfera

Encurvamento do pelo

radicular

Formação do nódulo

Células de Rhizobium trifolii aderidas à superfície da ponta da raiz de trevo

Foto: Frank Dazzo (obtida de homepage)

12

2

Rhizobium trifolii aderidos à superfície da raiz de trevo. Formação de uma rede de microfibrilas (celulose/exopolissacarídeos)

Foto: Frank Dazzo (obtida de homepage)

B.

japonicumB.

japonicum

R. leguminosaru

m

R. leguminosaru

m

controle

R. meliloti

Efeito de fatores de nodulação em raiz de siratro

Microscopia de varredura de uma célula infectada de Vicia faba,

mostrando bacteróides alongados(Sprent, 1979)

Microscopia eletrônica de transmissão de células de Glycine max contendo

bacteródies ativos

Nodulação em espécies não-leguminosas promovidas por actinomicetos do gênero

Frankia

Microscopia de varredura de nódulode Myrica Células infectadas

Nódulos radiculares

nódulos radiculares

nódulos caulinares

crescimento determinado

crescimento indeterminado

nóduloscaulinares

nódulosradiculares

Nódulos caulinares

de Sesbania rostrata

Fixação Biológica de Nitrogênio

inoculado

não inoculado

Siratro cultivado em condições estéreis

não inoculado

inoculado

Quantificação da FBN em caupi

N fixado Referênciakg N fixado.ha-1 % do N total da planta

73-354 - Nutman (1976)9-51 - Boddey et al. (1989)3,5 - Watanabe et al. (1990)- 83-89 Eaglesham et al. (1977)- 90 Minchin & Summerfield (1978)- 66 Ofori et al. (1987)- 42-72 Ankomah et al. (1996)

Especificidade na interação da leguminosa com bactérias do grupo

“rizóbio”

Rizóbio tropical

• Altamente diverso;

• estirpes de crescimento lento;

• reconhecem um grande número de hospedeiros;

raiz de leguminosa

flavonóides lipoquitooligossacarídeos

rizóbio

**

* *

Teste de inoculação cruzada

0

20

40

60

80

100

% d

e is

ola

do

s

nodulação eficaz

nodulação ineficaz

nodulação não observada

Carolina E. Santos

Isolados de amendoim

Isolados de A. americana

Isolados de S.guianensis

Nod em Stylosant

hes

Nod em caupi

Nod em amendoi

m e siratro

Nod em Aeschynome

ne

Esquema de inoculação cruzada

Carolina E. Santos

St+

Am+

Am-

Am-

Si-

Si+

Si+

Aes+

Aes+

Ca+

Ca+

Ca+Estirpes isoladas de nódulos de amendoim

Estirpes isoladas de nódulos de Aeschynomene

Estirpes isolada de nódulo de Aeschynomene

Estirpes isoladas de nódulos de Stylosanthes

Dendrograma de estirpes de rizóbio de acordo com resultado de inoculação cruzada

Competividade entre estirpes de rizóbio tropical

Produção de bacteriocina em meio de cultura

BR29

B.elkanii

BR33B.japonicum

0

25

50

75

100

% d

e o

cup

ação

no

du

lar

5s13

2a17

8a4

Taxa de ocupação em nódulo de caupi

por 3 estirpes utilizadas como inoculante

Brasil

EUA

Nigéria

Gustavo R. Xavier

Diversidade do rizóbio tropical

Família Rhizobiaceae~ Bergey´s manual 1984 ~

Rizóbio (rhiza: raiz e bios: vida – o que vive na raiz)

1) Células estimulam a formação de nódulos em raízes de leguminosas. Quando em simbiose reduzem N2 atmosférico

2 gêneros classificados:• Rhizobium (Frank 1889) - crescimento rápido em meio com

manitol/extrato de levedura, geralmente nodulam leguminosas temperadas, reação ácida no meio. Teor G+C: 59-64

• Bradyrhizobium (Jordan 1982) - crescimento lento em meio com manitol/extrato de levedura, geralmente nodulam leguminosas tropicais, reação alcalina no meio. Teor G+C: 61-65

2) Células não causam a formação de nódulos nas raízes mas a maioria das spp produzem outros tipos de hipertrofia em várias plantas. Não fixam nitrogênio

Rhizobium (Frank 1889)

• Bastonetes. Geralmente contém grânulos de Poli-B-hidroxibutirato• Não forma esporo• Gram-negativa• Motilidade através de 1 flagelo polar ou subpolar ou vários ao redor da

célula• Aerobiose• Capaz de crescer em microaerofilia• Colônias são circulares, convexas, semi-translúcidas, produtoras de muco• Utilizam uma faixa ampla de fontes de carbono• Produção de muco abundante em meio contendo carboidrato• Reação ácida quando cresce em manitol ou outros carboidratos• Fonte de N: sais de amônio, nitrato e a maioria dos aminoácidos• São capazes de formar nódulos com leguminosas de clima temperado e

algumas de clima tropical• Nos nódulos, assume formas pleomórficas (bacteróides)

Bradyrhizobium (Jordan 1982)

• Bastonetes. Geralmente contém grânulos de Poli-B-hidroxibutirato• Não forma esporo• Gram-negativa• Motilidade através de 1 flagelo polar ou subpolar• Aeróbico• Capaz de crescer em microaerofilia• Colônias são circulares, convexas, opacas, produtoras de muco• Utilizam uma faixa ampla de fontes de carbono• Produção de muco abundante em meio contendo carboidrato• Reação alcalina quando cresce em manitol ou em outros carboidratos• Fonte de N: sais de amônio, nitrato e alguns aminoácidos• São capazes de formar nódulos com leguminosas de clima tropical e

algumas de clima temperado• Nos nódulos, assume formas pleomórficas (bacteróides)

Estirpes de rizóbio

isoladas de nódulos de

caupi cultivado

em amostras de solo do Nordeste do Brasil Bradyrhizobi

um japonicum

BR 2001

Rhizobium

Sinorhizobium

Azorhizobium

Rhizobium

Sinorhiz.

Mesorhiz.

sem similaridade com spp descritas

Bradyrhiz.

Azorhiz.

Isolados de nódulos de amendoim

Alteração do pH do meio de cultura

por estirpes de rizóbio

0

20

40

60

80

100

Arach

is s

pp

Stylo

santh

es spp

Aeschyn

omene s

pp

Arach

is s

pp

Stylo

santh

es spp

Aeschyn

omene s

pp

Arach

is s

pp

Stylo

santh

es spp

Aeschyn

omene s

pp

% d

e is

ola

do

s

reção ácida

reação alcalina

1 dia >2 dias2 dias

0

10

20

30

40

50

Arachis spp Stylosanthes spp Aeschynomene spp

%

Composição dos grupos de rizóbio isolados de

nódulos radiculares de gêneros da tribo

Aeschynomeneae

***

Espécies da tribo Aeschynomeneae

Riqueza de grupos de rizóbio isoladosde nódulos radiculares

0

1

2

3

4

5

6

7

Índice de Margalef

S-1/logN

0

1

2

3

4

5

Eng. U

mbu

IAC 5

BR 1

IAC J

umbo

IAC 8

112

IAC 8

86 L 7

IAC T

atu

Índice de Margalef

Riqueza de grupos de rizóbio isolados

de nódulos radiculares de

cultivares de amendoim

S-1/logN

Obrigado!!!

norma@cnpab.embrapa.br